L'autore ringrazia profondamente Dr. Asako Sugimoto (Università di Tohoku) per la sua discussione utile. wyIs251 era un dono generoso da Dr. Kang Shen (Stanford University). mnIs17 è stato fornito dalla CGC, che è finanziato dall'ufficio di NIH di programmi di ricerca dell'infrastruttura (P40 OD010440). Questo lavoro è stato supportato da grant JSPS KAKENHI #17 H 05010 e #16 H 06536 e Fondazione di Daiichi Sankyo, Brain Science Foundation e Naito Foundation.

1. preparazione del campione <ol><li>genera un transgenico c. elegans ceppo di interesse utilizzando metodologie transgeniche 18. In alternativa, ottenere ceppi appropriati da Caenorhabditis Genetics Center (CGC). Per visualizzare il trasporto assonale dei precursori delle vescicole sinaptiche, utilizzare la linea transgenica wyIs251 [Pmig-13::gfp::rab-3] 7. Per osservare IFT, ottenere la linea transgenica mnIs17 [osm-6::gfp] 19. Questi ceppi sono utilizzati in questo protocollo. 
	Nota: Una matrice extracromosomico, integrazione genomica o anche GFP knock-in works. Per ridurre i segnali di fondo, utilizzare promotori di cellula-specifico, piuttosto che pan-neuronale promotori. 
	Nota: Manutenzione di worms è descritto in altri protocolli 20. Ceppi sono stati mantenuti su prati dell'alimentatore Escherischia coli OP50 sulla crescita del nematode piastre di terreno (NGM) (agarosio 1,7% (p/v), 50 mM NaCl, 0,25% (p/v) di peptone, 1 mM CaCl 2, 5mg/mL colesterolo, 25mm KH 2 PO 4, 1mm MgSO 4 su piatti di plastica di diametro 60 mm) a 20 ° C.</li>
	<li>Crescere i vermi a 20 ° C sulle piastre di NGM a qualsiasi fase del ciclo di vita dei vermi. 
	Nota: Si può osservare sia trasporto assonale e IFT in qualsiasi fase. L4 tardivo a giovane adulto è un buon controllo positivo perché più pubblicazioni hanno utilizzato queste fasi e visualizzato in quel momento 22 eventi traffico 14 , 21 , , 23.</li>
</ol> 2. Preparazione del 10% dell'agarosi Nota: molti fornitori offrono prodotti simili, quali polveri di agar agar e agarosio. Utilizzare agarosio per elettroforesi (resistenza del gel &#62; 1200 g/cm 2). Polveri di agar a buon mercato non funzionano perché il gel risultante non è abbastanza forte per immobilizzare worm.
<ol><li>Mix 0,4 g agarosio in 4 mL di acqua distillata acqua (DW) in un tubo di vetro (1,5 x 10,5 cm). Mettere un coperchio sul tubo di vetro per evitare l'evaporazione.</li>
	<li>Mettere il tubo di vetro su un blocco di calore di 95 ° C per 90 min. Inoltre, preparare un altro tubo di vetro (1,5 x 10,5 cm) riempito con DW e tenerlo a 95 ° C. mettere una pipetta Pasteur a 95 ° C DW ( Figura 1 A). Un sacco di piccole bolle sarà visibili nel tubo di agarosio e la soluzione deve essere torbida. Lasciare fino a quando la soluzione diventa chiara. Quindi, mescolare pipettando su e giù fino a quando la soluzione di agarosio diventa omogenea. 
	Nota: Forno a microonde non può essere utilizzato per preparare la soluzione di agarosio 10% quando effettuata in DW e dell'agarosi. Piccole bolle causate dalle microonde evitare la fusione dell'agarosi. Tuttavia, gel di agarosio solidificato 10% facilmente possono essere fusi nuovamente utilizzando un forno a microonde. Tubi di vetro contenenti gel di agarosio al 10% possono essere preparati in anticipo e conservati a 4 ° C per almeno 6 mesi. Se in questo modo, sciogliere il brodo utilizzando un forno a microonde quando necessario e iniziare dal passaggio 3 in questo protocollo. 
	Nota: Agarosio perde gradualmente la capacità di solidificare se incubate a 95 ° C per un tempo lungo o dopo ripetute solidificazione e fusione. Se questo accade, preparare nuove 10% agarosio.</li>
</ol> 3. Preparazione di agarosio Pad <ol><li>usando la pipetta di Pasteur riscaldata preparata al punto 2.2, inserire 2 gocce di agarosio al 10% in una diapositiva di 76 x 22 mm.</li>
	<li>Rapidamente coprire con una seconda diapositiva 2 76 x 22 mm prima della caduta dell'agarosi si solidifica come mostrato in Figura 1 B e spingere verso il basso della seconda diapositiva per appiattire la soluzione di agarosio. Lo spessore deve essere di 0,5-1 mm.</li>
	<li>Rapidamente svuotare la pipetta di Pasteur di pipettaggio 95 ° C DW su e giù fino a quando la soluzione di agarosio è lavata fuori. In caso contrario, la pipetta sarà ostruirsi di gel di agarosio. Lasciare la pipetta a 95 ° C DW.</li>
	<li>Attesa per 1 min. Il pad di agarosio forma e diventa torbida. Quindi, far scorrere le diapositive apart a mano ( Figura 1 C).</li>
</ol> 4. Montaggio di vermi Nota: anche piccole quantità di movimento verme prevenire buona osservazione. Levamisole è stato tradizionalmente usato per impedire il movimento della vite senza fine sull'agarosio pad 24 , 25. Tuttavia, Levamisole inibisce i recettori neuronali in c. elegans e pertanto può influenzare eventi di traffici in neuroni 15. Utilizzando microsfere di polistirolo descritto qui una buona alternativa 17.
<ol><li>Sotto un microscopio stereo equipaggiato con una transilluminazione specchio scorrevole, trasferire ~ 30 vermi transgenici che esprimono gli indicatori appropriati per un nuovo NGM piastra senza batteri utilizzando un filo di platino pick. 
	Nota: Un filo di platino pick è costituito da filo di platino e pipetta Pasteur (5 pollici), e la punta del filo platino è stata appiattita. La preparazione dei picconi filo di platino e la manipolazione di vermi con questi sono descritti in Wormbook (http://www.wormbook.org).</li>
	<li>Lasciare la piastra per 1 min. batteri vengono rimossi automaticamente dalle superfici di vermi come i vermi muoversi su gel di agarosio NGM senza batteri.</li>
	<li>Put a 0,5-1,0 µ l goccia del 2,6% 100 microsfere di polistirolo del diametro nm in acqua sul blocchetto di agar ( Figura 1 D). Consente di trasferire le microsfere 10-20 vermi dalla piastra di NGM esente da batteri. Goccia e la diffusione di worm usando il legare di platino pick per evitare la sovrapposizione di verme corpi ( Figura 1 E).</li>
	<li>Applicare un vetrino coprioggetti 2 di 22 x 40 mm ( Figura 1, F). Spingere delicatamente per rimuovere le bolle d'aria, ma evitare di schiacciare le viti senza fine. Il campione è pronto per l'imaging. 
	Nota: Poiché non è amministrata anestesia, vermi vengono risolti solo dalla forza di attrito generata da agar pad, microsfere di polistirolo e coprioggetto 17. La presenza di batteri di alimentatore e/o troppo soluzione renderà la forza di attrito più debole. 
	Nota: Diverse dimensioni del lavoro di vetrini coprioggetti (ad es., 22 x 22 mm 2, 18 x 18 mm 2). Tuttavia, le lamelle più grandi possono impedire immersione acqua o olio dalla lente dell'obiettivo che perde in campioni durante l'osservazione.</li>
</ol> 5. Osservazione Nota: appropriati parametri di imaging (potenza laser, guadagno, binning, ecc.) saranno diverso per ogni sistema di microscopio e la fotocamera. Qui, viene utilizzato un microscopio widefield equipaggiato con uno scanner confocale del disco rotante e una macchina fotografica digitale del CCD.
<ol><li>Impostare il controllo della temperatura della fase a 20 ° C, o regolare la temperatura a 20 ° C.</li>
	<li>Mettere il vetrino sul tavolino del microscopio. Utilizzare x 100 (apertura numerica = 1.3 o superiore) dell'obiettivo.</li>
	<li>Cercare le aree indicate in Figura 2 A (per wyIs251 e trasporto assonale) o Figura 2 B (per mnIs17 e IFT) come controlli positivi . Altre zone possono essere analizzati come ben 22.</li>
	<li>Set di parametri (CCD guadagno = 200, Binning = 1 o 2, potenza laser a 488 nm = 1.0-1.3 mW). Eseguire la registrazione continua a 4 fotogrammi/s per fino a 1 min Salva file come formato mutli-TIFF. 
	Nota: Se GFP segnali scomparire ed è difficile continuare a osservare GFP::RAB-3 o OSM-6::GFP per 30 s, la potenza del laser è troppo forte. In tal caso, ridurre la potenza del laser. Al contrario, se non è registrato nessun movimento vescicolare, la potenza del laser è troppo debole. In tal caso, aumentare la potenza del laser.</li>
	<li>Osservare un worm diverso e ripetere 5.3 e 5.4. Le osservazioni possono durare fino a 20 min, ma ogni verme deve essere registrati una sola volta per evitare gli effetti di pdanni di Hoto. 
	Nota: I vermi sono stati osservati per almeno 20 min senza difetti significativi 7 , 27 , 28. Osservazione più lunga può essere possibile, ma porto &#39; t stato ancora testato. Un chiaro segno della morte neuronale è il cambiamento della morfologia neuronale come gonfiore del neurite. Segnali deboli di GFP possono essere visto negli assoni e dendriti sia wyIs251 e mnIs17, morfologia del neurite può essere facilmente controllato da solo guardando gli assoni o dendriti. Morfologia neuronale è illustrato nella Figura 2.</li>
	<li>Generare filmati.
	<ol><li>Apri il file Multi-TIFF file utilizzando software di Fiji. Vai a File &#62; Open quindi selezionare il file Multi-TIFF salvato al passaggio 5.4. 
		Nota: Fiji può essere scaricato presso jttps://fiji.sc. Immagine J e plugin può anche essere utilizzato per generare chimografi. Se in questo modo, seguire le istruzioni pertinenti per il plugin scelto.</li> <li>scegliere la &#34; selezione rettangolare &#34; ( Figura 3 A, freccia) e seleziona l'area di interesse disegnando un rettangolo con un mouse del computer (rettangolo giallo in Figura 3 A). Vai a immagine &#62; stack &#62; strumenti &#62; fare Substacks e selezionare i numeri di fetta che sono inclusi nel film. Viene generato un substack.</li>
		<li>Attivare la finestra di substack cliccando e passare all'immagine &#62; regolare &#62; luminosità/contrasto. Una finestra per regolare la luminosità e il contrasto si presenta. Nella finestra, fare scorrere la parte superiore bar (minimo) a destra così che il segnale di fondo sparisce e il secondo bar top (massimo) a sinistra così che le particelle e le vescicole commovente possono essere visto abbastanza bene sullo sfondo.</li>
		<li>Vai a immagine &#62; stack &#62; tempo Stamper. Come il film è registrato a 4 fotogrammi/s al punto 5.4, l'intervallo di tempo è 0,25 s. Quindi, digitare &#34; 0.25 &#34; nell'intervallo di.</li>
		<li>Generare un file di filmato selezionando Salva come &#62; AVI dal menu File (film 1 e 2). 
		Nota: Utilizzando il plugin appropriato, è possibile salvare il file come altri formati come &#34; mpeg4 &#34; o &#34; mov &#34; file.</li>
	</ol></li> <li>Generare chimografi.
	<ol><li>Aprire i file del filmato originale utilizzando software di FIji nuovamente e ripetere i passaggi 5.6.2 e 5.6.3 per regolare la luminosità e il contrasto.</li>
		<li>Clic &#34; segmentato linea &#34; ( Figura 3 B, freccia). Usando un mouse, disegnare una linea segmentata lungo le ciglia o assone (linea gialla, in Figura 3 B).</li>
		<li>Andare a analizzare &#62; Multi Kymograph &#62; Multi Kymograph ( Figura 3 C). Linea larghezza finestra ( Figura 3 D). Tipo &#34; 3 &#34; nella finestra di Linewidth e fare clic su OK ( Figura 3 D).</li>
		<li>Kymograph finestra viene creata. Salvare l'immagine in formato TIFF o JPEG.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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L'autore non ha nulla di divulgare.

Limitazione per quanto riguarda i metodi esistenti Il metodo qui descritto è ottimizzato per osservare eventi veloci come trasporto assonale e IFT. Così, l'immobilizzazione è più una priorità di incubazione più lungo. Mentre siamo stati in grado di osservare eventi di traffici per almeno 20 min senza perturbazione significativa, questo metodo potrebbe non essere sempre adatto per osservare eventi lenti che richiedono osservazioni più lungo, ad esempio allungamento dell'assone e migrazione cellulare. Per le osservazioni più lungo, uno ha bisogno di ottimizzare le condizioni di riduzione della percentuale di agarosio (cioè, aumentando l'acqua per evitare il prosciugamento e riducendo la pressione che potenzialmente provoca danni). In alternativa, il dispositivo microfluidico descritto sopra15 o immobilizzazione di vermi utilizzando anestesia e pastiglie di agarosio può essere più adatto16 , mentre gli effetti collaterali dovrebbero essere valutati con attenzione.
Fasi critiche all'interno del protocollo Per un'adeguata osservazione, gli indicatori sono fondamentali. Marcatori devono essere incorporati in vescicole o particelle ed essere di sufficiente luminosità. Extracromosomico matrici o linee integrate possono essere utilizzati. Per la visualizzazione del trasporto assonale dei precursori della vescicola sinaptica nei neuroni DA9, il ceppo di wyIs251 è utile7,23. jsIs821 è stato usato per osservare il trasporto assonale in neuroni che mechanosensory in alcuni studi26,27. Quando vengono analizzati altri neuroni, proteine delle vescicole sinaptiche dovrebbero essere espresso nei neuroni interessati utilizzando promotori specifici delle cellule. Questi promotori dovrebbero essere abbastanza forti. RAB-3 e SNB-1 sono ampiamente usati per etichettare delle vescicole sinaptiche precursori22,23,26. Per osservare IFT, i componenti dei complessi IFT devono essere etichettati. Come controllo positivo, il ceppo di mnIs17 è una buona scelta di29. Ciglia che emana da 8 celle (ASE, ASG, ASI, ASL, ASH, ASK, ADF e ADL) è raggruppati in testa (amphid) mentre ciglia da 2 celle (PHA e PHB) è in bundle nella coda (fasmide). Perché OSM-6::GFP è espresso nei neuroni tutti i ciliati in mnIs17, può essere difficile da analizzare l'IFT dettagliatamente nelle ciglia di testa. Tuttavia, nella regione della coda, solo i neuroni PHA e PHB sono etichettati e IFT in ogni cella può essere facilmente risolto. Altre proteine IFT etichettati da proteine fluorescenti possono essere utilizzati per osservare IFT21,28. Se si vuole analizzare i neuroni testa, promotori di cellula-specifico sarebbe utili. Mentre testa ciglia hanno diverse morfologie, gli eventi di trasporto possono essere registrato29. Incrociando i mutanti con questi marcatori, le funzioni di qualsiasi geni nel trasporto assonale e IFT può essere analizzato in vivo. I parametri che possono essere analizzati sono stati descritti nel precedente lavoro22,23,26,27. GFP è la scelta migliore e primaria. mCherry e tdTomato possono anche essere usate22, tuttavia, è molto più opaca del GFP mCherry. tdTomato è un dimero di tandem e maggiore di proteine fluorescenti monomeriche, che a volte colpisce la dinamica delle proteine di fusione30. Pertanto, i risultati devono essere analizzati e interpretati con cautela quando si utilizza tdTomato. mScarlet, una proteina fluorescente rossa monomerica brillante che recentemente è stata sviluppata, è una scelta alternativa31.
Mentre la filatura microscopia confocale disco è ampiamente usato per osservare il trasporto assonale e IFT7,21, l'apparecchiatura è costoso e può essere di difficile accesso in alcuni ambienti di ricerca. Tuttavia, questi fenomeni possono essere anche registrati e analizzati in c. elegans utilizzando microscopi fluorescenti standard, se dotato di alta NA lenti, perché c. elegans è un piccolo e trasparente animale e facile da osservare.
Applicazioni future Dal metodo di immobilizzazione simili descritto qui, è stata osservata la risoluzione di singola molecola in vivo32IFT. Inoltre, sono stati sviluppati diversi tipi di microscopia di Super-risoluzione. Si possono applicare direttamente i metodi descritti qui all'analisi microscopica di Super-risoluzione. Nella mia esperienza, la modalità veloce di Airyscan33 funziona molto bene per analizzare IFT. Teoricamente, un microscopio di Super-risoluzione di disco rotante (SDSRM) sarebbe una buona scelta come ben34. In conclusione, combinando mutanti biblioteche e queste nuove tecniche, il metodo descritto qui dovrebbe essere utile per chiarire i meccanismi molecolari del trasporto assonale e IFT in vivo.

Live cell imaging è uno strumento essenziale per l'analisi di trasporto intracellulare. Nella biologia delle cellule neuronali, sono essenziali per comprendere la funzione e la morfogenesi neuronale1analisi del trasporto assonale con formazione immagine di cellule vive. Difetti nel trasporto assonale sono alla base di disordini neurodegenerative diversi2. Dineina e chinesina superfamiglia proteine svolgere trasporto assonale anterograda e retrogradely, rispettivamente1,2.
Le ciglia sono un altro compartimento cellulare in cui la rete dei microtubuli e traffico macchine sono altamente sviluppato3. Macchinario di sintesi proteica non è localizzata nelle ciglia, il che significa che ciliare proteine devono essere trasportati dal citoplasma verso le punte di ciglia. Cilia-specifiche chinesina e dineina, chiamato chinesina-2 e citoplasmatici dineina-2, rispettivamente, i componenti di ciglia4, in un fenomeno chiamato trasporto intraflagellare (IFT)5di trasporto. Il danno dell'IFT causa uno spettro di malattie chiamate ciliopatie6. Così, per capire i meccanismi di base della formazione ciliare e la patogenesi sono necessaria analisi del meccanismo IFT da formazione immagine di cellule vive.
Caenorhabditis elegans (C. elegans) è un buon modello per studiare il trasporto assonale e IFT7,8,9. Per osservare IFT, Chlamydomonas è stato ampiamente utilizzato come organismo modello5,6. Essendo un organismo unicellulare Chlamydomonas , il rapporto dell'IFT con invecchiamento, funzione di un neurone e comportamento sarebbe difficile da analizzare. Inoltre, tecniche di genetiche essenziale come CRISPR/Cas9 non siano state applicate a Chlamydomonas. Negli più alti organismi di modello, come topi e Drosophila, interruzione del trasporto assonale e IFT spesso provoca fenotipi letali perché trasporto assonale e IFT sono essenziali per la morfogenesi e l'omeostasi del animali 10, 11. Nel caso di topi, trasfezione e coltura delle cellule è generalmente necessario osservare trasporto assonale e IFT, che richiede molte competenze e tempo estesa12,13. Inoltre, un sacco di contesto fisiologico importante può essere perso in linee cellulari e cellule coltivate. Poiché il sistema nervoso non è essenziale per la sopravvivenza dei vermi, c. elegans mutanti in cui trasporto assonale o IFT sono interrotti non sono spesso letali7,9,14. Trasporto assonale e IFT può essere osservato direttamente in vivo senza dissezione perché c. elegans è trasparente ed è quindi facile osservare GFP-etichettato marcatori.
Esistono diversi protocolli per immobilizzare c. elegans, come l'utilizzo di un dispositivo di microfluidica15, pastiglie di agarosio con anestesia16o microsfere17. L'inclusione dell'anestesia può inibire gli eventi traffici in neuroni15. Un chiaro svantaggio del metodo microfluidici-periferica è che preparando un dispositivo microfluidico non è sempre facile. Invece, l'immobilizzazione di agarosio pastiglie e microsfere è un modo conveniente e facile per eseguire imaging lasso di tempo in c. elegans. Qui, descrivo questo protocollo di base per immobilizzare c. elegans e visualizzare trasporto assonale e IFT in vivo in elegans del c. Rispetto agli altri metodi, il metodo qui descritto non richiede attrezzature speciali ed è molto più economico e più facile da eseguire.

<table><tbody><tr><td>Slideglass (76&amp;nbsp; x 26 mm)</td><td>Matsunami</td><td>S1111</td><td></td></tr><tr><td>Coverglass (22&amp;nbsp; x 40 mm)</td><td>Matsunami</td><td>C024401</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Wako</td><td>318-01195</td><td></td></tr><tr><td>Polystylene microbeads 0.1 micron</td><td>Polysciences</td><td>#00876</td><td></td></tr><tr><td>Heat block</td><td>TAITEC</td><td>0063288-000</td><td>CTU-mini</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX-71</td><td>widefield microscope</td></tr><tr><td>Spinning disk Scanner</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-X1</td><td>spinning disc confocal scanner&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Digital CCD camera</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C10600-10B</td><td>ORCA-R2 degital CCD camera</td></tr><tr><td>Objective lens (x100, NA1.4)</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO 100XO</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipette (5 inch)</td><td>IWAKI</td><td>IK-PAS-5P</td><td></td></tr><tr><td>Glass tube (1.5 cm diameter x 10.5 cm)</td><td>IWAKI</td><td>9820TST15-105NP</td><td></td></tr><tr><td>TV9211: &lt;em&gt;wyIs251&lt;/em&gt;</td><td>Laboratory of Kang Shen</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>OTL11: &lt;em&gt;mnIs17&lt;/em&gt;</td><td>Ref. 27, 29</td><td>N/A</td><td>SP2101 was backcrossed with wild type for 6 times</td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>435064-9000-000</td><td>STEMI 508&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mirror transillumination unit</td><td>Carl Zeiss</td><td>435425-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>platinum wire (0.2 mm)</td><td>Nilaco Corporation</td><td>m78483501</td><td></td></tr><tr><td>60 mm plastic dish</td><td>Falcon</td><td>#351007</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>https://fiji.sc/</td></tr><tr><td>nematode growth medium (NGM)&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>1.7% (w/v) agarose, 50mM NaCl, 0.25% (w/v) Peptone, 1 mM CaCl2, 5 mg/mL Cholesterol, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

immobilization of caenorhabditis elegans to analyze intracellular transport in neurons

Trasporto assonale e trasporto intraflagellare (IFT) sono essenziali per la funzione e la morfogenesi dell'assone e le ciglia. Dineina e chinesina superfamiglia delle proteine sono motori molecolari che regolano anterograda e retrograda trasporto, rispettivamente. Questi motori utilizzano microtubule network come rotaie. Caenorhabditis elegans (C. elegans) è un organismo potente modello per studiare il trasporto assonale e IFT in vivo. Qui, descrivo un protocollo per osservare il trasporto assonale e IFT nella vita di c. elegans. Merce trasportata può essere visualizzato mediante codifica proteine cargo utilizzando proteine fluorescenti come proteina fluorescente verde (GFP). C. elegans è trasparente e proteine GFP-etichettato cargo possono essere espresso in cellule specifiche sotto promotori di cellula-specifico. Viti senza fine viventi possono essere risolto microsfere su gel di agarosio 10% senza uccidere o anestetizzare i vermi. In queste condizioni, movimento di carico può essere osservato direttamente negli assoni e ciglia di vivere c. elegans senza dissezione. Questo metodo può essere applicato per l'osservazione di qualsiasi molecola di carico in tutte le cellule modificando proteine bersaglio e/o le cellule in che si sono espressi. Le proteine più elementari quali motori molecolari e proteine adattatrici che sono coinvolti nel trasporto assonale e IFT sono conservate in c. elegans. Rispetto ad altri organismi di modello, mutanti possono essere ottenute e mantenute più facilmente in c. elegans. Combinando questo metodo con vari mutanti di c. elegans può chiarire i meccanismi molecolari del trasporto assonale e IFT.

Trasporto assonale nel neurone DA9 Utilizzando la riga di wyIs251 , l'anterograda e il trasporto assonale retrogrado di GFP::RAB-3 possa essere registrata simultaneamente nel neurone motore DA9. La velocità media di anterograda e retrograda trasporto nell'assone dorsale prossimale del neurone DA9 è circa 1,8 e 2,6 μm/s, rispettivamente22. Il numero delle vescicole commovente è circa 0,03 e 0,018 a μm di assone a s. Così, per un'osservazione s 30 10 μm di assone DA9 utilizza un obiettivo 100x, uno può trovare circa 9 e 5 vescicole in movimento nell'assone (Figura 4 e Movie 1). Se nessun movimento vescicolare può essere osservato, è possibile che la potenza del laser è troppo debole. Oltre alle esecuzioni di lungo raggio, movimento di corto raggio delle piscine della vescicola può essere registrata (1 film). Alcune vescicole smettere queste piscine della vescicola, mentre gli altri dissociare da lì7,23. Questi parametri possono essere monitorati e utilizzati per analizzare i fenotipi mutanti.
IFT in neuroni di coda Ciglia è localizzati all'estremità dei dendriti in c. elegans (Figura 2B). Il ceppo di mnIs17 esprime GFP-etichettato OSM-6, una delle subunità IFT29. OSM-6 è espresso in entrambi testa e coda neuroni19. Mentre molte ciglia testa è etichettati da mnIs17, solo due ciglia è chiaramente osservato nel neurone coda. Così, osservando queste ciglia è più facile che testa ciglia (veda inoltre la discussione). OSM-6::GFP è diffuso nel citoplasma neuronale come quello trovato nell'assone, corpo cellulare e dendrite. Tuttavia, nelle ciglia, OSM-6::GFP è concentrato a cilia e incorporata in particelle in movimento. La lunghezza delle ciglia PHA e PHB sono circa 6,5 μm. Anterograde IFT è bifasica 8,9. La velocità di anterograda IFT è di circa 0,7 e 1.3 μm/s nei segmenti medio e distali delle ciglia, rispettivamente (Figura 5 e Movie 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56690/56690fig1.jpg"> 
Figura 1 : Dimostrazione della preparazione del campione. (A) Hot DW, pipetta Pasteur e 10% di agarosio su blocco di calore. (B e C) Preparazione di pastiglie di agarosio: un pad dell'agarosi è formato tra le diapositive (B). Slittone superiore viene rimosso dopo un forme di rilievo di agarosio (C). (D) schema mostrando come polistirolo tallone soluzione è mettere sul pad di agarosio. Schema elettrico (E) disegno illustrante come vermi sono messi nella soluzione perlina polistirolo usando un filo di platino pick. (F) un vetrino coprioggetto (22 x 44 mm2) è messo sul pad di agarosio. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56690/56690fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56690/56690fig2.jpg"> 
Figura 2 : Area di imaging. (A) disegno schematico del DA9 e VA12 neuroni e un'immagine rappresentativa di wyIs251. Nei neuroni DA9, il ventrale dell'assone e la commessura prossimale dell'assone non dispone di sinapsi mature. Ma precursori delle vescicole sinaptiche vengono trasportati dal corpo cellulare alla sinapsi attraverso queste regioni assonale. La regione che deve essere osservata è mostrata dalle scatole. (B) disegno schematico del PHA e PHB i neuroni e le loro ciglia. La regione che deve essere osservata è mostrata dalle scatole. Barra della scala = 10 μm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56690/56690fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56690/56690fig3.jpg"> 
Figura 3 : Generazione di film e chimografi utilizzando software di Fiji. (A) fare clic sul pulsante "Selezione rettangolare" (freccia) e selezionare l'area che uno vorrebbe concentrarsi su disegnando un rettangolo (scatola gialla) per generare substacks. (B) fare clic sul pulsante linea segmentata (freccia) e disegnare una linea segmentata lungo le ciglia con un mouse (linea gialla). (C) selezionare "Analizza", "Multi Kymograph" e "Multi Kymograph" per avviare un plugin per generare chimografi. (S) Input linewidth, fare clic su "OK" e generare chimografi (Figura 5 e Figura 7). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56690/56690fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56690/56690fig4.jpg"> 
Figura 4 : Kymograph rappresentante del trasporto assonale dei precursori delle vescicole sinaptiche. GFP::Rab-3 movimento è osservato a asynaptic regione prossimale del neurone DA9 e il kymograph è stato generato con Multi Kymograph di Fiji. Barre orizzontali e verticali rappresentano rispettivamente la lunghezza e tempo. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56690/56690fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56690/56690fig5.jpg"> 
Figura 5 : Kymograph rappresentante dell'IFT. OSM-6::GFP è osservato nelle ciglia di PHA e PHB e questo kymograph è generato dall'evento traffico in uno di essi. Il kymograph è stato generato con Multi Kymograph di Fiji. Barre orizzontali e verticali rappresentano rispettivamente la lunghezza e tempo. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56690/56690fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/56690/56690movie1.jpg"> 
Movie 1: film rappresentativo del trasporto assonale dei precursori delle vescicole sinaptiche. GFP::Rab-3 movimento è osservato a asynaptic regione prossimale del neurone DA9. GFP::Rab-3 è incorporato in precursori delle vescicole sinaptiche e trasportati. Vengono registrati sia anterograda e trasporto assonale retrogrado. Alcune vescicole interrompere ma riavviare nuovamente. Il film è stato registrato a 4 frame/s e riproduce a 15 fotogrammi/s. Scabar le = 5 μm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56690/movie1.mp4" target="_blank">Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)</a>
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/56690/56690Movie2.jpg"> 
Movie 2: il film rappresentativo dell'IFT. OSM-6::GFP è osservato nelle ciglia di PHA e PHB. OSM-6::GFP è incorporata l'IFT complesse e si muove lungo le ciglia. Il film è stato registrato a 4 frame/s e riproduce a 15 fotogrammi/s. scala bar = 5 μm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56690/Movie2.mov" target="_blank">Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)</a>

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Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans (C. elegans) è un buon modello per studiare il trasporto assonale e intracellulare. Qui, descrivo un protocollo per la registrazione in vivo e l'analisi del trasporto assonale e intraflagellare c.elegans.

Immobilizzazione del Caenorhabditis elegans per analizzare il trasporto intracellulare nei neuroni

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

8.0K Views.  Tohoku University. Caenorhabditis elegans (C. elegans) è un buon modello per studiare il trasporto assonale e intracellulare. Qui, descrivo un protocollo per la registrazione in vivo e l'analisi del trasporto assonale e intraflagellare c.elegans.

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In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for the targeted expression of genetically encoded calcium sensors. This protocol outlines the use of these sensors for the in vivo imaging of calcium dynamics in targeted cells, specifically the body wall muscles of the worms. By utilizing the co-expression of presynaptic channelrhodopsin, stimulation of acetylcholine release from excitatory motor neurons can be induced using blue light pulses, resulting in muscle depolarization and reproducible changes in cytoplasmic calcium levels. Two worm immobilization techniques are discussed with varying levels of difficulty. Comparison of these techniques demonstrates that both approaches preserve the physiology of the neuromuscular junction and allow for the reproducible quantification of calcium transients. By pairing optogenetics and functional calcium imaging, changes in postsynaptic calcium handling and homeostasis can be evaluated in a variety of mutant backgrounds. Data presented validates both immobilization techniques and specifically examines the roles of the C. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase and the calcium-activated BK potassium channel in the body wall muscle calcium regulation.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

This method provides a way to couple optogenetics and genetically encoded calcium sensors to image baseline cytosolic calcium levels and changes in evoked calcium transients in the body wall muscles of the model organism C. elegans.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Muscoli della parete del corpo

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Ricerca

Biochimica

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

In vivo imaging di calcio neuronale in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Neuroscienze

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological conditions. Post-mitotic neurons represent a major cell type affected by aging. Although multiple mammalian models of neuronal aging exist, they are challenging and expensive to establish. The roundworm Caenorhabditis elegans is a powerful model to study neuronal aging, as these animals have short lifespan, an available robust genetic toolbox, and well-cataloged nervous system. The method presented herein allows for seamless isolation of specific cells based on the expression of a transgenic green fluorescent protein (GFP). Transgenic animal lines expressing GFP under distinct, cell type-specific promoters are digested to remove the outer cuticle and gently mechanically disrupted to produce slurry containing various cell types. The cells of interest are then separated from non-target cells through fluorescence-activated cell sorting, or by anti-GFP-coupled magnetic beads. The isolated cells can then be cultured for a limited time or immediately used for cell-specific ex vivo analyses such as transcriptional analysis by real time quantitative PCR. Thus, this protocol allows for rapid and robust analysis of cell-specific responses within different neuronal populations in C. elegans.

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for simple isolation of specific groups of live neuronal cells expressing green fluorescent protein from transgenic Caenorhabditis elegans lines. This method enables a variety of ex vivo studies focused on specific neurons and has the capacity to isolate cells for further short-term culturing.

Isolamento di popolazioni di neuroni specifici da nematode Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...

Biologia dello sviluppo

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Microchambers Agarose per lungo termine Imaging di calcio<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

Un semplice chip microfluidico per la crescita a lungo termine e l'imaging di Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...

Bioingegneria

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

Excitotoxic necrosis is a leading form of neurodegeneration. This process of regulated necrosis is triggered by the synaptic accumulation of the neurotransmitter glutamate, and the excessive stimulation of its postsynaptic receptors. However, information on the subsequent molecular events that culminate in the distinct neuronal swelling morphology of this type of neurodegeneration is lacking. Other aspects, such as changes in specific subcellular compartments, or the basis for the differential cellular vulnerability of distinct neuronal subtypes, remain under-explored. Furthermore, a range of factors that come into play in studies that use in vitro or ex vivo preparations might modify and distort the natural progression of this form of neurodegeneration. It is therefore important to study excitotoxic necrosis in live animals by monitoring the effects of interventions that regulate the extent of neuronal necrosis in the genetically amenable and transparent&#160;model system of the nematode Caenorhabditis elegans. This protocol describes methods of studying excitotoxic necrosis in C. elegans neurons, combining optical, genetic, and molecular analysis. To induce excitotoxic conditions in C. elegans, a&#160;knockout of a glutamate transporter gene (glt-3) is combined with a neuronal sensitizing genetic background (nuls5 [Pglr-1::G&#945;S(Q227L)]) to produce glutamate receptor hyperstimulation and neurodegeneration. Nomarski differential interference contrast (DIC), fluorescent, and confocal microscopy in live animals are methods used to quantify neurodegeneration, follow subcellular localization of fluorescently labeled proteins, and quantify mitochondrial morphology in the degenerating neurons. Neuronal Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) is used to distinctly sort at-risk neurons for cell-type specific transcriptomic analysis of neurodegeneration. A combination of live imaging and FACS methods as well as the benefits of the C. elegans model organism allow researchers to leverage this system to obtain reproducible data with a large sample size. Insights from these assays could translate to novel targets for therapeutic intervention in neurodegenerative diseases.

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

In a C. elegans excitotoxicity model, this protocol employs in vivo imaging to analyze the regulation of necrotic neurodegeneration, the effect of genes encoding candidate mediators, and involvement of mitochondria. Cell dissociation and sorting is used to specifically obtain at-risk neurons for cell-specific transcriptomic analysis of neurodegeneration and neuroprotection mechanisms.

Excitotoxic necrosis is a leading form of neurodegeneration. This process of regulated necrosis is triggered by the synaptic accumulation of the ...

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed orientation. Here we describe methods to label, image, and analyze the microtubule dynamics and growth during the development and regeneration of touch neurons in C. elegans. Using genetically encoded fluorescent reporters of microtubule tips, we imaged the axonal microtubules. The local changes in microtubule behavior that initiates axon regeneration following axotomy can be quantified using this protocol. This assay is adaptable to other neurons and genetic backgrounds to investigate the regulation of microtubule dynamics in various cellular processes.

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

A protocol for imaging the dynamic microtubules in vivo using fluorescently labeled End binding protein has been presented. We described the methods to label, image, and analyze the dynamic microtubules in the Posterior lateral microtubule (PLM) neuron of C. elegans.

In vivo Valutazione della dinamica e dell'orientamento dei microtubuli nei neuroni della caenorhabditis elegans

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a crucial component of intracellular signaling. The visualization of subcellular Ca2+ dynamics in vivo,&#160;where neurons can be studied in their native, intact circuitry, has proven technically challenging in complex nervous systems. The transparency and relatively simple nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans enable the cell-specific expression and in vivo visualization of fluorescent tags and indicators. Among these are fluorescent indicators that have been modified for use in the cytoplasm as well as various subcellular compartments, such as the mitochondria. This protocol enables non-ratiometric Ca2+ imaging in vivo with a subcellular resolution that permits the analysis of Ca2+ dynamics down to the level of individual dendritic spines and mitochondria. Here, two available genetically encoded indicators with different Ca2+ affinities are used to demonstrate the use of this protocol for measuring relative Ca2+ levels within the cytoplasm or mitochondrial matrix in a single pair of excitatory interneurons (AVA). Together with the genetic manipulations and longitudinal observations possible in C. elegans, this imaging protocol may be useful for answering questions regarding how Ca2+ handling regulates neuronal function and plasticity.

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

The current methods describe a non-ratiometric approach for high-resolution, sub-compartmental calcium imaging in vivo in Caenorhabditis elegans using readily available genetically encoded calcium indicators.

Imaging subcellulare della manipolazione neuronale del calcio in vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Costruzione e funzionamento di uno stadio di raffreddamento per immobilizzare in massa C. elegans

Assembly and Operation of a Cooling Stage to Immobilize C. elegans on Their Culture Plates

High-resolution in vivo microscopy approaches can reveal subtle information and fine details inside the model animal Caenorhabditis elegans (C. elegans), but require strong animal immobilization to prevent motion blur in the images. Unfortunately, most current immobilization techniques require substantial manual effort, rendering high-resolution imaging low-throughput. Immobilization of C. elegans is greatly simplified by using a cooling approach that can easily immobilize entire populations directly on their cultivation plates. The cooling stage can establish and maintain a wide range of temperatures with a uniform distribution on the cultivation plate. In this article, the whole process of building the cooling stage is documented. The aim is that a typical researcher can build an operational cooling stage in their laboratory following this protocol without difficulty. Utilization of the cooling stage following three protocols is shown, and each protocol has advantages for different experiments. Also shown is an example cooling profile of the stage as it approaches its final temperature and some helpful tips in using cooling immobilization.

Autore in primo piano: Assemblaggio e funzionamento di una fase di raffreddamento per immobilizzare C. elegans sulle loro piastre di coltura  

This paper describes protocols for constructing and operating a cooling stage to immobilize C. elegans on their original cultivation plates en masse.

Assemblaggio e funzionamento di uno stadio di raffreddamento per immobilizzare C. elegans sulle loro piastre di coltura

High-resolution in vivo microscopy approaches can reveal subtle information and fine details inside the model animal Caenorhabditis elegans (C. elegans), ...

Immobilizzazione del Caenorhabditis elegans per analizzare il trasporto intracellulare nei neuroni

Riepilogo

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Capitoli in questo video

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Muscoli della parete del corpo

In vivo imaging di calcio neuronale in C. elegans

Isolamento di popolazioni di neuroni specifici da nematode Caenorhabditis elegans

Microchambers Agarose per lungo termine Imaging di calcio

Un semplice chip microfluidico per la crescita a lungo termine e l'imaging di Caenorhabditis elegans

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

In vivo Valutazione della dinamica e dell'orientamento dei microtubuli nei neuroni della caenorhabditis elegans

Imaging subcellulare della manipolazione neuronale del calcio in vivo

Assemblaggio e funzionamento di uno stadio di raffreddamento per immobilizzare C. elegans sulle loro piastre di coltura

Assemblaggio e funzionamento di uno stadio di raffreddamento per immobilizzare C. elegans sulle loro piastre di coltura