המחבר עמוקות תודה ד ר Asako סוגימוטו (אוניברסיטת Tohoku) לדיון מועיל שלה. wyIs251 היה מתנה נדיבה של ד ר קאנג שן (אוניברסיטת סטנפורד). mnIs17 סופק על ידי CGC, אשר ממומן על ידי משרד NIH תוכניות תשתית מחקר (P40 OD010440). עבודה זו נתמכה על ידי גרנט JSPS KAKENHI #17 H 05010 ו- #16 H 06536, תחנת Sankyo קרן, קרן מדעי המוח וקרן נאיטו.

1. הכנת הדוגמא <ol><li>צור הטרנסגניים C. elegans זן עניין באמצעות מתודולוגיות הטרנסגניים 18. לחלופין, להשיג זנים המתאימים של מרכז הגנטיקה Caenorhabditis (CGC). כדי להמחיש תחבורה עצב של שלפוחית סינפטית מבשרי, השתמש את קו הטרנסגניים wyIs251 [Pmig-13::gfp::rab-3] 7. להתבונן: אי, להשיג את mnIs17 [osm-6::gfp] הטרנסגניים קו 19. זנים אלו נמצאים בשימוש בפרוטוקול זה. 
	הערה: גם מערך extrachromosomal, אינטגרציה הגנומי או אפילו GFP טוק-אין עבודות. כדי לצמצם את הרקע אותות, להשתמש היזמים תא ספציפי, ולא היזמים פאן עצבית. 
	הערה: תחזוקה של תולעים מתואר פרוטוקולים אחרים 20. זנים היו מתוחזקים על המדשאות של החיידק Escherischia OP50 מזין על גידול נמטודות צלחות (NGM) בינונית (1.7% (w/v) agarose, 50 מ מ NaCl, peptone 0.25% (w/v), 1 מ"מ CaCl 2, 5 מ"ג/מ"ל כולסטרול, 25 מ מ ח' 2 PO 4, 1 מ מ MgSO 4 על מנות פלסטיק קוטר 60 מ"מ) בגיל 20 מעלות צלזיוס</li>
	<li>לגדול תולעים ב 20 מעלות צלזיוס על צלחות NGM כדי בכל שלב במחזור החיים של התולעים. 
	הערה: אחד ניתן להבחין תחבורה עצב והן: אי בכל שלב. L4 מאוחר עד בוגר צעיר הוא פקד חיובי טוב כי פרסומים מרובים להשתמש אלה שלבים ודמיינו סחר אירועים 14 , 21 , 22 , 23.</li>
</ol> 2. הכנה של 10% Agarose הערה: ספקי רבים לספק מוצרים דומים כגון אגר אגר אבקות, agarose. השתמש agarose כיתה אלקטרופורזה (ג'ל חוזק &#62; 1200 גרם/ס"מ 2). אבקות אגר זול לא עובדים כי הג'ל שנוצר אינה חזקה מספיק כדי לשתק תולעים.
<ol><li>Agarose 0.4 גרם מיקס 4 מ"ל מים (DW) שפופרת זכוכית (1.5 ס"מ x 10.5 ס"מ) מזוקקים. לשים מכסה על צינור זכוכית כדי למנוע אידוי.</li>
	<li>שמכניסים את נקז זכוכית על גוש חום 95 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות. בנוסף, להכין עוד מבחנה (1.5 ס"מ x 10.5 ס"מ) מלא DW, לשמור את זה 95 מעלות צלזיוס pipet של פסטר הכניס 95 ° C DW ( איור 1 א'). ניתן לראות הרבה בועות קטנות בצינור agarose, הפתרון צריך להיות עכורים. . תשאיר את זה עד הפתרון נעשה ברור ואז לערבב על ידי pipetting למעלה ולמטה עד הפתרון agarose הופך הומוגניות. 
	הערה: מיקרוגל לא ניתן להשתמש כדי להכין 10% הפתרון agarose כאשר עשה מ ד ו ו agarose. בועות קטנות הנגרמת על ידי מיקרוגל למנוע agarose נמס. עם זאת, הקרושה 10% agarose ג'ל יכול בקלות להיות מומסת שוב באמצעות מיקרוגל. צינורות זכוכית המכיל 10% agarose ג'ל יכול להיות שהוכנו מבעוד מועד ומאוחסנים ב 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 6 חודשים. אם כך להמיס את המניות באמצעות מיקרוגל בעת הצורך ולהתחיל שהוזכר בשלב 3 של פרוטוקול זה. 
	הערה: Agarose מאבד בהדרגה את היכולת לגבש אם מודגרות ב 95 מעלות צלזיוס במשך זמן רב או לאחר התמצקות חוזרות ונשנות, התכה. אם זה קורה, להכין חדש 10% agarose.</li>
</ol> 3. הכנת משטח Agarose <ol><li>שימוש את pipet פסטר ומחוממת מוכן בשלב 2.2, במקום 2 טיפות של 10% agarose על שקופית 76 x 22 מ מ.</li>
	<li>במהירות לכסות עם שקופית 2 76 x 22 מ מ השני לפני הירידה agarose עפור כפי שמוצג באיור 1 B ולדחוף למטה על השקופית השניה כדי לשטח את הפתרון agarose. העובי צריך להיות 0.5-1 מ מ.</li>
	<li>במהירות לרוקן את פיפטה פסטר מאת pipetting 95 ° C DW למעלה ולמטה עד הפתרון agarose נשטף. אחרת, pipet סתומים על ידי ג'ל agarose. להשאיר את עומד פיפטה 95 ° C DW.</li>
	חכה <li>1 דקות. משטח agarose טפסים והופך להיות מעונן. לאחר מכן, להחליק את השקופיות בנפרד ביד ( איור 1 ג).</li>
</ol> 4. הרכבה של תולעים הערה: כמויות קטנות אפילו בתנועת תולעת למנוע בתצפית. Levamisole באופן מסורתי שימש כדי למנוע תנועה תולעת agarose pad 24 , 25. עם זאת, Levamisole מעכב קולטנים עצביים C. elegans, ולכן עשוי להשפיע על האירועים סחר נוירונים 15. באמצעות גרגרי פוליסטירן תיאר אז היא חלופה טובה 17.
<ol><li>תחת מיקרוסקופ סטריאו מצויד transillumination מראה slidable, העברת ~ 30 תולעים הטרנסגניים לבטא את סמני המתאים כדי NGM החדש צלחת ללא חיידקים באמצעות חוט פלטינה לבחור. 
	הערה: איסוף חוט פלטינה פלטינה וארץ פסטר פיפטה (5 אינץ '), ונוצר שוטח את קצה החוט פלטינה. הכנת הפיקים תיל פלטינה וטיפול תולעים עם אלה מתוארים את Wormbook (http://www.wormbook.org).</li>
	<li>להשאיר את הצלחת עבור מינימלית 1 חיידקים הסרה אוטומטית של המשטחים של תולעים כמו התולעים הלאה NGM agarose ג'ל ללא חיידקים.</li>
	µL <li>לשים 0.5-1.0 ירידה של 2.6% 100 ננומטר קוטר פוליסטירן גרגרי במים על גבי משטח אגר ( איור 1 D). העבר 10-20 תולעים מהצלחת NGM נטולי חיידקים גרגרי. ירידה וכפולה התולעים באמצעות הכבל פלטינה לבחור להימנע חופפים של תולעת גופים ( איור 1 E)-</li>
	<li>להחיל על 22 x 40 מ מ 2 coverslip ( איור 1 F). לחצו בעדינות כדי להסיר בועות אוויר, אך להימנע תולעים מוחצת. המדגם מוכן כעת לדימות. 
	הערה: מכיוון מנוהלת בלי הרדמה, תולעים קבועים רק על ידי כוח חיכוך שנוצר על ידי משטח אגר, גרגרי פוליסטירן, coverslip 17. הנוכחות של חיידקים מזין ו/או פתרון מידי יגרום את כוח חיכוך חלש יותר. 
	הערה: עבודה בגדלים שונים coverslips (למשל, 22 x 22 מ מ 2, 18 פרק 18 מ מ 2). עם זאת, coverslips גדול יכול למנוע טבילה במים או שמן מן המטרה העדשה דולפים לתוך דגימות במהלך הצפייה.</li>
</ol> 5. תצפית הערה: פרמטרים הדמיה מתאימים (עוצמת הלייזר, רווח, binning, וכו ') יהיה שונה עבור כל מערכת המיקרוסקופ והמצלמה. כאן, משמש מיקרוסקופ widefield מצויד ספינינג דיסק קונפוקלי סורק ומצלמה של מצלמות דיגיטלית.
<ol><li>להגדיר את בקרת טמפרטורה של השלב 20 ° C, או להתאים את טמפרטורת החדר ל- 20 מעלות צלזיוס</li>
	<li>לשים את השקופית מדגם על הבמה מיקרוסקופ. השתמש 100 x (מפתח נומרי = 1.3 או יותר) המטרה עדשה.</li>
	<li>לחפש את האזורים המצוין איור 2 א (עבור wyIs251 ותחבורה עצב) או איור 2 B (עבור mnIs17 ו: אי) כפקדים חיובי . ניתן לנתח תחומים אחרים כמו טוב 22.</li>
	<li>ערכת פרמטרים (CCD רווח = 200, Binning = 1 או 2, עוצמת הלייזר-488 ננומטר = 1.0-1.3 מגה-וואט). לבצע את זמן ההקלטה לשגות-4 מסגרות/s עבור עד 1 מינימלית שומרות קבצים כמו בתבנית mutli TIFF. 
	הערה: אם GFP אותות נעלמים וזה קשה להמשיך להתבונן GFP::RAB-3 או OSM-6::GFP ל 30 s, עוצמת הלייזר חזק מדי. במקרה זה, להפחית את עוצמת הלייזר. לעומת זאת, אם אין תנועה vesicular מוקלטת, עוצמת הלייזר הוא חלש מדי. במקרה כזה, להגביר את עוצמת הלייזר.</li>
	<li>להתבונן תולעת שונה וחזור 5.3 ו- 5.4. התצפיות יכולים להימשך עד 20 דקות, אבל כל תולעת צריך לצרוב פעם אחת בלבד כדי למנוע את ההשפעות של pנזק מרוכז. 
	הערה: תולעים נצפו לפחות 20 דקות ללא פגמים משמעותיים 7 , 27 , 28. התבוננות יותר ייתכן אבל הייבן &#39; t כבר נבדק עדיין. סימן ברור של מוות העצבית היא השינוי של מורפולוגיה עצביים כגון נפיחות neurite. כפי שניתן לראות אותות חלשים GFP אקסונים ו דנדריטים, הן wyIs251 והן mnIs17, מורפולוגיה neurite ניתן לבדוק בקלות על ידי פשוט להסתכל על אקסונים או דנדריטים. מורפולוגיה עצביים מוצגת באיור 2.</li>
	<li>ליצור קבצי סרט.
	<ol><li>פתוח TIFF מרובה הקובץ באמצעות תוכנה פיג'י. עבור אל הקובץ &#62; פתח ובחר את קובץ TIFF מרובה שנשמר בשלב 5.4. 
		הערה: פיג'י ניתן להוריד בכתובת jttps://fiji.sc. התמונה J ו תוספים יכול לשמש גם כדי ליצור kymographs. אם כך בצע את ההוראות הרלוונטיות עבור תוסף שבחרת.</li> <li>לחץ &#34; בחירה מלבנית &#34; לחצן ( איור 3 , חץ) ובחר תחום העניין על ידי ציור מלבן עם עכבר המחשב (מלבן צהוב איור 3 א). עבור אל התמונה &#62; ערימות &#62; כלי &#62; להפוך Substacks ובחר את מספרי פרוסה כלולים בתוך הסרט. נוצר substack.</li>
		<li>הפעל החלון substack על-ידי לחיצה וללכת תמונה &#62; התאם &#62; בהירות/חדות. מופיע חלון כדי להתאים את הבהירות והניגודיות. בחלון, החלק העליון בר (מינימום) ימינה כך האות רקע נעלם והיא השנייה להתעלות על הבר (מקסימום) שמאלה אז זה נעה שלפוחית חלקיקים ניתן לראות היטב מעל הרקע.</li>
		<li>ללכת תמונה &#62; ערימות &#62; זמן סטמפר. כמו בסרט מוקלטת-4 מסגרות לשנייה בשלב 5.4, מרווח הזמן הוא 0.25 s. לפיכך, הקלד &#34; 0.25 &#34; במרווח.</li>
		<li>לייצר קובץ הסרט על-ידי בחירת שמור &#62; AVI מהתפריט קובץ (הסרט 1 ו- 2). 
		הערה: באמצעות תוספים המתאים, באפשרותך לשמור את הקובץ בפורמטים אחרים כגון &#34; mpeg4 &#34; או &#34; mov &#34; קבצים.</li>
	</ol></li> <li>צור kymographs.
	<ol><li>לפתוח את הקבצים המקוריים של הסרט באמצעות תוכנה פיג'י שוב וחזור על שלבים 5.6.2 ו 5.6.3 להתאמת הבהירות והניגוד.</li>
		<li>לחץ &#34; מקוטע בקו &#34; ( איור 3 ב, חץ). באמצעות עכבר, צייר קו מקוטע לאורך האקסון (קו צהוב, איור 3 B) או cilia.</li>
		<li>הולכים לנתח &#62; רב Kymograph &#62; רב Kymograph ( איור 3 ג'). מופיע קו רוחב חלון ( איור 3 ד'). סוג &#34; 3 &#34; Linewidth חלון, לחץ על אישור ( איור 3 ד')-</li>
		חלון kymograph <li>נוצר. לשמור את התמונה בתבנית TIFF או JPEG.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+motors+in+neurons:+transport+mechanisms+and+roles+in+brain+function,+development,+and+disease.">Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease.</a> Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).</li><li>Holzbaur, E. L., Scherer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules,+axonal+transport,+and+neuropathy.">Microtubules, axonal transport, and neuropathy.</a> N Engl J Med. 365 (24), 2330-2332 (2011).</li><li>Kamiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+of+axonemal+dyneins+as+studied+in+Chlamydomonas+mutants.">Functional diversity of axonemal dyneins as studied in Chlamydomonas mutants.</a> Int Rev Cytol. 219, 115-155 (2002).</li><li>Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraflagellar+transport+motors+in+cilia:+moving+along+the+cell's+antenna.">Intraflagellar transport motors in cilia: moving along the cell's antenna.</a> J Cell Biol. 180 (1), 23-29 (2008).</li><li>Rosenbaum, J. L., Witman, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraflagellar+transport.">Intraflagellar transport.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (11), 813-825 (2002).</li><li>Ishikawa, H., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliogenesis:+building+the+cell's+antenna.">Ciliogenesis: building the cell's antenna.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (4), 222-234 (2011).</li><li>Niwa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoinhibition+of+a+Neuronal+Kinesin+UNC-104/KIF1A+Regulates+the+Size+and+Density+of+Synapses.">Autoinhibition of a Neuronal Kinesin UNC-104/KIF1A Regulates the Size and Density of Synapses.</a> Cell Rep. 16 (8), 2129-2141 (2016).</li><li>Snow, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+anterograde+intraflagellar+transport+motors+cooperate+to+build+sensory+cilia+on+C.+elegans+neurons.">Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons.</a> Nat Cell Biol. 6 (11), 1109-1113 (2004).</li><li>Ou, G., Blacque, O. E., Snow, J. J., Leroux, M. R., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+coordination+of+intraflagellar+transport+motors.">Functional coordination of intraflagellar transport motors.</a> Nature. 436 (7050), 583-587 (2005).</li><li>Zhou, R., Niwa, S., Homma, N., Takei, Y., Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIF26A+is+an+unconventional+kinesin+and+regulates+GDNF-Ret+signaling+in+enteric+neuronal+development.">KIF26A is an unconventional kinesin and regulates GDNF-Ret signaling in enteric neuronal development.</a> Cell. 139 (4), 802-813 (2009).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charcot-Marie-Tooth+disease+type+2A+caused+by+mutation+in+a+microtubule+motor+KIF1Bbeta.">Charcot-Marie-Tooth disease type 2A caused by mutation in a microtubule motor KIF1Bbeta.</a> Cell. 105 (5), 587-597 (2001).</li><li>Niwa, S., Tanaka, Y., Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIF1Bbeta-+and+KIF1A-mediated+axonal+transport+of+presynaptic+regulator+Rab3+occurs+in+a+GTP-dependent+manner+through+DENN/MADD.">KIF1Bbeta- and KIF1A-mediated axonal transport of presynaptic regulator Rab3 occurs in a GTP-dependent manner through DENN/MADD.</a> Nat Cell Biol. 10 (11), 1269-1279 (2008).</li><li>Zhou, R., Niwa, S., Guillaud, L., Tong, Y., Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+motor,+KIF13A,+controls+anxiety+by+transporting+the+serotonin+type+1A+receptor.">A molecular motor, KIF13A, controls anxiety by transporting the serotonin type 1A receptor.</a> Cell Rep. 3 (2), 509-519 (2013).</li><li>Klassen, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Arf-like+small+G+protein,+ARL-8,+promotes+the+axonal+transport+of+presynaptic+cargoes+by+suppressing+vesicle+aggregation.">An Arf-like small G protein, ARL-8, promotes the axonal transport of presynaptic cargoes by suppressing vesicle aggregation.</a> Neuron. 66 (5), 710-723 (2010).</li><li>Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+microfluidic+devices+for+in+vivo+imaging+of+C.+elegans,+Drosophila+and+zebrafish.">Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish.</a> J Vis Exp. (67), (2012).</li><li>Chai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+cellular+dynamics+during+Caenorhabditis+elegans+postembryonic+development.">Live imaging of cellular dynamics during Caenorhabditis elegans postembryonic development.</a> Nat Protoc. 7 (12), 2090-2102 (2012).</li><li>Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+using+nanoparticle-mediated+immobilization.">Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization.</a> PLoS One. 8 (1), 53419 (2013).</li><li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection.">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. (18), (2008).</li><li>Collet, J., Spike, C. A., Lundquist, E. A., Shaw, J. E., Herman, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+osm-6,+a+gene+that+affects+sensory+cilium+structure+and+sensory+neuron+function+in+Caenorhabditis+elegans.">Analysis of osm-6, a gene that affects sensory cilium structure and sensory neuron function in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 148 (1), 187-200 (1998).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Niwa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nephronophthisis-related+gene+ift-139+is+required+for+ciliogenesis+in+Caenorhabditis+elegans.">The nephronophthisis-related gene ift-139 is required for ciliogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Sci Rep. 6, 31544 (2016).</li><li>Maeder, C. I., San-Miguel, A., Wu, E. Y., Lu, H., Shen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+neuron-wide+analysis+of+synaptic+vesicle+precursor+trafficking.">In vivo neuron-wide analysis of synaptic vesicle precursor trafficking.</a> Traffic. 15 (3), 273-291 (2014).</li><li>Wu, Y. E., Huo, L., Maeder, C. I., Feng, W., Shen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+balance+between+capture+and+dissociation+of+presynaptic+proteins+controls+the+spatial+distribution+of+synapses.">The balance between capture and dissociation of presynaptic proteins controls the spatial distribution of synapses.</a> Neuron. 78 (6), 994-1011 (2013).</li><li>Dwyer, N. D., Adler, C. E., Crump, J. G., L'Etoile, N. D., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+dendritic+transport+and+the+AP-1+mu1+clathrin+adaptor+UNC-101+localize+odorant+receptors+to+olfactory+cilia.">Polarized dendritic transport and the AP-1 mu1 clathrin adaptor UNC-101 localize odorant receptors to olfactory cilia.</a> Neuron. 31 (2), 277-287 (2001).</li><li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microsurgery+in+Caenorhabditis+elegans.">Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 107, 177-206 (2012).</li><li>Kumar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+Kinesin-3+motor+UNC-104/KIF1A+is+degraded+upon+loss+of+specific+binding+to+cargo.">The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo.</a> PLoS Genet. 6 (11), 1001200 (2010).</li><li>Zheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vesicle+protein+SAM-4+regulates+the+processivity+of+synaptic+vesicle+transport.">The vesicle protein SAM-4 regulates the processivity of synaptic vesicle transport.</a> PLoS Genet. 10 (10), 1004644 (2014).</li><li>Blacque, O. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WD+repeat-containing+protein+IFTA-1+is+required+for+retrograde+intraflagellar+transport.">The WD repeat-containing protein IFTA-1 is required for retrograde intraflagellar transport.</a> Mol Biol Cell. 17 (12), 5053-5062 (2006).</li><li>Evans, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+modulation+of+IFT+kinesins+extends+the+sensory+repertoire+of+ciliated+neurons+in+Caenorhabditis+elegans.">Functional modulation of IFT kinesins extends the sensory repertoire of ciliated neurons in Caenorhabditis elegans.</a> J Cell Biol. 172 (5), 663-669 (2006).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li><li>Bindels, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mScarlet:+a+bright+monomeric+red+fluorescent+protein+for+cellular+imaging.">mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging.</a> Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).</li><li>Prevo, B., Mangeol, P., Oswald, F., Scholey, J. M., Peterman, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+differentiation+of+cooperating+kinesin-2+motors+orchestrates+cargo+import+and+transport+in+C.+elegans+cilia.">Functional differentiation of cooperating kinesin-2 motors orchestrates cargo import and transport in C. elegans cilia.</a> Nat Cell Biol. 17 (12), 1536-1545 (2015).</li><li>Robison, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detyrosinated+microtubules+buckle+and+bear+load+in+contracting+cardiomyocytes.">Detyrosinated microtubules buckle and bear load in contracting cardiomyocytes.</a> Science. 352 (6284), 0659 (2016).</li><li>Hayashi, S., Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+superresolution+fluorescence+imaging+with+spinning+disk+confocal+microscope+optics.">Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics.</a> Mol Biol Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).</li></ol>

המחבר אין לחשוף.

הגבלה לגבי שיטות קיימות השיטה המתוארת כאן ממוטבת להתבונן מהר אירועים כגון: אי ולהזמנת עצב. לפיכך, קיבעון יותר תקבל עדיפות גבוהה יותר זמן הדגירה. ואילו היינו מסוגלים להבחין באירועים סחר לפחות 20 דקות ללא ההפרעות משמעותית, שיטה זו ייתכן שלא יתאים תמיד להתבונן איטי אירועים הדורשים תצפיות יותר, כגון אקסון התארכות נדידת תאים. עבור תצפיות יותר זמן, שצריך למטב את התנאים על-ידי הפחתת אחוז agarose (דהיינו, הגדלת המים כדי למנוע ייבוש והפחתת הלחץ הזה פוטנציאל גורמת נזק). לחלופין, המכשיר microfluidic המתואר לעיל15 או קיבעון של תולעים באמצעות רפידות agarose והרדמה עשוי להיות מתאים יותר16 ואילו תופעות לוואי וצריך להעריך בזהירות.
שלבים קריטיים בתוך פרוטוקול השגחה נאותה, סמני הם קריטיים. סמנים צריכים להיות משולבים לתוך שלפוחית או חלקיקים, להיות על בהירות מספקת. מערכים extrachromosomal או קווים משולב יכול לשמש. עבור ויזואליזציה של התחבורה עצב של שלפוחית סינפטית מבשרי בנוירונים DA9, המתח wyIs251 הוא שימושי7,23. jsIs821 שימש להתבונן תחבורה עצב בנוירונים mechanosensory כמה מחקרים26,27. כאשר מאבחנים נוירונים אחרים, שלפוחית סינפטית חלבונים צריך לבוא לידי ביטוי גם נוירונים באמצעות תאים ספציפיים היזמים. היזמים אלה צריך להיות חזק מספיק. ראב-3 ו- SNB-1 נמצאים בשימוש נרחב כדי להדביק תווית שלפוחית סינפטית מבשרי22,23,26. להתבונן: אי, מרכיבי: אי. מורכבים יש לתייג. כפקד חיובית, המתח mnIs17 היא בחירה טובה29. Cilia שמקורם 8 תאים (ASE ASG, אסי, ASL, אפר, שאל, מזין מסמכים אוטומטי, אדל) מקובצות יחדיו בראש (amphid) בעוד cilia מתאי 2 (פא ו PHB) יפקחו על ההר (phasmid). כי OSM-6::GFP מתבטאת כל הנוירונים ciliated ב mnIs17, זה עשוי להיות קשה לנתח את: אי. בפירוט cilia ראש. עם זאת, באזור הזנב, רק נוירונים פא ו PHB מסומנות,: אי. בכל תא אפשר בקלות לפתור. לחלבונים אחרים: אי המתויגים באמצעות חלבונים פלורסנט ניתן להתבונן: אי21,28. אם אדם רוצה לנתח את הנוירונים ראש, היזמים תא ספציפי יהיה שימושי. בעוד הראש cilia מורפולוגיות שונות, תחבורה אירועים יכול להיות מוקלט29. על ידי חציית מוטציות עם סמנים אלה, הפונקציות של כל גנים: אי ולהזמנת עצב יכול להיות שנותחה ויוו. הפרמטרים ניתן לנתח תוארו הקודם העבודה22,23,26,27. GFP היא הבחירה הטובה ביותר ואת ראשי. mCherry tdTomato ניתן גם בשימוש22, עם זאת, mCherry מעומעמת יותר מאשר ה-GFP. tdTomato הוא דיימר טנדם יותר מ monomeric חלבונים פלורסנט, אשר לפעמים משפיע על הדינמיקה של פיוז'ן חלבונים30. לכן, התוצאות צריך להיות מנותח, לפרש בזהירות כאשר נעשה שימוש tdTomato. mScarlet, בהירים monomeric אדום פלואורסצנטי חלבון אשר פותחה לאחרונה, היא בחירה חלופיים31.
בזמן ספינינג דיסק מיקרוסקופיה קונפוקלית נעשה שימוש נרחב כדי להתבונן תחבורה עצב ו-7,: אי21, הציוד יקר, עלול להיות קשה לגשת בסביבות מחקר מסוימות. אולם, תופעות אלו יכולים גם להיות מוקלט וניתח ב- C. elegans באמצעות מיקרוסקופים פלורסנט רגיל, אם מצוידים עם עדשות נה גבוהה, כי C. elegans , קטן ושקוף בעלי חיים ופשוט להתבונן.
יישומים עתידיים בשיטה דומה הנייח המתוארים כאן, נצפתה: אי ברזולוציה מולקולה בודדת ב vivo32. יתר על כן, פותחו מספר סוגים של מיקרוסקופ ברזולוציה-העל. אפשר לייחס ישירות בשיטות המתוארות כאן ניתוח מיקרוסקופי סופר רזולוציה. מניסיוני, מצב מהיר של Airyscan33 עובד טוב מאוד לנתח: אי. באופן תיאורטי, מיקרוסקופ סופר-ברזולוציה דיסק מסתובב (SDSRM) יהיה בחירה טובה טוב34. לסיכום, על ידי שילוב של ספריות מוטציה, טכניקות חדשות אלה, השיטה המתוארת כאן צריך להיות להבהרת המנגנון המולקולרי תחבורה עצב,: אי ויוו.

תא חי הדמיה הוא כלי חיוני עבור ניתוח התחבורה תאיים. בביולוגיה דופאמינרגיים, ניתוחים של תחבורה עצב תאים חיים הדמיה חיוניים להבנת תפקוד ואת מורפוגנזה עצביים1. פגמים תחבורה עצב ביסוד הפרעות ניווניות מספר2. קינזין superfamily חלבונים ו דינאין נושאים תעבורה עצב anterogradely והן retrogradely, בהתאמה1,2.
Cilia הם עוד תא הסלולר שבה microtubule רשת ומכונות לסחר בבני אדם הם מפותח מאוד3. מכונות סינתזת חלבון הוא לא מקומי ב- cilia, מה שאומר חלבונים ciliary חייב להיות מועבר מן הציטופלסמה אל העצות cilia. קינזין cilia ספציפיים דינאין, קראו קינזין-2 ו- cytoplasmic דינאין-2, בהתאמה, להעביר את הרכיבים של cilia4, תופעה הנקראת intraflagellar תחבורה: (אי)5. ירידת ערך של: אי גורמת קשת של מחלות שנקרא ciliopathies6. לפיכך, ניתוח של המנגנון: אי על ידי הדמיה תא חי נדרש להבין מנגנונים בסיסיים של היווצרות ciliary ו פתוגנזה.
Caenorhabditis elegans (C. elegans) הוא מודל טוב ללמוד תחבורה עצב ו: אי-7,-8,-9. להתבונן: אי, Chlamydomonas כבר בשימוש נרחב כמו אורגניזם מודל5,6. כמו Chlamydomonas הוא אורגניזם חד־תאיות, קשרי הגומלין בין: אי עם ההזדקנות, תפקוד התנהגות יהיה קשה לנתח. בנוסף, טכניקות גנטיים חיוניים כגון CRISPR/Cas9 לא הוחלו על Chlamydomonas. מודל עילאיים, כגון עכברים דרוזופילה, הפרעה תחבורה עצב,: אי לעיתים קרובות גורמת פנוטיפים קטלני משום תחבורה עצב,: אי חיוניים עבור מורפוגנזה והומאוסטזיס של חיות 10, 11. במקרה של עכברים, תרבית תאים, תרביות תאים בדרך כלל צורך להתבונן תחבורה עצב,: אי, אשר דורש מיומנויות רבות זמן רב12,13. בנוסף, הרבה חשוב בהקשר פיזיולוגיים עלול ללכת לאיבוד בתוך תאים בתרבית, שורות תאים. . כי מערכת העצבים אינה חיונית להישרדותו של התולעים, C. elegans מוטציות תחבורה עצב או: אי אילו הם שיבשו אינן קרובות קטלני7,9,14. תחבורה עצב,: אי ישירות נראים ויוו ללא ניתוח כי C. elegans הוא שקוף, ולכן קל להתבונן סמני מתויג GFP.
ישנם מספר פרוטוקולים לשתק C. elegans, כגון באמצעות מכשיר microfluidic15, רפידות agarose עם הרדמה16, או גרגרי17. ההכללה של הרדמה עלול לעכב את האירועים סחר נוירונים15. חיסרון ברור של שיטת microfluidic-התקן היא הכנת התקן microfluidic אינה תמיד קלה. במקום זאת, קיבעון על-ידי agarose כריות וגרגרי היא דרך נוחה וקלה לביצוע זמן לשגות הדמיית C. elegans. כאן, אתאר את פרוטוקול בסיסי זה כדי לשתק C. elegans והמחש תחבורה עצב,: אי ויוו ב C. elegans. בהשוואה לשיטות אחרות, השיטה המתוארת כאן אינו מצריך ציוד מיוחד, הרבה יותר זול וקל לביצוע.

<table><tbody><tr><td>Slideglass (76&amp;nbsp; x 26 mm)</td><td>Matsunami</td><td>S1111</td><td></td></tr><tr><td>Coverglass (22&amp;nbsp; x 40 mm)</td><td>Matsunami</td><td>C024401</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Wako</td><td>318-01195</td><td></td></tr><tr><td>Polystylene microbeads 0.1 micron</td><td>Polysciences</td><td>#00876</td><td></td></tr><tr><td>Heat block</td><td>TAITEC</td><td>0063288-000</td><td>CTU-mini</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX-71</td><td>widefield microscope</td></tr><tr><td>Spinning disk Scanner</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-X1</td><td>spinning disc confocal scanner&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Digital CCD camera</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C10600-10B</td><td>ORCA-R2 degital CCD camera</td></tr><tr><td>Objective lens (x100, NA1.4)</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO 100XO</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipette (5 inch)</td><td>IWAKI</td><td>IK-PAS-5P</td><td></td></tr><tr><td>Glass tube (1.5 cm diameter x 10.5 cm)</td><td>IWAKI</td><td>9820TST15-105NP</td><td></td></tr><tr><td>TV9211: &lt;em&gt;wyIs251&lt;/em&gt;</td><td>Laboratory of Kang Shen</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>OTL11: &lt;em&gt;mnIs17&lt;/em&gt;</td><td>Ref. 27, 29</td><td>N/A</td><td>SP2101 was backcrossed with wild type for 6 times</td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>435064-9000-000</td><td>STEMI 508&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mirror transillumination unit</td><td>Carl Zeiss</td><td>435425-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>platinum wire (0.2 mm)</td><td>Nilaco Corporation</td><td>m78483501</td><td></td></tr><tr><td>60 mm plastic dish</td><td>Falcon</td><td>#351007</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>https://fiji.sc/</td></tr><tr><td>nematode growth medium (NGM)&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>1.7% (w/v) agarose, 50mM NaCl, 0.25% (w/v) Peptone, 1 mM CaCl2, 5 mg/mL Cholesterol, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

immobilization of caenorhabditis elegans to analyze intracellular transport in neurons

עצב תחבורה ותעבורה intraflagellar: (אי) חיוניים עבור מורפוגנזה האקסון ואת cilia ותפקוד. קינזין superfamily חלבונים דינאין המנועים המולקולריים המסדירים anterograde ותעבורה רטרוגרדית, בהתאמה בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. מנועים אלה להשתמש microtubule רשתות מסילות. Caenorhabditis elegans (C. elegans) הוא אורגניזם מודל חזק ללמוד תחבורה עצב ו: אי ויוו. כאן, אתאר פרוטוקול להתבונן תחבורה עצב,: אי חי C. elegans. ניתן לאבחן מטען מועבר על-ידי תיוג חלבונים מטענים באמצעות חלבונים פלורסנט כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). C. elegans הוא שקוף, יכול לבוא לידי ביטוי מתויג GFP מטען החלבונים תאים מסוימים תחת תאים ספציפיים היזמים. תולעים חיים ניתן לתקן באמצעות גרגרי על 10% agarose ג'ל מבלי להרוג או מאלחש את התולעים. בתנאים אלה, תנועת המטען יכול להיות ישירות שנצפו אקסונים ו cilia החיים C. elegans ללא ניתוח. בשיטה זו ניתן ליישם את ההתבוננות בכל מולקולה מטען תאים על-ידי שינוי החלבונים היעד ו/או את התאים שהם באים לידי ביטוי. חלבונים הבסיסיות ביותר כגון המנועים המולקולריים, מתאם חלבונים המעורבים: אי ולהזמנת עצב נשמרים C. elegans. בהשוואה לאורגניזמים אחרים מודל, מוטציות יכול להיות שהושג ומתוחזק בקלות רבה יותר C. elegans. שילוב של שיטה זו עם מוטציות C. elegans שונים יכול להבהיר את המנגנונים המולקולריים תחבורה עצב,: אי.

תחבורה עצב בנוירונים DA9 באמצעות קו wyIs251 , anterograde והן רטרוגרדית עצב התעבורה של GFP::RAB-3 ניתן במקביל להקליט בנוירון מוטורי DA9. המהירות הממוצעת של anterograde ותעבורה רטרוגרדית ב- proximal הגבי הפעולה באקסון של הנוירון DA9 הוא כ 1.8 ו- 2.6 μm/s, בהתאמה22. המספר של שלפוחית בתנועה הוא 0.03 ועל 0.018 לכל μm של האקסון לכל s. לפיכך, עבור אבחנה s 30 של 10 μm של האקסון DA9 באמצעות עדשה 100 x, אפשר למצוא כ 9 ו-5 לגור שלפוחית הפעולה באקסון (איור 4 ו- 1 סרט). אם אין תנועה vesicular יכול להיות שנצפו, זה אפשרי כי עוצמת הלייזר הוא חלש מדי. בנוסף ריצות ארוכות טווח, ניתן קצרת-טווח התנועה של שלפוחית בריכות מוקלט (1 סרטים). כמה שלפוחית עוצרים ובבריכות שלפוחית, בעוד אחרים מביצועם שם7,23. פרמטרים אלה ניתן, יש להשתמש בה כדי לנתח פנוטיפים מוטציה.
: אי בנוירונים זנב Cilia המותאמות לשפה הקצה של דנדריטים ב- C. elegans (איור 2B). המתח mnIs17 מבטא GFP מתויג OSM-6, אחד של subunits: אי29. OSM-6 מתבטאת בשני ראש וזנב נוירונים19. בעוד cilia ראש רבים מסומנים על-ידי mnIs17, רק שני cilia הם בבירור נצפו נוירון הזנב. לפיכך, התבוננות cilia אלה קל יותר cilia ראש (ראה גם הדיון). OSM-6::GFP הוא מפוזר בציטופלסמה עצביים כגון כי מצאה האקסון, תאי הגוף ועל דנדריט. עם זאת, ב- cilia, OSM-6::GFP מרוכז cilia, שולבו רדיואקטיבי. האורך של cilia פא ו PHB הם בערך 6.5 μm. : אי Anterograde הוא 8,biphasic9. מהירות anterograde: אי היא על 0.7 ו- 1.3 μm/s המקטעים האמצעי של cilia, בהתאמה (איור 5 ו 2 סרט).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56690/56690fig1.jpg"> 
איור 1 : הפגנה של הכנת המדגם. (א) חם DW, פסטר pipet ו- 10% agarose בבלוק חום. (B ו- C) הכנת agarose רפידות: רכיב pad agarose נוצר בין שקופיות (B). השקופית העליונה מוסרת לאחר טפסים pad agarose (ג). שרטוט מציג פתרון חרוז איך פוליסטירן סכמטי (D) הוא לשים על משטח agarose. שרטוט מציג איך שמים תולעים הפתרון חרוז פוליסטירן באמצעות חוט פלטינה סכמטי (E) לבחור. Coverslip (F) א (22 x 44 מ מ2) הוא לשים על משטח agarose. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56690/56690fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56690/56690fig2.jpg"> 
איור 2 : הדמיה באזור. (א) שרטוט סכמטי של נוירונים DA9 ואת VA12 ואת תמונת הנציגה של wyIs251. בנוירונים DA9, האקסון הגחון, commissure ו- proximal האקסון אינו חייב הסינפסות בוגרת. שלפוחית סינפטית מבשרי הם מועברים בגוף התא אל הסינפסות דרך אזורים אלה עצב. האזור להתייחס מוצג באמצעות תיבות. (B) שרטוט סכמטי של נוירונים פא ו PHB ו- cilia שלהם. האזור להתייחס מוצג באמצעות תיבות. סרגל קנה מידה = 10 μm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56690/56690fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56690/56690fig3.jpg"> 
איור 3 : דור של סרטים, kymographs באמצעות תוכנה פיג'י. (א) לחץ על הלחצן "בחירה מלבנית" (חץ), בחר את אזור אחד הייתי רוצה להתמקד על ידי ציור מלבן (תיבת צהוב) כדי ליצור substacks. (B) לחץ על לחצן קו מקוטע (חץ) וצייר קו מקוטע לאורך cilia משתמש בעכבר (קו צהוב). (ג) בחר 'נתח', "רב Kymograph" ואת "רב Kymograph" כדי להפעיל את תוסף ליצירת kymographs. (S) linewidth קלט, לחץ על "אישור" ולהפיק kymographs (איור 5 , איור 7). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56690/56690fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56690/56690fig4.jpg"> 
איור 4 : Kymograph נציג התחבורה עצב של שלפוחית סינפטית מבשרי. GFP::RAB-3 תנועה נצפית על האזור asynaptic הפרוקסימלית של נוירון DA9, kymograph נוצר עם ריבוי Kymograph של פיג'י. אופקי ואנכי העמודות מייצגות אורך וזמן, בהתאמה. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56690/56690fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56690/56690fig5.jpg"> 
איור 5 : Kymograph הנציגה של: אי. OSM-6::GFP הוא ציין cilia פא ו PHB, kymograph הזה נוצר מתוך האירוע סחר של אחד מהם. Kymograph נוצר עם ריבוי Kymograph של פיג'י. אופקי ואנכי העמודות מייצגות אורך וזמן, בהתאמה. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56690/56690fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/56690/56690movie1.jpg"> 
סרט 1: הסרט נציג התחבורה עצב של שלפוחית סינפטית מבשרי. GFP::RAB-3 תנועה נצפית על האזור asynaptic הפרוקסימלית של הנוירון DA9. GFP::RAB-3 שולבו מבשרי שלפוחית סינפטית, מועבר. Anterograde ותעבורה עצב רטרוגרדית נרשמים. שלפוחית יש להפסיק אך מחדש שוב. הסרט הוקלט ב 4 מסגרות לשנייה ומחזות -מסגרות/ס' 15 סרוקle בר = 5 μm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56690/movie1.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)</a>
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/56690/56690Movie2.jpg"> 
סרט 2: סרט נציג של: אי. OSM-6::GFP הוא ציין cilia פא ו PHB. OSM-6::GFP הוא שולב: אי. מורכבים ועובר לאורך cilia. הסרט הוקלט ב 4 מסגרות לשנייה ומחזות בבר סולם מסגרות/ס' 15 = 5 μm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56690/Movie2.mov" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons at JoVE.com

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans (C. elegans) הוא מודל טוב ללמוד תחבורה עצב, תאיים. . הנה, אני מתארת פרוטוקול ויוו הקלטה וניתוח התחבורה עצב, intraflagellar C. elegans.

קיבעון של Caenorhabditis elegans לנתח להובלה תאיים בנוירונים

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

immobilization-caenorhabditis-elegans-to-analyze-intracellular

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

8.0K Views.  Tohoku University. Caenorhabditis elegans (C. elegans) הוא מודל טוב ללמוד תחבורה עצב, תאיים. . הנה, אני מתארת פרוטוקול ויוו הקלטה וניתוח התחבורה עצב, intraflagellar C. elegans.

Video: Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for the targeted expression of genetically encoded calcium sensors. This protocol outlines the use of these sensors for the in vivo imaging of calcium dynamics in targeted cells, specifically the body wall muscles of the worms. By utilizing the co-expression of presynaptic channelrhodopsin, stimulation of acetylcholine release from excitatory motor neurons can be induced using blue light pulses, resulting in muscle depolarization and reproducible changes in cytoplasmic calcium levels. Two worm immobilization techniques are discussed with varying levels of difficulty. Comparison of these techniques demonstrates that both approaches preserve the physiology of the neuromuscular junction and allow for the reproducible quantification of calcium transients. By pairing optogenetics and functional calcium imaging, changes in postsynaptic calcium handling and homeostasis can be evaluated in a variety of mutant backgrounds. Data presented validates both immobilization techniques and specifically examines the roles of the C. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase and the calcium-activated BK potassium channel in the body wall muscle calcium regulation.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

This method provides a way to couple optogenetics and genetically encoded calcium sensors to image baseline cytosolic calcium levels and changes in evoked calcium transients in the body wall muscles of the model organism C. elegans.

בשנת הדמיה Vivo סידן בג. אלגיה שרירי הגוף

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Biochemistry

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

בהדמיה עצבית סיד vivo ב C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Neuroscience

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological conditions. Post-mitotic neurons represent a major cell type affected by aging. Although multiple mammalian models of neuronal aging exist, they are challenging and expensive to establish. The roundworm Caenorhabditis elegans is a powerful model to study neuronal aging, as these animals have short lifespan, an available robust genetic toolbox, and well-cataloged nervous system. The method presented herein allows for seamless isolation of specific cells based on the expression of a transgenic green fluorescent protein (GFP). Transgenic animal lines expressing GFP under distinct, cell type-specific promoters are digested to remove the outer cuticle and gently mechanically disrupted to produce slurry containing various cell types. The cells of interest are then separated from non-target cells through fluorescence-activated cell sorting, or by anti-GFP-coupled magnetic beads. The isolated cells can then be cultured for a limited time or immediately used for cell-specific ex vivo analyses such as transcriptional analysis by real time quantitative PCR. Thus, this protocol allows for rapid and robust analysis of cell-specific responses within different neuronal populations in C. elegans.

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for simple isolation of specific groups of live neuronal cells expressing green fluorescent protein from transgenic Caenorhabditis elegans lines. This method enables a variety of ex vivo studies focused on specific neurons and has the capacity to isolate cells for further short-term culturing.

בידוד אוכלוסיות מסוימות של תא העצב מתוך האלאנים

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Microchambers agarose לסידן הדמיה לטווח ארוך של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

שבב מיקרופלואידי פשוט לגדילה והדמיה ארוכת טווח של Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...

Bioengineering

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

Excitotoxic necrosis is a leading form of neurodegeneration. This process of regulated necrosis is triggered by the synaptic accumulation of the neurotransmitter glutamate, and the excessive stimulation of its postsynaptic receptors. However, information on the subsequent molecular events that culminate in the distinct neuronal swelling morphology of this type of neurodegeneration is lacking. Other aspects, such as changes in specific subcellular compartments, or the basis for the differential cellular vulnerability of distinct neuronal subtypes, remain under-explored. Furthermore, a range of factors that come into play in studies that use in vitro or ex vivo preparations might modify and distort the natural progression of this form of neurodegeneration. It is therefore important to study excitotoxic necrosis in live animals by monitoring the effects of interventions that regulate the extent of neuronal necrosis in the genetically amenable and transparent&#160;model system of the nematode Caenorhabditis elegans. This protocol describes methods of studying excitotoxic necrosis in C. elegans neurons, combining optical, genetic, and molecular analysis. To induce excitotoxic conditions in C. elegans, a&#160;knockout of a glutamate transporter gene (glt-3) is combined with a neuronal sensitizing genetic background (nuls5 [Pglr-1::G&#945;S(Q227L)]) to produce glutamate receptor hyperstimulation and neurodegeneration. Nomarski differential interference contrast (DIC), fluorescent, and confocal microscopy in live animals are methods used to quantify neurodegeneration, follow subcellular localization of fluorescently labeled proteins, and quantify mitochondrial morphology in the degenerating neurons. Neuronal Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) is used to distinctly sort at-risk neurons for cell-type specific transcriptomic analysis of neurodegeneration. A combination of live imaging and FACS methods as well as the benefits of the C. elegans model organism allow researchers to leverage this system to obtain reproducible data with a large sample size. Insights from these assays could translate to novel targets for therapeutic intervention in neurodegenerative diseases.

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

In a C. elegans excitotoxicity model, this protocol employs in vivo imaging to analyze the regulation of necrotic neurodegeneration, the effect of genes encoding candidate mediators, and involvement of mitochondria. Cell dissociation and sorting is used to specifically obtain at-risk neurons for cell-specific transcriptomic analysis of neurodegeneration and neuroprotection mechanisms.

Excitotoxic necrosis is a leading form of neurodegeneration. This process of regulated necrosis is triggered by the synaptic accumulation of the ...

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed orientation. Here we describe methods to label, image, and analyze the microtubule dynamics and growth during the development and regeneration of touch neurons in C. elegans. Using genetically encoded fluorescent reporters of microtubule tips, we imaged the axonal microtubules. The local changes in microtubule behavior that initiates axon regeneration following axotomy can be quantified using this protocol. This assay is adaptable to other neurons and genetic backgrounds to investigate the regulation of microtubule dynamics in various cellular processes.

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

A protocol for imaging the dynamic microtubules in vivo using fluorescently labeled End binding protein has been presented. We described the methods to label, image, and analyze the dynamic microtubules in the Posterior lateral microtubule (PLM) neuron of C. elegans.

In vivo הערכה של מיקרוטובולה דינמיקה והתמצאות ב Caenorhabditis elegans נוירונים

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a crucial component of intracellular signaling. The visualization of subcellular Ca2+ dynamics in vivo,&#160;where neurons can be studied in their native, intact circuitry, has proven technically challenging in complex nervous systems. The transparency and relatively simple nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans enable the cell-specific expression and in vivo visualization of fluorescent tags and indicators. Among these are fluorescent indicators that have been modified for use in the cytoplasm as well as various subcellular compartments, such as the mitochondria. This protocol enables non-ratiometric Ca2+ imaging in vivo with a subcellular resolution that permits the analysis of Ca2+ dynamics down to the level of individual dendritic spines and mitochondria. Here, two available genetically encoded indicators with different Ca2+ affinities are used to demonstrate the use of this protocol for measuring relative Ca2+ levels within the cytoplasm or mitochondrial matrix in a single pair of excitatory interneurons (AVA). Together with the genetic manipulations and longitudinal observations possible in C. elegans, this imaging protocol may be useful for answering questions regarding how Ca2+ handling regulates neuronal function and plasticity.

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

The current methods describe a non-ratiometric approach for high-resolution, sub-compartmental calcium imaging in vivo in Caenorhabditis elegans using readily available genetically encoded calcium indicators.

הדמיה תת-תאית של טיפול בסידן עצבי ב-Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

הקמה והפעלה של שלב קירור לשיתוק C. elegans בהמוניהם

Assembly and Operation of a Cooling Stage to Immobilize C. elegans on Their Culture Plates

High-resolution in vivo microscopy approaches can reveal subtle information and fine details inside the model animal Caenorhabditis elegans (C. elegans), but require strong animal immobilization to prevent motion blur in the images. Unfortunately, most current immobilization techniques require substantial manual effort, rendering high-resolution imaging low-throughput. Immobilization of C. elegans is greatly simplified by using a cooling approach that can easily immobilize entire populations directly on their cultivation plates. The cooling stage can establish and maintain a wide range of temperatures with a uniform distribution on the cultivation plate. In this article, the whole process of building the cooling stage is documented. The aim is that a typical researcher can build an operational cooling stage in their laboratory following this protocol without difficulty. Utilization of the cooling stage following three protocols is shown, and each protocol has advantages for different experiments. Also shown is an example cooling profile of the stage as it approaches its final temperature and some helpful tips in using cooling immobilization.

מחבר זרקור: הרכבה והפעלה של במת קירור כדי לשתק C. elegans על צלחות התרבות שלהם  

This paper describes protocols for constructing and operating a cooling stage to immobilize C. elegans on their original cultivation plates en masse.

הרכבה והפעלה של במת קירור כדי לשתק C. elegans על צלחות התרבות שלהם

High-resolution in vivo microscopy approaches can reveal subtle information and fine details inside the model animal Caenorhabditis elegans (C. elegans), ...

קיבעון של Caenorhabditis elegans לנתח להובלה תאיים בנוירונים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

בשנת הדמיה Vivo סידן בג. אלגיה שרירי הגוף

בהדמיה עצבית סיד vivo ב C. elegans

בידוד אוכלוסיות מסוימות של תא העצב מתוך האלאנים

Microchambers agarose לסידן הדמיה לטווח ארוך של

שבב מיקרופלואידי פשוט לגדילה והדמיה ארוכת טווח של Caenorhabditis elegans

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

In vivo הערכה של מיקרוטובולה דינמיקה והתמצאות ב Caenorhabditis elegans נוירונים

הדמיה תת-תאית של טיפול בסידן עצבי ב-Vivo

הרכבה והפעלה של במת קירור כדי לשתק C. elegans על צלחות התרבות שלהם

הרכבה והפעלה של במת קירור כדי לשתק C. elegans על צלחות התרבות שלהם