この研究は、自然科学およびエンジニアリング研究協議会（Canada Discovery Grant）RGPIN36481-08によってWilliam G. Bendenaに支持された。

1.実験生物の調製<ol><li> 生物が試験の際に若年成人であることを確認するために、アッセイを開始する24時間前に10株あたり10 L4段階の線虫を選ぶ。試験したそれぞれの突然変異体または対照線虫について、10匹のL4s（対照については10、アッセイについては10）を選択する。 <ol><li>標準的な方法26、OP50 大腸菌を播種し、標準的な寒天プレート上で27 24時間を使用して、L4生物を維持します。その後の洗浄ステップ中に生物が失われた場合は、開始サンプルサイズを増やして補正します（ つまり 、10個ではなく20個のワームを選ぶ）。 注：行動は本来変わる表現型です。 3つの別々の日に各株について3通りずつ方法を実施する。議論のセクションで強調したように、新規株のための追加の対照株および条件を含める。 </li></ol></li><li> アッセイの直前に、実験用のorga細菌を含まない寒天プレートに接種し、線虫が1分間自由に動いて余分な細菌を除去することを可能にする。 <ol><li>実験生物がアッセイの24時間前に汚染条件を経験した場合は、それらを捨てる。 </li></ol></li><li>細菌を含まないプレートに1 mLのM9をピペットで入れ、ワームをマイクロ遠心チューブに洗います。 </li><li> 3,000 xgで1分間遠心する。虫は、チューブの底にペレットを形成するはずです。ワームペレットを破壊することなくM9溶液を吸引する。ワームペレットに1 mLのM9を加え、チューブを反転させてワームを溶液と混合する。 </li><li> ステップ1.4をさらに3回繰り返します。 <ol><li>余分な細菌が最初にワームで移された場合は、合計5回繰り返します。銅フードレースプレートに細菌を移すべきではありません。食品がアッセイプレートに移されると、正確なデータ収集が妨げられます。 </li></ol></li><li>最終洗浄後、100まで上清を吸引する81; M9のLおよびワームペレットが残る。 注意：飢餓関連の行動は30分後に明らかになります。その結果、ワームはすぐに洗い流しが完了したら解決から移すべきです。 </li></ol> 2.アッセイプレートの調製<ol><li> 標準NGM寒天プレートをアッセイの2日前に調製する。 <ol><li>プレートを湿気の多い環境に置く場合は、アッセイの3日前に寒天プレートを作製する。あるいは、プレートのふたを3〜6時間はがしてください（滅菌環境の場合）。 </li></ol></li><li>太い恒久的なマーカーを使用して、プレートの外面に沿って下側に線を作り、中線のバリアを形成するようにもう一方の線を作ってください（ 図1 ）。ミッドラインバリアは、プレートの各エッジから等距離にある必要があります。正確な測定を保証するためにルーラーを使用してください。これらの系統は、バクテリアと銅溶液を移すときの目安となります。それを提供する大腸菌は銅溶液の前に移され、これらの系統は指標となる。 </li><li> シードプレートに50μLのOP50 E. coliを銅障壁の片側にのみ塗布し、均一な芝生を作製した（ 図2 ）。細菌濃度は、アッセイ全体にわたって一定でなければならない。しかしながら、濃度の穏やかな差異に応答して、ほとんど変化しないことが観察された。 <ol><li>プレートの下側​​にあるマーク付きの線を使用して、細菌が銅溶液と接触しないようにします。銅溶液がプレートの縁に沿って中間線バリアを形成するならば、銅溶液が食物源と接触しないように細菌を移す。 </li></ol></li><li>第2セットのプレートに印を付け、OP50 E.coliをそれらに移さない（ 図2 ）。これらのプレートは、ネガティブコントロールを評価するのに役立つ。これらのプレートにはまた、最初の転写起点を示すためにプレートの半分にマーキングする。 </li><li>細菌を乾燥させ、プレートを37℃で一晩インキュベートする。 37℃のインキュベーターまたは室内に移す際に細菌のパッチが乱されないように注意してください。過度の妨害は、食品パッチの位置または形状を変える可能性がある。 </li></ol> 3.走化性アッセイ<ol><li>アッセイ開始時間の前に、0.5M硫酸銅（II）溶液を新鮮に調製する。プレートあたり125μLの溶液が使用される場合、使用されるアッセイプレートの数（ 例えば、 5つのアッセイプレート、625μL）に依存して、この体積をスケールアップする。 </li><li> 100μLの硫酸銅（II）溶液を寒天の端にピペットで入れ、外側の銅バリアを作ります。マークされたプレートの下面が目安になります。 </li><li> 25μLの硫酸銅（II）溶液をピペットで入れ、中線バリアを作成する。 <ol><li>銅（II）硫酸塩溶液が細菌パッチとは接触しません。ストリークは寒天上のくぼみ/傷に起因する運動に影響を与える可能性があるため、点検技術を使用してください。 </li></ol></li><li>銅溶液をプレート上に乾燥させる。時間は、プレートとラボの条件によって異なります。移動後5分ごとに目視で乾燥状態をチェックする。 注：銅溶液は青色の色合いを示し、容易に識別できます。実験室のティッシュを使用して、プレートの端近くの溶液を軽く拭き取って乾燥を確認します。 </li><li> チューブの底からアッセイプレートの無菌半分上にウォームペレット20μLをピペットで加える。 <ol><li> 10個のワームがアッセイプレートに移されていることを確認します。追加のワームが誤って含まれていた場合は、ハロカーボンオイルで拭いて除去し、プレートに細菌が追加されていないことを確認します。各アッセイは、アッセイ中に一貫した数の線虫を有するべきである。 注：あまりにも少ない数のワームが感染している場合初期サンプルサイズを増加させることは、洗浄および移動の間の潜在的な損失を軽減する。 </li></ol></li><li>実験室の組織でプレートから過剰のM9を除去する。 M9は硫酸銅（II）溶液と接触してはならない。 注意：この手順を実行中は、ワームや寒天表面に影響を与えないように注意してください。あまりにも過酷に使用された場合、実験室組織はプレートの寒天表面にくぼみを形成し、ワームを除去することができます。 KimWipe 経由で誤って削除されたワームは破棄する必要があります。 </li><li> M9溶液を取り除き、すべてのワームが非液体歩行パターンを開始したら、アッセイストップウォッチを開始します。 <ol><li>最適には、分以内にM9溶液を除去する。本質的なパラメータは、正弦波運動の同定である。ワームは、時に液体で、異なっlocomote 例えばスラッシングではなく、正弦波。実験用の器官ごとに1回、アッセイ停止時計を開始するismsはスラッシングを止める。 </li></ol></li><li> 30分ごとにアッセイプレートをチェックする。 <ol><li>細菌パッチを含むアッセイプレートの場合、4時間にわたって食品パッチに到達すると、生物を正に評価する。ネガティブコントロールプレートについては、障壁を越えた場合には、生物にプラスのスコアを付けます。 </li></ol></li></ol>

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私たちは何も開示することはありません。

このアッセイ設計は、食品レースアッセイ24を変更して、嫌気性正中線バリアを作成し、線虫の損失を防ぐためにプレートの縁の周りに銅溶液を含むようにする。生物は、嫌悪の障壁を横切り、4時間にわたって食物パッチに達する能力について試験される。 npr-9（GF）との関連で 、我々は飢餓状態が嫌悪反応および食物の検出にどのように影響するかを評価するためにこのアッセイを利用した。以前はnpr-9（GF）を食物および嫌がらせの応答性に欠陥があると判断した場合、飢餓がnpr-9（GF）の欠陥行動を調節できるかどうかを評価するために、このアッセイは、検出し、化学的刺激や食品手がかり3、4に対応するワームの能力に依存しています。様々な変数を分析すると、ex混乱の要因を排除するためには、周囲の生物を注意深く制御しなければならない。未特徴の突然変異体、 すなわち未知の退行性または食物応答性を有するものについては、追加の対照株を利用する必要がある。 例えば、 che-2またはodr-3 28のような 、Aversive欠損株および食物からの歩行パターンを変えない突然変異体、 例えば tph-1 29も、銅および飢餓状態が適切に制御されることを確実にするために並行して評価されるべきである。さらに、評価された挙動に対する飢餓の寄与をより直接的に強調するために、追加の対照について別個のアッセイ条件を開発することもできる。例えば、線虫はアッセイの直前に飢えさせられ、飢餓状態の生物がどれくらい迅速に銅に反応して食物パッチに到達するかを同定するためにアッセイプレート（食物と共に）に移される。当社の現在のアッセイでは、実験的生物が十分に栄養を与えられた状態から飢えた状態に進行するにつれて、ersiveな反応を示す。 本発明者らのアッセイは、より長期間にわたって行動を評価するために、より強い刺激（ すなわち、高濃度）が組み込まれた、一般的に用いられるC.エレガンス走化性アッセイ4の改変である。瞬間的な反応を評価するのではなく、このアッセイを利用して、飢えた状態に向かって生物が進行するにつれて嫌悪反応の変化を測定することができます（必要なコントロールが含まれている場合）。同様の評価は、エタノール離脱応答、 すなわち 、食物を見つける線虫を時間の経過と共に評価するために、銅の非存在下で用いられている24 。 線虫での行動アッセイの場合と同様に、環境変数を制御することは、一貫して再現性のある結果を確保する上で不可欠です。生物はすべて同じagでなければなりません行動反応は年齢によって異なる可能性があるので、e。さらに、ワームの栄養状態の変動は、飢餓状態への順応を変える可能性があります。したがって、実験用ワームは、このプロトコールの前のどの時点でも飢餓状態になるべきではありません。親世代の飢餓体験も子孫の行動に影響を及ぼす30 。したがって、実験生物が少なくとも2世代にわたって十分に給餌されていることを確認することが望ましい。さらに、局所集団密度が散布率に影響を及ぼす可能性がある場合、アッセイプレートに移される生物数は一定でなければならない31 。ワームがプレートに移されたら、寒天表面を損傷することなく、過剰なM9溶液を実験室組織で除去することが重要です。表面への変化は、自発的な歩行パターンを妨げる可能性がある。余分な解決策は、公式の開始を開始する前に適切に削除する必要があります。スラッシング行動、 すなわち液体中に観察される線虫の歩行パターンが存在しないことを確実にするアッセイ。明確な指標は、クロールの動作を探すことです。 アッセイプレートは、プレートと細菌の乾燥が一致するように制御する必要があります。過度に新鮮なプレートは、運動器官の欠陥を引き起こす可能性がありますし、また、環境刺激6の検出を妨害することができます。銅溶液の適用は、妨害障壁が適切に厚く、それらが食物源と接触しないようにできるだけ一貫している必要がある。あまりにも少ない銅溶液を適用すると、野生型の嫌な応答時間を短縮することができ、あまりにも多くは線虫に致命的であることが判明する可能性がある。銅溶液に対する均一な厚さを目指すと、最良の結果が得られる。銅溶液塗布中に寒天にくぼみが生じた場合、アッセイプレートを廃棄する必要があります。ワームは、このような穴32を通って穿孔することができる特に、嫌悪物質や飢えに直面しているとき。サンプル間でプレートの均一性を保証するために、ワームの混合集団（ すなわち突然変異体および野生型）は、（GFP など を介して ）明確に標識されていれば、同じプレート上で測定することができる。 このアッセイは標準サイズの寒天プレート上で実施されたが、より大きなプレート（ 例えば直径100mm）を使用することができる。このシナリオでは、ワームの移動に十分な時間を提供するために、アッセイ時間を6時間に延長する必要があります。より大きなプレートはより大きな集団の試験を可能にし、集団密度が長期間の嫌悪反応にどのように影響するかを調べるために使用することができる。移動可能なステージ33に結合されたウォームトラッキング装置を使用することにより、より技術的に高度な手順を組み込むこともできる。ワームトラッキングは、より正確な測定を可能にし、追加の変数の収集を可能にする（ 例えば、 </em&gt;ターニング周波数、反転周波数）。さらに、データ収集は4時間にわたって連続的に記録され、飢餓誘発行動のより正確なタイムラインを与える。 アッセイは、代替の表現型の測定を可能にするように容易に適合させることができる。ワームの年齢は、年齢関連の飢餓誘発性の嫌悪的な変化を測定できるように変更することができます。さらに、実験的な虫の栄養状態の変化はまた、食物および化学嫌悪という文脈での飢餓への慣れの分析を可能にする可能性がある。限りプロトコルは同等のデータセット間で一貫しているように、実験生物のほとんどすべてのプレコンディショニングは、走化性アッセイを介して評価することができます。

Caenorhabditis elegansは、わずか302個のニューロンのみからなる神経系の回路分析の比較的容易さのために、数十年間の神経生物学の研究のモデルとして用いられてきた1 。有機体が環境の合図に反応することに頼っているならば、神経系の多くは環境信号の統合を規制することに専念している2 。その神経系の単純さにもかかわらず、 C.エレガンスは、忌避剤3 、誘引物質4 、温度5 、さらには湿度6を含む多様な環境シグナルを検出し、応答することができる。適切に環境シグナルを統合するための失敗は、哺乳動物モデル系の7- 9における行動障害および神経変性条件の数にリンクされています。様々な利用可能な神経疾患モデル<html> C. elegansの 10 株および線虫医薬スクリーン11の開発により、この生物は神経生物学の研究に有用なシステムであることが証明されています。ほぼすべての線虫ゲノム12中の遺伝子、線虫の神経系の我々の理解、ひいては私たち自身にマッピングされた線虫のコネクトーム1および変異の利用可能性を考えると、部分的に創造適切なアッセイの設計によって制限されています。 走化性アッセイの数は、多様な嫌悪刺激3、4、13、14、15に線虫応答性を評価するために、過去40年にわたって開発されてきました。最初の実験では、急速な環境刺激の導入が関与していたが、単一のワームが寒天プレート= &quot;XREF&quot;&gt; 3、14、16。歩行応答に対する即時の変化が記録された。例えば、揮発性臭気物質オクタノールは、毛髪に適用され、野生型ワーム17における後方移動の開始を刺激するために、線虫の鼻の前で漂流され得る。行動選択の評価手段として複数の変数を組み込むために、より複雑なアッセイも開発されている18 。このアッセイのバリエーションには、銅溶液を使用して嫌気性中線バリアを作成することが必要です4 。誘引物質、すなわちジアセチルは、ジアセチル源から離れて移動した虫の化学的障壁の一方の側に置かれた。銅の嫌悪反応に欠陥のあるワームは直ちに障壁を越えてジアセチルに達し、野生型ワームは最初に障壁によって反発した。ワームが最初に銅の障壁に近づいたときの応答が採点された長期間の観察なしに。 ワームが飢餓状態を経て評価されると、環境刺激に対する感受性は低下する19 。忌み嫌う化学オクタノールが線虫の鼻の前で漂流されると、野生型生物は食べ物の上に3〜5秒以内に後退運動を刺激する。これらの生物は10分間食品から除去された後、8〜10秒の遅れた応答を示す20 。したがって、飢餓が増加すると、食物の探索が生存にとってより重要になるので、線虫は有害な環境シグナルに対する嫌悪反応を減少させる。逆に、その過剰発現神経ペプチド受容体9（NPR-9）線虫、食品オンまたはオフオクタノールに応答し、嫌悪刺激21の数に対応することができないことを示しません。これらのnpr-9（GF）生物はまた、食物の存在下でそれらの逆転頻度を調節しないが、過酷なタッチ刺激に反応して逆方向に動き、後方への移動21が可能であることを示す。我々はまた、彼らはまだ食べ物オフ異常な低下反転周波数を示すことが与えられたNPR-9（LF）の変異体は、食品21の存在下で、彼らの行動を調節することができる評価しました。急性外部刺激の導入により、ワームの栄養状態を結合することは食品関連の経路が広く感覚シグナル伝達が22、23の経路を調節することができますするメカニズムの解明に支援しています。線虫環境における食物の存在はまた、エタノール離脱反応を評価するために使用されている24 。この実験では、ワームを様々な濃度のエタノール中でインキュベートし、次いで「飼料競合アッセイ」として知られている寒天プレート上に置いた。食物パッチをプレートの一端に置き、線虫をw食品源から離れて置かれている。エタノール離脱は、ワームが食物のパッチに到達するのに必要な時間を測定することによって評価した。 この栄養ベースの銅回避アッセイは、時間経過に伴う行動変化を評価しながら、追加の環境変数、すなわち食物および銅を統合するための食品競争アッセイに基づいている。これはC. elegansコミュニティー全体で一般的に使用されるプロトコルの適応です4 。このプロトコールは、嫌悪反応および4時間にわたる食物の検出を評価するために使用されている21 。ワームの展示飢餓行動ので、絶食25の30分後、我々はまた、栄養状態への変更は、環境対応に影響を与えることができるかを評価することができます。このアッセイの条件は、実験生物が時間の経過とともに嫌悪感の刺激に反応する反応をどのように変化させるかを測定するため、行動変化を生物は飢えた状態に向かって進行する（そして継続的な飢餓の継続的な測定）。 npr-9（GF）動物は、食べ物や多くの嫌悪的な手がかりに反応して行動を変えないので、これらの行動障害が飢餓の状況で持続するかどうかを特定しようとした。最終的に、このアッセイ設計は、 npr-9（GF）突然変異体を特異的に評価するように処方されているが、新規な菌株を特徴付けるためにさらに適合させることができる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="689">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;width:332px;">M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.]</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Produced in lab</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:332px;">Cupric Sulfate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C-1297</td>
			<td style="width:167px;">Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a caenorhabditis elegans nutritional-status based copper aversion assay

生き残りを確実にするために、生物は、不安定な生息地を避け、一貫した食物源を確保することができなければならない。 Caenorhabditis elegansは、多様な環境刺激の検出時に彼らの歩行パターンを変更し、飢餓状態に応じて行動反応のスイートを調整することができます。線虫は、典型的には、食物源から30分を超えて除去されると、嫌悪反応が減少する。変化する栄養状態に応答する行動変化の観察は、十分に栄養を与えられた状態から飢餓状態への移行を調節する機構に洞察を与えることができる。 本発明者らは、嫌悪な障壁（ すなわち、銅）を横切って長時間にわたり食物源に到達する線虫の能力を測定するアッセイを開発した。このプロトコルは、以前の研究を基にしています。有機体がますます飢えている状態。さらに、このアッセイは、より大きい線虫の集団を同時に評価することができるように、増加したサンプルサイズを可能にする。 銅を検出または応答する能力に欠陥がある生物は、化学バリアを直ちに横切り、一方、野生型線虫は最初に忌避される。野生型ワームはますます飢えているので、障壁を越えて食物源に到達し始めます。我々は、食品感覚または嫌悪な化学物質の検出を含む、多様な環境的合図に応答することができない変異体を評価するためにこのアッセイを設計した。このプロトコルで評価したところ、欠陥のある生物はすぐに障壁を越えたが、食物源を検出することもできなかった。したがって、これらの突然変異体は一時的に食物源に達するにもかかわらず、化学的バリアを繰り返し交差する。このアッセイは、嫌悪と飢餓に関連する可能性のある経路の欠陥を評価するために、ワームの集団を直接的に試験することができる。

野生型（N2）、 npr-9（tm1652）およびnpr-9過剰発現株、 すなわち npr-9（GF） （IC836- npr-9 :: npr-9; sur-5 :: gfp; odr -1 :: rfp）、飢餓と銅嫌悪に対する応答を評価する。野生型生物は、 嫌気的銅障壁を検出し応答することができるが、 npr-9（GF）突然変異体は、4時間のアッセイ21で銅に対して嫌悪反応を開始しない。飢餓の30分後、野生型（N2）生物のおよそ50〜60％が銅障壁を横切って食物パッチに到達する。 2時間の時点で、野生型線虫の75％が食物源に到達する。アッセイの終わりまでに、100％のN 2生物が食物源に移動した。対照的に、大部分のnpr-9（GF）生物は、食物に応答して運動パターンを調節せず、食物と接触した後でも嫌悪感の障壁を横断し続けるであろうソース。 npr-9（GF）ワームは、4時間にわたるアッセイで食物に応答して運動を変化させ続けることができず、試験生物の30％のみがいつでも食物に存在する。 npr-9（LF）動物はN2生物と同様に機能しませんが、飢餓が増加して食物パッチに達すると、その歩行パターンを調節します （ 図3 ）。 N2またはnpr-9（LF）生物が食物なしでこのアッセイによって評価される場合、それらは銅障壁をめったに通過しない。 npr-9（GF）変異体は、障壁を前後に繰り返し交差する（ 図4 ）。 <img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55939/55939fig1.jpg" /> 図1 ：5cmのペトリ皿の下側に銅溶液配置を示すマーキングの視覚的表示。これらの指標は、プレートのセクションは適切に測定され、細菌パッチを移し、次に銅溶液を寒天表面に移すときのガイドラインとして役立つ。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55939/55939fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55939/55939fig2.jpg" /> 図2 ：5cmペトリ皿は、オン・フード・アッセイ・プレート用に2つのセクションに分けられ、細菌芝生は、オン・フード・プレート用のこれらのセクションの1つのセンターに形成される。フードパッチは、プレートの縁を揃え、正中線の障壁を形成する試験化合物と接触してはならない。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55939/55939fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> &lt;p class = &quot;jove_content&quot; fo：keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="図3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55939/55939fig3.jpg" /> 図3 ：栄養状態ベースの銅回避アッセイに応答して4時間にわたり食物源に到達するN2、 npr-9（tm1652）、およびnpr-9（GF）ワームのパーセンテージ 。データポイントは、両方の株について別々の日に実施された少なくとも3回の実験（n&gt; 30回のワーム）の平均である。データは、平均±標準誤差として提示され、二元反復測定ANOVAで分析される。 **同一の条件下でN2動物と有意に異なるp &lt;0.01。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55939/55939fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55939/55939fig4.jpg" /> 図4 ： 4時間のアッセイで食物源なしで銅障壁を 横切る N2、 npr-9（tm1652） および npr-9（GF）W ormsのパーセンテージ。上記の菌株は、食物が存在しない場合の銅嫌悪について評価した。正の応答は、銅障壁を横切り、プレートの非原点半分上にとどまるようにスコア付けされる。データポイントは、両方の株について別々の日に実施された少なくとも3回の実験（n&gt; 30回のワーム）の平均である。データは平均±SEとして提示され、2方向反復測定ANOVAで分析した3つの独立した実験において少なくとも10匹の動物をアッセイした。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55939/55939fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>

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A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt;栄養状態ベースの銅回避アッセイ

ここでは、有機体がよく摂食された状態から飢えた栄養状態に進行するにつれて、銅回避行動の変化および共通の食物源を見つける能力を評価するために設計されたCaenorhabditis elegans特異的アッセイを提示する。

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their ...

a-caenorhabditis-elegans-nutritional-status-based-copper-aversion

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

6.4K ビュー.  Queen's University. ここでは、有機体がよく摂食された状態から飢えた栄養状態に進行するにつれて、銅回避行動の変化および共通の食物源を見つける能力を評価するために設計されたCaenorhabditis elegans特異的アッセイを提示する。 

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Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

シナプス蛍光の自動定量<em&gt; C.エレガンス</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

神経科学

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

A<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</emAmylopathyの研究のための&gt;モデルシステム

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C. elegans genome includes potential antipsychotic drug (APD) targets conserved in humans, including genes encoding proteins required for neurotransmitter synthesis and for synaptic structure and function. APD exposure produces developmental delay and/or lethality in nematodes in a concentration-dependent manner. These phenotypes are caused, in part, by APD-induced inhibition of pharyngeal pumping1,2. Thus, the developmental phenotype has a neuromuscular basis, making it useful for pharmacogenetic studies of neuroleptics. Here we demonstrate detailed procedures for testing APD effects on nematode development and pharyngeal pumping. For the developmental assay, synchronized embryos are placed on nematode growth medium (NGM) plates containing APDs, and the stages of developing animals are then scored daily. For the pharyngeal pumping rate assay, staged young adult animals are tested on NGM plates containing APDs. The number of pharyngeal pumps per unit time is recorded, and the pumping rate is calculated. These assays can be used for studying many other types of small molecules or even large molecules.

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Approaches for testing the effects of antipsychotic drugs (APDs) in Caenorhabditis elegans are demonstrated. Assays are described for testing drug effects on development and viability and on pharyngeal pumping rate. These methods are also applicable for pharmacogenetic experiments with drug classes other than APDs.

抗精神病薬の作用のメカニズムを研究するための方法<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the development of more effective treatments is the relative lack of understanding of the molecular underpinnings of the effects of ethanol on behavior. The nematode, Caenorhabditis elegans (C.&#160;elegans), provides a useful model in which to generate and test hypotheses about the molecular effects of ethanol. Here, we describe an assay that has been developed and used to examine the roles of particular genes and environmental factors in behavioral responses to ethanol, in which locomotion is the behavioral output. Ethanol dose-dependently causes an acute depression of crawling on an agar surface. The effects are dynamic; animals exposed to a high concentration demonstrate an initial strong depression of crawling, referred to here as initial sensitivity, and then partially recover locomotion speed despite the continued presence of the drug. This ethanol-induced behavioral plasticity is referred to here as the development of acute functional tolerance. This assay has been used to demonstrate that these two phenotypes are distinct and genetically separable. The straightforward locomotion assay described here is suitable for examining the effects of both genetic and environmental manipulations on these acute behavioral responses to ethanol in C.&#160;elegans.

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

C. elegans is a useful model for studying the effects of ethanol on behavior. We present a behavioral assay that quantifies the effects of ethanol on the locomotion speed of crawling worms; both initial sensitivity and the development of acute functional tolerance to ethanol can be measured with this assay.

の歩行速度に対するエタノールの効果を測定するためのアッセイ<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

の長期カルシウムイメージングのためのアガロースマイクロチャンバー<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense organs provide an excellent model system for the study of mechanosensation. This protocol describes a simple touch behavior in fruit flies which can be used to identify mutations that interfere with mechanosensation. The tactile stimulation of a macrochaete bristle on the thorax of flies elicits a grooming reflex from either the first or third leg. Mutations that interfere with mechanotransduction (such as NOMPC), or with other aspects of the reflex arc, can inhibit the grooming response. A traditional screen of adult behaviors would have missed mutants that have essential roles during development. Instead, this protocol combines the touch screen with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) to allow for only limited regions of homozygous mutant cells to be generated and marked by the expression of green fluorescent protein (GFP). By testing MARCM clones for abnormal behavioral responses, it is possible to screen a collection of lethal p-element mutations to search for new genes involved in mechanosensation that would have been missed by more traditional methods.

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

In order to identify novel mutations affecting mechanosensation, we designed an assay that measures the behavioral response to tactile stimulation of fly bristles in mutant clones generated by the MARCM method. The combination of techniques allows for the identification of mechanosensitive mutations that would otherwise be lethal.

でMARCMベースのクローンのMechanosensationための行動アッセイ<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. Embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans is a late developmental stage consisting of the elongation of the embryo along its longitudinal axis. This developmental stage is controlled by intercellular communication between hypodermal cells and underlying body-wall muscles. These signaling mechanisms control the morphology of hypodermal cells by remodeling the cytoskeleton and the cell-cell junctions. Measurement of embryonic lethality and developmental arrest at larval stages as well as alteration of cytoskeleton and cell-cell adhesion structures in hypodermal and muscle cells are classical phenotypes that have been used for more than 25 years to dissect these signaling pathways. Recent studies required the development of novel metrics specifically targeting either early or late elongation and characterizing morphogenic defects along the antero-posterior axis of the embryo. Here, we provide detailed protocols enabling the accurate measurement of the length and the width of the elongating embryos as well as the length of synchronized larvae. These methods constitute useful tools to identify genes controlling elongation, to assess whether these genes control both early and late phases of this stage and are required evenly along the antero-posterior axis of the embryo.

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Here we detail protocols specifically designed to monitor morphogenic defects that occur during early and late phases of embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans. Ultimately, these protocols are designed to identify genes that regulate these phases and to characterize their differential requirements along the antero-posterior axis of the embryo.

新規メトリックは、線虫の胚伸びを特徴づけるために、<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc superoxide dismutase 1 (SOD1). The structural instability of SOD1 and the detection of SOD1-positive inclusions in familial-ALS patients supports a potential causal role for misfolded and/or aggregated SOD1 in ALS pathology. In this study, we describe the development of a cell-based assay designed to quantify the dynamics of SOD1 aggregation in living cells by high content screening approaches. Using lentiviral vectors, we generated stable cell lines expressing wild-type and mutant A4V SOD1 tagged with yellow fluorescent protein and found that both proteins were expressed in the cytosol without any sign of aggregation. Interestingly, only SOD1 A4V stably expressed in HEK-293, but not in U2OS or SH-SY5Y cell lines, formed aggregates upon proteasome inhibitor treatment. We show that it is possible to quantify aggregation based on dose-response analysis of various proteasome inhibitors, and to track aggregate-formation kinetics by time-lapse microscopy. Our approach introduces the possibility of quantifying the effect of ALS mutations on the role of SOD1 in aggregate formation as well as screening for small molecules that prevent SOD1 A4V aggregation.

We describe a method to quantify the aggregation of misfolded proteins. Our protocol details lentiviral induced stable cell line generation, automated confocal imaging, and image analysis of protein aggregates. As an illustrative application, we studied the effect of small molecules in promoting SOD1 aggregation in a time- and dose-dependent manner.

Sod1 突然変異体蛋白質集計における細胞の高いコンテンツ定量化のための分析法の開発

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

線虫の行動で個々 のニューロンのレシオ メトリック カルシウム イメージング

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are specialized sites of synaptic innervation modulated by activity and serve as substrates for learning and memory. Recently, dendritic spines have been described for DD GABAergic neurons as the input sites from presynaptic cholinergic neurons in the motor circuit of Caenorhabditis elegans. This synaptic circuit can now serve as a powerful new in vivo model of spine morphogenesis and function that exploits the facile genetics and ready accessibility of C. elegans to live-cell imaging. 
This protocol describes experimental strategies for assessing DD spine structure and function. In this approach, a super-resolution imaging strategy is used to visualize the intricate shapes of actin-rich dendritic spines. To evaluate the DD spine function, the light-activated opsin, Chrimson, stimulates the presynaptic cholinergic neurons, and the calcium indicator, GCaMP, reports the evoked calcium transients in postsynaptic DD spines. Together, these methods comprise powerful approaches for identifying genetic determinants of dendritic spines in C. elegans that could also direct spine morphogenesis and function in the brain.

Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are important cellular features of the nervous system. Here live imaging methods are described for assessing the structure and function of dendritic spines in C. elegans.&#160;These approaches support the development of mutant screens for genes that define dendritic spine shape or function.

カエノラブディティス・エレガンスにおける樹状突起棘のイメージング

Dendritic spines are specialized sites of synaptic innervation modulated by activity and serve as substrates for learning and memory. Recently, dendritic ...