Questo lavoro è stato sostenuto dal Consiglio di Ricerca delle Scienze Naturali e di Ingegneria del Canada Discovery Grant RGPIN36481-08 a William G. Bendena.

1. Preparazione degli organismi sperimentali <ol><li> Prelevare 10 nematodi in scatola L4 per ceppo 24 h prima di iniziare il test per assicurare che gli organismi siano giovani adulti quando sono stati sottoposti a test. Per ogni mutato o nematodo di controllo sperimentato, scegliere 10 L4s (10 per il controllo e 10 per il saggio). <ol><li> Mantenere gli organismi L4 utilizzando metodi standard 26 , 27 per 24 ore su piatti standard di agar seminati con OP50 Escherichia coli . Se gli organismi si perdono durante i passi successivi di lavaggio, compensare aumentando la dimensione del campione iniziale ( cioè scegliere 20 worm più che 10). Nota: Il comportamento è un fenotipo variabile innaturale. Eseguire il metodo in triplice copia per ogni ceppo in tre giorni separati. Includere i ceppi di controllo aggiuntivi e le condizioni per i nuovi ceppi, come evidenziato nella sezione di discussione. </li></ol></li><li> Immediatamente prima del dosaggio, trasferire l&#39;organo sperimentaleIn un piatto di agar senza batteri e permettere ai nematodi di muoversi liberamente per 1 min per rimuovere batteri in eccesso. <ol><li> Se gli organismi sperimentali hanno sperimentato condizioni di contaminazione durante le 24 ore prima del dosaggio, scartarle. </li></ol></li><li> Pipettare 1 ml di M9 sulla piastra priva di batteri per lavare i vermi in un tubo di microcentrifuga. </li><li> Centrifugare a 3.000 xg per 1 min. I vermi dovrebbero formare un pellet nella parte inferiore del tubo. Aspirare la soluzione M9 senza interrompere il pellame di verme. Aggiungere 1 ml di M9 alla pellicola del verme, invertire il tubo per mescolare i vermi con la soluzione. </li><li> Ripetere i passaggi 1.4 ancora tre volte. <ol><li> Se i batteri in eccesso sono stati inizialmente trasferiti con i vermi, ripetere per un totale di 5 volte. Nessun batterio dovrebbe essere trasferito alle piastre di corsa alimentare in rame. Se il cibo viene trasferito sulla piastra di dosaggio, interferirà con una raccolta precisa dei dati. </li></ol></li><li> Dopo il lavaggio finale, aspirare il surnatante fino al 10081, L di M9 e il pellet verme rimane. Attenzione: i comportamenti legati alla fame risultano evidenti dopo 30 minuti. Di conseguenza, i vermi dovrebbero essere immediatamente trasferiti dalla soluzione una volta completati i passaggi di lavaggio. </li></ol> 2. Preparazione delle lastre di analisi <ol><li> Preparare le piastre standard di agar NGM due giorni prima del dosaggio. <ol><li> Se le lastre sono tenute in un ambiente umido, fare piastre agar 3 giorni prima del dosaggio. In alternativa, rimuovere il coperchio della piastra per 3 - 6 h per garantire una corretta secchezza (se in ambiente sterile). </li></ol></li><li> Con un marcatore permanente lungo, fare una linea sul lato inferiore della piastra lungo il bordo esterno e un altro per formare una barriera intermedia ( figura 1 ). La barriera intermedia dovrebbe essere equidistante da ogni bordo della piastra. Utilizzare un righello per garantire misurazioni precise. Queste linee serviranno come guida durante il trasferimento di batteri e la soluzione di rame. PurchéE. coli viene trasferito prima della soluzione di rame, queste linee serviranno come indicatori. </li><li> Piastra di semi con 50 μl di OP 50 E. coli su un solo lato della barriera di rame per creare un prato uniforme ( Figura 2 ). La concentrazione batterica dovrebbe rimanere coerente in tutti i dosaggi; Tuttavia, è stata osservata una piccola variabilità in risposta a lievi differenze di concentrazione. <ol><li> Utilizzare le linee contrassegnate sulla parte inferiore della piastra per assicurare che i batteri non vengano a contatto con la soluzione di rame. Fintanto che la soluzione di rame allinea il bordo della piastra e forma una barriera di media linea, trasferire i batteri in modo che la soluzione di rame non venga a contatto con la fonte alimentare. </li></ol></li><li> Segna un secondo set di piastre e non trasferisce OP50 E. coli a loro ( Figura 2 ). Queste lastre serviranno a valutare il controllo negativo. Queste piastre dovrebbero anche avere unMarcatura su una metà della piastra per indicare l&#39;origine di trasferimento iniziale. </li><li> Lasciare asciugare i batteri e incubare le piastre a 37 ° C per una notte. Assicurarsi che le patch batteriche non siano disturbate quando si trasferisce ad un incubatore oa una camera di 37 ° C. Il disturbo eccessivo potrebbe alterare la posizione o la forma della patch alimentare. </li></ol> 3. Analisi chimotassi <ol><li> Appena preparare una soluzione di solfato di rame (II) 0,5 M prima del tempo di inizio del test. A condizione che 125 μL di soluzione sia utilizzata per piastra, scalare questo volume in funzione del numero di piastre di dosaggio utilizzate ( ad es. 5 piastre di dosaggio, 625 μL). </li><li> Pipettare 100 μL della soluzione di solfato di rame (II) sul bordo dell&#39;agar per creare una barriera esterna in rame. Il contrassegno sottostante della piastra dovrebbe servire da guida. </li><li> Pipettare 25 μL della soluzione di solfato di rame (II) per creare una barriera di medie linee. <ol><li> Assicurarsi che la soluzione di solfato di rame (II)Non entrare in contatto con la patch batterica. Utilizzare una tecnica macchiata poiché le striature possono influenzare la locomozione a causa di indentazioni / graffi sull&#39;agar. </li></ol></li><li> Lasciare asciugare la soluzione di rame sulla lastra. Il periodo di tempo può variare a seconda delle piastre e delle condizioni del laboratorio. Controllare visivamente la secchezza ogni 5 min dopo il trasferimento. Nota: la soluzione di rame mostra una tonalità blu e facilmente identificabile. Utilizzare un tessuto di laboratorio per abbassare leggermente la soluzione vicino al bordo della piastra per discernere la secchezza. </li><li> Pipettare 20 μL di pellet di worm dal fondo del tubo sulla metà libera dal batterio della piastra di dosaggio. <ol><li> Assicurarsi che 10 vermi siano trasferiti alla piastra di dosaggio. Se i worm extra sono stati inclusi accidentalmente, rimuoverli raccogliendo con l&#39;olio di alogeno per assicurare che nessun batterio sia stato aggiunto alla piastra. Ogni dosaggio dovrebbe avere un numero consistente di nematodi durante il dosaggio. NOTA: se troppo pochi worm sono trasfErrato durante i test, incrementando la dimensione iniziale del campione, ridurrà le potenziali perdite durante le operazioni di lavaggio e trasferimento. </li></ol></li><li> Rimuovere l&#39;eccesso M9 dalla piastra con un tessuto di laboratorio. M9 non dovrebbe entrare in contatto con la soluzione di solfuro di rame (II). Attenzione: assicurarsi che i worm e la superficie del agar rimangano inalterati durante l&#39;esecuzione di questo passaggio. Se usato troppo duro, il tessuto di laboratorio può creare indentazioni sulla superficie del piatto agar e può rimuovere i vermi. I worms eliminati accidentalmente via KimWipe dovrebbero essere scartati. </li><li> Una volta che la soluzione M9 è stata rimossa e tutti i vermi hanno iniziato motivi locomotori non liquidi, avviare il cronometro del dosaggio. <ol><li> Ottimamente, rimuovere la soluzione M9 entro un min. Il parametro essenziale è l&#39;identificazione della locomozione sinusoidale. I worms si allontanano in modo diverso, ad esempio , se non liquido, piuttosto che sinusoidale. Avviare l&#39;orologio di stop di analisi una volta l&#39;organo sperimentaleGli ismi smettono di schiacciare. </li></ol></li><li> Controllare le lastre di dosaggio ogni 30 min. <ol><li> Per le piastre di analisi con patch batteriche, positivamente punteggio gli organismi se raggiungono la patch alimentare per un periodo di 4 h. Per le piastre di controllo negativo, organizzano positivamente gli organismi se hanno attraversato la barriera. </li></ol></li></ol>

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Non abbiamo niente da divulgare.

Questo disegno del dosaggio modifica il test di corsa alimentare 24 per includere una soluzione di rame per creare una barriera media lineare avversa e intorno al bordo della piastra per evitare una perdita di nematodi. Gli organismi sono testati per la loro capacità di attraversare la barriera avversaria e raggiungere una patch di cibo per un periodo di 4 h. Nel contesto di npr-9 (GF) abbiamo utilizzato questo test per valutare come le condizioni di fame potrebbero influenzare le risposte avversarie e la rilevazione di alimenti. A condizione che in precedenza abbiamo caratterizzato egli-9 (GF) come difettoso per la sensibilità al cibo e ai segnali avversi, abbiamo combinato gli indicatori ambientali multipli con lo stato nutrizionale per valutare se la fame potrebbe modulare i comportamenti difettosi npr-9 (GF) . Questo saggio si basa sulla capacità di un verme di rilevare e rispondere agli stimoli chimici e agli indizi alimentari 3 , 4 . Data le varie variabili analizzate, le condizioni dell&#39;exGli organismi sperimentali devono essere controllati minuziosamente per eliminare i fattori confondenti. Per i mutanti non caratterizzati, vale a dire quelli con avversione sconosciuta o reattività alimentare, dovrebbero essere utilizzati ceppi di controllo aggiuntivi. Anche i ceppi difettosi avversi, ad es. Che -2 o odr-3 28 e mutanti che non alterano i motori locomotori alimenti, ad esempio tph-1 29 , dovrebbero essere valutati in parallelo per garantire che le condizioni di rame e di fame siano adeguatamente controllate. Inoltre, per evidenziare più direttamente il contributo della fame al comportamento valutato, condizioni di analisi separate possono essere sviluppate anche per ulteriori controlli. Ad esempio, i nematodi possono essere affamati immediatamente prima del dosaggio e trasferiti alla piastra di dosaggio (con alimenti) per identificare quanto rapidamente un organismo in condizioni di affaticamento risponderà al rame e raggiungere la patch di cibo. Il nostro test attuale evidenzia avCome gli organismi sperimentali avanzano da uno stato ben nutrito e affamato. Il nostro dosaggio è una modifica del metodo comunemente usato di C. elegans chemotaxis 4 in cui è stato incorporato uno stimolo più forte (ad esempio un&#39;alta concentrazione) per valutare i comportamenti per un periodo di tempo più prolungato. Invece di valutare le risposte istantanee, questo saggio può essere utilizzato per misurare le variazioni delle risposte avversive in quanto gli organismi avanzano verso uno stato affamato (se sono inclusi i controlli necessari). Sono state utilizzate analisi simili in assenza di rame per valutare le reazioni di ritiro dell&#39;etanolo, ossia i nematodi che individuano cibo, nel corso del tempo 24 . Come nel caso di un test comportamentale in C. elegans, il controllo delle variabili ambientali è essenziale per garantire risultati costantemente riproducibili. Gli organismi devono essere tutti ugualiE, dato che le risposte comportamentali possono variare con l&#39;età. Inoltre, la variabilità dello stato nutrizionale dei vermi può alterare l&#39;acclimatazione alle condizioni di fame. Pertanto, i worm sperimentali non dovrebbero subire la fame in nessun punto prima di questo protocollo. L&#39;esperienza di invecchiamento della generazione genitoriale può anche influenzare il comportamento di progenie 30 ; Pertanto, è consigliabile assicurare che gli organismi sperimentali siano ben alimentati per almeno due generazioni. Inoltre, il numero di organismi trasferiti sulle lastre di dosaggio dovrebbe rimanere coerente in quanto la densità locale della popolazione può influenzare i tassi di dispersione 31 . Una volta che i vermi sono stati trasferiti sulle piastre, è fondamentale rimuovere l&#39;eccesso di soluzione M9 con un tessuto di laboratorio senza danneggiare la superficie del agar. L&#39;alterazione alla superficie può interferire con schemi locomotori spontanei. La soluzione in eccesso deve essere rimossa correttamente prima di iniziare l&#39;inizio ufficialeIl saggio per assicurare che il comportamento di rottura, cioè un motivo locomotorio nematode osservato in liquido, non sia presente. Un indicatore chiaro è cercare un comportamento strisciante. Le piastre di prova devono essere controllate in modo che la piastra e la secchezza batterica siano coerenti. Piastre troppo fresche possono causare difetti locomotori e possono anche interferire con la rilevazione degli stimoli ambientali 6 . L&#39;applicazione delle soluzioni di rame deve essere il più coerente possibile in modo che le barriere avversarie siano adeguatamente spesse e non entrano in contatto con la fonte alimentare. Applicando troppo poco la soluzione di rame potrebbe diminuire il tempo di risposta aversivo di tipo selvaggio, mentre troppo potrebbe provare letale ai nematodi. L&#39;obiettivo per uno spessore uniforme alla soluzione di rame produce i migliori risultati. Se si creano indentazioni nell&#39;agar durante l&#39;applicazione della soluzione in rame, la piastra di dosaggio deve essere scartata. I vermi possono penetrare attraverso tali fori 32, Soprattutto quando si trovano di fronte ad una sostanza avversa o alla fame. Per assicurare l&#39;uniformità delle piastre tra i campioni, sulla stessa piastra potevano essere misurate le popolazioni miste di vermi ( cioè un mutante e un tipo selvatico) se si distinguesse chiaramente ( ad esempio tramite GFP). Anche se questo test è stato eseguito su piastre di agar di dimensioni standard, possono essere impiegate piastre più grandi ( ad es. Diametro 100 mm). In questo scenario, la durata del dosaggio deve essere estesa a 6 h per fornire tempo sufficiente per il movimento di worm. Le piastre più grandi potrebbero permettere la sperimentazione di popolazioni più grandi e potrebbero essere utilizzate per indagare su come la densità della popolazione influenza risposte avversive per lunghi periodi di tempo. Inoltre potrebbero essere incorporate procedure più avanzate tecnicamente con l&#39;uso di apparecchiature di monitoraggio del worm accoppiato ad uno stadio mobile 33 . Il monitoraggio del worm permetterebbe misure più precise e consentire la raccolta di variabili aggiuntive ( ad es </Em&gt; frequenza di rotazione, frequenza di inversione). Inoltre, la raccolta dei dati sarà continuamente registrata nel corso del periodo di 4h per dare una data precisa dei comportamenti indotti dalla fame. Il dosaggio può essere facilmente adattato per consentire la misura di fenotipi alternativi. L&#39;età del verme può essere variata per consentire di misurare i cambiamenti avversi indotti dalla fame causati dall&#39;invecchiamento. Inoltre, le variazioni allo stato nutrizionale dei vermi sperimentali potrebbero anche consentire l&#39;analisi dell&#39;abitudine alla fame nell&#39;ambito dell&#39;avversione alimentare e chimica. Fintanto che i protocolli sono coerenti tra set di dati paragonabili, quasi tutti i precondizionamenti di organismi sperimentali potrebbero essere valutati attraverso il dosaggio della chemotaxis.

Caenorhabditis elegans è stato usato come modello per lo studio della neurobiologia da decenni a causa della relativa facilità nell&#39;analisi della circuiteria di un sistema nervoso composto da soli 302 neuroni 1 . Fintanto che l&#39;organismo è affidato a rispondere alle indicazioni ambientali, gran parte del sistema nervoso è dedicato a regolare l&#39;integrazione dei segnali ambientali 2 . Nonostante la semplicità del suo sistema nervoso, C. elegans può rilevare e rispondere a diversi segnali ambientali, compresi repellenti 3 , attrattivi 4 , temperatura 5 e persino umidità 6 . Un fallimento per integrare correttamente i segnali ambientali è stato collegato a una serie di disturbi del comportamento e delle condizioni neurodegenerative in sistemi modello di mammiferi 7- 9. Con una gamma di modelli di malattie neurali disponibili<html> 10 in C. elegans e lo sviluppo di schermi farmaceutici nematodi 11 , questo organismo si è rivelato un utile sistema per lo studio della neurobiologia. Dato la disponibilità di un mappato connettorio 1 e mutazioni a quasi tutti i genomi del genoma nematode 12 , la nostra comprensione del sistema nervoso nematode, e per estensione la nostra, è parzialmente limitata dalla progettazione di test creativamente appropriati. Negli ultimi 40 anni sono stati sviluppati diversi test di chemotaxis per valutare la reattività del nematode a diversi stimoli avversi 3 , 4 , 13 , 14 , 15 . La sperimentazione iniziale ha comportato l&#39;introduzione di uno stimolo ambientale acuto, mentre un singolo worm ha percorso un piatto di agar= &quot;Xref&quot;&gt; 3 , 14 , 16 . Sono state registrate modifiche immediate alle risposte locomotorie. Ad esempio, l&#39;odorante volatile dell&#39;ottanolo può essere applicato a un capello e si è spostato di fronte a un naso di nematode per stimolare l&#39;inizio della locomozione all&#39;indietro nei vermi di tipo selvatico 17 . Sono stati inoltre sviluppati test più complessi per incorporare più variabili come mezzo per valutare la scelta comportamentale 18 . Una variante di questo dosaggio comporta l&#39;impiego di una soluzione di rame per creare una barriera avversaria della linea mediana 4 . Un attraente, vale a dire diacetilico, è stato posto su un lato della barriera chimica con vermi trasferiti lontani dalla fonte di diacetile. I vermi difettosi per le risposte aversive di rame immediatamente attraversarono la barriera per raggiungere il diacetil, mentre i vermi di tipo selvaggio furono inizialmente respinti dalla barriera. Le risposte sono state rilevate quando i vermi hanno avvicinato la barriera al rameSenza osservazioni a lungo termine. Quando i vermi vengono valutati dopo essere stati sottoposti a fame, la loro sensibilità agli stimoli ambientali diminuisce 19 . Quando l&#39;ottanolo chimico avversivo viene distrutto davanti al naso nematode, gli organismi di tipo selvatico stimolano il movimento all&#39;indietro entro 3 - 5 s quando sono al cibo. Dopo che questi organismi sono stati rimossi dal cibo per 10 minuti, presentano una risposta ritardata di 8-10 s 20 . Così, con una maggiore fame, i nematodi mostrano una diminuita risposta avversa a segnali ambientali nocivi, poiché la ricerca di cibo diventa più essenziale per la sopravvivenza. Viceversa, i nematodi che il recettore neuropeptidico 9 ( esim-9) eccessivamente esprimono, non rispondono all&#39;ottanolo in o fuori dal cibo e presentano un&#39;incapacità di rispondere ad un certo numero di stimoli avversi 21 . Questi organisms ego-9 (GF) non modulano anche la loro frequenza di inversione in presenza di cibo, ma possonoReverse in risposta a stimoli di tocco duro che indicano che sono in grado di una locomozione indietro 21 . Abbiamo anche valutato i Mutanti z1-9 (LF) dato che presentano una frequenza di inversione anormalmente ridotta al di fuori del cibo, ma possono modulare il loro comportamento in presenza di cibo 21 . Accoppiare lo stato nutrizionale del verme con l&#39;introduzione di stimoli esterni acuti ha contribuito a spiegare i meccanismi attraverso i quali un percorso alimentare può ampiamente modulare i percorsi sensoriali di segnalazione 22 , 23 . La presenza di cibo nell&#39;ambiente nematodi è stata utilizzata anche per valutare le risposte di prelievo di etanolo 24 . In questo esperimento, i vermi sono stati incubati in varie concentrazioni di etanolo e poi sono state poste su un piatto di agar con una patch di alimento conosciuto come un &quot;assaggio della corsa alimentare&quot;. La patch alimentare è stata posta su un bordo della piastra mentre i nematodi wEretta lontano dalla fonte alimentare. Il ritiro di etanolo è stato valutato misurando la durata del tempo necessario per i worm per raggiungere la zona di cibo. Questo test di avversione di rame basata sulla nutrizione si basa sul test sulla corsa alimentare per integrare ulteriori variabili ambientali, vale a dire cibo e rame, valutando nel contempo i cambiamenti comportamentali. Questo è un adattamento di un protocollo di uso comune in tutta la comunità C. elegans 4 . Questo protocollo è stato utilizzato per valutare le risposte avversarie e la rilevazione del cibo durante un periodo di quattro ore 21 . Poiché i vermi mostrano comportamenti di fame dopo 30 minuti di deprivazione alimentare 25 , siamo anche in grado di valutare come le modifiche allo stato nutrizionale possano influenzare le risposte ambientali. Le condizioni di questo dosaggio misurano come gli organismi sperimentali cambino la risposta a stimoli avversi nel tempo, quindi valuta i cambiamenti comportamentaliGli organismi avanzano verso uno stato affamato (e continue misurazioni di fame di lunga durata). Dal momento che gli animali da zo-9 (GF) non alterano il loro comportamento in risposta a cibo oa molti segnali avversi, abbiamo cercato di identificare se questi disfunzioni comportamentali continuerebbero a persistere nel contesto della fame. In definitiva, questo progetto di dosaggio è stato formulato per valutare in modo specifico i mutanti z1-9 (GF), ma può essere ulteriormente adattato anche a caratterizzare nuovi ceppi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="689">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;width:332px;">M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.]</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Produced in lab</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:332px;">Cupric Sulfate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C-1297</td>
			<td style="width:167px;">Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a caenorhabditis elegans nutritional-status based copper aversion assay

Per garantire la sopravvivenza, gli organismi devono essere in grado di evitare habitat sfavorevoli pur garantendo una fonte alimentare coerente. Caenorhabditis elegans altera i loro modelli locomotori sulla rilevazione di diversi stimoli ambientali e può modulare la loro suite di risposte comportamentali in risposta alle condizioni di fame. I nematodi presentano tipicamente una diminuzione della risposta avversa quando vengono rimossi da una fonte alimentare per oltre 30 minuti. L&#39;osservazione dei cambiamenti comportamentali in risposta a un cambiamento dello stato nutrizionale può fornire una visione dei meccanismi che regolano la transizione da uno stato ben nutrito allo stato affamato. Abbiamo sviluppato un saggio che misura una capacità del nematode di attraversare una barriera avversaria ( cioè rame) e quindi raggiungere una fonte di cibo per un lungo periodo di tempo. Questo protocollo si basa sul lavoro precedente integrando più variabili in modo tale da consentire una continua raccolta dei dati quando gli organismi si spostano verso unN condizioni sempre più affamate. Inoltre, questo esame consente una maggiore dimensione del campione in modo che le popolazioni più grandi di nematodi possano essere valutate simultaneamente. Gli organismi difettosi per la capacità di rilevare o reagire al rame attraversano immediatamente la barriera chimica, mentre i nematodi di tipo selvatico vengono inizialmente respinti. Poiché i vermi di tipo selvaggio sono sempre più affamati, iniziano a attraversare la barriera e raggiungere la fonte alimentare. Abbiamo progettato questo test per valutare un mutante incapace di rispondere a varie indicazioni ambientali, tra cui la sensazione di cibo o la rilevazione di sostanze chimiche avverse. Quando vengono valutati tramite questo protocollo, gli organismi difettosi hanno subito attraversato la barriera, ma sono stati anche incapaci di rilevare una fonte di cibo. Quindi, questi mutanti attraversano ripetutamente la barriera chimica nonostante temporaneamente raggiungono una fonte di cibo. Questo test può testare in modo diretto le popolazioni di vermi per valutare i possibili difetti di percorso correlati all&#39;avversione e alla fame.

Utilizziamo il tipo selvatico (N2), npr-9 (tm1652) e un ceppo di sovraespressione npr-9 , cioè npr-9 (GF) (IC836 - npr-9 :: npr-9; sur-5 :: gfp; -1 :: rfp), per valutare le risposte alla fame e all&#39;avversione di rame. Gli organismi di tipo selvatico sono in grado di rilevare e rispondere alla barriera di rame avversa, mentre i mutanti z-9 (GF) non iniziano una risposta avversaria al rame nel corso del test di 4 ore 21 . Dopo 30 minuti di fame, circa il 50-60% degli organismi selvatici (N2) attraversano la barriera di rame e raggiungono la zona alimentare. Al contrassegno di 2 h, il 75% dei nematodi di tipo selvatico raggiunge la fonte alimentare. Alla fine del test, il 100% degli organismi N2 si è trasferito alla fonte alimentare. Al contrario, la maggior parte degli organismi z-9 (GF) non modulano i motivi locomotori in risposta al cibo e continueranno ad attraversare la barriera avversaria anche dopo essere entrati in contatto con un alimentofonte. I vermi z1-9 (GF) continuano a non alterare la loro locomozione in risposta al cibo durante il saggio di 4h e solo il 30% degli organismi di prova si trovano sul cibo in un dato momento. Gli animali da zo-9 (LF) non sono in grado di eseguire né gli organismi N2, ma modulano i loro modelli locomotori, poiché aumenta la fame per raggiungere la zona alimentare ( Figura 3 ). Quando gli organismi N2 o ego-9 (LF) vengono valutati attraverso questo saggio senza cibo, attraversano raramente la barriera di rame. I mutanti z1-9 (GF) attraversano ripetutamente la barriera avanti e indietro ( Figura 4 ). <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55939/55939fig1.jpg" /> Figura 1 : Una rappresentazione visiva delle marcature per indicare la collocazione della soluzione di rame sul sottostante di un piatto di Petri da 5 cm. Queste indicazioni vengono utilizzate per assicurarleLe sezioni della piastra sono state adeguatamente misurate e servono da guida quando trasferiscono la patch batterica e poi la soluzione di rame sulla superficie del agar. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55939/55939fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55939/55939fig2.jpg" /> Figura 2 : Il piatto di Petri da 5 cm è suddiviso in due sezioni per on e off le piastre di analisi alimentare e un prato batterico è formato nel centro di una di queste sezioni per la piastra alimentare. La patch alimentare non dovrebbe entrare in contatto con il composto di prova che allinea i bordi della piastra e forma una barriera di mediana. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55939/55939fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> &lt;P class = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55939/55939fig3.jpg" /> Figura 3 : Percentuale di N2, npr-9 (tm1652) e preludi di ze-9 (GF) che raggiungono la fonte alimentare in un periodo di quattro ore in risposta all&#39;analisi di aversione di rame basata sullo stato nutrizionale. I punti dati sono medie di almeno tre esperimenti (n&gt; 30 worm) eseguiti in giorni separati per entrambi i ceppi. I dati sono presentati come errori medio ± standard e vengono analizzati con una misura bidirezionale ANOVA. ** p &lt;0.01, significativamente diverso dagli animali N2 in condizioni identiche. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55939/55939fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55939/55939fig4.jpg" /> Figura 4 : Percentuale di N2, npr-9 (tm1652) e npr-9 (GF) W orms che attraversano la barriera di rame senza fonte di cibo durante un test a quattro ore. I suddetti ceppi sono stati valutati per l&#39;avversione di rame in assenza di cibo. Le risposte positive sono segnate come attraversando la barriera di rame e rimanendo sulla metà non di origine della piastra. I punti dati sono medie di almeno tre esperimenti (n&gt; 30 worm) eseguiti in giorni separati per entrambi i ceppi. I dati sono presentati come media ± SE e almeno 10 animali sono stati analizzati in tre esperimenti indipendenti analizzati con una misura a due vie ANOVA. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55939/55939fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

UN<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Analisi di Aversione di rame basata sullo stato nutrizionale

Qui presentiamo un esame specifico di Caenorhabditis elegans progettato per valutare i cambiamenti nel comportamento avversione di rame e la capacità di individuare una fonte di cibo comune, in quanto l&#39;organismo progredisce da uno stato alimentare ben nutrito e affamato.

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their ...

a-caenorhabditis-elegans-nutritional-status-based-copper-aversion

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

6.4K Views.  Queen's University.  Qui presentiamo un esame specifico di Caenorhabditis elegans progettato per valutare i cambiamenti nel comportamento avversione di rame e la capacità di individuare una fonte di cibo comune, in quanto l'organismo progredisce da uno stato alimentare ben nutrito e affamato. 

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Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

Quantificazione automatica di fluorescenza in Synaptic<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

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Neuroscienze

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Sistema modello per Amylopathy Studio

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C. elegans genome includes potential antipsychotic drug (APD) targets conserved in humans, including genes encoding proteins required for neurotransmitter synthesis and for synaptic structure and function. APD exposure produces developmental delay and/or lethality in nematodes in a concentration-dependent manner. These phenotypes are caused, in part, by APD-induced inhibition of pharyngeal pumping1,2. Thus, the developmental phenotype has a neuromuscular basis, making it useful for pharmacogenetic studies of neuroleptics. Here we demonstrate detailed procedures for testing APD effects on nematode development and pharyngeal pumping. For the developmental assay, synchronized embryos are placed on nematode growth medium (NGM) plates containing APDs, and the stages of developing animals are then scored daily. For the pharyngeal pumping rate assay, staged young adult animals are tested on NGM plates containing APDs. The number of pharyngeal pumps per unit time is recorded, and the pumping rate is calculated. These assays can be used for studying many other types of small molecules or even large molecules.

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Approaches for testing the effects of antipsychotic drugs (APDs) in Caenorhabditis elegans are demonstrated. Assays are described for testing drug effects on development and viability and on pharyngeal pumping rate. These methods are also applicable for pharmacogenetic experiments with drug classes other than APDs.

Metodi per studiare i meccanismi d&#39;azione di farmaci antipsicotici in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the development of more effective treatments is the relative lack of understanding of the molecular underpinnings of the effects of ethanol on behavior. The nematode, Caenorhabditis elegans (C.&#160;elegans), provides a useful model in which to generate and test hypotheses about the molecular effects of ethanol. Here, we describe an assay that has been developed and used to examine the roles of particular genes and environmental factors in behavioral responses to ethanol, in which locomotion is the behavioral output. Ethanol dose-dependently causes an acute depression of crawling on an agar surface. The effects are dynamic; animals exposed to a high concentration demonstrate an initial strong depression of crawling, referred to here as initial sensitivity, and then partially recover locomotion speed despite the continued presence of the drug. This ethanol-induced behavioral plasticity is referred to here as the development of acute functional tolerance. This assay has been used to demonstrate that these two phenotypes are distinct and genetically separable. The straightforward locomotion assay described here is suitable for examining the effects of both genetic and environmental manipulations on these acute behavioral responses to ethanol in C.&#160;elegans.

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

C. elegans is a useful model for studying the effects of ethanol on behavior. We present a behavioral assay that quantifies the effects of ethanol on the locomotion speed of crawling worms; both initial sensitivity and the development of acute functional tolerance to ethanol can be measured with this assay.

Un test per misurare gli effetti di etanolo sulla velocità di Locomotion<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Microchambers Agarose per lungo termine Imaging di calcio<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense organs provide an excellent model system for the study of mechanosensation. This protocol describes a simple touch behavior in fruit flies which can be used to identify mutations that interfere with mechanosensation. The tactile stimulation of a macrochaete bristle on the thorax of flies elicits a grooming reflex from either the first or third leg. Mutations that interfere with mechanotransduction (such as NOMPC), or with other aspects of the reflex arc, can inhibit the grooming response. A traditional screen of adult behaviors would have missed mutants that have essential roles during development. Instead, this protocol combines the touch screen with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) to allow for only limited regions of homozygous mutant cells to be generated and marked by the expression of green fluorescent protein (GFP). By testing MARCM clones for abnormal behavioral responses, it is possible to screen a collection of lethal p-element mutations to search for new genes involved in mechanosensation that would have been missed by more traditional methods.

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

In order to identify novel mutations affecting mechanosensation, we designed an assay that measures the behavioral response to tactile stimulation of fly bristles in mutant clones generated by the MARCM method. The combination of techniques allows for the identification of mechanosensitive mutations that would otherwise be lethal.

Un test comportamentale per Mechanosensation di cloni in marcm-based<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. Embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans is a late developmental stage consisting of the elongation of the embryo along its longitudinal axis. This developmental stage is controlled by intercellular communication between hypodermal cells and underlying body-wall muscles. These signaling mechanisms control the morphology of hypodermal cells by remodeling the cytoskeleton and the cell-cell junctions. Measurement of embryonic lethality and developmental arrest at larval stages as well as alteration of cytoskeleton and cell-cell adhesion structures in hypodermal and muscle cells are classical phenotypes that have been used for more than 25 years to dissect these signaling pathways. Recent studies required the development of novel metrics specifically targeting either early or late elongation and characterizing morphogenic defects along the antero-posterior axis of the embryo. Here, we provide detailed protocols enabling the accurate measurement of the length and the width of the elongating embryos as well as the length of synchronized larvae. These methods constitute useful tools to identify genes controlling elongation, to assess whether these genes control both early and late phases of this stage and are required evenly along the antero-posterior axis of the embryo.

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Here we detail protocols specifically designed to monitor morphogenic defects that occur during early and late phases of embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans. Ultimately, these protocols are designed to identify genes that regulate these phases and to characterize their differential requirements along the antero-posterior axis of the embryo.

Nuovi parametri per caratterizzare embrionale Allungamento del nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc superoxide dismutase 1 (SOD1). The structural instability of SOD1 and the detection of SOD1-positive inclusions in familial-ALS patients supports a potential causal role for misfolded and/or aggregated SOD1 in ALS pathology. In this study, we describe the development of a cell-based assay designed to quantify the dynamics of SOD1 aggregation in living cells by high content screening approaches. Using lentiviral vectors, we generated stable cell lines expressing wild-type and mutant A4V SOD1 tagged with yellow fluorescent protein and found that both proteins were expressed in the cytosol without any sign of aggregation. Interestingly, only SOD1 A4V stably expressed in HEK-293, but not in U2OS or SH-SY5Y cell lines, formed aggregates upon proteasome inhibitor treatment. We show that it is possible to quantify aggregation based on dose-response analysis of various proteasome inhibitors, and to track aggregate-formation kinetics by time-lapse microscopy. Our approach introduces the possibility of quantifying the effect of ALS mutations on the role of SOD1 in aggregate formation as well as screening for small molecules that prevent SOD1 A4V aggregation.

We describe a method to quantify the aggregation of misfolded proteins. Our protocol details lentiviral induced stable cell line generation, automated confocal imaging, and image analysis of protein aggregates. As an illustrative application, we studied the effect of small molecules in promoting SOD1 aggregation in a time- and dose-dependent manner.

Sviluppo di analisi per la quantificazione alto contenuto di formazione aggregata di Sod1 mutante della proteina in cellule viventi

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

Raziometrici calcio Imaging di singoli neuroni nel comportarsi Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are specialized sites of synaptic innervation modulated by activity and serve as substrates for learning and memory. Recently, dendritic spines have been described for DD GABAergic neurons as the input sites from presynaptic cholinergic neurons in the motor circuit of Caenorhabditis elegans. This synaptic circuit can now serve as a powerful new in vivo model of spine morphogenesis and function that exploits the facile genetics and ready accessibility of C. elegans to live-cell imaging. 
This protocol describes experimental strategies for assessing DD spine structure and function. In this approach, a super-resolution imaging strategy is used to visualize the intricate shapes of actin-rich dendritic spines. To evaluate the DD spine function, the light-activated opsin, Chrimson, stimulates the presynaptic cholinergic neurons, and the calcium indicator, GCaMP, reports the evoked calcium transients in postsynaptic DD spines. Together, these methods comprise powerful approaches for identifying genetic determinants of dendritic spines in C. elegans that could also direct spine morphogenesis and function in the brain.

Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are important cellular features of the nervous system. Here live imaging methods are described for assessing the structure and function of dendritic spines in C. elegans.&#160;These approaches support the development of mutant screens for genes that define dendritic spine shape or function.

Imaging delle spine dendritiche in Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are specialized sites of synaptic innervation modulated by activity and serve as substrates for learning and memory. Recently, dendritic ...