Yazar Dr. Asako Sugimoto (Tohoku Üniversitesi) derinden yararlı onun tartışma için teşekkürler. wyIs251 Doktor Kang Shen (Stanford Üniversitesi) cömert bir hediye etmişti. mnIs17 araştırma altyapı programları (P40 OD010440) NIH ofisi tarafından finanse edilen CGC tarafından sağlandı. Bu eser JSP'ler KAKENHI grant #17 H 05010 ve #16 H 06536 ve Daiichi Sankyo Vakfı, beyin bilim Vakfı ve Naito Vakfı tarafından desteklenmiştir.

1. numune hazırlama <ol><li>Generate transgenik C. elegans zorlanma transgenik metodolojisi 18 kullanarak ilgi. Alternatif olarak, uygun suşların Caenorhabditis genetik Merkezi (CGC) dan elde edilir. Sinaptik vezikül öncüleri aksonal taşımacılığının görselleştirmek için transgenik çizgi wyIs251 kullanın [Pmig-13::gfp::rab-3] 7. LFT gözlemlemek için transgenik çizgi mnIs17 [osm-6::gfp] 19 edinin. Bu protokol için bu suşlar kullanılır. 
	Not: Ya extrachromosomal dizi, genomik entegrasyonu veya bile GFP çakma çalışır. Arka plan sinyalleri azaltmak için pan-nöronal rehberleri yerine hücre özel Organizatör kullanın. 
	Not: Bakım Worms diğer protokolleri 20 dakika içinde açıklanmıştır. Suşları tutulan Escherischia coli OP50 besleyici nematodunun büyüme üzerinde çimenler üzerinde orta (NGM) levhalar (%1,7 (w/v) özel, 50 mM NaCl, %0.25 (w/v) pepton, 1 mM CaCl 2, 5 mg/mL kolesterol, 25 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgSO 4 60 mm çap plastik yemekleri) 20 ° C.</li>
	<li>Grow solucanlar 20 ° C'de NGM Tabaklarda solucanlar herhangi bir yaşam döngüsü aşaması için. 
	Not: Bir aksonal transport ve LFT herhangi bir aşamada gözlemleyebilirsiniz. Genç Yetişkin geç L4 çünkü iyi bir pozitif kontrol birden çok yayın-si olmak kullanılmış bu aşamaları ve görüntülenmeyecektir kaçakçılığı olayları 14 , 21 , 22 , 23.</li>
</ol> 2. % 10 hazırlanması özel Not: pek çok satıcı agar agar tozlar ve özel gibi benzer ürünler sağlar. Elektroforez sınıf özel kullanın (jel gücü &#62; 1200 g/cm 2). Ucuz agar tozlar işe yaramaz çünkü elde edilen jel solucanlar hareketsiz yeterince güçlü değil.
<ol><li>Mix 0.4 g özel 4 mL distile su (DW) bir cam tüp (1.5 cm x 10,5 cm). Buharlaşma önlemek için cam tüp üzerinde bir kapak koyun.</li>
	<li>90 dk için 95 ° C ısı bloğu cam tüp yerleştirilir. Buna ek olarak, DW ile dolu başka bir cam tüp (1.5 cm x 10,5 cm) hazırlamak ve 95 tutmak ° C. koymak Pasteur damlalıklı 95 ° C'de DW ( şekil 1 A). Bir sürü küçük kabarcıklar özel tüp içinde görülecektir ve çözüm bulanık olmalıdır. Çözüm açık hale gelinceye kadar bırakın. Sonra karıştırmak özel çözüm homojen hale gelinceye kadar yukarı ve aşağı tarafından pipetting. 
	Not: Mikrodalga fırın DW ve özel yapılmış zaman % 10 özel çözüm hazırlamak için kullanılamaz. Küçük kabarcıklar mikrodalga tarafından neden olduğu özel erime önlemek. Ancak, katılaşmış % 10 özel jel kolayca kullanarak yeniden bir mikrodalga erimiş olabilir. Cam tüpler % 10 özel jel içeren önceden hazırlanan ve 4 ° C'de en az 6 ay süreyle depolanır. Böylece, gerektiğinde bir mikrodalga kullanarak stok eritmek ve bu iletişim kuralı 3 adımda başlayabilirsiniz. 
	Not: Özel yavaş yavaş uzun bir süre veya sonra tekrarlanan katılaşma ve erime 95 ° C'de inkübe Eğer kuvvetlendirmek için yetenek kaybeder. Bu durumda, yeni % 10 özel hazırlayın.</li>
</ol> 3. Hazırlık özel ped <ol><li>Adım 2.2, hazırlanan ısıtılan Pasteur damlalıklı kullanarak 76 x 22 mm slayt üzerinde 2 damla % 10 özel yerleştirin.</li>
	<li>Hızlı bir şekilde Resim 1 B ve itme aşağı ikinci slaytta özel çözüm düzleştirmek için gösterildiği gibi kapak özel damla önce ikinci 76 x 22 mm 2 kaydıraklı katılaşır. Kalınlığı 0,5-1 olmalıdır mm.</li>
	Özel çözüm yıkanır kadar <li>hızlı bir şekilde Pasteur pipet pipetting 95 ° C DW tarafından yukarı ve aşağı yıkayın. Aksi takdirde, damlalıklı tarafından özel jel haline tıkanmış. Pipet ayakta 95 ° C'de DW bırakın.</li>
	<li>1 dk bekle. Özel defteri oluşturur ve bulutlu olur. Sonra el ile ( şekil 1 C) ayrı slaytları slayt.</li>
</ol> 4. Kurtlardan montaj Not: solucan hareketi bile az miktarda önlemek iyi gözlem. Levamisole solucan hareket özel yastık 24 , 25 önlemek için geleneksel olarak kullanılmıştır. Ancak, Levamisole C. elegans nöronal reseptörleri inhibe ve bu nedenle nöronlar 15 kaçakçılığı olayları etkileyebilir. Polistren lastikteki kullanarak açıklanan burada iyi bir alternatif 17.
<ol><li>~ 30 transgenik solucanlar yeni NGM için uygun veri işaretleyicilerini ifade plaka Platin tel kullanarak bakteri almak olmadan bir sürgülü ayna transillumination ile donatılmış bir stereo mikroskop altında transfer. 
	Not: Platin tel ve Pasteur pipet (5 inç) bir platin tel çekme yapılmış ve platin tel ucu dümdüz. Platin tel alır hazırlanması ve bunlar solucanlarla kullanımı Wormbook (http://www.wormbook.org) açıklanmıştır.</li>
	<li>Plaka terk solucanlar NGM özel jel bakteri olmadan hareket olarak 1 dk. için bakteri otomatik olarak solucanlar yüzeyler arasında kaldırılır.</li>
	<li>Yerine 0,5-1,0 a µL % 2,6 100 nm çapında polistren lastikteki agar pad ( şekil 1 D) üzerine su içinde damla. 10-20 solucanlar bakteri-özgür NGM plaka için lastikteki aktarın. Damla ve platin tel kullanarak solucanlar almak, örtüşen önlemek için forma solucan organları ( şekil 1 E).</li>
	<li>22 x 40 mm 2 coverslip ( şekil 1 F) uygulanır. Hava kabarcıkları kaldırmak, ancak ezici solucanları önlemek için yavaşça itin. Örnek görüntüleme için hazırdır. 
	Not: anestezi yönetilen çünkü solucanlar sadece agar pad, polistren lastikteki ve coverslip 17 tarafından üretilen sürtünme Kuvvetleri tarafından sabitlenir. Besleyici bakteri ve/veya çok fazla çözüm varlığı sürtünme kuvveti zayıf yapacak. 
	Not: Coverslips (örneğin, 22 x 22 mm 2, 18 x 18 mm 2) iş farklı boyutlarda. Ancak, daha büyük coverslips daldırma su veya örnekleri gözlem sırasında sızıntı objektif lens yağdan önleyebilirsiniz.</li>
</ol> 5. Gözlem Not: her mikroskop sistem ve kamera için uygun görüntüleme parametreleri (lazer gücü, kazanç, binning, vb) farklılık gösterir. Burada, bir iplik disk confocal tarayıcı ve dijital bir CCD kamera ile donatılmış widefield mikroskop kullanılmaktadır.
<ol><li>20 ° C sıcaklık kontrolü sahne alanı ayarla veya oda sıcaklığında 20 ayarlamak ° C.</li>
	<li>Örnek slayt mikroskop sahneye koydu. 100 x kullanın (sayısal diyafram = 1.3 veya daha iyi) objektif lens.</li>
	 Şekil 2 A (için wyIs251 ve aksonal transport) veya Resim 2 B (mnIs17 ve LFT için) pozitif denetimleri olarak belirtilen alanlar için <li>Bak . Diğer alanlarda iyi 22 analiz edilebilir.</li>
	<li>Kümesi parametreleri (CCD kazanç = 200, Binning = 1 veya 2, 488 güçte lazer nm = 1.0-1.3 mW). 4 kare/s zaman sukut yazmak ilâ 1 dk. dosyaları Kaydet mutli-TIFF biçimi olarak gerçekleştirmek. 
	Not: GFP sinyalleri yok ve GFP::RAB-3 veya OSM-6::GFP 30 için izlemeye devam etmek zordur eğer s, lazer güç çok güçlü. Bu durumda, lazer gücü düşür. Diğer taraftan, veziküler hiçbir hareket kaydedildiyse, lazer gücü çok zayıftır. Bu durumda, lazer gücü arttır.</li>
	<li>Farklı bir solucan gözlemlemek ve 5.3 ve 5,4 yineleyin. Gözlemler 20 dakikaya kadar sürebilir, ama her solucan p etkilerini önlemek için yalnızca bir kez kaydedilmesi gerekenHo'ya hasar. 
	Not: En az 20 dk olmadan önemli kusurları 7 , 27 , 28 için solucanlar gözlenmiştir. Daha uzun gözlem cenneti mümkün olabilir &#39; t oldu henüz test. Açık bir işareti nöronal ölüm neurite şişme gibi nöronal Morfoloji değişimdir. Zayıf GFP sinyaller akson ve dendrites wyIs251 ve mnIs17 görüldüğü gibi neurite Morfoloji aksonlar veya dendrites sadece bakarak kolayca denetlenebilir. Nöronal Morfoloji Şekil 2 ' de gösterildiği.</li>
	<li>Film dosyaları oluşturmak.
	Fiji yazılımı kullanarak <ol><li>açık çok TIFF dosyasını. Dosya gidin &#62; aç sonra 5.4. adımda kaydettiğiniz çok TIFF dosyası seçin. 
		Not: Fiji-ebilmek var olmak downloaded jttps://fiji.sc. Resmi J ve eklentileri kymographs oluşturmak için kullanılabilir. Böylece, ilgili talimatları için seçilen eklenti.</li> <li>'ı tıklatın &#34; dikdörtgen seçim &#34; düğmesini ( şekil 3 bir, ok) seçeneğini belirleyip bir dikdörtgen çizerek ilgi alanı bir bilgisayar fare ile (sarı dikdörtgen şekil 3 A). Görüntü gidin &#62; yığınları &#62; araçlar &#62; yapmak Substacks ve filmde içerdiği dilim numaralarını seçin. Bir substack oluşturulur.</li>
		<li>Substack pencereyi tıklatarak etkinleştirin ve resim gidin &#62; ayarla &#62; Parlaklık/Kontrast. Parlaklık ve kontrastı ayarlamak için bir pencere gösterir. Pencerede, üst slayt bar (en az) sağa doğru böylece arka plan sinyal kaybolur ve ikinci top bar (maksimum) sola kadar bu hareketli veziküller ve parçacıklar oldukça iyi arka plan üzerinde görülebilir.</li>
		<li>Gitmek için görüntü &#62; yığınları &#62; zaman Stamper. Film 4 kare/s 5,4 adımda kaydedilen zaman aralığını 0.25 olduğu s. Böylece, yazın &#34; 0,25 &#34; aralığındaki.</li>
		<li>Oluşturmak bir film dosyası olarak kaydet seçerek &#62; AVI Dosya menüsünden (film 1 ve 2). 
		Not: uygun eklentileri kullanarak, dosyayı, diğer biçimleri aşağıdaki gibi kaydedebilirsiniz &#34; mpeg4 &#34; veya &#34; mov &#34; dosyaları.</li>
	</ol></li> <li>Kymographs oluşturmak.
	<ol><li>FIji yazılım kullanarak yeniden özgün film dosyaları açın ve tekrar adım 5.6.2 ve parlaklık ve kontrastı ayarlamak için 5.6.3.</li>
		<li>Tıklama &#34; satır parçalara &#34; ( şekil 3 B, ok). Bir fare kullanarak kirpikler veya axon (Sarı Hat, şekil 3 B) boyunca parçalı bir çizgi çizin.</li>
		<li>Gitmek için analiz &#62; çok Kymograph &#62; çok Kymograph ( şekil 3 C). Satır genişliği penceresi ( şekil 3 D) görüntülenir. Türü &#34; 3 &#34; Linewidth pencere ve Tamam'ı tıklatın ( şekil 3 D).</li>
		<li>Kymograph pencere oluşturulur. Resmi TIFF ya da JPEG formatında kaydedin.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+motors+in+neurons:+transport+mechanisms+and+roles+in+brain+function,+development,+and+disease.">Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease.</a> Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).</li><li>Holzbaur, E. L., Scherer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules,+axonal+transport,+and+neuropathy.">Microtubules, axonal transport, and neuropathy.</a> N Engl J Med. 365 (24), 2330-2332 (2011).</li><li>Kamiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+of+axonemal+dyneins+as+studied+in+Chlamydomonas+mutants.">Functional diversity of axonemal dyneins as studied in Chlamydomonas mutants.</a> Int Rev Cytol. 219, 115-155 (2002).</li><li>Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraflagellar+transport+motors+in+cilia:+moving+along+the+cell's+antenna.">Intraflagellar transport motors in cilia: moving along the cell's antenna.</a> J Cell Biol. 180 (1), 23-29 (2008).</li><li>Rosenbaum, J. L., Witman, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraflagellar+transport.">Intraflagellar transport.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (11), 813-825 (2002).</li><li>Ishikawa, H., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliogenesis:+building+the+cell's+antenna.">Ciliogenesis: building the cell's antenna.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (4), 222-234 (2011).</li><li>Niwa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoinhibition+of+a+Neuronal+Kinesin+UNC-104/KIF1A+Regulates+the+Size+and+Density+of+Synapses.">Autoinhibition of a Neuronal Kinesin UNC-104/KIF1A Regulates the Size and Density of Synapses.</a> Cell Rep. 16 (8), 2129-2141 (2016).</li><li>Snow, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+anterograde+intraflagellar+transport+motors+cooperate+to+build+sensory+cilia+on+C.+elegans+neurons.">Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons.</a> Nat Cell Biol. 6 (11), 1109-1113 (2004).</li><li>Ou, G., Blacque, O. E., Snow, J. J., Leroux, M. R., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+coordination+of+intraflagellar+transport+motors.">Functional coordination of intraflagellar transport motors.</a> Nature. 436 (7050), 583-587 (2005).</li><li>Zhou, R., Niwa, S., Homma, N., Takei, Y., Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIF26A+is+an+unconventional+kinesin+and+regulates+GDNF-Ret+signaling+in+enteric+neuronal+development.">KIF26A is an unconventional kinesin and regulates GDNF-Ret signaling in enteric neuronal development.</a> Cell. 139 (4), 802-813 (2009).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charcot-Marie-Tooth+disease+type+2A+caused+by+mutation+in+a+microtubule+motor+KIF1Bbeta.">Charcot-Marie-Tooth disease type 2A caused by mutation in a microtubule motor KIF1Bbeta.</a> Cell. 105 (5), 587-597 (2001).</li><li>Niwa, S., Tanaka, Y., Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIF1Bbeta-+and+KIF1A-mediated+axonal+transport+of+presynaptic+regulator+Rab3+occurs+in+a+GTP-dependent+manner+through+DENN/MADD.">KIF1Bbeta- and KIF1A-mediated axonal transport of presynaptic regulator Rab3 occurs in a GTP-dependent manner through DENN/MADD.</a> Nat Cell Biol. 10 (11), 1269-1279 (2008).</li><li>Zhou, R., Niwa, S., Guillaud, L., Tong, Y., Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+motor,+KIF13A,+controls+anxiety+by+transporting+the+serotonin+type+1A+receptor.">A molecular motor, KIF13A, controls anxiety by transporting the serotonin type 1A receptor.</a> Cell Rep. 3 (2), 509-519 (2013).</li><li>Klassen, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Arf-like+small+G+protein,+ARL-8,+promotes+the+axonal+transport+of+presynaptic+cargoes+by+suppressing+vesicle+aggregation.">An Arf-like small G protein, ARL-8, promotes the axonal transport of presynaptic cargoes by suppressing vesicle aggregation.</a> Neuron. 66 (5), 710-723 (2010).</li><li>Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+microfluidic+devices+for+in+vivo+imaging+of+C.+elegans,+Drosophila+and+zebrafish.">Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish.</a> J Vis Exp. (67), (2012).</li><li>Chai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+cellular+dynamics+during+Caenorhabditis+elegans+postembryonic+development.">Live imaging of cellular dynamics during Caenorhabditis elegans postembryonic development.</a> Nat Protoc. 7 (12), 2090-2102 (2012).</li><li>Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+using+nanoparticle-mediated+immobilization.">Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization.</a> PLoS One. 8 (1), 53419 (2013).</li><li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection.">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. (18), (2008).</li><li>Collet, J., Spike, C. A., Lundquist, E. A., Shaw, J. E., Herman, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+osm-6,+a+gene+that+affects+sensory+cilium+structure+and+sensory+neuron+function+in+Caenorhabditis+elegans.">Analysis of osm-6, a gene that affects sensory cilium structure and sensory neuron function in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 148 (1), 187-200 (1998).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Niwa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nephronophthisis-related+gene+ift-139+is+required+for+ciliogenesis+in+Caenorhabditis+elegans.">The nephronophthisis-related gene ift-139 is required for ciliogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Sci Rep. 6, 31544 (2016).</li><li>Maeder, C. I., San-Miguel, A., Wu, E. Y., Lu, H., Shen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+neuron-wide+analysis+of+synaptic+vesicle+precursor+trafficking.">In vivo neuron-wide analysis of synaptic vesicle precursor trafficking.</a> Traffic. 15 (3), 273-291 (2014).</li><li>Wu, Y. E., Huo, L., Maeder, C. I., Feng, W., Shen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+balance+between+capture+and+dissociation+of+presynaptic+proteins+controls+the+spatial+distribution+of+synapses.">The balance between capture and dissociation of presynaptic proteins controls the spatial distribution of synapses.</a> Neuron. 78 (6), 994-1011 (2013).</li><li>Dwyer, N. D., Adler, C. E., Crump, J. G., L'Etoile, N. D., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+dendritic+transport+and+the+AP-1+mu1+clathrin+adaptor+UNC-101+localize+odorant+receptors+to+olfactory+cilia.">Polarized dendritic transport and the AP-1 mu1 clathrin adaptor UNC-101 localize odorant receptors to olfactory cilia.</a> Neuron. 31 (2), 277-287 (2001).</li><li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microsurgery+in+Caenorhabditis+elegans.">Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 107, 177-206 (2012).</li><li>Kumar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+Kinesin-3+motor+UNC-104/KIF1A+is+degraded+upon+loss+of+specific+binding+to+cargo.">The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo.</a> PLoS Genet. 6 (11), 1001200 (2010).</li><li>Zheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vesicle+protein+SAM-4+regulates+the+processivity+of+synaptic+vesicle+transport.">The vesicle protein SAM-4 regulates the processivity of synaptic vesicle transport.</a> PLoS Genet. 10 (10), 1004644 (2014).</li><li>Blacque, O. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WD+repeat-containing+protein+IFTA-1+is+required+for+retrograde+intraflagellar+transport.">The WD repeat-containing protein IFTA-1 is required for retrograde intraflagellar transport.</a> Mol Biol Cell. 17 (12), 5053-5062 (2006).</li><li>Evans, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+modulation+of+IFT+kinesins+extends+the+sensory+repertoire+of+ciliated+neurons+in+Caenorhabditis+elegans.">Functional modulation of IFT kinesins extends the sensory repertoire of ciliated neurons in Caenorhabditis elegans.</a> J Cell Biol. 172 (5), 663-669 (2006).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li><li>Bindels, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mScarlet:+a+bright+monomeric+red+fluorescent+protein+for+cellular+imaging.">mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging.</a> Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).</li><li>Prevo, B., Mangeol, P., Oswald, F., Scholey, J. M., Peterman, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+differentiation+of+cooperating+kinesin-2+motors+orchestrates+cargo+import+and+transport+in+C.+elegans+cilia.">Functional differentiation of cooperating kinesin-2 motors orchestrates cargo import and transport in C. elegans cilia.</a> Nat Cell Biol. 17 (12), 1536-1545 (2015).</li><li>Robison, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detyrosinated+microtubules+buckle+and+bear+load+in+contracting+cardiomyocytes.">Detyrosinated microtubules buckle and bear load in contracting cardiomyocytes.</a> Science. 352 (6284), 0659 (2016).</li><li>Hayashi, S., Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+superresolution+fluorescence+imaging+with+spinning+disk+confocal+microscope+optics.">Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics.</a> Mol Biol Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).</li></ol>

Yazar ifşa etmek hiçbir şey vardır.

Sınırlama ile ilgili mevcut yöntemler Burada açıklanan yöntemi aksonal transport ve LFT gibi hızlı olayları gözlemlemek için optimize edilmiştir. Böylece, immobilizasyon daha daha uzun kuluçka öncelik. Ise önemli pertürbasyon olmadan en az 20 dk için kaçakçılık olayları gözlemlemek mümkün olabilirdi, bu yöntem her zaman axon uzama ve hücre göç gibi uzun gözlem gerektiren yavaş olayları gözlemlemek uygun olmayabilir. Daha uzun gözlem için bir özel yüzdesini azaltarak koşulları optimize etmek gerekiyor (Yani, kurutma ve bu potansiyel olarak basınç düşürme önlemek için su artan neden hasar). Alternatif olarak, yan etkileri dikkatle değerlendirilmesi süre15 veya özel yastıkları ve anestezi kullanılarak Worms immobilizasyon açıklanan mikrosıvısal cihaz daha uygun16 olabilir.
Protokol içindeki kritik adımlar Yeterli gözlem için işaretleri kritik öneme sahiptir. İşaretleyicileri veziküller veya parçacıkları dahil olmak ve yeterli parlaklığını olmak zorunda. Extrachromosomal diziler veya tümleşik hatları kullanılabilir. Sinaptik vezikül öncüleri DA9 nöronlar içinde aksonal transport görselleştirme için faydalı7,23 wyIs251 yük olduğunu. jsIs821 bazı çalışmalar26,27mechanosensory nöronlarda aksonal Ulaştırma gözlemlemek için kullanılmıştır. Ne zaman diğer neurons analiz edilir, sinaptik vezikül proteinler hücre belirli Organizatör kullanarak baktılar nöronlarda ifade edilmelidir. Bu Organizatör kadar güçlü olmalıdır. RAB-3 ve SNB-1 sinaptik vezikül öncüleri22,23,26etiketlemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. LFT gözlemlemek için karmaşık LFT bileşenleri biçiminde etiketlenmiş olmalıdır. Pozitif kontrol, bir iyi bir seçim29 mnIs17 yük olduğunu. Kirpikler 2 hücrelerden (PHA ve PHB) kuyruk (değişkeni) paketlenmiştir iken 8 hücrelerden (ASE, ASG, ASI, ASL, ASH, ASK, ADF ve ADL) yayılan kirpikler başından (amphid) birlikte paketlenmiştir. OSM-6::GFP siliyer sinir hücreleri mnIs17olarak ifade edilir çünkü ayrıntılı olarak baş kirpikler LFT analiz etmek zor olabilir. Ancak, kuyruk bölgesinde tek PHA ve PHB nöronlar etiketlenir ve her hücrede LFT kolayca çözülebilir. Floresan proteinler tarafından etiketli diğer LFT proteinler LFT21,28gözlemlemek için kullanılabilir. Eğer bir baş nöronlar analiz etmek dilek, hücre özel Organizatör yararlı olacaktır. Baş kirpikler değişen türleri Morfoloji varken, taşıma olaylar kaydedilen29olabilir. Bu işaretçileri olan mutantlar crossing tarafından herhangi bir gen aksonal transport ve LFT işlevleri analiz vivo içindeolabilir. Analiz edilebilir parametreleri önceki iş22,23,26,27tarif edilmistir. GFP ve birincil en iyi seçimdir. mCherry ve tdTomato da kullanılan22olabilir, ancak, mCherry GFP çok kısık. tdTomato olan bir tandem dimer ve bazen füzyon protein30dinamikleri etkiler monomeric floresan proteinler daha büyük. Bu nedenle, sonuçları analiz edilmelidir ve dikkatli tdTomato kullanıldığında yorumlanır. mScarlet, son zamanlarda geliştirilmiştir, bir parlak monomeric kırmızı floresan protein bir başka seçim31' dir.
Disk confocal mikroskobu iplik yaygın aksonal transport ve LFT7,21gözlemlemek için kullanılırken, ekipman pahalı ve bazı araştırma ortamlarda erişmek zor olabilir. Ancak, bu olayları Ayrıca kaydedilen ve standart floresan mikroskoplar, eğer C. elegans bir küçük ve şeffaf hayvan ve gözlemlemek kolay olduğundan yüksek NA lensler ile donatılmış kullanarak C. elegans içinde analiz.
Yönelik uygulama Burada açıklanan benzer immobilizasyon yöntemine göre LFT vivo32tek molekül çözünürlükte gözlendi. Ayrıca, çeşitli süper çözünürlük mikroskobu geliştirilmiştir. Bir doğrudan yöntem tanımlamak burada süper çözünürlük mikroskobik analizlerin yapıldığı için uygulayabilirsiniz. Benim durumumda, Airyscan33 hızlı modu LFT analiz etmek için çok iyi çalışıyor. Teorik olarak, bir iplik disk süper çözünürlük mikroskop (SDSRM) iyi34iyi bir seçim olurdu. Sonuç olarak, mutant kütüphaneler ve bu yeni teknikler, açıklanan yöntemi birleştirerek burada olması gerektiğini aksonal transport ve LFT vivomoleküler mekanizmaları açıklığa kavuşturulması için yararlı.

Canlı hücre görüntüleme hücre içi taşıma analiz etmek için önemli bir araçtır. Nöronal hücre Biyolojide canlı hücre görüntüleme ile aksonal taşıma nöronal fonksiyon ve morfogenetik1anlamak için gerekli analizlerdir. Aksonal transport kusurları birkaç nörodejeneratif hastalıklar2altında yatan. Sırasıyla kinesin süper proteinler ve dinein aksonal transport anterogradely ve retrogradely,1,2taşır.
Kirpikler Mikrotubul ağ ve kaçakçılığı makine gelişmiş3olan başka bir hücresel yuvası vardır. Protein sentezi makine kirpikler, silier proteinler kirpikler ipuçları sitoplazma gönderilmesi gerekir yani yerelleştirilmemiştir. Kirpikler özel kinesin ve dinein, aradım kinesin-2 ve sitoplazmik dinein-2, sırasıyla, kirpikler4, intraflagellar taşıma (LFT)5denilen bir fenomen bileşenleri taşıma. LFT bozukluğu hastalıkları ciliopathies6adı verilen bir spektrum neden olur. Böylece, LFT mekanizması tarafından canlı hücre görüntüleme analizi silier oluşumu ve patogenezinde temel mekanizmaları anlamak için gereklidir.
Caenorhabditis elegans (C. elegans) aksonal transport ve LFT7,8,9eğitim için iyi bir modeldir. LFT gözlemlemek için Chlamydomonas yaygın olarak bir model organizma5,6kullanılmıştır. Chlamydomonas tek hücreli bir organizma olduğu için LFT ilişki ile yaşlanma, nöronal fonksiyon ve davranış analiz etmek zor olacaktır. Buna ek olarak, CRISPR/Cas9 gibi temel genetik teknikleri Chlamydomonasiçin uygulanmadı. Çünkü aksonal transport ve LFT morfogenez ve homeostasis hayvanlar 10için gerekli olan fare ve Drosophila, gibi daha yüksek model organizmalar bozulma aksonal transport ve LFT kez ölümcül fenotipleri neden olur, 11. Fare olması durumunda, hücre kültürü ve transfection genellikle aksonal transport ve birçok beceri ve geniş zaman12,13gerektirir LFT gözlemlemek için gereklidir. Buna ek olarak, önemli fizyolojik bağlam çok kültürlü hücreleri ve hücre satırlarını kaybetmiş. Sinir sisteminin solucanların yaşam için gerekli olduğundan, C. elegans mutantlar hangi aksonal taşıma veya LFT kesintiye öldürücü7,9,14değil çoğu zaman. Doğrudan aksonal transport ve LFT vivo içinde diseksiyon olmadan C. elegans saydamdır ve bu nedenle GFP etiketli işaretleri gözlemlemek kolaydır çünkü görülebilmektedir.
C. elegans, anestezi16veya lastikteki17bir mikrosıvısal aygıt15, özel kablolar kullanarak gibi hareketsiz için çeşitli protokoller vardır. Anestezi eklenmesi nöronlar15kaçakçılığı olayları inhibe. Mikrosıvısal-aygıt yöntemin açık bir dezavantajı bir mikrosıvısal aygıt hazırlanıyor her zaman kolay değildir. Bunun yerine, özel yastıkları ve lastikteki immobilizasyon zaman atlamalı görüntüleme C. elegansiçinde gerçekleştirmek için rahat ve kolay bir yöntem var. Burada, C. elegans hareketsiz ve aksonal transport ve LFT in vivo olarak görselleştirmek için bu temel iletişim kurallarını açıklamak C. elegans. Diğer yöntemlerine göre burada açıklanan yöntemi özel ekipman gerektirmez ve çok daha ucuz ve daha kolay gerçekleştirmek.

<table><tbody><tr><td>Slideglass (76&amp;nbsp; x 26 mm)</td><td>Matsunami</td><td>S1111</td><td></td></tr><tr><td>Coverglass (22&amp;nbsp; x 40 mm)</td><td>Matsunami</td><td>C024401</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Wako</td><td>318-01195</td><td></td></tr><tr><td>Polystylene microbeads 0.1 micron</td><td>Polysciences</td><td>#00876</td><td></td></tr><tr><td>Heat block</td><td>TAITEC</td><td>0063288-000</td><td>CTU-mini</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX-71</td><td>widefield microscope</td></tr><tr><td>Spinning disk Scanner</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-X1</td><td>spinning disc confocal scanner&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Digital CCD camera</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C10600-10B</td><td>ORCA-R2 degital CCD camera</td></tr><tr><td>Objective lens (x100, NA1.4)</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO 100XO</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipette (5 inch)</td><td>IWAKI</td><td>IK-PAS-5P</td><td></td></tr><tr><td>Glass tube (1.5 cm diameter x 10.5 cm)</td><td>IWAKI</td><td>9820TST15-105NP</td><td></td></tr><tr><td>TV9211: &lt;em&gt;wyIs251&lt;/em&gt;</td><td>Laboratory of Kang Shen</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>OTL11: &lt;em&gt;mnIs17&lt;/em&gt;</td><td>Ref. 27, 29</td><td>N/A</td><td>SP2101 was backcrossed with wild type for 6 times</td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>435064-9000-000</td><td>STEMI 508&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mirror transillumination unit</td><td>Carl Zeiss</td><td>435425-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>platinum wire (0.2 mm)</td><td>Nilaco Corporation</td><td>m78483501</td><td></td></tr><tr><td>60 mm plastic dish</td><td>Falcon</td><td>#351007</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>https://fiji.sc/</td></tr><tr><td>nematode growth medium (NGM)&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>1.7% (w/v) agarose, 50mM NaCl, 0.25% (w/v) Peptone, 1 mM CaCl2, 5 mg/mL Cholesterol, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

immobilization of caenorhabditis elegans to analyze intracellular transport in neurons

Aksonal taşıma ve intraflagellar taşıma (LFT) akson ve kirpikler morfogenez ve işlevi için gerekli olan. Kinesin süper proteinler ve dinein anterograd ve retrograd taşıma, sırasıyla düzenleyen moleküler motorlar vardır. Bu motorlar Mikrotubul ağları raylar kullanır. Caenorhabditis elegans (C. elegans) aksonal transport ve LFT vivo içindeçalışmaya bir güçlü model organizmadır. Burada, aksonal transport ve LFT yaşam gözlemlemek için bir protokol tarif C. elegans. Taşınan kargo kargo protein flüoresan proteinler yeşil flüoresan protein (GFP) gibi kullanarak etiketleyerek görüntülenmeyecektir. C. elegans şeffaf ve kargo GFP öğesini proteinler hücre özel Organizatör altında belirli hücrelerdeki ifade edilebilir. Yaşayan solucanlar lastikteki % 10 özel jel üzerinde öldürmek veya solucanlar anesthetizing tekrarlanmasıyla çözülebilir. Bu koşullar altında kargo hareket doğrudan akson ve yaşam kirpikler gözlenen C. elegans diseksiyon olmadan. Bu yöntem hedef proteinler değiştirerek herhangi bir hücre ve/veya onlar ifade edilir hücreleri herhangi bir kargo molekül gözlenmesi için uygulanabilir. Moleküler motorlar gibi en temel proteinler ve aksonal transport ve LFT katılmaktadırlar adaptör protein C. elegansiçinde korunmuş. Diğer model organizmalar için karşılaştırıldığında, mutantlar elde edilen ve daha kolay C. elegansiçinde saklanır. Bu yöntem çeşitli C. elegans mutantlarla birleştirerek aksonal transport ve LFT moleküler mekanizmaları açıklığa kavuşturmak.

Aksonal DA9 nöron nakliyesi Anterograd ve retrograd aksonal transport GFP::RAB-3 wyIs251 satırını kullanarak aynı anda DA9 motor nöron kaydedilebilir. Anterograd ve retrograd DA9 nöron proksimal dorsal axon taşımacılığında ortalama hızı yaklaşık 1,8 ve 2.6 mikron/s, sırasıyla22var. 0.03 ve akson s başına mikron başına 0,018 hakkında hareketli veziküller sayısıdır. Böylece, bir 30 s gözlem DA9 akson 100 x lens ile 10 mikron için bir yaklaşık 9 ve 5 veziküller axon (şekil 4 ve film 1) hareketli bulabilirsiniz. Veziküler hiçbir hareketi gözlenen, lazer gücü çok zayıftır mümkündür. Uzun menzilli çalışır ek olarak kısa menzilli hareketi vezikül havuzları olabilir (film 1) kaydedildi. Diğerleri orada7' den,23ayırmak iken bazı veziküller bu vezikül havuzları kes. Bu parametreler izlenir ve mutant fenotipleri çözümlemek için kullanılabilir.
LFT kuyruk nöronlar içinde Kirpikler C. elegans (Şekil 2B) dendrites ucuna lokalizedir. MnIs17 zorlanma GFP öğesini OSM-6, LFT alt birimleri29birini ifade eder. OSM-6 her iki kafasından ifade edilir ve nöronlar19kuyruk. Birçok kafa kirpikler mnIs17tarafından etiketlenir iken, sadece iki kirpikler kuyruk nöron açıkça görülmektedir. Böylece, bu kirpikler gözlemleyerek (Ayrıca bkz: tartışma) baş kirpikler kolaydır. OSM-6::GFP akson, hücre beden ve dendrite bulduğu gibi nöronal sitoplazmada dağınık. Ancak, kirpikler, OSM-6::GFP kirpikler için konsantre ve parçacıklar hareket dahil. PHA ve PHB kirpikler uzunluğu yaklaşık 6,5 mikron vardır. Anterograd LFT bifazik 8,9' dur. Anterograd LFT 0.7 ve kirpikler, orta ve distal segmentlerinin 1.3 mikron/s hakkında sırasıyla (şekil 5 ve Film 2) hızıdır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56690/56690fig1.jpg"> 
Resim 1 : Numune hazırlama gösteri. (A)sıcak DW, Pasteur damlalıklı ve % 10 özel ısı blokta. (B ve C) Özel yastıkları hazırlanması: bir özel yastık slaytlar arasında (B) oluşturulur. Üst slayt bir özel yastık formları (C) sonra kaldırılır. (D) şematik nasıl polistren boncuk çözüm gösterilen çizim üzerinde özel yastık konur. (E) şematik solucanlar bir platin tel kullanarak polistren boncuk çözümde nasıl konur gösterilen çizim seç. (F) A coverslip (22 x 44 mm2) özel yastık konur. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56690/56690fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56690/56690fig2.jpg"> 
Resim 2 : Görüntüleme alanı. (A)şeması çizim DA9 ve VA12 nöronlar ve wyIs251temsilcisi bir görüntü. DA9 nöronlarda ventral axon, komissür ve proksimal axon olgun sinapslarda yok. Ama sinaptik vezikül öncüleri hücre gövdesinden sinapslarda aksonal bu bölgeler ile taşınmaktadır. Dikkat edilmelidir bölge kutuları ile gösterilir. (B) şeması çizim PHA ve PHB nöronlar ve onların kirpikler. Dikkat edilmelidir bölge kutuları ile gösterilir. Ölçek çubuğu 10 mikron =. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56690/56690fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56690/56690fig3.jpg"> 
Şekil 3 : Nesil Filmler ve Fiji yazılımı kullanarak kymographs. (A)"Dikdörtgen seçimi" düğmesini (ok) tıklatın ve bir substacks oluşturmak için bir dikdörtgen (sarı kutu) çizerek odaklanmak istiyorum alanını seçin. (B) kesimli çizgi düğmesini (ok) tıklatın ve bir fare (Sarı Hat) kullanarak kirpikler boyunca parçalı bir çizgi çizin. (C) "Analiz", "Çok Kymograph" ve "Çok Kymograph" bir eklenti başlatmak için kymographs oluşturmak için seçin. (S) giriş linewidth, tıkırtı "OK" ve kymographs (şekil 5 ve Şekil 7) oluşturur. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56690/56690fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56690/56690fig4.jpg"> 
Şekil 4 : Sinaptik vezikül öncüleri aksonal taşıma temsilcisi kymograph. gfp::rab-3 hareket DA9 nöron proksimal asynaptic bölge görülmektedir ve kymograph Fiji Multi Kymograph ile oluşturuldu. Yatay ve dikey çubuklar uzunluk ve zaman, sırasıyla gösterir. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56690/56690fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56690/56690fig5.jpg"> 
Şekil 5 : LFT temsilcisi kymograph. OSM-6::GFP PHA ve PHB kirpikler görülmektedir ve bu kymograph, ikisinden biri içinde kaçakçılık olayı oluşturulur. Kymograph Fiji Multi Kymograph ile oluşturuldu. Yatay ve dikey çubuklar uzunluk ve zaman, sırasıyla gösterir. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56690/56690fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/56690/56690movie1.jpg"> 
Film 1: sinaptik vezikül öncüleri aksonal taşıma temsilcisi film. gfp::rab-3 hareket DA9 nöron proksimal asynaptic bölge görülmektedir. gfp::rab-3 sinaptik vezikül öncüleri dahil ve nakli. Anterograd ve retrograd aksonal transport kaydedilir. Bazı veziküller durmak ama yeniden başlatın. Film 4 kare/s ve çalış 15 kare/s ani kalp durması kaydedildiLe bar 5 mikron =. Bu videoyu izlemek için <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56690/movie1.mp4" target="_blank">lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)</a>
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/56690/56690Movie2.jpg"> 
Movie 2: lFT temsilcisi film. OSM-6::GFP PHA ve PHB kirpikler görülmektedir. OSM-6::GFP karmaşık LFT dahil ve kirpikler hareket eder. Film 4 kare/s ve çalış kaydedildi 15 kare/s. ölçek çubuğu 5 mikron =. Bu videoyu izlemek için <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56690/Movie2.mov" target="_blank">lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons at JoVE.com

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans (C. elegans) aksonlar ve hücre içi taşıma çalışma için iyi bir modeldir. Burada, vivo içinde kayıt ve analiz C. elegansaksonlar ve intraflagellar taşıma için bir protokol açıklayın.

Caenorhabditis elegans nöron hücre içi taşıma analiz immobilizasyon

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

immobilization-caenorhabditis-elegans-to-analyze-intracellular

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

8.0K Görüntüleme.  Tohoku University. Caenorhabditis elegans (C. elegans) aksonlar ve hücre içi taşıma çalışma için iyi bir modeldir. Burada, vivo içinde kayıt ve analiz C. elegansaksonlar ve intraflagellar taşıma için bir protokol açıklayın.

Video: Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for the targeted expression of genetically encoded calcium sensors. This protocol outlines the use of these sensors for the in vivo imaging of calcium dynamics in targeted cells, specifically the body wall muscles of the worms. By utilizing the co-expression of presynaptic channelrhodopsin, stimulation of acetylcholine release from excitatory motor neurons can be induced using blue light pulses, resulting in muscle depolarization and reproducible changes in cytoplasmic calcium levels. Two worm immobilization techniques are discussed with varying levels of difficulty. Comparison of these techniques demonstrates that both approaches preserve the physiology of the neuromuscular junction and allow for the reproducible quantification of calcium transients. By pairing optogenetics and functional calcium imaging, changes in postsynaptic calcium handling and homeostasis can be evaluated in a variety of mutant backgrounds. Data presented validates both immobilization techniques and specifically examines the roles of the C. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase and the calcium-activated BK potassium channel in the body wall muscle calcium regulation.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

This method provides a way to couple optogenetics and genetically encoded calcium sensors to image baseline cytosolic calcium levels and changes in evoked calcium transients in the body wall muscles of the model organism C. elegans.

In Vivo Kalsiyum Görüntüleme C. elegans Vücut Duvar Kasları

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Biyokimya

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

C. vivo Nöronal Kalsiyum Imaging&#39;de elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Nörobilim

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological conditions. Post-mitotic neurons represent a major cell type affected by aging. Although multiple mammalian models of neuronal aging exist, they are challenging and expensive to establish. The roundworm Caenorhabditis elegans is a powerful model to study neuronal aging, as these animals have short lifespan, an available robust genetic toolbox, and well-cataloged nervous system. The method presented herein allows for seamless isolation of specific cells based on the expression of a transgenic green fluorescent protein (GFP). Transgenic animal lines expressing GFP under distinct, cell type-specific promoters are digested to remove the outer cuticle and gently mechanically disrupted to produce slurry containing various cell types. The cells of interest are then separated from non-target cells through fluorescence-activated cell sorting, or by anti-GFP-coupled magnetic beads. The isolated cells can then be cultured for a limited time or immediately used for cell-specific ex vivo analyses such as transcriptional analysis by real time quantitative PCR. Thus, this protocol allows for rapid and robust analysis of cell-specific responses within different neuronal populations in C. elegans.

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for simple isolation of specific groups of live neuronal cells expressing green fluorescent protein from transgenic Caenorhabditis elegans lines. This method enables a variety of ex vivo studies focused on specific neurons and has the capacity to isolate cells for further short-term culturing.

Roundworm Caenorhabditis elegans belirli neuron nüfus yalıtım

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...

Gelişim Biyolojisi

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Uzun süreli Kalsiyum Görüntüleme için Agaroz microchambers<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

Caenorhabditis elegans'ın Uzun Süreli Büyümesi ve Görüntülenmesi için Basit Bir Mikroakışkan Çip

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...

Biyomühendislik

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

Excitotoxic necrosis is a leading form of neurodegeneration. This process of regulated necrosis is triggered by the synaptic accumulation of the neurotransmitter glutamate, and the excessive stimulation of its postsynaptic receptors. However, information on the subsequent molecular events that culminate in the distinct neuronal swelling morphology of this type of neurodegeneration is lacking. Other aspects, such as changes in specific subcellular compartments, or the basis for the differential cellular vulnerability of distinct neuronal subtypes, remain under-explored. Furthermore, a range of factors that come into play in studies that use in vitro or ex vivo preparations might modify and distort the natural progression of this form of neurodegeneration. It is therefore important to study excitotoxic necrosis in live animals by monitoring the effects of interventions that regulate the extent of neuronal necrosis in the genetically amenable and transparent&#160;model system of the nematode Caenorhabditis elegans. This protocol describes methods of studying excitotoxic necrosis in C. elegans neurons, combining optical, genetic, and molecular analysis. To induce excitotoxic conditions in C. elegans, a&#160;knockout of a glutamate transporter gene (glt-3) is combined with a neuronal sensitizing genetic background (nuls5 [Pglr-1::G&#945;S(Q227L)]) to produce glutamate receptor hyperstimulation and neurodegeneration. Nomarski differential interference contrast (DIC), fluorescent, and confocal microscopy in live animals are methods used to quantify neurodegeneration, follow subcellular localization of fluorescently labeled proteins, and quantify mitochondrial morphology in the degenerating neurons. Neuronal Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) is used to distinctly sort at-risk neurons for cell-type specific transcriptomic analysis of neurodegeneration. A combination of live imaging and FACS methods as well as the benefits of the C. elegans model organism allow researchers to leverage this system to obtain reproducible data with a large sample size. Insights from these assays could translate to novel targets for therapeutic intervention in neurodegenerative diseases.

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

In a C. elegans excitotoxicity model, this protocol employs in vivo imaging to analyze the regulation of necrotic neurodegeneration, the effect of genes encoding candidate mediators, and involvement of mitochondria. Cell dissociation and sorting is used to specifically obtain at-risk neurons for cell-specific transcriptomic analysis of neurodegeneration and neuroprotection mechanisms.

Excitotoxic necrosis is a leading form of neurodegeneration. This process of regulated necrosis is triggered by the synaptic accumulation of the ...

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed orientation. Here we describe methods to label, image, and analyze the microtubule dynamics and growth during the development and regeneration of touch neurons in C. elegans. Using genetically encoded fluorescent reporters of microtubule tips, we imaged the axonal microtubules. The local changes in microtubule behavior that initiates axon regeneration following axotomy can be quantified using this protocol. This assay is adaptable to other neurons and genetic backgrounds to investigate the regulation of microtubule dynamics in various cellular processes.

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

A protocol for imaging the dynamic microtubules in vivo using fluorescently labeled End binding protein has been presented. We described the methods to label, image, and analyze the dynamic microtubules in the Posterior lateral microtubule (PLM) neuron of C. elegans.

In vivo Caenorhabditis elegans Nöronlarında Mikrotübül Dinamiklerinin ve Oryantasyonunun Değerlendirilmesi

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a crucial component of intracellular signaling. The visualization of subcellular Ca2+ dynamics in vivo,&#160;where neurons can be studied in their native, intact circuitry, has proven technically challenging in complex nervous systems. The transparency and relatively simple nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans enable the cell-specific expression and in vivo visualization of fluorescent tags and indicators. Among these are fluorescent indicators that have been modified for use in the cytoplasm as well as various subcellular compartments, such as the mitochondria. This protocol enables non-ratiometric Ca2+ imaging in vivo with a subcellular resolution that permits the analysis of Ca2+ dynamics down to the level of individual dendritic spines and mitochondria. Here, two available genetically encoded indicators with different Ca2+ affinities are used to demonstrate the use of this protocol for measuring relative Ca2+ levels within the cytoplasm or mitochondrial matrix in a single pair of excitatory interneurons (AVA). Together with the genetic manipulations and longitudinal observations possible in C. elegans, this imaging protocol may be useful for answering questions regarding how Ca2+ handling regulates neuronal function and plasticity.

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

The current methods describe a non-ratiometric approach for high-resolution, sub-compartmental calcium imaging in vivo in Caenorhabditis elegans using readily available genetically encoded calcium indicators.

Nöronal Kalsiyum Kullanımının In Vivo Subsellüler Görüntülemesi

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

C. elegans'ı toplu halde hareketsiz hale getirmek için bir soğutma aşaması oluşturmak ve işletmek

Assembly and Operation of a Cooling Stage to Immobilize C. elegans on Their Culture Plates

High-resolution in vivo microscopy approaches can reveal subtle information and fine details inside the model animal Caenorhabditis elegans (C. elegans), but require strong animal immobilization to prevent motion blur in the images. Unfortunately, most current immobilization techniques require substantial manual effort, rendering high-resolution imaging low-throughput. Immobilization of C. elegans is greatly simplified by using a cooling approach that can easily immobilize entire populations directly on their cultivation plates. The cooling stage can establish and maintain a wide range of temperatures with a uniform distribution on the cultivation plate. In this article, the whole process of building the cooling stage is documented. The aim is that a typical researcher can build an operational cooling stage in their laboratory following this protocol without difficulty. Utilization of the cooling stage following three protocols is shown, and each protocol has advantages for different experiments. Also shown is an example cooling profile of the stage as it approaches its final temperature and some helpful tips in using cooling immobilization.

Yazar Spot Işığı: C. elegans'ı Kültür Plakalarında Hareketsiz Hale Getirmek için Bir Soğutma Aşamasının Montajı ve Çalıştırılması  

This paper describes protocols for constructing and operating a cooling stage to immobilize C. elegans on their original cultivation plates en masse.

C. elegans'ı kültür plakalarında hareketsiz hale getirmek için bir soğutma aşamasının montajı ve çalıştırılması

High-resolution in vivo microscopy approaches can reveal subtle information and fine details inside the model animal Caenorhabditis elegans (C. elegans), ...

Caenorhabditis elegans nöron hücre içi taşıma analiz immobilizasyon

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

In Vivo Kalsiyum Görüntüleme C. elegans Vücut Duvar Kasları

C. vivo Nöronal Kalsiyum Imaging'de elegans

Roundworm Caenorhabditis elegans belirli neuron nüfus yalıtım

Uzun süreli Kalsiyum Görüntüleme için Agaroz microchambers

Caenorhabditis elegans'ın Uzun Süreli Büyümesi ve Görüntülenmesi için Basit Bir Mikroakışkan Çip

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

In vivo Caenorhabditis elegans Nöronlarında Mikrotübül Dinamiklerinin ve Oryantasyonunun Değerlendirilmesi

Nöronal Kalsiyum Kullanımının In Vivo Subsellüler Görüntülemesi

C. elegans'ı kültür plakalarında hareketsiz hale getirmek için bir soğutma aşamasının montajı ve çalıştırılması

C. elegans'ı kültür plakalarında hareketsiz hale getirmek için bir soğutma aşamasının montajı ve çalıştırılması