Questo protocollo consente l'isolamento, la coltivazione e l'interrogatorio senza soluzione di continuità delle risposte trascrizionale in una specifica discendenza cellulare da C.elegans. Il vantaggio principale di questo protocollo è l'alto livello di adattabilità alle diverse fasi di vita dei worm o dei tipi di cellule specifiche da isolare. A dimostrare la procedura saremo io e Nataliya Zahayko, una tecnico del nostro laboratorio.
Dopo aver raccolto gli animali, centrifugarli a 1600 volte g per cinque minuti. Rimuovere tutti i supernatanti e rimescolare i vermi in un millilitro di mezzi M9. Trasferire la sospensione su un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri.
Centrifuga a 1600 volte g per cinque minuti per pellettare i vermi. Quindi aggiungere 200 microlitri di tampone SDS-DTT e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. I vermi dovrebbero ora apparire rugosi lungo il corpo se visti al microscopio leggero.
Quindi, aggiungere 800 microlitri di tampone di isolamento ghiacciato e mescolare facendo scorrere delicatamente il tubo. Centrifuga a 13.000 volte g e a quattro gradi Celsius per un minuto per pellettare i vermi. Rimuovere il supernatante e lavare con un millilitro di tampone di isolamento.
Ripetere il processo di centrifugazione e lavaggio per un totale di cinque volte, assicurandosi di rimuovere con cura il tampone di isolamento ogni volta. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di miscela di proteasi da Streptomyces griseus, sciolti in tampone di isolamento, al pellet. Incubare a temperatura ambiente per 10-15 minuti, assicurandosi di applicare interruzioni meccaniche tubazioni su e giù da 60 a 70 volte con una punta in micropipetta da 200 microliter contro il fondo del tubo.
Per determinare lo stadio della digestione, rimuovere da uno a cinque microlitri della miscela di digestione, lasciarlo cadere su uno scivolo di vetro e ispezionarlo utilizzando un microscopio a coltura tissutale. Dopo cinque o sette minuti, i frammenti di verme dovrebbero avere una cuticola visibilmente ridotta e un liquame di cellule sarà facilmente visibile. Fermare la reazione aggiungendo 900 microlitri del mezzo L-15 di Leibovitz disponibile in commercio, integrato con 10%FBS e penicillina-streptomicina.
Centrifuga a 10.000 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti per pellet frammenti isolati e cellule. Lavare le celle pellettate altre due volte con mezzi integrati L-15 freddi utilizzando un millilitro di supporto per lavaggio. Resopend le cellule pellettate in un millilitro di L-15 supporti integrati, e lasciare sul ghiaccio per 30 minuti.
Quindi prendere lo strato superiore, che è di circa 700-800 microlitri, e trasferirlo in un tubo di microcentrifugo. Utilizzare un contatore di celle automatizzato o un emacitometro per misurare la densità cellulare da 10 a 25 microlitri di cellule isolate. Centrifugare le cellule dalla sospensione cellulare isolata a 10.000 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti.
Scartare il supernatante e rimescolare le cellule pellettate in L-15 integrato medio a una densità cellulare non superiore a sei milioni di cellule per millilitro per evitare di sovraccaricare il citometro di flusso. Quindi, ordinare le celle in base all'espressione positiva della GFP usando un citometro di flusso in grado di ordinare i campioni. Le celle negative GFP possono essere utilizzate come controllo per l'analisi non specifica del tipo di cella.
Dopo questo, placcare le cellule isolate nei pozzi di una piastra sterile a sei pozzi, posizionare la piastra in un contenitore di plastica, aggiungere una salvietta umida o carta dei tessuti molli per aggiungere umidità alle cellule e incubare a 20 gradi Celsius. Centrifugare le cellule dalla sospensione cellulare isolata in un tubo di microcentrifugo privo di RNasi da 1,5 millilitri a 10.000 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Utilizzando una micropipetta, rimuovere il supernatante e aggiungere 100 microlitri di mezzo M9 per lavare via il mezzo integrato L-15.
Quindi, centrifugare le cellule a 10.000 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti e rimuovere il supernatante. Ripetere questo processo di lavaggio e centrifugazione tre volte il totale per assicurarsi che tutti i supporti vengano rimossi, assicurandosi di rimuovere con cura il supernatante ogni volta. Quindi, aggiungere un millilitro di soluzione di isotiocianato di fenolo e guanidina alle cellule e pipettare la sospensione su e giù con attenzione.
Incubare la miscela a temperatura ambiente per cinque minuti. Successivamente, aggiungere 250 microlitri di cloroformio e invertire delicatamente il tubo da 15 a 20 volte. Incubare a temperatura ambiente per cinque minuti.
Centrifuga a 10.000 volte g e a 25 gradi Celsius per cinque minuti. Utilizzare una micropipetta per rimuovere con cura la maggior parte possibile dello strato acquoso superiore, assicurandosi di non disturbare gli strati organici inferiori. Trasferire lo strato inferiore su un nuovo tubo di microcentrifugo privo di RNasi da 1,5 millilitri.
Al nuovo tubo aggiungere 500 microlitri di isopropanolo e mescolare invertendo il tubo. Incubare questa soluzione a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi centrifugare il tubo a 14.000 volte g e a 25 gradi Celsius per 20 minuti.
Posizionare i campioni sul ghiaccio e utilizzare una micropipetta per rimuovere il più possibile l'isopropanolo. Aggiungere delicatamente un millilitro di 70% di etanolo in acqua distillata doppia senza RNasi al tubo applicandolo sul lato del tubo. Centrifuga a 10.000 volte g e a 25 gradi Celsius per cinque minuti.
Rimuovere la maggior parte dell'etanolo e lasciare asciugare l'aria del tubo sul ghiaccio per tre o cinque minuti. Successivamente, aggiungere da 15 a 20 microlitri di acqua distillata doppia senza RNasi. Utilizzare uno spettrofotometro a 260 nanometri per misurare la concentrazione e la purezza dell'RNA.
In questo studio, i neuroni colinergici unc-17:GFP-positivi vengono estratti e isolati dai c.elegans del nematode per successivi studi ex vivo. Il gene unc-17 è espresso in tutto il corpo C.elegans, e codici per un trasportatore transmembrana acetilcolina vescicolare. L'espressione di questo gene può essere osservata nei neuroni testa, midbody e coda, e nelle proiezioni neuronali.
Qui sono mostrate le micrografie rappresentative della fluorescenza dei neuroni unc-17:GFP-positivi dopo l'isolamento, così come un rispettivo controllo negativo da animali di tipo selvatico N2 non modificato. Le cellule isolate possono rimanere in vita fino a tre giorni se integrate con il mezzo L-15 di Leibovitz e il 10%FBS. I dati rappresentativi del qPCR dei neuroni colinergici che esprimono la GFP, così come le cellule muscolari che esprimono la GFP, sono mostrati qui.
Dopo aver smistato con successo le cellule, l'RNA viene isolato attraverso un metodo di isotiocianato di fenolo e guanidina, dopo di che il cDNA è stato prodotto utilizzando un kit di sintesi. L'espressione di geni colinergici specifici dei neuroni, tph-1, un idrossilasi triptofano, e snb-1, un trasportatore sinaptico di vescicola, è elevata in cellule isolate unc-17:GFP. Tuttavia, questa espressione non è presente nelle celle isolate di myo-3:GFP.
L'inverso è vero con l'espressione della trascrizione della catena miosina-pesante specifica del muscolo del mio-2, poiché l'espressione di questo gene è limitata alle cellule muscolari isolate, ma non alle cellule colinergiche isolate. È importante incubare completamente i vermi. Tuttavia, l'incubazione prolungata della cuticola del verme può causare la morte del verme o ulteriore stress per l'animale.
Dopo l'isolamento, le cellule possono essere coltivate per un certo periodo di tempo o utilizzate per l'isolamento dell'RNA e l'analisi qRT-PCR. I neuroni coltivati possono essere ulteriormente analizzati mediante misurazioni dell'elettroforesi del patch clamp. Questa tecnica potrebbe facilitare l'analisi ex vivo di gruppi specifici di cellule, contribuendo così a migliorare la nostra comprensione delle risposte specifiche delle cellule nel contesto degli organismi multicellulari in varie fasi del suo ciclo di vita.
Poiché durante questo esperimento vengono utilizzate sostanze chimiche come SDS e DTT, le procedure generali di sicurezza di laboratorio dovrebbero essere seguite durante la produzione e l'utilizzo di buffer.
