Riconosciamo Hannah Fox per aiuto nella preparazione di questo manoscritto. Questo lavoro è stato supportato dal NIH concedere R01AI030612.

1. colture cellulari, infezione virale e l'EdC etichettatura ( Figura 1) il seguente protocollo coinvolge funzionare con virus. Fare riferimento al proprio Istituto &#39; protocolli di biosicurezza di s per quanto riguarda la manipolazione sicura di virus e altri agenti biologici. Questo protocollo è stato approvato da Institutional Review Board dell'Università di Pittsburgh.
<ol><li>Tripsinizzano un pallone di coltura tissutale 2 cm 150 confluenti di cellule MRC-5 e trasferire le cellule ad una piastra di coltura del tessuto di 2 600 cm contenente 100 mL DMEM con 10% FBS. Incubare a 37 ° C in presenza di 5% CO 2 per 3-4 giorni per raggiungere la fase stazionaria ed confluenza. Un piatto di 2 cm 600 confluenti contiene ~ 7 x 10 7 cellule. Preparare 1 piastra per ogni condizione e 1 piatto per ogni controllo negativo corrispondente. 
	Nota: Le cellule devono raggiungere la fase stazionaria per inibire la replicazione del DNA cellulare per garantire che solo vDNA viene etichettato e purificata nei passaggi successivi. 
	Nota: Ogni campione richiede un accesso senza etichetta di controllo negativo, preparato con le stesse condizioni di infezione e il punto di tempo senza l'aggiunta di EdC. 
	Nota: Una versione ridimensionata di questo esperimento dovrebbe essere effettuata in tandem per testare per l'etichettatura del DNA cellulare da formazione immagine usando crescita cellulare paragonabile, infezione, EdC condizioni, di etichettatura e intervalli di tempo (vedi passo 2).</li>
	<li>Diluire 7 x 10 8 PFU HSV-1 in 7 mL di freddo Buffered Saline (TBS). Rimuovere il mezzo di crescita e conservare a 37 ° C. Per infettare, aggiungere 7-mL diluito virus alle cellule MRC-5 e rock per 1 h a temperatura ambiente. A seguito di adsorbimento, rimuovere inoculo, sciacquare con temperatura ambiente 50 mL TBS e sostituire il mezzo di crescita originale. Incubare a 37 ° C in presenza di 5% CO 2. Questo passaggio deve essere effettuato per ogni condizione sperimentale ed il controllo negativo. 
	Nota: Maggiore EdC etichettatura possa essere acquisito utilizzando HSV-1 mutanti difettosi per l'espressione del dUTPase virale (gene UL50) e/o uracile glicosilasi (gene UL2). HSV-1 dUTPase ha specificità di substrato basso e può fare diminuire l'attivazione di alcuni inibitori nucleosidici analoghi 25 , 27.</li>
	<li>Genomi virali di etichetta con EdC. Seguire le indicazioni per etichettare in arrivo genomi (1.3.1.), la replica di genomi (1.3.2.), o forche di replicazione virale (1.3.3.). 
	Nota: Solo un passo 1.3.1, 1.3.2 o 1.3.3 deve avvenire, a seconda se in arrivo genomi, genomi replicati o forcelle replica devono essere analizzati nei passaggi successivi, rispettivamente. 
	Nota: EdU o f-ara EdU può essere sostituito per EdC. La tossicità di analoghi nucleosidici deve essere monitorata e ridotto al minimo.
	<ol><li>Uso prelabeled scorte per realizzare l'infezione nel punto 1.2 e procedere al passaggio 2 o 3 all'interno di 4 h post infezione (hpi) per studiare non replicata vDNA ( Figura 1A). 
		Nota: Preparare prelabeled virus scorte utilizzando il protocollo descritto in precedenza 25. Stock di virus deve essere passato attraverso una colonna di G-25 per rimuovere qualsiasi residuo EdC.</li>
		<li>Etichetta replicante vDNA aggiungendo 5-25 µM EdC al terreno di coltura delle cellule delle cellule infettate per 2-4 h ( Figura 1B). Prima di aggiungere, diluire EdC in 1 mL di terreno di coltura.</li>
		<li>Per etichettare le forcelle di replicazione virale, dopo l'inizio della replica vDNA (&#8805; 4 hpi), etichetta di impulso replica vDNA con 5-25 µM EdC per 5-20 min. Per inseguire, sciacquare 3 x con mezzo di chase contenente 25-100 µM 2´deoxycytidine (deoxyC) e poi incubare in presenza di medium di chase per altri 20-40 min ( Figura 1). 
		Nota: Pulse e chase medio dovrebbe essere equilibrato al 37 ° C e 5% CO 2 prima dell'uso. 
		Nota: Per esperimenti di pulse chase, è importante considerare la quantità di tempo che necessaria per nucleosidi entrare nella cellula ed essere fosforilato prima che queste possano essere incorporate nella replica del DNA. Questo deve essere determinato empiricamente. 
		Nota: Per determinare la risoluzione di esperimenti di pulse chase, calcolare il tasso di replicazione virale nelle circostanze sperimentali utilizzati. Questo può essere determinato mediante PCR quantitativa di genomi virali durante un singolo passaggio crescita tempo corso 26. 
		Nota: Per l'imaging di genomi virali procedere al passaggio 2 e per la purificazione di genomi virali, procedere al passaggio 3.</li>
	</ol></li></ol> 2. Formazione immagine di EdC DNA ( Figura 2A) contrassegnato Nota: è utile effettuare imaging in tandem con il metodo di purificazione del genoma virale per verificare che il DNA cellulare non è etichettato in esperimenti. La formazione immagine può essere utilizzata anche per visualizzare la natura di vDNA con etichetta e per convalidare i dati di proteomica. Esempi di DNA virale e cellulare modelli di macchiatura sono mostrati nella Figura 3.
<ol><li>Svolgere infezioni ed EdC etichettatura come indicato nel passaggio 1, ad eccezione di utilizzando ridimensionato condizioni sulle lamelle in un piatto di coltura del tessuto 12-pozzetti contenente 1 mL di terreno di coltura.</li>
	<li>Fix cellule con 1 mL 3,7% paraformaldeide in PBS 1X per 15 minuti a TA. Dopo la fissazione, risciacquo celle 2 volte con 1 mL 3% BSA in PBS. 
	Attenzione: Paraformaldeide può causare lesioni gravi o permanenti. Attenersi alle precauzioni di sicurezza. 
	Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui e le lamelle possono essere memorizzate a 4 ° C nel secondo lavaggio per fino a 3 giorni.</li>
	<li>Permeabilize le cellule con 1 mL di tampone di permeabilizzazione [vedi Tabella materiali] per 20 min a temperatura ambiente mentre dondolo.</li>
	<li>Lavare con 1 mL di 3% BSA e quindi blocco con 1 mL 3% BSA in PBS per 30 min a temperatura ambiente mentre dondolo.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL della reazione clicca cocktail [vedi Tabella materiali] alle lamelle di coniugare covalentemente Alexa Fluor 488 azoturo di EdC DNA contrassegnato. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti mentre a dondolo. Aspirare e lavare due volte con 1 mL di PBS.</li>
	<li>Macchia DNA cellulare con 1 mL di una diluizione di 1:2,000 di Hoechst in PBS per 30 min a temperatura ambiente mentre a dondolo. Aspirare e lavare due volte con 1 mL di PBS.</li>
	Immunofluorescenza indiretta <li>macchia con gli anticorpi primari e secondari secondo standard di protocolli 25. 
	Nota: VDNA con etichetta colocalizza con ICP8, ICP4 o UL42 ed etichettati cellular DNA colocalizza con macchia di Hoechst.</li>
	<li>Montare vetrini coprioggetti sui vetrini e immagine celle utilizzando un microscopio a fluorescenza. 
	Nota: I vetrini possono essere conservati a 4 ° C per diverse settimane.</li>
</ol> 3. Purificazione di vDNA e proteine associate Nota: diversi aspetti del presente protocollo sono stati adattati da Leung et al. 22 Nota: tutti i buffer e i reagenti devono essere refrigerati il ghiaccio prima dell'uso e tutti i passaggi devono essere effettuati sul ghiaccio se non diversamente indicato.
<ol><li>Raccogliere nuclei. 
	Nota: Prima di isolamento dei nuclei, formaldeide può essere utilizzato per crosslink proteine a DNA. Condizioni più rigorose di lavare quindi possono essere utilizzate durante la purificazione del DNA su perline rivestite con streptavidina. Per crcondizioni di osslinking e lavaggio vedere Sirbu et al. 21. <ol><li>sostituire crescita medio con 20 mL di tampone di estrazione di Nuclei (NEB) e incubare per 20 min a 4 ° C con occasionali a dondolo. I nuclei diventano visibili al microscopio.</li>
		<li>Raschiare i nuclei dalla piastra con un raschietto in cella e trasferire in una provetta conica da 50 mL. Centrifugare per 10 min 2.500 x g a 4 ° C per a pellet di nuclei, scartare il surnatante. 
		Nota: Trypan blu colorazione può essere utilizzato per verificare l'isolamento dei nuclei da cellule.</li>
		<li>Delicatamente sloggiare la pallina nucleare in 10 mL di PBS, trasferirlo in una provetta conica 15 mL e pellet mediante centrifugazione per 10 min a 2.500 x g a 4 ° C. completamente rimuovere PBS. 
		Nota: I Nuclei possono essere congelati e il protocollo può essere sospesa a questo punto. A tale scopo, Risospendere delicatamente la pallina nucleare in 500 µ l di congelamento nel buffer e incubare la provetta in un bagno di ghiaccio di etanolo/a secco. Memorizzare i nuclei congelati a-80 ° C. Prima dell'uso, scongelare i nuclei a temperatura ambiente, trasferire rapidamente di ghiaccio, aggiungere 10 mL di PBS, roccia delicatamente per mescolare, pellet mediante centrifugazione per 10 min a 2.500 x g a 4 ° C e rimuovere completamente PBS. I nuclei di congelamento può provocare ridotta resa.</li>
	</ol></li> <li>Covalentemente coniugato biotina-azoturo di EdC etichettato vDNA.
	<ol><li>Risospendere il pellet nucleare in reazione clicca 10ml mescolare [vedi Tabella materiali] pipettando delicatamente su e giù 5 volte con una pipetta da 10 mL. 
		Nota: È importante che i reagenti inclusi nella combinazione di reazione di clic vengono aggiunti nell'ordine indicato.</li>
		<li>Ruotare per 1h a 4 ° C. Durante la rotazione preparare e chill buffer B1, B2 e B3 [vedi Tabella materiali].</li>
		<li>Pellet nuclei mediante centrifugazione per 10 min a 2.500 x g a 4 ° C. completamente rimuovere fare clic su mix di reazione e lavare la pallina delicatamente risospendere in 10 mL di PBS e centrifugazione per 10 min a 2.500 x g a 4 ° C.</li>
		<li>Risospendere delicatamente la pallina nucleare in 1 mL di PBS e trasferirlo in una provetta di microfuge 1,5 mL utilizzando un puntale di grande diametro. Pellet di nuclei mediante centrifugazione per 10 min a 2.500 x g a 4 ° C. completamente rimuovere PBS e freeze flash in azoto liquido. 
		Nota: Il protocollo può essere sospesa a questo punto e nuclei congelati possono essere conservati a-80 ° C. gelo disgelo aiuta con conseguente lisi quindi è consigliabile che i nuclei essere flash congelati anche quando si procede a passo 3.3 nello stesso giorno.</li>
	</ol></li> <li>Lyse nuclei e il frammento di DNA.
	<ol><li>Scongelare i nuclei su ghiaccio e risospendere in 500 µ l di Buffer B1 pipettando su e giù. Incubare in ghiaccio per 45 min.</li>
		<li>Sonicate campioni 6 volte per 30 s ogni ampiezza 40% usando una sonda del microtip di 3 mm. Posizionare il campione sul ghiaccio per 30 s tra gli impulsi. Dopo sonicazione, campioni dovrebbero apparire chiaro, non nuvoloso. 
		Nota: Condizioni di sonicazione devono essere ottimizzate per sonicatori individuali. Per istruzioni dettagliate su come ottimizzare le condizioni di sonicazione riferirsi a Leung et al. 22.</li> <li>pellet detriti cellulari mediante centrifugazione a 14.000 x g per 10 min a 4 ° C. Il formato della pallina dovrebbe diminuire sostanzialmente. Filtrare il surnatante con colino di cella 100 µM e mantenere il flusso attraverso.</li>
		<li>Aggiungere 500 µ l tampone B2 per il surnatante filtrato. 900 µ l di questo esempio verrà utilizzato nel passaggio 3.4.2.</li>
		<li>Prendere una parte aliquota di ciascuna condizione per isolamento del DNA (50 µ l o 1/20th volume) e aggiungere 50 µ l 2 x soluzione SDS-bicarbonato [vedi Tabella materiali]. Procedere con il protocollo di isolamento del DNA (punto 3.6).</li>
		<li>Prendere una parte aliquota di ciascuna condizione per ingresso proteina (50 µ l o 1/20th volume) e aggiungere 50 µ l 2 x tampone di Laemmli, congelato in azoto liquido e conservare a -80 ° C. uso nel passaggio 3.5.6.</li>
	</ol></li> <li>Bind biotinylated del DNA di streptavidina rivestito perline.
	<ol><li>Preparare Streptavidin T1 biglie magnetiche trasferendo 300 µ l di liquami tallone ad un tubo di microfuge 1,5 mL. Preparare una provetta di perline per campione. Lavare 3 volte con 1 mL di Buffer B2 su vortex per risospendere, applicando un magnete per separare le perline, e aspirando il tampone di lavaggio delle perle. 
		Nota: Ottimizzato vincolante il risultato di condizioni nel fondo minimo legame e resa ingrandita. È stato determinato sperimentalmente che biglie magnetiche Streptavidin T1 hanno una capacità di associazione significativamente maggiore rispetto dell'agarosi branelli, come pure altri branelli di streptavidina e meno sfondo vincolante di perle di streptavidina C1 ( Figura 4A ).</li>
		<li>Aggiungere 900 µ l di campione dal punto 3.3.4. ai branelli lavati e ruotare durante la notte a 4 ° C. 
		Nota: Non non perle di vortice, una volta che il campione viene aggiunto a loro. 
		Nota: Se gli importi significativi di DNA o proteine sono isolati nel controllo negativo senza etichetta, questo passaggio può essere ridotto da pernottamento a 4 h per ridurre rilegatura.</li>
	</ol></li> <li>Lavare perline ed eluire vDNA e proteine associate. 
	Nota: Si consiglia di utilizzare puntali con filtro per i passaggi rimanenti.
	<ol><li>Campioni di posto in una cremagliera del tubo magnetico microfuge, Rimuovi sovranatante, Risospendere delicatamente in 1 mL di Buffer B2, ruotare a 4 ° C per 5 min</li>
		<li>Ripetere tre volte il punto 3.5.1.</li>
		<li>Posizionare i campioni in una cremagliera del tubo magnetico microfuge, rimuovere il surnatante, risospendere in 1 mL di Buffer B3, delicatamente e ruotare a 4 ° C per 5 min.</li>
		<li>Miscela di microsfere di trasferire 100 µ l (volume di th 1/10) ad un nuovo tubo per isolamento del DNA associato. Applicare questo tubo al magnete, rimuovere il surnatante, risospendere perline in 100 µ l 1 x soluzione SDS-bicarbonato e procedere con il protocollo di isolamento del DNA (punto 3.6).</li>
		<li>Applicare il tubo contenente la miscela di microsfere di 900 µ l restante dal punto 3.5.3. al magnete, rimuovere il surnatante e risospendere perline in 50 µ l 2 x Laemmli buffer del campione per eluire complessi della DNA-proteina e proteina.</li>
		<li>Campioni di ebollizione a 95 ° C per 15 min, vortice, rapidamente nel microfuge e applicare il magnete. Trasferire l'eluato a un nuovo tubo, congelamento flash e conservare a -80 ° C. 
		Nota: Uso cap blocchi per garantire che i tubi non pop aprire durante la cottura. 
		Nota: Il protocollo può essere sospesa a questo punto e campioni possono essere conservati a-80 ° C per diverse settimane.</li>
		<li>Analizza campioni di proteine di Blue di Coomassie macchiatura, macchiarsi occidentale o spettrometria di massa di procedure standard 25. Risultati rappresentativi sono mostrati in Figura 4 e Figura 5. 
		Nota: Per determinare se il rendimento di proteina è sufficiente per la spettrometria di massa, 7,5 µ l di ogni campione viene utilizzato per l'analisi di macchiatura blu di Coomassie e 7,5 µ l per macchiarsi occidentale di un genoma virale rappresentanza associato la proteina (ICP4, ICP8 o UL42). Lo stesso volume di lisati dal passaggio 3.3.6. vengono eseguiti a fianco al controllo per i livelli della proteina di input. Il campione rimanente (35 µ l) viene poi analizzato dalla massa spettrometria come descritto in precedenza 25.</li>
	</ol></li> <li>Isolamento del DNA <ol><li>Incubare i campioni da passaggi 3.3.5. e 3.5.4. a 65 ° C per 4-16 h. Rimuovi il campione dai branelli magnetici, se necessario.</li>
		<li>Estrarre campioni con 150 µ l fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (PCI) e trasferire la fase acquosa ad un nuovo tubo.</li>
		<li>Estrarre la rimanente PCI con 100 µ l Tris-EDTA (TE) e aggiungere la fase acquosa ad un nuovo tubo.</li>
		<li>Estrarre campioni con 200 µ l cloroformio: alcool isoamilico (24:1).</li>
		<li>Purificare la fase acquosa utilizzando il Kit di purificazione di PCR secondo il produttore &#39; protocollo s. 
		Nota: L'indicatore di pH nel Buffer PB diventerà viola quando aggiunto al campione. Aggiungere 10 & n.181; PH di L 3m NaOAc 5.0 per diminuire il pH del campione.</li>
		<li>Concentrazione di DNA determinare utilizzando un fluorometro. 
		Nota: Questo protocollo produce in genere 100-400 ng associato a perlina del DNA. Nessun DNA dovrebbe essere rilevato nell'eluito del controllo negativo in cui EdC non è stato aggiunto al passaggio 1.3.</li>
		<li>DNA può essere conservato in un grippaggio del DNA basso tubo a 4 o - 20 ° C e può essere utilizzato per PCR in tempo reale o analisi di sequenziamento di throughput elevato.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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B., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+spatiotemporal+dynamics+of+proteins+at+replication+forks+and+in+assembled+chromatin+using+isolation+of+proteins+on+nascent+DNA.">Monitoring the spatiotemporal dynamics of proteins at replication forks and in assembled chromatin using isolation of proteins on nascent DNA.</a> Nat Protoc. 7, 594-605 (2012).</li><li>Leung, K. H., Abou El Hassan, M., Bremner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+to+purify+proteins+at+replication+forks+under+native+conditions.">A rapid and efficient method to purify proteins at replication forks under native conditions.</a> BioTechniques. 55, 204-206 (2013).</li><li>Hobbs, W. E., DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation+of+cell+cycle+progression+and+cellular+gene+expression+as+a+function+of+herpes+simplex+virus+ICP0.">Perturbation of cell cycle progression and cellular gene expression as a function of herpes simplex virus ICP0.</a> J Virol. 73, 8245-8255 (1999).</li><li>Lomonte, P., Everett, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+immediate-early+protein+Vmw110+inhibits+progression+of+cells+through+mitosis+and+from+G(1)+into+S+phase+of+the+cell+cycle.">Herpes simplex virus type 1 immediate-early protein Vmw110 inhibits progression of cells through mitosis and from G(1) into S phase of the cell cycle.</a> J Virol. 73, 9456-9467 (1999).</li><li>Dembowski, J. A., DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+recruitment+of+nuclear+factors+to+productively+replicating+herpes+simplex+virus+genomes.">Selective recruitment of nuclear factors to productively replicating herpes simplex virus genomes.</a> PLoS Pathog. 11, e1004939 (2015).</li><li>Dembowski, J. A., Dremel, S. E., DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-Coupled+Recruitment+of+Viral+and+Cellular+Factors+to+Herpes+Simplex+Virus+Type+1+Replication+Forks+for+the+Maintenance+and+Expression+of+Viral+Genomes.">Replication-Coupled Recruitment of Viral and Cellular Factors to Herpes Simplex Virus Type 1 Replication Forks for the Maintenance and Expression of Viral Genomes.</a> PLoS Pathog. 13, e1006166 (2017).</li><li>Bjornberg, O., Nyman, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dUTPases+from+herpes+simplex+virus+type+1+and+mouse+mammary+tumour+virus+are+less+specific+than+the+Escherichia+coli+enzyme.">The dUTPases from herpes simplex virus type 1 and mouse mammary tumour virus are less specific than the Escherichia coli enzyme.</a> J Gen Virol. 77 (Pt 12), 3107-3111 (1996).</li><li>Chiou, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-+and+protein-scission+activities+of+ascorbate+in+the+presence+of+copper+ion+and+a+copper-peptide+complex.">DNA- and protein-scission activities of ascorbate in the presence of copper ion and a copper-peptide complex.</a> J Biochem. 94, 1259-1267 (1983).</li><li>Kennedy, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+consequences+of+copper+complexes+used+to+catalyze+bioorthogonal+click+reactions.">Cellular consequences of copper complexes used to catalyze bioorthogonal click reactions.</a> J Am Chem Soc. 133, 17993-18001 (2011).</li><li>Snel, B., Lehmann, G., Bork, P., Huynen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STRING:+a+web-server+to+retrieve+and+display+the+repeatedly+occurring+neighbourhood+of+a+gene.">STRING: a web-server to retrieve and display the repeatedly occurring neighbourhood of a gene.</a> Nucleic Acids Res. 28, 3442-3444 (2000).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo protocollo include più passaggi che, se non seguite con attenzione, possono provocare rese significativamente riduttrice della proteina o contaminazione con DNA cellulare. È fondamentale che cellule stazionarie sono utilizzate per tutti gli esperimenti per garantire che DNA cellulare non è etichettato e purificato. Questo può essere confermato dall'assenza di polimerasi del DNA cellulare del campione di proteine perché HSV-1 non utilizzare il cellulare DNA polimerasi per la sintesi di genoma. Durante EdC etichettatura e nuclei passaggi di raccolta, campioni dovrebbero essere sfalsati per garantire che ciascuno è trattato ugualmente. Durante fasi di purificazione, si dovrebbe prestare attenzione non per manipolare i nuclei pipettando troppo. Questo può portare a lisi prematura dei nuclei, nonché campione perdita dovuto attaccare ai lati delle punte di pipetta. Inoltre, il passo di sonicazione deve essere ottimizzato per sonicatori individuali e la quantità di perline rivestite con streptavidina utilizzata per l'associazione di biotina dovrebbe essere titolata per una resa ottimale della proteina.
Parecchie modifiche possono essere fatta al presente protocollo e includono l'uso di diversi virus o tipi cellulari o l'aggiunta di un passaggio alla reticolazione proteina al DNA. Quando si sceglie un tipo di cella da utilizzare per analisi proteomica, è importante verificare la disponibilità di un database di sequenze di proteine per quella specie. Mancanza di risorse di proteomica limiterà in maniera significativa a valle analisi di dati della proteina. Un'altra limitazione è la necessità di un numero elevato di celle, quindi può essere difficile da preparare abbastanza cellule primarie, quali neuroni, per questo esperimento. Questo metodo dovrebbe essere compatibile con altri virus del DNA o RNA, purché l'infezione virale non dipende dalla replicazione del DNA cellulare. Inoltre, sarebbe interessante esplorare i cambiamenti nelle interazioni della DNA-proteina che si verificano nei mutanti di HSV-1. Un'altra modifica al presente protocollo potrebbe essere l'aggiunta di un passaggio di reticolazione di formaldeide prima isolamento dei nuclei, che consentirebbe di condizioni più rigorose di lavaggio durante la purificazione21. L'aggiunta di formaldeide non influenzerà la capacità di raccogliere i nuclei ma può provocare in diminuzione della proteina resa a causa difficilmente invertendo le reticolazioni durante l'eluizione di proteina.
Risultati da questo protocollo rappresentano lo stato medio del DNA virale in esame. Di conseguenza, è difficile distinguere se complessi sono insieme sulle molecole del DNA stesse o separate. vDNA etichettatura metodi descritti qui in combinazione con formazione immagine ad alta risoluzione può essere utilizzato per verificare i dati di proteomica e può aiutare a distinguere tra diverse popolazioni del DNA con etichettato all'interno di una cella. Inoltre, ChIP-seq potrebbe essere usato come un follow-up metodo per identificare le posizioni specifiche delle proteine sul genoma virale.

I virus hanno una limitata capacità di svolgere le funzioni essenziali e pertanto dipendono da fattori dell'ospite per facilitare gli aspetti critici dell'infezione compreso trasporto, replica, riparazione, ricombinazione ed espressione genica virale. Le attività di questi fattori dell'ospite sono spesso aumentate di proteine codificate virally. Inoltre, virus deve evitare il rilevamento e interferenze di risposte cellulari all'infezione virale. Di conseguenza, interazioni ospite virus dettano l'esito dell'infezione. Di fondamentale importanza è capire come virus alterano l'ambiente cellulare per adattare il macchinario cellulare per facilitare processi virali. Di particolare interesse è identificare i fattori e i processi agiscono sui genomi virali durante tutto il ciclo infettivo.
Herpes simplex virus tipo 1 (HSV-1) è che una doppia elica del DNA virus che infetta una parte sostanziale della popolazione umana. Entro la prima ora di infezione, il genoma virale entra nel nucleo, dove una cascata ordinata dell'espressione genica virale ensues in coordinamento con virale del DNA (vDNA) replica1. Nel nucleo, genomi sono soggetti a regolazione epigenetica, sottoposti a riparazione e ricombinazione e sono confezionati in capsidi, tale che i primi virioni di progenie sono prodotte in meno di sei ore. La valutazione completa delle proteine del genoma virale associato durante tutto il corso dell'infezione getterà le basi per indagare i dettagli molecolari dei processi che agiscono sui genomi virali e forniranno la comprensione di quali fattori virali e cellulari sono coinvolti nelle varie fasi dell'infezione.
Metodi precedenti per l'indagine sui fattori dell'ospite coinvolti nell'infezione virale includono purificazione di affinità delle proteine virali per l'analisi di proteine cellulari associati2,3,4,5 , 6 , 7 , 8 , 9. questi saggi sono stati strumentali per l'identificazione di fattori cellulari coinvolti nella risposta antivirale ospite, così come modifica virale della cromatina, espressione genica, e riparazione del DNA. Tuttavia, è difficile da accertare se interazioni dipendono l'associazione con vDNA e proteomica solo consentono di comprendere le interazioni che si verificano in funzione di uno specifico fattore virale. Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è stato utilizzato per identificare dove specifiche proteine virali e cellulari legano al genoma virali10,11,12,13,14 , 15 e ibridazione in situ fluorescente (FISH) combinato con immunocitochimica ha permesso la visualizzazione dei fattori cellulari che colocalize con vDNA16,17,18, 19 , 20. queste analisi consentono analisi spazio e temporale. Tuttavia, le limitazioni comprendono la necessità per gli anticorpi altamente specifici, sensibilità limitata e la necessità di approfondimenti precedenti interazioni ospite di virus. Abbiamo pertanto sviluppato un metodo basato su iPOND (isolamento delle proteine sul DNA nascente)21 e aniPOND (accelerata nativo iPOND)22 per selettivamente etichettare e purificare vDNA da infettato le cellule per l'imparziale identificazione del genoma virale proteine associate mediante spettrometria di massa. iPOND è stato determinante per l'indagine delle dinamiche di forcella di replicazione cellulare.
Per la purificazione selettiva di genomi virali da cellule infette, la replica di vDNA è etichettata con nucleosidi Etinil per volta, 5-Etinil-2-deoxyuridine (EdU) o 5-Etinil-2-deoxycytidine (EdC) (Figura 1), seguita da covalente Coniugazione di azoturo di biotina tramite clic su chimica per facilitare purificazione singolo passo del genoma virale e proteine associate su perline rivestite con streptavidina (Figura 2B). D'importanza, le infezioni avvengono nelle cellule fisse, che non sono impegnate nella replicazione del DNA cellulare per attivare specifici di etichettatura di vDNA. Inoltre, l'infezione HSV-1 provoca l'arresto del ciclo cellulare ed inibisce cellular DNA replica23,24. Virus può essere prelabeled prima dell'infezione per l'analisi di proteine associate con genomi virali in ingresso (Figura 1A) o con l'etichetta durante la replicazione del DNA per l'analisi di proteine associate con vDNA recentemente sintetizzato (Figura 1B) 25. Inoltre, analisi di inseguimento di impulso possono essere utilizzato per indagare la natura di proteine associate con replicazione virale forcelle (Figura 1)26. Inoltre, vDNA Etinil-modificato può essere coniugato covalentemente a un fluoroforo per indagine spaziale della dinamica della proteina (Figura 2A e Figura 3). Formazione immagine permette la visualizzazione diretta del vDNA è un approccio gratuito per la validazione delle interazioni della proteina-vDNA e può essere adattata per tenere traccia di genomi virali durante l'infezione. Ci aspettiamo che questi approcci potrebbero essere ulteriormente modificati per studiare qualsiasi aspetto dell'infezione herpesviral, compresa la latenza e riattivazione e di studiare altri virus a DNA. Inoltre, etichettatura con uridina 5-Etinil potrebbe consentire l'analisi di genomi virali RNA (UE).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1930">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">MRC-5 cells</td>
			<td style="width:197px;">ATCC</td>
			<td style="width:101px;">CCL-171</td>
			<td style="width:1215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:197px;">Gibco</td>
			<td style="width:101px;">26140-179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:197px;">Gibco</td>
			<td style="width:101px;">12800-082</td>
			<td>substituted with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM&#160; (for growth in flasks) or 30 mM (for growth in dishes) sodium-bicarbinate</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:419px;">600 cm2 tissue culture dish</td>
			<td style="width:197px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:101px;">166508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:419px;">HSV-1 stock</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>stocks with titers greater than 1x109 PFU/mL work best</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Sephadex G-25&#160; column (PD-10 Desalting Column)</td>
			<td style="width:197px;">GE Healthcare</td>
			<td align="right" style="width:101px;">17085101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:197px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">D128-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">5&#180;-Ethynyl-2&#180;-deoxycytidine (EdC)</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T511307</td>
			<td>Dissolve in DMSO to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">2&#180;-deoxycytidine (deoxyC)</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">D3897</td>
			<td>Dissolve in water to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:419px;">Nuclear Extraction Buffer (NEB)</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>prepare fresh (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Sucrose, 0.5% Igepal)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Cell scraper</td>
			<td style="width:197px;">Bellco glass</td>
			<td style="width:101px;">7731-22000</td>
			<td>Autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Trypan blue solution</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:419px;">PBS, pH 7.2 (10x)</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (dilute to 1x in sterile water before use)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4-5H2O)</td>
			<td style="width:197px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">C489</td>
			<td>Prepare 100 mM stock and store at 4 &#176;C for up to 1 month</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">(+) Sodium L-ascorbate</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">A4034</td>
			<td>Freshly prepare 100 mM stock and store on ice until use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Biotin azide</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">B10184</td>
			<td>Prepare 10 mM stock in DMSO, aliquot, and store at -20 &#176;C for up to 1 year&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:419px;">Click Reaction Mix</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>prepare immediately before use by adding reagents in the indicated order (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodium ascorbate)&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:197px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:101px;">11697498001</td>
			<td>Dissolve in 1 mL water to prepare 50x stock, can store at 4 &#176;C for up to 1 week, or directly add 1 pill to 50 mL buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">freezing buffer</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>prepare fresh (7 mL 100% glycerol, 3 mL NEB, 200 &#956;L 50x protease inhibitor)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Buffer B1</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>prepare fresh (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x protease inhibitor)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Buffer B2</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x protease inhibitor)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Buffer B3</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x protease inhibitor)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibra Cell Ultra Sonic Processer equipped with a 3 mm microtip probe</td>
			<td style="width:197px;">Sonics</td>
			<td style="width:101px;">VCX 130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Cell strainer</td>
			<td style="width:197px;">Falcon</td>
			<td align="right" style="width:101px;">352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td>
			<td style="width:197px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:101px;">65601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">DynaMag-2 Magnet</td>
			<td style="width:197px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:101px;">12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Mini-Tube Rotator</td>
			<td style="width:197px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">260750F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">2X Laemmli sample buffer</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>Mix 400 mg of SDS, 2 mL 100% glycerol, 1.25 mL of 1 M Tris (pH 6.8), and 10 mg of bromophenol blue in 8 mL water. Store at 4&#160; &#176;C for up to 6 months. Before use add 1 M DTT to a final concentration of 200 mM.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">cap locks for 1.5 mL tube</td>
			<td style="width:197px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">NC9679153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Standard western blotting reagents</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">NOVEX Colloidal Blue Staining Kit</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">LC6025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">12-well tissue culture dish</td>
			<td style="width:197px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:101px;">3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Coverslips</td>
			<td style="width:197px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">12-545-100</td>
			<td>Autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:197px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">12-552-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:419px;">16% paraformaldehyde</td>
			<td style="width:197px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td align="right" style="width:101px;">15710</td>
			<td>dilute to 3.7% in 1x PBS before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:197px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">BP1605</td>
			<td>prepare 3% in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Permeabilization buffer (0.5% Triton-X 100)</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T8787</td>
			<td>prepare 0.5% Triton-X 100 in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:419px;">Click reaction cocktail - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit</td>
			<td style="width:197px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:101px;">C10337</td>
			<td>prepare according to manufactorer&#39;s protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:197px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:101px;">H1399</td>
			<td>prepare 10 mg/mL in water, can store at 4 &#176;C for up to 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">mouse anti-ICP8 primary antibody</td>
			<td style="width:197px;">Abcam</td>
			<td style="width:101px;">ab20194</td>
			<td>Use a 1:200 dilution in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">mouse anti-UL42 primary antibody (2H4)</td>
			<td style="width:197px;">Abcam</td>
			<td style="width:101px;">ab19311</td>
			<td>Use a 1:200 dilution in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Goat anti-mouse 594-conjugated secondary antibody</td>
			<td style="width:197px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:101px;">a11005</td>
			<td>Use a 1:500 dilution in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Immu-mount</td>
			<td style="width:197px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:101px;">9990402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">2x SDS-bicarb solution</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>2% SDS, 200 mM NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Phenol:chloroform:isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>mix 25:24:1 at least 1 day before use, store at 4 &#176;C in the dark</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">chloroform:isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>mix 24:1 at least 1 day before use, store at room temperature in the dark</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">10x Tris EDTA (TE), pH 8.0</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>100 mM Tris, 10 mM EDTA (dilute to 1x before use)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Qiaquick PCR purification kit</td>
			<td style="width:197px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:101px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">3 M sodium acetate pH 5.2</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Qubit assay tubes</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Fluorescence microscope equipped with imaging software</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Microcentrifuge for 1.5 mL tubes</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Tabletop centrifuge for 15 and 50 mL tubes</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Cell culture incubator</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Biosafety cabinet</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Heat blocks</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>65 &#176;C and 95 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of viral dna for the identification of associated viral and cellular proteins

L'obiettivo del presente protocollo è per isolare il virus herpes simplex tipo 1 (HSV-1) DNA da cellule infettate per l'identificazione di associato virale e proteine cellulari di spettrometria di massa. Anche se le proteine che interagiscono con genomi virali svolgono un ruolo importante nel determinare l'esito dell'infezione, un'analisi completa delle proteine del genoma virale associato non era in precedenza fattibile. Qui dimostriamo un metodo che consente la purificazione diretta del genoma di HSV-1 da cellule infette. Replica del DNA virale in modo selettivo è etichettata con nucleotidi modificati che contengono un gruppo funzionale di alchini. Con etichetta DNA quindi è specificamente e irreversibilmente contrassegnato tramite il legame covalente di azide biotina tramite un rame (I)-catalizzato reazione di cicloaddizione o clic di azide-alchino. Biotina-etichetta DNA viene purificata su rivestite di streptavidina e proteine associate sono eluite e identificate mediante spettrometria di massa. Questo metodo consente il targeting selettivo e l'isolamento di HSV-1 replica forchette o interi genomi da ambienti biologici complessi. Inoltre, l'adattamento di questo approccio vi permetterà per l'indagine sui diversi aspetti della infezione herpesviral, nonché l'esame dei genomi di altri virus a DNA.

L'uso della chimica clicca per la purificazione di DNA dalle cellule è stata compiuta in primo luogo il metodo di iPOND21. Lo scopo di iPOND è quello di purificare le forcelle di replicazione cellulare per l'identificazione di proteine associate. Abbiamo adattato questa tecnica per studiare specificatamente interazioni proteina vDNA durante l'infezione. Manipolazione dell'approccio di etichettare genomi virali con EdC (Figura 1), combinati con le infezioni sincronizzate, ha permesso per l'isolamento selettivo e l'indagine di popolazioni separate di vDNA. DNA di HSV-1 è etichettata con EdC (Figura 1) per facilitare il collegamento covalente di un fluoroforo per l'imaging o biotina per purificazione (Figura 2). Virus può essere prelabeled prima dell'infezione per l'analisi di proteine associate con genomi in ingresso (Figura 1A) o con l'etichetta durante la replicazione del DNA per l'analisi di proteine associate con vDNA recentemente sintetizzato (Figura 1B)25. Inoltre, analisi di inseguimento di impulso possono essere utilizzato per indagare la natura di proteine associate con replicazione virale forcelle (Figura 1)26. DNA può essere visualizzato all'interno delle cellule per fornire informazioni spaziali sulla natura del DNA con etichetta e supporto per le interazioni identificate vDNA-proteina (Figura 3). Presi insieme, i protocolli descritti qui consentono l'indagine proteomica su molteplici aspetti della infezione produttiva per fornire una conoscenza dinamica dei cambiamenti che si verificano sui genomi di HSV-1. Questi approcci potrebbero essere ulteriormente adattati per studiare la latenza e riattivazione, per esaminare i fenotipi associati con mutanti virali e per studiare altri virus a DNA e RNA.
Gli aspetti di questo metodo di purificazione della proteina sono stati adattati da Leung et al. 22. qui un miglioramento importante per la purificazione di EdC DNA contrassegnato è l'uso delle perle di streptavidina T1 invece di perline rivestite con streptavidina agarosio. Per ottimizzare la purificazione del DNA, diversi tipi di perline rivestite con streptavidina sono stati testati per legame non specifico quando l'infezione è stato effettuato in assenza di EdC e per il recupero massimo della proteina in presenza di EdC (Figura 4A). Per questi esperimenti, macchiare occidentale è stato effettuato per la proteina vDNA ICP4. Purificazioni effettuate su streptavidina T1 perline ha provocati la quantità minima di rilegatura in assenza di EdC e il recupero di massimo proteine in presenza di EdC.
Proteine associate con vDNA possono essere identificati da metodi di proteomica compreso western blotting e spettrometria di massa. Macchiarsi occidentale può essere utilizzato per studiare la dinamica delle interazioni e spettrometria di massa può essere utilizzata come un approccio imparziale per identificare proteine romanzo vDNA associato. Un esempio di proteina resa come una funzione di crescente EdC etichettatura è mostrata in Figura 4B. Una sbavatura, piuttosto che un disegno a strisce chiara, è osservata solitamente di macchiatura blu di Coomassie. Questo è probabilmente perché c'è il DNA presente nel campione della proteina o perché c'è un'abbondanza di proteine. È anche importante notare che il rame catalizzatore usato nella reazione clic può causare parziale degradazione di proteine e acidi nucleici28,29. Mediante western blotting, i livelli simili di ICP4 vengono in genere rilevati in eluati (passaggio 3.5.5). dopo la purificazione di vDNA che è stata etichettata per 60 min con EdC come quella presente nella stessa quantità di input campione preparato da nucleare lystates (passo 3.3.6.). Questa informazione utilizzabile come guida per determinare se il recupero è sufficiente inviare il campione rimanente per l'analisi di spettrometria di massa.
Nano cromatografia liquida con spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) può essere effettuata come descritto in precedenza25 per identificare proteine associate vDNA purificata. LC-MS/MS dati sono analizzati confrontando i valori spettrali totali (SpC) tra il campione sperimentale EdC-con l'etichetta e il controllo negativo senza etichetta corrispondente. Proteine sono considerate essere arricchita nel campione sperimentale basato sui seguenti criteri: 1) proteina ha almeno 5 conteggi spettrali (SpC) nel campione sperimentale, 2) proteina non viene rilevata nel controllo o è arricchita nel corso del controllo di almeno quattro volte Basato su dividendo i valori SpC e 3) la proteina è arricchita nel corso del controllo in due o più repliche biologiche. Il fattore di abbondanza spettrale normalizzata (NSAF: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56374/56374eq1.jpg"> </img>) può essere utilizzato per tenere conto delle differenze di peso molecolare (MW) e la proteina totale resa. Questa equazione determina l'abbondanza relativa delle singole proteine all'interno di un campione e consente il confronto diretto di due differenti condizioni sperimentali in cui gli importi differenti di vDNA sono purificati (ad esempio, confrontando (ingresso genomi virali Figura 1A) per replicare genomi (Figura 1B)).
Ci sono diversi modi per presentare i dati di arricchimento di proteine. Alcuni esempi includono i grafici a torta, diagrammi di Venn e reti di interazione della proteina. Grafici a torta possono essere utilizzati per illustrare la proporzione di proteine identificate che sono noti per funzionare in un determinato processo biologico (Figura 5A). Tuttavia, possono verificarsi problemi quando una proteina ha più di una funzione biologica, che è spesso il caso. Inoltre è difficile confrontare i dati tra diversi grafici a torta. Diagrammi di Venn sono utili per illustrare le relazioni tra proteine identificate sotto diverse condizioni sperimentali, ma non forniscono tutte le informazioni funzionali sulle proteine identificate (figura 5B). Reti di interazione della proteina ritrarre un'illustrazione visiva di potenziali interazioni tra proteine identificate e fornire informazioni sui tipi di processi biologici che sono coinvolti (Figura 5). Diverse risorse online sono disponibili per il mapping di interazioni proteina-proteina preveduta cui STRING (strumento di ricerca per il recupero di interazione geni/proteine)30. Strumenti online generalmente sono attrezzati per gestire i dati di proteomica di una varietà di specie e fornire preziose informazioni host proteine coinvolte nella meccanica del genoma virale. Tuttavia, proteine virali non sono generalmente inclusi nei database, che possono complicare l'analisi. Pertanto, è importante considerare le conclusioni principali uno vorrebbe trasmettere al momento di decidere come presentare dati di proteomica.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56374/56374fig1.jpg"> 
Figura 1:ONG &gt; approcci all'etichetta DNA HSV-1. (A) analizzare lo stato del virus in ingresso, che riposa MRC-5 celle in G0 sono infettate con HSV-1 prelabeled e genomi sono dosati a meno di 4 hpi per studiare il DNA virale non replicato. (B) analizzare lo stato di replicate virus, cellule MRC-5 sono infettate con HSV-1 senza etichetta ed EdC (stelle arancioni) è aggiunto al medium della crescita delle cellule infettate e incubate per 2-4 h dopo l'inizio della replicazione del DNA virale (≥ 4 hpi). (C) test forcelle di replicazione virale, cellule infette sono etichettato con EdC per forcelle replica 5-20 min possono poi essere inseguite con deoxyC di impulso. EdC DNA contrassegnato è arancione. Questa figura è stata modificata da Dembowski e DeLuca25. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56374/56374fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56374/56374fig2.jpg"> 
Figura 2: Le procedure descritte in questo documento per analisi di EdC DNA contrassegnato. (A) una descrizione del metodo per l'imaging dell'EdC DNA contrassegnato. Tagged DNA è rappresentato in verde. (B) un contorno del metodo per la purificazione e l'analisi a valle di EdC etichettato vDNA. Questa figura è stata modificata da Dembowski e DeLuca25. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56374/56374fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56374/56374fig3.jpg"> 
Figura 3: Visualizzazione di EdC DNA contrassegnato. Le cellule erano infetti, etichettate e imaged come descritto nella Figura 1 e Figura 2. Immagini rappresentative di DNA virale e cellulare con etichettato vengono visualizzati. DNA cellulare colocalizza con macchia di Hoechst e vDNA con ICP4. Barra della scala: 5 µm.This figura è stata modificata da Dembowski e DeLuca25 and Dembowski et al. 26. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56374/56374fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56374/56374fig4.jpg"> 
Figura 4 : Risultati di purificazione della proteina rappresentante. (A) confronto del rendimento di proteina quando punti di purificazione sono stati effettuati utilizzando diversi tipi di perline di streptavidina. L'infezione è stato effettuato in presenza di EdC (+) per confrontare il rendimento di proteina o in assenza di EdC (-) per confrontare la rilegatura. Le infezioni e l'etichettatura di EdC sono stati effettuati come descritto in Figura 1B e complessi della DNA-proteina sono stati purificati seguendo i passaggi descritti in Figura 2B utilizzando importi paragonabili di diversi tipi di perline di streptavidina. Pannello superiore: confronto del rendimento della proteina dopo purificazione su streptavidina rivestito dell'agarosi branelli o streptavidina M-280. Pannello inferiore: confronto del rendimento di proteina dopo purificazione su streptavidina M-270, M-280, streptavidina C1 o streptavidina T1. Macchiarsi occidentale è stato effettuato con un anticorpo contro la proteina virale ICP4. ICP4 purificata è mostrato nella prima corsia per il confronto. Esposizione più lunga del pannello inferiore è stato richiesto di osservare una simile intensità di ICP4 nelle corsie "280" come nel pannello superiore. (B) rappresentante della proteina purificazione risultati in funzione del tempo di EdC etichettatura sono mostrati. Le infezioni e l'etichettatura di EdC sono stati effettuati come descritto in Figura 1B e complessi della DNA-proteina sono stati purificati seguendo i passaggi descritti in Figura 2B usando le perle di streptavidina T1. Etichettatura di EdC è stato effettuato per 0, 20, 40, o 60 min e Blue di Coomassie colorazione (in alto) e risultati (in basso) macchiantesi occidentali sono mostrati. Macchiarsi occidentale è stato effettuato con gli anticorpi specifici per ICP4, UL42 o GAPDH. Dal passaggio 3.5.5 è stato prelevato il campione di eluato. e lisato dal passaggio 3.3.6. La freccia indica la streptavidina, mentre L indica la scaletta della proteina. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56374/56374fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56374/56374fig5.jpg"> 
Figura 5: Esempi dei diversi modi di presentare dati proteomica. Grafici a torta (A) sintetizzare proteine che sono state identificate mediante spettrometria di massa di eluati di proteina associata con genomi virali purificati alle 6 hpi. I valori indicano il numero di proteine identificate per ogni categoria funzionale. T indica il numero totale di proteine identificate. Colori indicano le seguenti categorie: viola - elaborazione del RNA, rosso - trascrizione, verde - rimodellamento della cromatina, arancio - replicazione del DNA, giallo - nucleare trasporto, proteine strutturali di teal - citoscheletro, blu scuro - HSV e grigio - altri/unknown. (B) diagrammi di Venn raffigurano la sovrapposizione delle proteine identificate per essere associato con genomi virali a 6, 8 o 12 hpi. (C) A stringa mappa raffigura proteine arricchiti sulle forcelle di replicazione virale dopo un 5 min impulso di EdC. Proteine umane arricchite da 5 volte rispetto al controllo negativo senza etichetta vengono visualizzati nella mappa interazione funzionale, che è stata generata utilizzando STRING30 con le impostazioni dei dati per visualizzare le interazioni solo alta fiducia. Nomi di gene sono stati usati per mappare le interazioni. Cerchi indicano proteine che funzionano nello stesso processo biologico. Questa figura è stata modificata da Dembowski e DeLuca25 and Dembowski et al. 26. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56374/56374fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

L'obiettivo del presente protocollo è specificamente tag e isolare selettivamente il DNA virale da cellule infettate per la caratterizzazione delle proteine del genoma virale associato.

Purificazione di DNA virale per l'identificazione delle proteine virali e cellulari associate

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

purification-viral-dna-for-identification-associated-viral-cellular

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.4K Views.  University of Pittsburgh School of Medicine. L'obiettivo del presente protocollo è specificamente tag e isolare selettivamente il DNA virale da cellule infettate per la caratterizzazione delle proteine del genoma virale associato.

Video: Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

Utilizzando un pan-virale Assay Microarray (Virochip) allo schermo campioni clinici di patogeni virali

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2. Viruses modulate host cell abundance and diversity, contribute to the cycling of nutrients, alter host cell phenotype, and influence the evolution of both host cell and viral communities through the lateral transfer of genes 3. Numerous studies have highlighted the staggering genetic diversity of viruses and their functional potential in a variety of natural environments. 
Metagenomic techniques have been used to study the taxonomic diversity and functional potential of complex viral assemblages whose members contain single-stranded DNA (ssDNA), double-stranded DNA (dsDNA) and RNA genotypes 4-9. Current library construction protocols used to study environmental DNA-containing or RNA-containing viruses require an initial nuclease treatment in order to remove nontargeted templates 10. However, a comprehensive understanding of the collective gene complement of the virus community and virus diversity requires knowledge of all members regardless of genome composition. Fractionation of purified nucleic acid subtypes provides an effective mechanism by which to study viral assemblages without sacrificing a subset of the community&#x2019;s genetic signature. 
Hydroxyapatite, a crystalline form of calcium phosphate, has been employed in the separation of nucleic acids, as well as proteins and microbes, since the 1960s11. By exploiting the charge interaction between the positively-charged Ca2+ ions of the hydroxyapatite and the negatively charged phosphate backbone of the nucleic acid subtypes, it is possible to preferentially elute each nucleic acid subtype independent of the others. We recently employed this strategy to independently fractionate the genomes of ssDNA, dsDNA and RNA-containing viruses in preparation of DNA sequencing 12. Here, we present a method for the fractionation and recovery of ssDNA, dsDNA and RNA viral nucleic acids from mixed viral assemblages using hydroxyapatite chromotography.

We describe an efficient method to separate single-stranded DNA, double-stranded DNA and RNA molecules from environmental viral communities. Nucleic acids are fractionated using hydroxyapatite chromatography with increasing concentrations of phosphate-containing buffers. This method permits the isolation of all viral nucleic acid types from environmental samples.

Separazione di DNA a singolo filamento, doppia elica del DNA e RNA da una Comunità Ambientale virale usando la cromatografia idrossiapatite

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. Several downstream applications require large quantities of pure viral DNA, which is provided by this protocol. These applications include viral genome sequencing, where the removal of host DNA is crucial to optimize data output for viral sequences, and the production of new viral recombinant strains, where co-transfection of purified plasmid and linear viral DNA facilitates recombination.1,2,3 
This procedure utilizes a combination of extractions and density-based centrifugation to isolate purified linear herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells.4,5 The initial purification steps aim to isolate purified viral capsids, which contain and protect the viral DNA during the extractions and centrifugation steps that remove cellular proteins and DNA. Lysis of nucleocapsids then releases viral DNA, and two final phenol-chloroform steps remove remaining proteins. The final DNA captured from solution is highly concentrated and pure, with an average OD260/280 of 1.90. Depending on the quantity of infected cells used, yields of viral DNA range from 150-800 &mu;g or more. The purity of this DNA makes it stable during long-term storage at 4C. This DNA is thus ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections. 
Prior to beginning the protocol, it is important to know the average number of cells per dish (e.g. an average of 8 x 106 PK-15 cells in a confluent 15 cm dish), and the titer of the viral stock to be used (e.g. 1 x 108 plaque-forming units per ml). These are necessary to calculate the appropriate multiplicity of infection (MOI) for the protocol.6 For instance, to infect one 15 cm dish of PK-15 cells with the above viral stock, at an MOI of 5, you would use 400 &mu;l of viral stock and dilute it with 3.6 ml of medium (total inoculation volume of 4 ml for one 15 cm plate).
Multiple viral DNA preparations can be prepared at the same time. The number of simultaneous preparations is limited only by the number of tubes held by the ultracentrifuge rotor (one per virus; see step 3.9 below). Here we describe the procedure as though being done for one virus.

We describe the process of isolating high purity herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells. The final DNA captured from solution is of high concentration and purity, making it ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections to produce new viral recombinants.

Estrazione di DNA virale da nucleocapsidi

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently being tested in human clinical trials. Wild-type AAV is a non-pathogenic member of the parvoviridae family and inherently replication-deficient. The broad transduction profile, low immune response as well as the strong and persistent transgene expression achieved with these vectors has made them a popular and versatile tool for in vitro and in vivo gene delivery. rAAVs can be easily and cheaply produced in the laboratory and, based on their favourable safety profile, are generally given a low safety classification. Here, we describe a method for the production and titering of chimeric rAAVs containing the capsid proteins of both AAV1 and AAV2. The use of these so-called chimeric vectors combines the benefits of both parental serotypes such as high titres stocks (AAV1) and purification by affinity chromatography (AAV2). These AAV serotypes are the best studied of all AAV serotypes, and individually have a broad infectivity pattern. The chimeric vectors described here should have the infectious properties of AAV1 and AAV2 and can thus be expected to infect a large range of tissues, including neurons, skeletal muscle, pancreas, kidney among others. The method described here uses heparin column purification, a method believed to give a higher viral titer and cleaner viral preparation than other purification methods, such as centrifugation through a caesium chloride gradient. Additionally, we describe how these vectors can be quickly and easily titered to give accurate reading of the number of infectious particles produced.

Recombinant adeno-associated virus (rAAVs) vectors are becoming increasingly valuable for in vivo studies in animals. We describe how rAAVs can be produced in the laboratory and how these vectors can be titered to give an accurate reading of the number of infectious particles produced.

Produzione e titolazione di vettori virali ricombinanti adeno-associato

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex (pMHC) proteins expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs). The TCR complex is composed of the ligand binding TCR&alpha;&beta; heterodimer that associates non-covalently with CD3 dimers (the &#949;&delta; and &#949;&gamma; heterodimers and the &zeta;&zeta; homodimer)1. Upon engagement of the receptor, the CD3 &zeta; chains are phosphorylated by the Src family kinase, Lck. This leads to the recruitment of the Syk family kinase, Zap70, which is then phosphorylated and activated by Lck. After that, Zap70 phosphorylates the adapter proteins LAT and SLP76, initiating the formation of the proximal signaling complex containing a large number of different signaling molecules2. 
The formation of this complex eventually results in calcium and Ras-dependent transcription factor activation and the consequent initiation of a complex series of gene expression programs that give rise to T cell differentiation2. TCR signals (and the resulting state of differentiation) are modulated by many other factors, including antigen potency and crosstalk with co-stimulatory/co-inhibitory, chemokine, and cytokine receptors 3-4. Studying the spatial and temporal organization of the proximal signaling complex under various stimulation conditions is, therefore, key to understanding the TCR signaling pathway as well as its regulation by other signaling pathways.
One very useful model system to study signaling initiated by the TCR at the plasma membrane in T cells is glass-supported lipid bilayers, as described previously5-6. They can be utilized to present antigenic pMHC complexes, adhesion, and co-stimulatory molecules to T cells-serving as artificial APCs. By imaging the T cells interacting with the lipid bilayer using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), we can restrict the excitation to within 100 nm of the space between the glass and the cell surface 7-8. This allows us to image primarily the signaling events occurring at the plasma membrane. As we are interested in imaging the recruitment of signaling proteins to the TCR complex, we describe a two-camera TIRF imaging system wherein the TCR, labeled with fluorescent Fab (fragment antigen binding) fragments of the H57 antibody (purified from hybridoma H57-597, ATCC, ATCC Number:HB-218) which is specific for TCR&beta;, and signaling proteins, tagged with GFP, may be imaged simultaneously and in real time. This strategy is necessary due to the highly dynamic nature of both the T cells and of the signaling events that are occurring at the TCR. This imaging modality has allowed researchers to image single ligands 9-11 as well as recruitment of signaling molecules to activated receptors and is an excellent system to study biochemistry in-situ12-16.

The compartmentalization of proteins either within the plasma membrane or into intracellular locations is one regulatory mechanism that can greatly influence signaling outcomes; hence, to understand signaling it is important to study the spatial and temporal behavior of the proteins involved. We describe here a TIRF microscopy based system to study signal transduction in T cells, but is broadly applicable.

Una tecnica di microscopia TIRF per Real-time, Imaging simultanea del TCR e delle sue proteine ​​associate segnalazione

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

Creazione di un liquido coperto Cultura polarizzata Airway epiteliali umane Calu-3 celle per studio cellulare risposta dell&#39;ospite agli agenti patogeni delle vie respiratorie<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Fenomica fagi: Approcci fisiologici per caratterizzare Novel virali Proteine

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

All&#39;inizio virali ingresso saggi per l&#39;identificazione e la valutazione di composti antivirali

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

Lo sviluppo del liofilizzato Loop-mediate isotermici amplificazione reagenti per la rilevazione di<em&gt; Burnetii Coxiella</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Misurare Influenza neuraminidasi Inibizione anticorpo I titoli da Enzyme-linked lectina Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...