Name: immobilization of caenorhabditis elegans to analyze intracellular transport in neurons
Uploaded: 2017-10-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons at JoVE.com

El autor agradece profundamente Dr. Asako Sugimoto (Tohoku University) para su discusión útil. wyIs251 fue un generoso regalo del Dr. Kang Shen (Stanford University). mnIs17 fue proporcionado por la CGC, que es financiada por los NIH oficina de programas de infraestructura de investigación (P40 OD010440). Este trabajo fue apoyado por JSPS KAKENHI grant #17 H 05010 y #16 H 06536 y Daiichi Sankyo Fundación, Brain Science Foundation y la Fundación de Naito.

1. preparación de la muestra <ol><li>generar un transgénico C. elegans cepa de interés utilizando metodologías transgénicas 18. Por otra parte, obtener cepas adecuadas desde el centro de genética de Caenorhabditis (CGC). Para visualizar el transporte axonal de los precursores de la vesícula sináptica, utilice la línea transgénica wyIs251 [Pmig-13::gfp::rab-3] 7. Para observar el IFT, obtener la línea transgénica mnIs17 [osm-6::gfp] 19. Estas cepas se utilizan en el presente Protocolo. 
	Nota: Ya sea matriz Extracromosómica, integración genómica o incluso GFP knock-en obras. Para reducir las señales de fondo, uso de promotores específicos de células, en lugar de pan-neuronal promotores. 
	Nota: Mantenimiento de gusanos se describe en otros protocolos 20. Las cepas se mantuvieron en el césped de Escherischia coli OP50 alimentador sobre el crecimiento de nematodos placas de medio (NGM) (agarosa al 1,7% (w/v), 50 mM NaCl, 0,25% (w/v) peptona, 1 mM CaCl 2, 5 mg/mL de colesterol, 25 m m KH 2 PO 4, 1 mM MgSO 4 en platos de plástico de diámetro 60 mm) a 20 ° C.</li>
	<li>Crecer gusanos a 20 ° C en las placas de NGM a cualquier fase del ciclo de vida de los gusanos. 
	Nota: Se pueden observar transporte axonal y IFT en cualquier etapa. L4 tarde a adulto joven es un buen control positivo ya que varias publicaciones han utilizado estas etapas y visualizar tráfico eventos 14 , 21 , 22 , 23.</li>
</ol> 2. Preparación del 10% agarosa Nota: muchos proveedores ofrecen productos similares tales como agar, polvo de agar y agarosa. Utilizar la electroforesis en agarosa de grado (fuerza del gel &#62; 1200 g/cm 2). Polvos de agar baratos no funcionan porque el gel resultante no es lo suficientemente fuerte para inmovilizar gusanos.
<ol><li>Agarosa de 0.4 g de mezcla de 4 mL agua destilada (DW) en un tubo de vidrio (1,5 cm x 10,5 cm). Ponga una tapa en el tubo de vidrio para evitar la evaporación.</li>
	<li>Poner el tubo de vidrio en un bloque de calor de 95 ° C durante 90 minutos. Además, preparar otro tubo de vidrio (1,5 cm x 10,5 cm) llenado de DW y mantener a 95 ° C. poner una pipeta de Pasteur en la 95 ° C DW ( figura 1 A). Se verá un montón de pequeñas burbujas en el tubo de la agarosa y la solución debe ser turbia. Dejarlo hasta que la solución sea clara. Luego, mezclar mediante pipeteo arriba y abajo hasta que la solución de agarosa sea homogénea. 
	Nota: Microondas no pueden utilizarse para preparar la solución de agarosa de 10% cuando hace de DW y agarosa. Pequeñas burbujas causadas por microondas evitar fusión de agarosa. Sin embargo, gel de agarosa de 10% solidificado puede fácilmente derretir otra vez usando un microondas. Tubos de vidrio que contiene gel de agarosa de 10% pueden ser preparados antes de tiempo y almacenados a 4 ° C durante al menos 6 meses. Si al hacerlo, derretir el caldo usando un microondas cuando sea necesario y comenzar desde el paso 3 en el presente Protocolo. 
	Nota: Agarosa gradualmente pierde la capacidad de solidificarse si se incuban a 95 ° C durante mucho tiempo o después de repetidos solidificación y fusión. Si esto sucede, preparar nuevas 10% agarosa.</li>
</ol> 3. Preparación de agarosa almohadilla <ol><li>utilizando la pipeta Pasteur caliente preparada en el paso 2.2, colocar 2 gotas de 10% de agarosa sobre un portaobjetos de 76 x 22 mm.</li>
	<li>Rápidamente cubierta con un segundo portaobjetos de 76 x 22 mm 2 antes de la caída de la agarosa se solidifica como se muestra en la figura 1 B y empuje hacia abajo en la segunda diapositiva para aplanar la solución de agarosa. El espesor debe ser de 0.5-1 mm.</li>
	<li>Rápidamente Limpie la pipeta de Pasteur pipetas 95 ° C DW hacia arriba y hacia abajo hasta que la solución de agarosa es eliminada. De lo contrario, la pipeta que se obstruyen por gel de agarosa. Salir de la situación de la pipeta en la 95 ° C DW.</li>
	<li>Espere 1 minuto. La agarosa forma y se convierte en turbia. Luego, deslice el portaobjetos apartes a mano ( figura 1 C).</li>
</ol> 4. Montaje de gusanos Nota: incluso las pequeñas cantidades de movimiento de gusano evitar buena observación. Levamisol se ha utilizado tradicionalmente para prevenir el movimiento del gusano en la agarosa pad 24 , 25. Sin embargo, levamisol inhibe los receptores neuronales en C. elegans y por lo tanto puede afectar tráfico eventos en neuronas 15. Utilizando microbeads del poliestireno descrito hereis una buena alternativa 17.
<ol><li>Microscopio estéreo equipado con una transiluminación espejo desplazable, transferencia de ~ 30 gusanos transgénicos que expresan los marcadores adecuados a un nuevo NGM placa sin bacterias usando un alambre de platino selección. 
	Nota: Una selección de alambre de platino se hace del alambre de platino y pipeta de Pasteur (5 pulgadas), y la punta del alambre de platino fue aplanada. La preparación de las selecciones de alambre de platino y manejo de lombrices con éstos se describen en el Wormbook (http://www.wormbook.org).</li>
	<li>Deja la placa durante 1 minuto las bacterias se eliminan automáticamente de las superficies de gusanos como los gusanos se mueven en gel de agarosa NGM sin bacterias.</li>
	<li>Puso un 0.5-1.0 μL caída de 2,6% microesferas poliestireno del diámetro de 100 nm en el agua sobre el bloque de agar ( figura 1 D). Transferencia de 10-20 gusanos de la placa NGM libre de bacterias a las microesferas. Gusano de gota y propagación de los gusanos usando el alambre de platino selección para evitar la superposición de cuerpos ( figura 1 E).</li>
	<li>Aplique 2 cubreobjetos 22 x 40 mm ( figura 1 F). Presionar suavemente para eliminar burbujas de aire, pero evitar la trituración de gusanos. La muestra está ahora lista para la proyección de imagen de. 
	Nota: Porque anestesia no es administrado, gusanos se fijan sólo por la fuerza de fricción generada por la almohadilla agar microbeads del poliestireno y cubreobjetos 17. La presencia de bacterias de alimentador o demasiada solución hará más débil la fuerza friccional. 
	Nota: Diferentes tamaños de trabajo cubreobjetos (p. ej., 22 x 22 mm 2, 18 x 18 mm 2). Sin embargo, pueden prevenir el cubreobjetos mayor inmersión agua o aceite de la lente del objetivo que se escapa en las muestras durante la observación.</li>
</ol> 5. Observación Nota: parámetros apropiados de la proyección de imagen (energía del laser, ganancia, binning, etc.) serán diferente para cada sistema de microscopio y cámara. Aquí, se utiliza un microscopio de campo amplio equipado con un escáner confocal de disco giratorio y una cámara CCD digital.
<ol><li>Regular la temperatura de la etapa a 20 ° C, o ajustar la temperatura a 20 ° C.</li>
	<li>Colocar la corredera de la muestra sobre la platina del microscopio. Utilizar 100 x (apertura numérica = 1.3 o mejor) objetivo.</li>
	<li>Busca de las esferas indicadas en la figura 2 A (para wyIs251 y transporte axonal) o figura 2 B (para mnIs17 y IFT) como controles positivos . Otras áreas pueden ser analizadas como bien 22.</li>
	<li>Conjunto de parámetros (aumento de CCD = 200, Binning = 1 o 2, energía del laser a 488 nm = 1.0-1.3 mW). Realizar la grabación de lapso de tiempo en 4 cuadros/s hasta 1 min guardar archivos en formato TIFF de páginas múltiples. 
	Nota: Si GFP señales desaparecen y es difícil de seguir observando OSM-6::GFP o GFP::RAB-3 por 30 s, la potencia del láser es demasiado fuerte. En ese caso, reduzca la potencia del láser. Por el contrario, si no se registra ningún movimiento vesicular, la potencia del láser es demasiado débil. En ese caso, aumentar la energía del laser.</li>
	<li>Observar un gusano diferente y repetir 5.3 y 5.4. Las observaciones pueden durar hasta 20 minutos, pero cada gusano debe registrarse una sola vez para evitar los efectos de photo daños. 
	Nota: Los gusanos se han observado por al menos 20 min sin defectos importantes 7 , 27 , 28. Una observación más larga posible pero asilo &#39; t sido probado todavía. Una clara señal de la muerte neuronal es el cambio de morfología neuronal como hinchazón de la neurita. Como pueden verse las señales débiles de GFP en axones y dendritas en wyIs251 y mnIs17, neurite morfología puede comprobarse fácilmente mirando a axones o dendritas. Morfología neuronal se muestra en la figura 2.</li>
	<li>Generar archivos de película.
	<ol><li>Abrir el multi-TIFF archivo utilizando el software de Fiji. Ir a archivo &#62; abrir Seleccione el archivo multi-TIFF guardó en el paso 5.4. 
		Nota: Fiji se puede descargar en jttps://fiji.sc. Imagen J y plugins también pueden usarse para generar kymographs. Si al hacer esto, siga las instrucciones para el plugin solicitadas.</li> <li>, haga clic en el &#34; selección Rectangular &#34; botón ( figura 3, flecha) y seleccione el área de interés por dibujar un rectángulo con un ratón de ordenador (rectángulo amarillo en la figura 3 A). Ir a la imagen &#62; pilas &#62; herramientas &#62; Substacks y seleccione los números de segmento que se incluyen en la película. Se genera un substack.</li>
		<li>Activar la ventana de substack haciendo clic y vamos a imagen &#62; ajuste &#62; brillo y contraste. Aparece una ventana para ajustar el brillo y contraste. En la ventana, deslice la parte superior de la barra (mínimo) a la derecha para que la señal de fondo desaparece y el segundo superior de la barra (máximo) a la izquierda así que el movimiento de vesículas y partículas pueden verse bastante bien sobre el fondo.</li>
		<li>Vamos a imagen &#62; pilas &#62; tiempo matriz. Como la película se graba en 4 cuadros/s en el paso 5.4, el intervalo de tiempo es de 0.25 s. Así, tipo &#34; 0,25 &#34; en intervalo de.</li>
		<li>Generar un archivo de película seleccionando Guardar como &#62; AVI desde el menú de archivo (pelicula 1 y 2). 
		Nota: Mediante el uso de plugins apropiados, usted puede guardar el archivo como otros formatos tales como &#34; mpeg4 &#34; o &#34; mov &#34; archivos.</li>
	</ol></li> <li>Genere kymographs.
	<ol><li>Abra los archivos originales de la película utilizando otra vez el software de FIji y repita los pasos 5.6.2 y 5.6.3 para ajustar el brillo y contraste.</li>
		<li>Clic &#34; segmentado línea &#34; ( figura 3 B, flecha). Utilizando un ratón, dibuje una línea segmentada a lo largo de la cilia o axón (línea amarilla, en la figura 3 B).</li>
		<li>Ir a analizar &#62; Multi Kymograph &#62; Multi Kymograph ( figura 3 C). Aparece la ventana de ancho de línea ( figura 3 D). Tipo &#34; 3 &#34; en la ventana de grosor de línea y haga clic en Aceptar ( figura 3 D).</li>
		Se crea la ventana de kymograph de <li>. Guardar la imagen en formato TIFF o JPEG.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+motors+in+neurons:+transport+mechanisms+and+roles+in+brain+function,+development,+and+disease.">Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease.</a> Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).</li><li>Holzbaur, E. L., Scherer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules,+axonal+transport,+and+neuropathy.">Microtubules, axonal transport, and neuropathy.</a> N Engl J Med. 365 (24), 2330-2332 (2011).</li><li>Kamiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+of+axonemal+dyneins+as+studied+in+Chlamydomonas+mutants.">Functional diversity of axonemal dyneins as studied in Chlamydomonas mutants.</a> Int Rev Cytol. 219, 115-155 (2002).</li><li>Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraflagellar+transport+motors+in+cilia:+moving+along+the+cell's+antenna.">Intraflagellar transport motors in cilia: moving along the cell's antenna.</a> J Cell Biol. 180 (1), 23-29 (2008).</li><li>Rosenbaum, J. L., Witman, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraflagellar+transport.">Intraflagellar transport.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (11), 813-825 (2002).</li><li>Ishikawa, H., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliogenesis:+building+the+cell's+antenna.">Ciliogenesis: building the cell's antenna.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (4), 222-234 (2011).</li><li>Niwa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoinhibition+of+a+Neuronal+Kinesin+UNC-104/KIF1A+Regulates+the+Size+and+Density+of+Synapses.">Autoinhibition of a Neuronal Kinesin UNC-104/KIF1A Regulates the Size and Density of Synapses.</a> Cell Rep. 16 (8), 2129-2141 (2016).</li><li>Snow, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+anterograde+intraflagellar+transport+motors+cooperate+to+build+sensory+cilia+on+C.+elegans+neurons.">Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons.</a> Nat Cell Biol. 6 (11), 1109-1113 (2004).</li><li>Ou, G., Blacque, O. E., Snow, J. J., Leroux, M. R., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+coordination+of+intraflagellar+transport+motors.">Functional coordination of intraflagellar transport motors.</a> Nature. 436 (7050), 583-587 (2005).</li><li>Zhou, R., Niwa, S., Homma, N., Takei, Y., Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIF26A+is+an+unconventional+kinesin+and+regulates+GDNF-Ret+signaling+in+enteric+neuronal+development.">KIF26A is an unconventional kinesin and regulates GDNF-Ret signaling in enteric neuronal development.</a> Cell. 139 (4), 802-813 (2009).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charcot-Marie-Tooth+disease+type+2A+caused+by+mutation+in+a+microtubule+motor+KIF1Bbeta.">Charcot-Marie-Tooth disease type 2A caused by mutation in a microtubule motor KIF1Bbeta.</a> Cell. 105 (5), 587-597 (2001).</li><li>Niwa, S., Tanaka, Y., Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIF1Bbeta-+and+KIF1A-mediated+axonal+transport+of+presynaptic+regulator+Rab3+occurs+in+a+GTP-dependent+manner+through+DENN/MADD.">KIF1Bbeta- and KIF1A-mediated axonal transport of presynaptic regulator Rab3 occurs in a GTP-dependent manner through DENN/MADD.</a> Nat Cell Biol. 10 (11), 1269-1279 (2008).</li><li>Zhou, R., Niwa, S., Guillaud, L., Tong, Y., Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+motor,+KIF13A,+controls+anxiety+by+transporting+the+serotonin+type+1A+receptor.">A molecular motor, KIF13A, controls anxiety by transporting the serotonin type 1A receptor.</a> Cell Rep. 3 (2), 509-519 (2013).</li><li>Klassen, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Arf-like+small+G+protein,+ARL-8,+promotes+the+axonal+transport+of+presynaptic+cargoes+by+suppressing+vesicle+aggregation.">An Arf-like small G protein, ARL-8, promotes the axonal transport of presynaptic cargoes by suppressing vesicle aggregation.</a> Neuron. 66 (5), 710-723 (2010).</li><li>Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+microfluidic+devices+for+in+vivo+imaging+of+C.+elegans,+Drosophila+and+zebrafish.">Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish.</a> J Vis Exp. (67), (2012).</li><li>Chai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+cellular+dynamics+during+Caenorhabditis+elegans+postembryonic+development.">Live imaging of cellular dynamics during Caenorhabditis elegans postembryonic development.</a> Nat Protoc. 7 (12), 2090-2102 (2012).</li><li>Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+using+nanoparticle-mediated+immobilization.">Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization.</a> PLoS One. 8 (1), 53419 (2013).</li><li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection.">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. (18), (2008).</li><li>Collet, J., Spike, C. A., Lundquist, E. A., Shaw, J. E., Herman, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+osm-6,+a+gene+that+affects+sensory+cilium+structure+and+sensory+neuron+function+in+Caenorhabditis+elegans.">Analysis of osm-6, a gene that affects sensory cilium structure and sensory neuron function in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 148 (1), 187-200 (1998).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Niwa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nephronophthisis-related+gene+ift-139+is+required+for+ciliogenesis+in+Caenorhabditis+elegans.">The nephronophthisis-related gene ift-139 is required for ciliogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Sci Rep. 6, 31544 (2016).</li><li>Maeder, C. I., San-Miguel, A., Wu, E. Y., Lu, H., Shen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+neuron-wide+analysis+of+synaptic+vesicle+precursor+trafficking.">In vivo neuron-wide analysis of synaptic vesicle precursor trafficking.</a> Traffic. 15 (3), 273-291 (2014).</li><li>Wu, Y. E., Huo, L., Maeder, C. I., Feng, W., Shen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+balance+between+capture+and+dissociation+of+presynaptic+proteins+controls+the+spatial+distribution+of+synapses.">The balance between capture and dissociation of presynaptic proteins controls the spatial distribution of synapses.</a> Neuron. 78 (6), 994-1011 (2013).</li><li>Dwyer, N. D., Adler, C. E., Crump, J. G., L'Etoile, N. D., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+dendritic+transport+and+the+AP-1+mu1+clathrin+adaptor+UNC-101+localize+odorant+receptors+to+olfactory+cilia.">Polarized dendritic transport and the AP-1 mu1 clathrin adaptor UNC-101 localize odorant receptors to olfactory cilia.</a> Neuron. 31 (2), 277-287 (2001).</li><li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microsurgery+in+Caenorhabditis+elegans.">Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 107, 177-206 (2012).</li><li>Kumar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+Kinesin-3+motor+UNC-104/KIF1A+is+degraded+upon+loss+of+specific+binding+to+cargo.">The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo.</a> PLoS Genet. 6 (11), 1001200 (2010).</li><li>Zheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vesicle+protein+SAM-4+regulates+the+processivity+of+synaptic+vesicle+transport.">The vesicle protein SAM-4 regulates the processivity of synaptic vesicle transport.</a> PLoS Genet. 10 (10), 1004644 (2014).</li><li>Blacque, O. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WD+repeat-containing+protein+IFTA-1+is+required+for+retrograde+intraflagellar+transport.">The WD repeat-containing protein IFTA-1 is required for retrograde intraflagellar transport.</a> Mol Biol Cell. 17 (12), 5053-5062 (2006).</li><li>Evans, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+modulation+of+IFT+kinesins+extends+the+sensory+repertoire+of+ciliated+neurons+in+Caenorhabditis+elegans.">Functional modulation of IFT kinesins extends the sensory repertoire of ciliated neurons in Caenorhabditis elegans.</a> J Cell Biol. 172 (5), 663-669 (2006).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li><li>Bindels, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mScarlet:+a+bright+monomeric+red+fluorescent+protein+for+cellular+imaging.">mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging.</a> Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).</li><li>Prevo, B., Mangeol, P., Oswald, F., Scholey, J. M., Peterman, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+differentiation+of+cooperating+kinesin-2+motors+orchestrates+cargo+import+and+transport+in+C.+elegans+cilia.">Functional differentiation of cooperating kinesin-2 motors orchestrates cargo import and transport in C. elegans cilia.</a> Nat Cell Biol. 17 (12), 1536-1545 (2015).</li><li>Robison, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detyrosinated+microtubules+buckle+and+bear+load+in+contracting+cardiomyocytes.">Detyrosinated microtubules buckle and bear load in contracting cardiomyocytes.</a> Science. 352 (6284), 0659 (2016).</li><li>Hayashi, S., Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+superresolution+fluorescence+imaging+with+spinning+disk+confocal+microscope+optics.">Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics.</a> Mol Biol Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).</li></ol>

El autor no tiene nada que revelar.

Limitación con respecto a los métodos existentes El método descrito aquí está optimizado para observar eventos rápidas como transporte axonal y IFT. Así, la inmovilización se priorice más de incubación más largo. Aunque hemos podido observar eventos de tráfico por al menos 20 min sin perturbación significativa, este método no sea siempre conveniente observar eventos lentos que requieren más observaciones, como la elongación del axón y migración celular. Para más observaciones, es necesario optimizar las condiciones de reducir el porcentaje de la agarosa (es decir, aumentar el agua para evitar la desecación y reducción de la presión que potencialmente causa daño). Alternativamente, el dispositivo de microfluidos descrito15 o inmovilización de los gusanos usando anestesia y almohadillas de agarosa puede ser más conveniente16 mientras que los efectos secundarios deben ser cuidadosamente evaluados.
Pasos críticos en el protocolo Para la observación adecuada, los marcadores son críticos. Marcadores necesitan incorporarse a vesículas o partículas y ser de suficiente brillo. Pueden utilizarse matrices extracromosómicos o líneas integradas. Para la visualización del transporte axonal de los precursores de la vesícula sináptica en neuronas DA9, la cepa de wyIs251 es útil7,23. jsIs821 se ha utilizado para observar el transporte axonal en mechanosensory neuronas en algunos estudios26,27. Cuando se analizan otras neuronas, proteínas de vesículas sinápticas deben expresarse en las neuronas interesadas utilizando promotores específicos de la célula. Estos promotores deben ser lo suficientemente fuertes. RAB-3 y SNB-1 son ampliamente utilizados para etiquetar vesícula sináptica precursores22,23,26. Para observar el IFT, los componentes de lo complejo EIF deben etiquetarse. Como control positivo la cepa de mnIs17 es una buena opción29. Cilios de 8 celdas (ASE, ASG, ASI, ASL, ceniza, ASK, ADF y ADL) son agrupadas en la cabeza (amphid) mientras que los cilios de las 2 células (PHA y PHB) están incluidos en la cola (fantasmáticos). Porque OSM-6::GFP se expresa en todas las neuronas ciliadas en mnIs17, puede ser difícil de analizar el IFT en detalle en cabeza cilios. Sin embargo, en la región de la cola, sólo las neuronas PHA y PHB son etiquetadas y IFT en cada celda puede ser fácilmente resuelto. Otras proteínas IFT por proteínas fluorescentes pueden ser utilizados para observar IFT21,28. Si se desea analizar las neuronas cabeza, promotores específicos de la célula podría ser útiles. Mientras que los cilios cabeza tienen morfologías diferentes, transporte eventos pueden ser registrados29. Mediante el cruce de mutantes con estos marcadores, las funciones de cualquier genes en el transporte axonal y IFT pueden ser analizado en vivo. Se han descrito los parámetros que pueden ser analizados en el anterior trabajo22,23,26,27. GFP es la mejor opción y la primaria. mCherry y tdTomato pueden también ser usados22, sin embargo, es mucho más dévil que GFP mCherry. tdTomato es un dímero de tándem y más grande que las proteínas fluorescentes monoméricas, que a veces afecta a la dinámica de las proteínas de fusión30. Por lo tanto, los resultados deben ser analizados e interpretaron con cautela cuando se utiliza tdTomato. mScarlet, una proteína fluorescente roja monomérica brillante que recientemente se ha desarrollado, es una alternativa31.
Mientras giro microscopia confocal de disco es ampliamente utilizado para observar el transporte axonal y IFT7,21, el equipo es caro y puede ser de difícil acceso en algunos entornos de investigación. Sin embargo, estos fenómenos también pueden ser registrados y analizados en C. elegans utilizando microscopios fluorescentes estándar, si está equipado con lentes de alta NA, ya que C. elegans es un pequeño y transparente animal y fáciles de observar.
Aplicación en el futuro Por el método de inmovilización similar descrito aquí, IFT se observó en la resolución de molécula única en vivo32. Por otra parte, se han desarrollado varios tipos de microscopia de la estupendo-resolución. Uno puede aplicar directamente los métodos descritos aquí al análisis microscópico de la estupendo-resolución. En mi experiencia, el modo rápido de Airyscan33 funciona muy bien para analizar IFT. Teóricamente, un microscopio de súper-resolución disco de spinning (SDSRM) sería una buena opción como bien34. En conclusión, mediante la combinación de bibliotecas mutantes y estas nuevas técnicas, el método descrito aquí debería ser útil para aclarar los mecanismos moleculares del transporte axonal y IFT en vivo.

Proyección de imagen de células vivas es una herramienta esencial para el análisis de transporte intracelular. En biología de la célula neuronal, análisis de transporte axonal con proyección de imagen de células vivas son esenciales para la comprensión de la función y la morfogénesis neuronal1. Defectos en el transporte axonal subyacen varios neurodegenerativas trastornos2. Dynein y proteínas de Kinesin Superfamilia realicen transporte axonal anterogradely y retrogradely, respectivamente1,2.
Cilios son otro compartimento celular en el que la red de microtúbulos y tráfico de maquinaria son altamente desarrollada3. Maquinaria de síntesis de proteína no se localiza en los cilios, lo que significa que deberán transportarse ciliares proteínas desde el citoplasma a las puntas de los cilios. Cilios específicos quinesina y dineína, llamado kinesin-2 y citoplásmica dineína-2, respectivamente, el transporte de los componentes de los cilios4, en un fenómeno llamado Transporte intraflagelar (IFT)5. Deterioro de IFT causa un espectro de enfermedades llamadas ciliopathies6. Así, análisis del mecanismo IFT por proyección de imagen de células vivas es necesaria para entender los mecanismos básicos de formación ciliar y patogenia.
Elegans de Caenorhabditis (C. elegans) es un buen modelo para estudiar el transporte axonal y IFT7,8,9. Para observar el IFT, Chlamydomonas se ha utilizado ampliamente como un organismo modelo5,6. Chlamydomonas es un organismo unicelular, la relación de IFT con el envejecimiento, la función neuronal y comportamiento serían difícil de analizar. Además, no han aplicado técnicas genéticas esenciales como CRISPR/Cas9 a Chlamydomonas. En organismos más altos del modelo, tales como ratones y Drosophila, interrupción del transporte axonal y IFT a menudo causa fenotipos letal transporte axonal y IFT son esenciales para la morfogénesis y la homeostasis de los animales 10, 11. En el caso de ratones, transfección y el cultivo celular se necesita generalmente para observar el transporte axonal y IFT, que requiere muchas habilidades y tiempo extenso12,13. Además, se puede perder mucho del contexto fisiológico importante en líneas celulares y células cultivadas. Porque el sistema nervioso no es esencial para la supervivencia de las lombrices, se interrumpen los mutantes de C. elegans transporte axonal o IFT no son a menudo letales7,9,14. Transporte axonal y IFT pueden observarse directamente en vivo sin la disección ya que C. elegans es transparente y por lo tanto es fácil observar los marcadores etiquetados de GFP.
Hay varios protocolos para inmovilizar, C. elegans, como el uso de un dispositivo de microfluidos15, cojines de agarosa con anestesia16o17de microesferas. La inclusión de la anestesia puede inhibir los trata de personas eventos en neuronas15. Un claro inconveniente del método dispositivo de microfluidos es que preparar un dispositivo de microfluidos no siempre es fácil. En cambio, inmovilización por pastillas de agarosa y microesferas es una manera conveniente y fácil para realizar imágenes de lapso de tiempo en C. elegans. Aquí describo este protocolo básico para inmovilizar C. elegans y visualizar el transporte axonal y IFT en vivo en C. elegans. En comparación con los otros métodos, el método descrito aquí no requiere equipo especial y es mucho más barato y más fácil de realizar.

<table><tbody><tr><td>Slideglass (76&amp;nbsp; x 26 mm)</td><td>Matsunami</td><td>S1111</td><td></td></tr><tr><td>Coverglass (22&amp;nbsp; x 40 mm)</td><td>Matsunami</td><td>C024401</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Wako</td><td>318-01195</td><td></td></tr><tr><td>Polystylene microbeads 0.1 micron</td><td>Polysciences</td><td>#00876</td><td></td></tr><tr><td>Heat block</td><td>TAITEC</td><td>0063288-000</td><td>CTU-mini</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX-71</td><td>widefield microscope</td></tr><tr><td>Spinning disk Scanner</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-X1</td><td>spinning disc confocal scanner&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Digital CCD camera</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C10600-10B</td><td>ORCA-R2 degital CCD camera</td></tr><tr><td>Objective lens (x100, NA1.4)</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO 100XO</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipette (5 inch)</td><td>IWAKI</td><td>IK-PAS-5P</td><td></td></tr><tr><td>Glass tube (1.5 cm diameter x 10.5 cm)</td><td>IWAKI</td><td>9820TST15-105NP</td><td></td></tr><tr><td>TV9211: &lt;em&gt;wyIs251&lt;/em&gt;</td><td>Laboratory of Kang Shen</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>OTL11: &lt;em&gt;mnIs17&lt;/em&gt;</td><td>Ref. 27, 29</td><td>N/A</td><td>SP2101 was backcrossed with wild type for 6 times</td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>435064-9000-000</td><td>STEMI 508&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mirror transillumination unit</td><td>Carl Zeiss</td><td>435425-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>platinum wire (0.2 mm)</td><td>Nilaco Corporation</td><td>m78483501</td><td></td></tr><tr><td>60 mm plastic dish</td><td>Falcon</td><td>#351007</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>https://fiji.sc/</td></tr><tr><td>nematode growth medium (NGM)&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>1.7% (w/v) agarose, 50mM NaCl, 0.25% (w/v) Peptone, 1 mM CaCl2, 5 mg/mL Cholesterol, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

immobilization of caenorhabditis elegans to analyze intracellular transport in neurons

Transporte axonal y el Transporte intraflagelar (IFT) son esenciales para la función y la morfogénesis axon y cilios. Proteínas del superfamilia de quinesina y dineína son motores moleculares que regulan anterograde y retrógrada transporte, respectivamente. Estos motores utilizan redes de microtúbulos como rieles. Elegans de Caenorhabditis (C. elegans) es un organismo modelo de gran alcance para estudiar transporte axonal y IFT en vivo. Aquí describo un protocolo para observar el transporte axonal y IFT en la vida del C. elegans. Transporte de carga puede visualizarse por selección de proteínas de carga utilizando proteínas fluorescentes como la proteína verde fluorescente (GFP). C. elegans es transparente y proteínas GFP-tagged carga pueden expresarse en células específicas bajo promotores específicos de la célula. Gusanos vivos pueden ser fijos por microesferas en gel de agarosa de 10% sin matar o anestesiar los gusanos. En estas condiciones, movimiento de carga se puede observar directamente en los axones y cilios de la vida de C. elegans sin disección. Este método puede ser aplicado a la observación de cualquier molécula de carga en las células mediante la modificación de las proteínas de la blanco o las células que expresan. Proteínas básicas como motores moleculares y proteínas adaptadoras que intervienen en el transporte axonal y IFT se conservan en C. elegans. Comparado con otros organismos modelo, mutantes pueden ser obtenidos y mantiene más fácilmente en C. elegans. Combinando este método con varios mutantes de C. elegans puede aclarar los mecanismos moleculares del transporte axonal y IFT.

Transporte axonal de neuronas DA9 Utilizando la línea de wyIs251 , la anterógrada y el transporte axonal retrógrado de GFP::RAB-3 se puede grabar simultáneamente en la neurona de motor DA9. La velocidad media de anterograde y transporte retrógrado en el axón proximal dorsal de la neurona DA9 es aproximadamente 1,8 y 2,6 μm/s, respectivamente22. El número de vesículas móviles es 0.03 y 0.018 por μm del axón por s. Así, para una observación de s 30 de 10 μm de axón DA9 utilizando una lente de 100 x, se encuentra cerca de 9 y 5 movimiento de vesículas en el axón (figura 4 y 1 película). Si ningún movimiento vesicular puede ser observado, es posible que la potencia del láser es demasiado débil. Además de carreras de largo alcance, corto alcance movimiento de piscinas de vesícula puede ser registrado (película 1). Algunas vesículas paren en estas piscinas de vesícula, mientras que otros disocian de allí7,23. Estos parámetros se pueden supervisar y utilizar para analizar los fenotipos mutantes.
IFT en neuronas de cola Cilios se localizan en la punta de las dendritas en C. elegans (figura 2B). La cepa de mnIs17 expresa tagged GFP OSM-6, una de las subunidades IFT29. OSM-6 se expresa en ambos cabeza y cola de neuronas19. Mientras que muchos cilios cabeza están marcados por mnIs17, sólo dos cilios se observan claramente en la neurona de la cola. Así, observando estos cilios es más fácil que cabeza cilios (véase también). OSM-6::GFP es difuso en el citoplasma neuronal como el axón, cuerpo celular y dendrita. Sin embargo, cilios, 6::GFP OSM es concentrado en a cilios e incorporado en el movimiento de las partículas. La longitud de los cilios PHA y PHB son aproximadamente 6,5 μm. IFT Anterograde es bifásica 8,9. La velocidad de anterograde IFT es sobre 0,7 y 1,3 μm/s en los segmentos mediados y distales de los cilios, respectivamente (figura 5 y película 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56690/56690fig1.jpg"> 
Figura 1 : Demostración de la preparación de la muestra. (A) caliente DW, pipeta Pasteur y 10% de agarosa en el bloque de calor. (B y C) Preparación de las almohadillas de agarosa: se forma un cojín de agarosa entre diapositivas (B). La diapositiva superior se quita después forma un cojín de agarosa (C). (D) esquema dibujo mostrando cómo poliestireno solución grano se coloca en la almohadilla de agarosa. Dibujo que muestra cómo los gusanos se ponen en la solución de poliestireno del grano mediante un alambre de platino de esquemático de (E) escoger. (F) A cubreobjetos (22 x 44 mm2) se ponen en el teclado de la agarosa. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56690/56690fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56690/56690fig2.jpg"> 
Figura 2 : Área de la proyección de imagen. (A) dibujo esquemático del neuronas DA9 y VA12 y una imagen representativa de wyIs251. En DA9 las neuronas, el axón ventral comisura y axón proximal no tiene sinapsis maduritas. Pero los precursores de la vesícula sináptica se transportan desde el cuerpo celular a sinapsis a través de estas regiones axonales. Se muestra la región que debe ser observada por las cajas. (B) dibujo esquemático del PHA y PHB neuronas y sus cilios. Se muestra la región que debe ser observada por las cajas. Barra de escala = 10 μm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56690/56690fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56690/56690fig3.jpg"> 
Figura 3 : Generación de películas y kymographs utilizando el software de Fiji. (A) haga clic en el botón "Selección Rectangular" (flecha) y seleccione el área que uno quisiera concentrarse dibujando un rectángulo (caja amarilla) para generar substacks. (B) haga clic en el botón de línea segmentada (flecha) y trace una línea segmentada a lo largo de los cilios usando un ratón (línea amarilla). (C) seleccionar "Analizar", "Multi Kymograph" y "Multi Kymograph" para iniciar un plugin para generar kymographs. (S) grosor de línea de entrada, haga clic en "Aceptar" y generar kymographs (figura 5 y figura 7). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56690/56690fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56690/56690fig4.jpg"> 
Figura 4 : Kymograph representante de transporte axonal de los precursores de la vesícula sináptica. GFP::Rab-3 movimiento se observa en la región proximal de la asynaptic de DA9 neurona y la kymograph fue generado con Multi Kymograph de Fiji. Barras horizontales y verticales representan la longitud y tiempo, respectivamente. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56690/56690fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56690/56690fig5.jpg"> 
Figura 5 : Representante kymograph de IFT. OSM-6::GFP se observa en PHA y PHB cilios y esta kymograph se genera el evento trata de personas en cada una de ellas. El kymograph fue generado con Multi Kymograph de Fiji. Barras horizontales y verticales representan la longitud y tiempo, respectivamente. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56690/56690fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/56690/56690movie1.jpg"> 
1 de la película: película representativa del transporte axonal de los precursores de la vesícula sináptica. GFP::Rab-3 movimiento se observa en la región proximal de la asynaptic de la neurona DA9. GFP::Rab-3 se incorpora en precursores de la vesícula sináptica y transportado. Anterógrada y transporte axonal retrógrado se registran. Algunas vesículas pararan pero reiniciar de nuevo. La película fue grabada en 4 cuadros/s y los juegos en 15 fotogramas/s. Scale bar = 5 μm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56690/movie1.mp4" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)</a>
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/56690/56690Movie2.jpg"> 
2 de la película: película representativa de IFT. OSM-6::GFP se observa en cilios PHA y PHB. OSM-6::GFP se integra en el IFT complejo y se mueve a lo largo de los cilios. La película fue grabada en 4 cuadros/s y los juegos en la barra de escala de 15 fotogramas/s. = 5 μm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56690/Movie2.mov" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons at JoVE.com

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Elegans de Caenorhabditis (C. elegans) es un buen modelo para estudiar el transporte axonal e intracelular. Aquí describo un protocolo para el análisis del transporte axonal e intraflagelar en C. elegansy grabación en vivo .

Inmovilización de Caenorhabditis elegans para analizar el transporte intracelular en las neuronas

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

immobilization-caenorhabditis-elegans-to-analyze-intracellular

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

8.0K vistas.  Tohoku University. Elegans de Caenorhabditis (C. elegans) es un buen modelo para estudiar el transporte axonal e intracelular. Aquí describo un protocolo para el análisis del transporte axonal e intraflagelar en C. elegansy grabación en vivo .

Video: Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for the targeted expression of genetically encoded calcium sensors. This protocol outlines the use of these sensors for the in vivo imaging of calcium dynamics in targeted cells, specifically the body wall muscles of the worms. By utilizing the co-expression of presynaptic channelrhodopsin, stimulation of acetylcholine release from excitatory motor neurons can be induced using blue light pulses, resulting in muscle depolarization and reproducible changes in cytoplasmic calcium levels. Two worm immobilization techniques are discussed with varying levels of difficulty. Comparison of these techniques demonstrates that both approaches preserve the physiology of the neuromuscular junction and allow for the reproducible quantification of calcium transients. By pairing optogenetics and functional calcium imaging, changes in postsynaptic calcium handling and homeostasis can be evaluated in a variety of mutant backgrounds. Data presented validates both immobilization techniques and specifically examines the roles of the C. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase and the calcium-activated BK potassium channel in the body wall muscle calcium regulation.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

This method provides a way to couple optogenetics and genetically encoded calcium sensors to image baseline cytosolic calcium levels and changes in evoked calcium transients in the body wall muscles of the model organism C. elegans.

In Vivo Calcium Imaging en C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Investigación

Bioquímica

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

Formación de imágenes in vivo de calcio neuronal en C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Neurociencias

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological conditions. Post-mitotic neurons represent a major cell type affected by aging. Although multiple mammalian models of neuronal aging exist, they are challenging and expensive to establish. The roundworm Caenorhabditis elegans is a powerful model to study neuronal aging, as these animals have short lifespan, an available robust genetic toolbox, and well-cataloged nervous system. The method presented herein allows for seamless isolation of specific cells based on the expression of a transgenic green fluorescent protein (GFP). Transgenic animal lines expressing GFP under distinct, cell type-specific promoters are digested to remove the outer cuticle and gently mechanically disrupted to produce slurry containing various cell types. The cells of interest are then separated from non-target cells through fluorescence-activated cell sorting, or by anti-GFP-coupled magnetic beads. The isolated cells can then be cultured for a limited time or immediately used for cell-specific ex vivo analyses such as transcriptional analysis by real time quantitative PCR. Thus, this protocol allows for rapid and robust analysis of cell-specific responses within different neuronal populations in C. elegans.

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for simple isolation of specific groups of live neuronal cells expressing green fluorescent protein from transgenic Caenorhabditis elegans lines. This method enables a variety of ex vivo studies focused on specific neurons and has the capacity to isolate cells for further short-term culturing.

Aislamiento de poblaciones de neuronas específicas de Roundworm Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...

Biología del Desarrollo

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Microcámaras de agarosa para Imagen de calcio a largo plazo de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

Un chip microfluídico simple para el crecimiento a largo plazo y la obtención de imágenes de Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...

Bioingeniería

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

Excitotoxic necrosis is a leading form of neurodegeneration. This process of regulated necrosis is triggered by the synaptic accumulation of the neurotransmitter glutamate, and the excessive stimulation of its postsynaptic receptors. However, information on the subsequent molecular events that culminate in the distinct neuronal swelling morphology of this type of neurodegeneration is lacking. Other aspects, such as changes in specific subcellular compartments, or the basis for the differential cellular vulnerability of distinct neuronal subtypes, remain under-explored. Furthermore, a range of factors that come into play in studies that use in vitro or ex vivo preparations might modify and distort the natural progression of this form of neurodegeneration. It is therefore important to study excitotoxic necrosis in live animals by monitoring the effects of interventions that regulate the extent of neuronal necrosis in the genetically amenable and transparent&#160;model system of the nematode Caenorhabditis elegans. This protocol describes methods of studying excitotoxic necrosis in C. elegans neurons, combining optical, genetic, and molecular analysis. To induce excitotoxic conditions in C. elegans, a&#160;knockout of a glutamate transporter gene (glt-3) is combined with a neuronal sensitizing genetic background (nuls5 [Pglr-1::G&#945;S(Q227L)]) to produce glutamate receptor hyperstimulation and neurodegeneration. Nomarski differential interference contrast (DIC), fluorescent, and confocal microscopy in live animals are methods used to quantify neurodegeneration, follow subcellular localization of fluorescently labeled proteins, and quantify mitochondrial morphology in the degenerating neurons. Neuronal Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) is used to distinctly sort at-risk neurons for cell-type specific transcriptomic analysis of neurodegeneration. A combination of live imaging and FACS methods as well as the benefits of the C. elegans model organism allow researchers to leverage this system to obtain reproducible data with a large sample size. Insights from these assays could translate to novel targets for therapeutic intervention in neurodegenerative diseases.

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

In a C. elegans excitotoxicity model, this protocol employs in vivo imaging to analyze the regulation of necrotic neurodegeneration, the effect of genes encoding candidate mediators, and involvement of mitochondria. Cell dissociation and sorting is used to specifically obtain at-risk neurons for cell-specific transcriptomic analysis of neurodegeneration and neuroprotection mechanisms.

Excitotoxic necrosis is a leading form of neurodegeneration. This process of regulated necrosis is triggered by the synaptic accumulation of the ...

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed orientation. Here we describe methods to label, image, and analyze the microtubule dynamics and growth during the development and regeneration of touch neurons in C. elegans. Using genetically encoded fluorescent reporters of microtubule tips, we imaged the axonal microtubules. The local changes in microtubule behavior that initiates axon regeneration following axotomy can be quantified using this protocol. This assay is adaptable to other neurons and genetic backgrounds to investigate the regulation of microtubule dynamics in various cellular processes.

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

A protocol for imaging the dynamic microtubules in vivo using fluorescently labeled End binding protein has been presented. We described the methods to label, image, and analyze the dynamic microtubules in the Posterior lateral microtubule (PLM) neuron of C. elegans.

In vivo Evaluación de la dinámica y orientación de los microtúbulos en las neuronas caenorhabditis elegans

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a crucial component of intracellular signaling. The visualization of subcellular Ca2+ dynamics in vivo,&#160;where neurons can be studied in their native, intact circuitry, has proven technically challenging in complex nervous systems. The transparency and relatively simple nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans enable the cell-specific expression and in vivo visualization of fluorescent tags and indicators. Among these are fluorescent indicators that have been modified for use in the cytoplasm as well as various subcellular compartments, such as the mitochondria. This protocol enables non-ratiometric Ca2+ imaging in vivo with a subcellular resolution that permits the analysis of Ca2+ dynamics down to the level of individual dendritic spines and mitochondria. Here, two available genetically encoded indicators with different Ca2+ affinities are used to demonstrate the use of this protocol for measuring relative Ca2+ levels within the cytoplasm or mitochondrial matrix in a single pair of excitatory interneurons (AVA). Together with the genetic manipulations and longitudinal observations possible in C. elegans, this imaging protocol may be useful for answering questions regarding how Ca2+ handling regulates neuronal function and plasticity.

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

The current methods describe a non-ratiometric approach for high-resolution, sub-compartmental calcium imaging in vivo in Caenorhabditis elegans using readily available genetically encoded calcium indicators.

Imágenes subcelulares del manejo neuronal del calcio in vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Construcción y operación de una etapa de enfriamiento para inmovilizar C. elegans en masa

Assembly and Operation of a Cooling Stage to Immobilize C. elegans on Their Culture Plates

High-resolution in vivo microscopy approaches can reveal subtle information and fine details inside the model animal Caenorhabditis elegans (C. elegans), but require strong animal immobilization to prevent motion blur in the images. Unfortunately, most current immobilization techniques require substantial manual effort, rendering high-resolution imaging low-throughput. Immobilization of C. elegans is greatly simplified by using a cooling approach that can easily immobilize entire populations directly on their cultivation plates. The cooling stage can establish and maintain a wide range of temperatures with a uniform distribution on the cultivation plate. In this article, the whole process of building the cooling stage is documented. The aim is that a typical researcher can build an operational cooling stage in their laboratory following this protocol without difficulty. Utilization of the cooling stage following three protocols is shown, and each protocol has advantages for different experiments. Also shown is an example cooling profile of the stage as it approaches its final temperature and some helpful tips in using cooling immobilization.

Autor destacado: Montaje y operación de una etapa de enfriamiento para inmovilizar C. elegans en sus placas de cultivo  

This paper describes protocols for constructing and operating a cooling stage to immobilize C. elegans on their original cultivation plates en masse.

Montaje y operación de una etapa de enfriamiento para inmovilizar C. elegans en sus placas de cultivo

High-resolution in vivo microscopy approaches can reveal subtle information and fine details inside the model animal Caenorhabditis elegans (C. elegans), ...

Inmovilización de Caenorhabditis elegans para analizar el transporte intracelular en las neuronas

Resumen

Explorar más videos

Capítulos en este video

In Vivo Calcium Imaging en C. elegans Body Wall Muscles

Formación de imágenes in vivo de calcio neuronal en C. elegans

Aislamiento de poblaciones de neuronas específicas de Roundworm Caenorhabditis elegans

Microcámaras de agarosa para Imagen de calcio a largo plazo de

Un chip microfluídico simple para el crecimiento a largo plazo y la obtención de imágenes de Caenorhabditis elegans

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

In vivo Evaluación de la dinámica y orientación de los microtúbulos en las neuronas caenorhabditis elegans

Imágenes subcelulares del manejo neuronal del calcio in vivo

Montaje y operación de una etapa de enfriamiento para inmovilizar C. elegans en sus placas de cultivo

Montaje y operación de una etapa de enfriamiento para inmovilizar C. elegans en sus placas de cultivo