עבודה זו נתמכה על ידי מדעי הטבע והנדסה מועצת המחקר של קנדה גילוי מענק RGPIN36481-08 כדי ויליאם ג &#39;בנדנה.

1. הכנת אורגניזמים ניסיוניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר 10 L4 מבוימות נמטודות לכל זן 24 שעות לפני תחילת assay כדי להבטיח כי אורגניזמים הם צעירים כאשר נבדק. עבור כל נמטודות מוטציה או שליטה נבדק, לבחור 10 L4s (10 עבור שליטה 10 עבור assay). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחזק L4 אורגניזמים בשיטות סטנדרטיות 26 , 27 במשך 24 שעות על לוחות אגר סטנדרטי seeded עם OP50 Escherichia coli . אם אורגניזמים אבדו במהלך הצעדים הבאים לשטוף, לפצות על ידי הגדלת גודל המדגם החל ( כלומר לבחור 20 תולעים במקום 10). הערה: התנהגות היא פנוטיפ משתנה באופן פנימי. בצע את השיטה בשלושה עותקים עבור כל זן על שלושה ימים נפרדים. כלול זנים נוספים שליטה ותנאים עבור זנים הרומן, כפי שמוצג בסעיף הדיון. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לפני assay, העברת אורגה ניסיוניNisms על צלחת אגר ללא חיידקים ולאפשר נמטודות לנוע בחופשיות במשך 1 דקות כדי להסיר חיידקים עודפים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אורגניזמים ניסיוני חווה תנאי זיהום במהלך 24 שעות לפני assay, להשליך אותם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 1 מ&quot;ל של M9 על צלחת ללא חיידקים לשטוף תולעים לתוך צינור microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 3000 במשך 1 דקות. תולעים צריך ליצור גלולה בחלק התחתון של הצינור. לשאוב M9 פתרון מבלי לשבש את גלולה תולעת. הוסף 1 מ&quot;ל של M9 כדי גלולה תולעת, להפוך צינור לערבב תולעים עם הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.4 שלוש פעמים נוספות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם חיידקים עודפים הועבר בתחילה עם תולעים, לחזור על סך של 5 פעמים. אין חיידקים צריכים להיות מועברים צלחות גזע מזון נחושת. אם המזון מועבר צלחת assay, זה יפריע איסוף נתונים מדויקים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף הסופי, לשאוב supernatant עד 10081, L של M9 ואת גלולה תולעת נשאר. זהירות: התנהגויות הקשורות רעב להתברר לאחר 30 דקות. כתוצאה מכך תולעים צריך להיות מועבר מיד מן הפתרון לאחר השלבים השלמה הושלמו. </li></ol> 2. הכנת לוחות Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת לוחות אגר NGM סטנדרטי יומיים לפני assay. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הצלחות נשמרות בסביבה לחה, לעשות צלחות אגר 3 ימים לפני assay. לחלופין, להסיר את המכסה של הצלחת במשך 3-6 שעות כדי להבטיח יובש נאות (אם בסביבה סטרילית). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם סמן קבוע עבה, לעשות קו על החלק התחתון של הצלחת לאורך הקצה החיצוני ועוד כדי ליצור מחסום קו באמצע ( איור 1 ). מחסום קו אמצע צריך להיות שווה מכל קצה של הצלחת. השתמש בסרגל כדי להבטיח מדידות מדויקות. קווים אלה ישמשו כמדריך בעת העברת חיידקים פתרון נחושת. ובלבדE. coli מועבר לפני הפתרון נחושת, שורות אלה ישמשו אינדיקטורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת זרע עם 50 μL של OP50 E. coli על צד אחד בלבד של המכשול נחושת כדי ליצור דשא אחיד ( איור 2 ). ריכוז בקטריאלי צריך להישאר עקבי על פני מבחני; עם זאת, השתנות מעט נצפתה בתגובה להבדלים מתונים בריכוז. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בקווים מסומנים על החלק התחתון של הצלחת כדי להבטיח את החיידקים לא באים במגע עם פתרון נחושת. בתנאי שתמיסת הנחושת תוחמת את קצה הצלחת ותיצור מחסום של קו אמצע, תעביר את החיידקים כך שפתרון הנחושת לא יבוא במגע עם מקור המזון. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן קבוצה שנייה של צלחות ולהעביר OP50 E. coli להם ( איור 2 ). לוחות אלה ישמשו להעריך את השליטה השלילית. צלחות אלה צריך גם להיותסימון על מחצית הצלחת כדי לציין את מקור ההעברה הראשונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר חיידקים לייבש ואז צלחות דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. ודא כי תיקוני בקטריאלי לא מופרעים בעת העברת לחממה 37 מעלות צלזיוס או בחדר. הפרעה מוגזמת יכולה לשנות את המיקום או הצורה של תיקון המזון. </li></ol> 3. Chemotaxis Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרי להכין 0.5 M נחושת (II) סולפט פתרון לפני זמן ההתחלה assay. בתנאי 125 μL של הפתרון משמש לכל צלחת, בהיקף עד נפח זה תלוי במספר צלחות assay בשימוש ( למשל 5 צלחות assay, 625 μL). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 100 μL של נחושת (II) סולפט פתרון על קצה של אגר כדי ליצור מחסום נחושת החיצוני. הצד המסומן של הצלחת צריך לשמש כמדריך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 25 μL של נחושת (II) סולפט פתרון ליצור מחסום קו האמצע. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי הפתרון נחושת (II) סולפט לעשותלא לבוא במגע עם תיקון חיידקי. השתמש בטכניקה מנוקדת כפי streaking עשוי להשפיע על תנועה עקב חריצים / שריטות על אגר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר פתרון נחושת להתייבש על צלחת. פרק הזמן יכול להשתנות בהתאם לתנאי הצלחת ולמעבדה. בדיקה ויזואלית עבור יובש כל 5 דקות לאחר ההעברה. הערה: פתרון הנחושת מציג גוון כחלחל וניתן לזיהוי בקלות. השתמש רקמות מעבדה כדי לטפטף קלות הפתרון ליד קצה הצלחת להבחין יובש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 20 μL של גלולה תולעת מהחלק התחתון של הצינור על חצי חיידקים חינם של צלחת assay. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי 10 תולעים מועברים צלחת assay. אם תולעים נוספות נכללו בטעות, להסיר אותם על ידי בחירה עם שמן הלוקרבון על מנת להבטיח כי אין חיידקים מתווספים לצלחת. Assay כל צריך להיות מספר עקבי של נמטודות במהלך assay. הערה: אם תולעים מעטות מדי הן transfטעה במהלך מבחני, הגדלת גודל המדגם הראשוני יקטין הפסדים פוטנציאליים במהלך שוטף והעברות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר עודף M9 מן הצלחת עם רקמת מעבדה. M9 לא צריך לבוא במגע עם נחושת (II) סולפט פתרון. זהירות: ודא כי תולעים משטח אגר להישאר מושפע בעת ביצוע שלב זה. אם משתמשים בחומרה רבה מדי, רקמת המעבדה יכולה ליצור חריצים למשטח אגר של הצלחת והוא יכול להסיר תולעים. תולעים שהוסרו בטעות באמצעות KimWipe צריך להיות מושלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר פתרון M9 הוסר וכל התולעים החלו דפוסי קטר לא נוזלי, להתחיל את stopwatch assay. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופטימלי, להסיר את הפתרון M9 בתוך דקות. הפרמטר החיוני הוא זיהוי התנועה הסינוסואידית. תולעים מקוטעות באופן שונה, למשל מחבט ולא סינוסי, כאשר בנוזל. הפעל את assay להפסיק לצפות פעם אחת של איבר ניסיוניאיסמס מפסיק לחבוט. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק צלחות assay כל 30 דקות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת צלחות assay עם תיקונים חיידקיים, ציון חיובי אורגניזמים אם הם מגיעים תיקון מזון על פני 4 שעות. עבור לוחות שליטה שלילית, חיובי ציון אורגניזמים אם הם חצו את המכשול. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 314 (1165), 1-340 (1986).</li><li>Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensation+in+C.+elegans+(October+25,+2006).">Chemosensation in C. elegans (October 25, 2006).</a> The C. elegans Research Community, WormBook. , (2006).</li><li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans.">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74 (3), 515-527 (1993).</li><li>Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+by+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+identification+of+attractants+and+analysis+of+the+response+by+use+of+mutants.">Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 70 (3), 817-821 (1973).</li><li>Ramot, D., MacInnis, B. L., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+temperature-sensing+by+a+single+thermosensory+neuron+in+C.+elegans.">Bidirectional temperature-sensing by a single thermosensory neuron in C. elegans.</a> Nat. Neurosci. 11 (8), 908-915 (2008).</li><li>Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humidity+sensation+requires+both+mechanosensory+and+thermosensory+pathways+in+Caenorhabditis+elegans.">Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (22), 8269-8274 (2014).</li><li>van Campen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+modulation+disorders+in+childhood+epilepsy.">Sensory modulation disorders in childhood epilepsy.</a> J. Neurodev. Disord. 7 (34), (2015).</li><li>Festa, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neocortical+disconnectivity+disrupts+sensory+integration+in+Alzheimer's+disease.">Neocortical disconnectivity disrupts sensory integration in Alzheimer's disease.</a> Neuropsych. 19 (6), 728-738 (2005).</li><li>Boecker, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+processing+in+Parkinson's+and+Huntington's+disease:+investigations+with+3D+H(2)(15)O-PET.">Sensory processing in Parkinson's and Huntington's disease: investigations with 3D H(2)(15)O-PET.</a> Brain. 122 (9), 1651-1665 (1999).</li><li>Markaki, M., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+disease+in+Caenorhabditis+elegans.">Modeling human disease in Caenorhabditis elegans.</a> Biotechnol. J. 5 (12), 1261-1276 (2010).</li><li>O'Reilly, L. P., Luke, C. J., Perlmutter, D. H., Silverman, G. A., Pak, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+in+high-throughput+drug+discovery.">C. elegans in high-throughput drug discovery.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. , 247-253 (2014).</li><li>Thompson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+million+mutation+project:+a+new+approach+to+genetics+in+Caenorhabditis+elegans.">The million mutation project: a new approach to genetics in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Res. 23 (10), 1749-1762 (2013).</li><li>Chao, M. Y., Komatsu, H., Fukuto, H. S., Dionne, H. M., Hart, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding+status+and+serotonin+rapidly+and+reversibly+modulate+a+Caenorhabditis+elegans+chemosensory+circuit.">Feeding status and serotonin rapidly and reversibly modulate a Caenorhabditis elegans chemosensory circuit.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101 (43), 15512-15517 (2004).</li><li>Maricq, A. V., Peckol, E., Driscoll, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensory+signaling+in+C.+elegans+mediated+by+the+GLR-1+glutamate+receptor.">Mechanosensory signaling in C. elegans mediated by the GLR-1 glutamate receptor.</a> Nat. 378 (6552), 78-81 (1995).</li><li>Chalasani, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+a+circuit+for+olfactory+behaviour+in+Caenorhabditis+elegans.">Dissecting a circuit for olfactory behaviour in Caenorhabditis elegans.</a> Nat. 450 (7166), 63-70 (2007).</li><li>Hilliard, M. A., Bargmann, C. I., Bazzicalupo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+responds+to+chemical+repellents+by+integrating+sensory+inputs+from+the+head+and+the+tail.">C. elegans responds to chemical repellents by integrating sensory inputs from the head and the tail.</a> Curr. Biol. 12 (9), 730-734 (2002).</li><li>Hart, A. C., Kass, J., Shapiro, J. E., Kaplan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+signaling+pathways+mediate+touch+and+osmosensory+responses+in+a+polymodal+sensory+neuron.">Distinct signaling pathways mediate touch and osmosensory responses in a polymodal sensory neuron.</a> J. Neurosci. 19 (6), 1952-1958 (1999).</li><li>Ishihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEN-1,+a+secretory+protein+with+an+LDL+receptor+motif,+regulates+sensory+integration+and+learning+in+Caenorhabditis+elegans.">HEN-1, a secretory protein with an LDL receptor motif, regulates sensory integration and learning in Caenorhabditis elegans.</a> Cell. 109 (5), 639-649 (2002).</li><li>Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+chemotaxis+revealed+by+paired+presentation+of+a+chemoattractant+and+starvation+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> J. Exp. Biol. 204 (10), 1757-1764 (2001).</li><li>Chao, M. Y., Komatsu, H., Fukuto, H. S., Dionne, H. M., Hart, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding+status+and+serotonin+rapidly+and+reversibly+modulate+a+Caenorhabditis+elegans+chemosensory+circuit.">Feeding status and serotonin rapidly and reversibly modulate a Caenorhabditis elegans chemosensory circuit.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (43), 15512-15517 (2004).</li><li>Campbell, J. C., Polan-Couillard, L. F., Chin-Sang, I. D., Bendena, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NPR-9,+a+Galanin-Like+G-Protein+Coupled+Receptor,+and+GLR-1+Regulate+Interneuronal+Circuitry+Underlying+Multisensory+Integration+of+Environmental+Cues+in+Caenorhabdities+elegans.">NPR-9, a Galanin-Like G-Protein Coupled Receptor, and GLR-1 Regulate Interneuronal Circuitry Underlying Multisensory Integration of Environmental Cues in Caenorhabdities elegans.</a> PLoS Genet. 12 (5), (2016).</li><li>Harris, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+distinct+amine+receptors+operating+at+different+levels+within+the+locomotory+circuit+are+each+essential+for+the+serotonergic+modulation+of+chemosensation+in+Caenorhabditis+elegans.">Three distinct amine receptors operating at different levels within the locomotory circuit are each essential for the serotonergic modulation of chemosensation in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurosci. 29 (5), 1446-1456 (2009).</li><li>Harris, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+serotonergic+food+signal+stimulating+sensory-mediated+aversive+behavior+in+C.+elegans.">Dissecting the serotonergic food signal stimulating sensory-mediated aversive behavior in C. elegans.</a> PLoS One. 6 (7), (2011).</li><li>Mitchell, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+differential+role+for+neuropeptides+in+acute+and+chronic+adaptive+responses+to+alcohol:+behavioural+and+genetic+analysis+in+Caenorhabditis+elegans.">A differential role for neuropeptides in acute and chronic adaptive responses to alcohol: behavioural and genetic analysis in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 5 (5), (2010).</li><li>Colbert, H. A., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+signals+modulate+olfactory+acuity,+discrimination,+and+memory+in+Caenorhabditis+elegans.">Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimination, and memory in Caenorhabditis elegans.</a> Learn Mem. 4 (2), 179-191 (1997).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genet. 77 (1), 71-71 (1974).</li><li>Hart, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior+(July+3,+2006).">Behavior (July 3, 2006).</a> The C. elegans Research Community, WormBook. , (2006).</li><li>Sambongi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+of+cadmium+and+copper+ions+by+externally+exposed+ADL,+ASE,+ASH+neurons+elicits+avoidance+response+in+Caenorhabditis+elegans.">Sensing of cadmium and copper ions by externally exposed ADL, ASE, ASH neurons elicits avoidance response in Caenorhabditis elegans.</a> NeuroReport. 10 (4), 753-757 (1999).</li><li>Gray, J. M., Hill, J. J., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+circuit+for+navigation+in+Caenorhabditis+elegans.">A circuit for navigation in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102 (9), 3184-3191 (2004).</li><li>Rechavi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Starvation-Induced+Transgenerational+Inheritance+of+Small+RNAs+in+C.+elegans.">Starvation-Induced Transgenerational Inheritance of Small RNAs in C. elegans.</a> Cell. 158 (2), 277-287 (2014).</li><li>Gloria-Soria, A., Azevedo, R. B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=npr-1+Regulates+Foraging+and+Dispersal+Strategies+in+Caenorhabditis+elegans.">npr-1 Regulates Foraging and Dispersal Strategies in Caenorhabditis elegans.</a> Cell. 18 (21), 1694-1699 (2008).</li><li>Beron, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+burrowing+behavior+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+A+new+assay+for+the+study+of+neuromuscular+disorders.">The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: A new assay for the study of neuromuscular disorders.</a> Genes Brain Behav. 14 (4), 357-368 (2015).</li><li>Wang, S. J., Wang, Z. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Track-A-Worm,+An+Open-Source+System+for+Quantitative+Assessment+of+C.+elegans+Locomotory+and+Bending+Behavior.">Track-A-Worm, An Open-Source System for Quantitative Assessment of C. elegans Locomotory and Bending Behavior.</a> PLoS One. 8 (7), (2013).</li></ol>

אין לנו מה לגלות.

עיצוב assay זה משנה את assay גזע מזון 24 לכלול פתרון נחושת כדי ליצור מחסום midline מרתיע סביב קצה הצלחת כדי למנוע אובדן של נמטודות. אורגניזמים נבדקים על יכולתם לחצות את מחסום מרתיע ולהגיע תיקון מזון על פני 4 שעות. בהקשר של npr-9 (GF) , יש לנו ניצלו assay זה כדי להעריך כיצד תנאי רעב יכול להשפיע על תגובות מרתיעה ואיתור מזון. בהינתן שהיינו מאופיינים בעבר ב- Npr-9 (GF) כעל פגמים בהיענות למזון ורמזים מרתיעים, שילבנו רמזים סביבתיים של כפולות עם מצב תזונתי כדי להעריך אם רעב יכול לשנות את התנהגויות ה- NF-9 הפגומות. Assay זה מסתמך על היכולת של תולעת לזהות ולהגיב לגירויים כימיים רמזים מזון 3 , 4 . בהתחשב במשתנים מגוונים לנתח, את התנאים של לשעבריש לשלוט בקפידה על אורגניזמים טרום-ימיים כדי למנוע גורמים מעורפלים. עבור מוטציות uncharacterized, כלומר אלה עם תגובה בלתי מוכרת מרתיעה או מזון, זנים נוספים שליטה צריך להיות מנוצל. יש להעריך גם את הזנים הפגומים, כגון cha -2 או odr-3 28 , ומוטנטים שאינם משנים דפוסי קטר מהאוכל, כגון tph-1 29 , במקביל כדי להבטיח שתנאי הנחושת והרעב מבוקרים כראוי. יתר על כן, כדי להדגיש באופן ישיר יותר את התרומה של רעב להתנהגות המוערך, התנאים assay נפרדים ניתן גם לפתח עבור בקרות נוספות. לדוגמה, נמטודות ניתן להרעיב מיד לפני assay והועברו צלחת assay (עם מזון) כדי לזהות כמה מהר אורגניזם במצב רעב יגיב נחושת להגיע תיקון מזון. Assay הנוכחי שלנו מדגיש avתגובות עזות כמו האורגניזמים הניסוי התקדמות ממצב טוב עד רעב. Assay שלנו הוא שינוי של C נפוץ cayotaxis ג elegans 4 שבו גירוי חזק יותר ( כלומר ריכוז גבוה) כבר שולבו על מנת להעריך התנהגויות על פני תקופה ארוכה יותר. במקום להעריך תגובות מיידיות, assay זה יכול להיות מנוצל כדי למדוד שינויים תגובות מרתיעה כמו התקדמות אורגניזמים לעבר מדינה מורעבת (אם שולטת הדרושים כלולים). הערכות דומות שימשו בהעדר נחושת על מנת להעריך תגובות אתנול נסיגה, כלומר נמטודות איתור מזון, לאורך זמן 24 . כמו במקרה עם assay התנהגותי ב C. elegans, שליטה על משתנים סביבתיים חיוני כדי להבטיח תוצאות לשחזור באופן עקבי. אורגניזמים חייבים להיות כולם מאותה אגE, בהתחשב בכך שהתגובות ההתנהגותיות יכולות להשתנות עם הגיל. יתר על כן, השתנות במצב התזונתי של התולעים יכולה לשנות את ההתאמה לתנאי רעב. לכן, תולעים ניסיוני לא צריך לעבור רעב בכל נקודה לפני פרוטוקול זה. חוויית הרעב של דור ההורים יכולה גם להשפיע על התנהגות הצאצאים 30 ; לכן, רצוי להבטיח כי אורגניזמים ניסיוני הם ניזון היטב במשך לפחות שני דורות. יתר על כן, מספר אורגניזמים שהועברו צלחות assay צריך להישאר עקבית בהתחשב בכך צפיפות האוכלוסייה המקומית יכולה להשפיע על שיעורי פיזור 31 . לאחר תולעים הועברו הצלחות, חשוב להסיר את הפתרון M9 עודף עם רקמת מעבדה מבלי לפגוע את פני אגר. שינוי פני השטח עלול להפריע לדפוסי קטר ספונטני. עודף הפתרון צריך להיות הוסר כראוי לפני תחילת רשמי שלAssay כדי להבטיח התנהגות מחבקת, כלומר דפוס קטר nematode שנצפה נוזל, אינו נוכח. מחוון ברור הוא לחפש התנהגות סריקה. צלחות Assay חייב להיות נשלט כך צלחת יובש חיידקי הם עקביים. צלחות טרי מדי יכול לגרום ליקויים קטרים ​​יכול גם להפריע גילוי של גירויים סביבתיים 6 . היישום של פתרונות נחושת צריך להיות עקבי ככל האפשר, כך מחסומים מרתיעים הם עבים כראוי והם לא באים במגע עם מקור המזון. החלת מעט מדי נחושת פתרון יכול להפחית את סוג בר תגובה תגובה מרתיעה, בעוד יותר מדי יכול להוכיח קטלני נמטודות. מכוון לעובי אחיד לפתרון הנחושת מניב את התוצאות הטובות ביותר. אם החריצים נוצרים אגר במהלך יישום פתרון נחושת, צלחת assay צריך להיות מושלך. תולעים עלולים לחדור דרך חורים כאלה 32, במיוחד כאשר הוא מתמודד עם חומר מרעב או רעב. כדי להבטיח אחידות צלחת בין דגימות, אוכלוסיות מעורבות של תולעים ( כלומר מוטציה סוג בר) ניתן למדוד על צלחת אותו אם אחד היו מסומנים בבירור ( למשל באמצעות GFP). למרות assay זה בוצע על לוחות בגודל אגר בגודל רגיל, צלחות גדול יותר ניתן להשתמש ( למשל 100 מ&quot;מ קוטר). בתרחיש זה, משך assay צריך להיות המורחבת ל 6 שעות כדי לספק מספיק זמן תנועה תולעת. צלחות גדולות יותר יכולות לאפשר בדיקה של אוכלוסיות גדולות יותר וניתן להשתמש בהן כדי לחקור כיצד צפיפות האוכלוסייה משפיעה על תגובות מרתיעה על פני תקופות זמן ממושכות. יותר טכניקות מתקדמות יכול גם להיות משולב עם השימוש בציוד מעקב תולעת מצמידים לשלב מוביילי 33 . מעקב תולעת יאפשר מדידות מדויקות יותר ולאפשר איסוף של משתנים נוספים ( למשל </Em&gt; תדירות מפנה, תדר הפוך). יתר על כן, איסוף נתונים יירשמו ברציפות על פני 4 שעות תקופה לתת ציר זמן מדויק יותר של התנהגויות רעב המושרה. Assay ניתן להתאים בקלות לאפשר מדידה של פנוטיפים חלופיים. הגיל של התולעת יכול להיות מגוונות כדי לאפשר מדידות על גיל רעב- induced שינויים מרעישים. יתר על כן, וריאציות למצב התזונתי של התולעים הניסוייות יכולות גם לאפשר ניתוח של הרגלה לרעב בהקשר של מזון ודחייה כימית. כל עוד פרוטוקולים הם עקביים בין ערכות נתונים דומים, כמעט כל מיזוג מראש של אורגניזמים ניסיוני יכול להיות מוערך באמצעות assay chemotaxis.

Caenorhabditis elegans שימש מודל לחקר הנוירוביולוגיה במשך עשרות שנים בשל הקלות היחסית בניתוח המעגל של מערכת העצבים המורכבת רק 302 נוירונים 1 . בתנאי שהאורגניזם מסתמך על תגובה לרמזים סביבתיים, חלק גדול ממערכת העצבים מוקדש לוויסות השילוב של אותות סביבתיים 2 . למרות הפשטות של מערכת העצבים שלה, C. elegans יכול לזהות ולהגיב על אותות סביבתיים מגוונים כולל repellents 3 , 4 , 5 טמפרטורות 5 , ואפילו לחות 6 . כישלון לשלב אותות סביבתיים כמו שצריך נקשר מספר הפרעות התנהגותיות תנאים ניווניות במערכות מודל יונקים 7- 9. עם מגוון של מודלים של מחלות עצביות זמינות<html> 10 ב C. elegans ופיתוח של nematode מסכי התרופות 11 , אורגניזם זה הוכיח להיות מערכת שימושית לחקר נוירוביולוגיה. בהתחשב בזמינות של מיפוי nematode connectome 1 ומוטציות כמעט כל גן בגנום nematode 12 , ההבנה שלנו של מערכת העצבים nematode, ועל ידי הארכה שלנו, מוגבל חלקית על ידי העיצוב של מבחני המתאים מבחינה יצירתית. מספר מבחני chemotaxis פותחו במהלך 40 השנים האחרונות כדי להעריך היענות nematode לגירויים מגוונים שונים 3 , 4 , 13 , 14 , 15 . הניסוי הראשוני כלל את ההקדמה של גירוי סביבתי חריף בעוד תולעת בודדת משוטטת על צלחת אגר= &quot;Xref&quot;&gt; 3 , 14 , 16 . נרשמו שינויים מיידיים בתגובות קטריות. לדוגמה, octorol ריחניים נדיפים ניתן להחיל על השיער ו wafted מול האף nematode כדי לעורר את החניכה של תנועה לאחור בתולעים סוג בר 17 . מבחנים מורכבים יותר פותחו גם כדי לשלב משתנים מרובים כאמצעי להערכת בחירה התנהגותית 18 . וריאציה של assay זה כרוך בשימוש של פתרון נחושת כדי ליצור מחסום midline מרתיע 4 . אטרקציה, כלומר דיאכטיל, הונחה על צד אחד של המכשול הכימי עם תולעים שהועברו ממקור הדיאצטיל. תולעים פגומות לתגובות נחושת נחפזות חצו מיד את המכשול כדי להגיע לדיאצטיל, בעוד שתולעים מסוג בר נדחקו בתחילה על ידי המכשול. התגובות נצבעו כאשר התולעים התקרבו לראשונה למחסום הנחושתללא תצפיות לטווח ארוך. כאשר תולעים מוערכים לאחר עוברים תנאי רעב, הרגישות שלהם לגירויים סביבתיים הוא ירד 19 . כאשר octanol כימית מרתיעה הוא wfted מול האף nematode, אורגניזמים סוג בר לעורר תנועה לאחור בתוך 3 - 5 s כאשר על מזון. לאחר אורגניזמים אלה הוסרו מן המזון במשך 10 דקות, הם מפגינים תגובה מאוחרת של 8 - 10 s 20 . לכן, עם רעב מוגבר, נמטודות להציג תגובה מרתיעה מופחתת אותות סביבתיים מזיקים כמו החיפוש אחר מזון הופך חיוני יותר להישרדות. לעומת זאת, נמטודות כי over-express קולטן neuropeptide 9 ( npr-9) , לא מגיבים אוקטנול על או ביטול מזון ולהציג חוסר היכולת להגיב על מספר גירויים מרתיעה 21 . אלה npr-9 (GF) אורגניזמים גם לא לשנות את תדירות היפוך שלהם בנוכחות מזון, אבל יכולהפוך בתגובה לגירויים מגע קשים המציין כי הם מסוגלים תנועה לאחור 21 . יש לנו גם העריכו npr-9 (LF) מוטציות בהתחשב בכך שהם מפגינים תדירות היפוך ירד באופן חריג את האוכל עדיין יכול לווסת את התנהגותם בנוכחות מזון 21 . צימוד המצב התזונתי של התולעת עם ההקדמה של גירויים חיצוניים חריפים סייעה בבירור המנגנונים שבאמצעותם מסלול הקשור למזון יכול לשנות את מסלולי האיתות החושי 22 , 23 . הנוכחות של מזון בסביבה נמטודות שימש גם כדי להעריך תגובות אתנול הנסיגה 24 . בניסוי זה, תולעים הודגרו בריכוזים שונים של אתנול ולאחר מכן הונחו על צלחת אגר עם כתם של מזון המכונה &quot;assay גזע מזון&quot;. תיקון המזון הונח על קצה אחד של הצלחת בעוד נמטודות wEre הניח ממקור המזון. נסיגה אתנול הוערך על ידי מדידת משך הזמן הנדרש עבור תולעים להגיע חתיכת מזון. זה מבוסס תזונת נחושת assay מבוסס בונה על assay גזע מזון לשלב משתנים סביבתיים נוספים, כלומר מזון ונחושת, תוך הערכת שינויים התנהגותיים לאורך זמן. זוהי הסתגלות של פרוטוקול שימוש נפוץ ברחבי הקהילה elegans C. 4 . פרוטוקול זה נעשה שימוש כדי להעריך תגובות מרתיעה ואיתור מזון על פני תקופה של ארבע שעות 21 . מאז התולעת של התנהגויות רעב התערוכה לאחר 30 דקות של מניעת מזון 25 , אנחנו גם מסוגלים להעריך כיצד שינויים במצב התזונתי יכול להשפיע על תגובות סביבתיות. התנאים של assay זה למדוד כיצד אורגניזמים ניסיוני לשנות את התגובה לגירויים מרתיעה לאורך זמן, ומכאן זה מעריך שינויים התנהגותיים כמואורגניזמים מתקדמים לעבר מדינה מורעבת (והמשיכו מדידות של רעב ממושך). מאחר שחיות ה- NF-9 (GF) אינן משנות את התנהגותן בתגובה לאוכל או לרמזים מרתיעים רבים, ביקשנו לזהות אם הגירעונות ההתנהגותיים הללו ימשיכו להתקיים בהקשר של רעב. בסופו של דבר, זה עיצוב assay כבר ניסח במיוחד כדי להעריך את npr-9 (GF) מוטציות אבל יכול להיות מותאם נוספת גם לאפיין זנים חדשניים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="689">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;width:332px;">M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.]</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Produced in lab</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:332px;">Cupric Sulfate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C-1297</td>
			<td style="width:167px;">Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a caenorhabditis elegans nutritional-status based copper aversion assay

כדי להבטיח הישרדות, אורגניזמים חייבים להיות מסוגלים להימנע בתי גידול שלילי תוך הבטחת מקור מזון עקבי. Caenorhabditis elegans לשנות את דפוסי locomotory שלהם על זיהוי של גירויים סביבתיים שונים והוא יכול לווסת את חבילת תגובות התנהגותיות בתגובה לתנאי רעב. נמטודות בדרך כלל התערוכה תגובה מרתיעה ירידה כאשר הוסרו ממקור מזון במשך 30 דקות. התבוננות בשינויים התנהגותיים בתגובה למעמד תזונתי משתנה יכולה לספק תובנה לגבי המנגנונים המסדירים את המעבר ממצב של רעב עד רעב. פיתחנו assay אשר מודד יכולת של נמטודות לעבור מחסום מרתיע ( כלומר נחושת) ואז להגיע למקור מזון על פני תקופה ממושכת של זמן. פרוטוקול זה בונה על עבודה קודמת על ידי שילוב משתנים מרובים באופן המאפשר איסוף נתונים המשיך כמו האורגניזמים לנוע לעברמצב יותר ויותר מורעב. יתר על כן, assay זה מאפשר הגדלת גודל המדגם, כך אוכלוסיות גדולות יותר של נמטודות ניתן להעריך בו זמנית. אורגניזמים פגומים ביכולת לזהות או להגיב לנחושת מיד לחצות את המכשול הכימי, בעוד נמטודות סוג בר בתחילה דחו. כמו תולעים סוג בר הם יותר ויותר מורעבים, הם מתחילים לחצות את המכשול ולהגיע למקור המזון. עיצבנו assay זה כדי להעריך מוטציה כי הוא מסוגל להגיב על רמזים סביבתיים מגוונים, כולל תחושת מזון או זיהוי של כימיקלים מרתיעה. כאשר מוערכים באמצעות פרוטוקול זה, אורגניזמים פגומים מיד חצה את המכשול, אבל גם לא היו מסוגלים לאתר מקור מזון. לפיכך, מוטציות אלה שוב ושוב לחצות את המכשול הכימי למרות להגיע באופן זמני למקור מזון. Assay זה יכול בקלות לבדוק אוכלוסיות של תולעים להעריך פגמים פוטנציאליים המסלול הקשורים סלידה והרעב.

השתמשנו סוג בר (N2), npr-9 (tm1652), ואת npr-9 overexpression זן, כלומר npr-9 (GF) (IC836 - npr-9 :: npr-9; sur-5 :: gfp; odr ), כדי להעריך תגובות לרעב ודחיקת נחושת. אורגניזמים מסוג בר מסוגלים לזהות ולהגיב על מחסום נחושת מרתיעה, ואילו מוטציות npr-9 (GF) אינן יוזמות תגובה מרתיעה לנחושת מעל assay 4 שעות 21 . לאחר 30 דקות של רעב, בערך 50 - 60% של סוג בר (N2) אורגניזמים לחצות את מחסום הנחושת ולהגיע תיקון מזון. ב 2 שעה סימן, 75% של סוג בר נמטודות להגיע למקור המזון. עד סוף assay, 100% של אורגניזמים N2 יש relocated למקור מזון. לעומת זאת, רוב האורגניזמים של ה- NF-9 (GF) אינם מווסתים דפוסי קטרה בתגובה למזון וימשיכו לחצות את המחסום המרתיע גם לאחר שבא במגע עם מזוןמָקוֹר. Npr-9 (GF) תולעים ברציפות נכשלים לשנות את התנועה שלהם בתגובה למזון על assay 4 שעות ו רק 30% של אורגניזמים הבדיקה נמצאים על האוכל בכל זמן נתון. Npr-9 (LF) בעלי חיים אינם מבצעים כמו גם אורגניזמים N2, אבל לעשות לווסת את דפוסי קטר כמו הרעב מגביר להגיע תיקון מזון ( איור 3 ). כאשר N2 או npr-9 (LF) אורגניזמים מוערכים באמצעות assay זה ללא מזון, הם רק לעתים נדירות לחצות את המכשול נחושת. NPR-9 (GF) מוטציות שוב ושוב לחצות את המכשול הלוך ושוב ( איור 4 ). <img alt="איור 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55939/55939fig1.jpg" /> איור 1 : ייצוג חזותי של סימונים כדי להצביע על מיקום נחושת מיקום על החלק התחתון של צלחת פטרי 5 ס&quot;מ. סימנים אלה משמשים כדי להבטיח את זהחלקים של הצלחת נמדדו כראוי לשמש כקו מנחה בעת העברת תיקון חיידקי ולאחר מכן פתרון נחושת על פני אגר. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55939/55939fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55939/55939fig2.jpg" /> איור 2 : צלחת פטרי 5 ס&quot;מ מחולק לשני חלקים עבור לסירוגין פלטות Assay מזון דשא חיידקי נוצרת במרכז אחד של חלקים אלה עבור צלחת על מזון. תיקון מזון לא צריך לבוא במגע עם המתחם הבדיקה אשר שורות את הקצוות של הצלחת ויוצר מחסום קו האמצע. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55939/55939fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> &lt;P class = &quot;jove_content&quot; עבור: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55939/55939fig3.jpg" /> איור 3 : אחוז התולעים של N2, npr-9 (tm1652) ו- npr-9 (GF) שמגיעות אל מקור המזון במשך תקופה של ארבע שעות בתגובה לאסוציאציה של מצב נחושת המבוסס על תזונה תזונתית. נקודות הנתונים הן ממוצעים של לפחות שלושה ניסויים (n&gt; 30 תולעים) שבוצעו בימים נפרדים עבור שני זנים. הנתונים מוצגים כ ממוצע ± שגיאת תקן ונותחו עם שני צעדים חוזרים אמצעים ANOVA. ** p &lt;0.01, שונה משמעותית מחיות N2 בתנאים זהים. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55939/55939fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55939/55939fig4.jpg" /> איור 4 : אחוז של N2, npr-9 (tm1652) ו- npr-9 (GF) או wms כי לחצות את המכשול נחושת ללא מקור מזון במשך Assay ארבע שעות. הזנים הנ&quot;ל הוערכו עבור רתיעה נחושת בהעדר מזון. תגובות חיוביות הם הבקיע כמו חציית מחסום נחושת הנותרים על חצי הלא מקור של הצלחת. נקודות הנתונים הן ממוצעים של לפחות שלושה ניסויים (n&gt; 30 תולעים) שבוצעו בימים נפרדים עבור שני זנים. הנתונים מוצגים כממוצע ± SE ו לפחות 10 בעלי חיים היו assayed בשלושה ניסויים עצמאיים נותחו עם שני צעדים חוזרים אמצעים ANOVA. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55939/55939fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay at JoVE.com

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

א<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; מצב תזונתיים מבוססי Assay Assersion

כאן, אנו מציגים assay Caenorhabditis elegans- Specific שנועד להעריך שינויים התנהגות הנטייה נחושת ואת היכולת לאתר מקור מזון משותף, כמו האורגניזם מתקדמת ממצב תזונה רעב עד כדי רעב.

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their ...

a-caenorhabditis-elegans-nutritional-status-based-copper-aversion

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

6.4K Views.  Queen's University.  כאן, אנו מציגים assay Caenorhabditis elegans- Specific שנועד להעריך שינויים התנהגות הנטייה נחושת ואת היכולת לאתר מקור מזון משותף, כמו האורגניזם מתקדמת ממצב תזונה רעב עד כדי רעב. 

Video: A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

כימות אוטומטי של הקרינה סינפטית<em&gt; ג elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; מערכת מודל לחקר Amylopathy

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C. elegans genome includes potential antipsychotic drug (APD) targets conserved in humans, including genes encoding proteins required for neurotransmitter synthesis and for synaptic structure and function. APD exposure produces developmental delay and/or lethality in nematodes in a concentration-dependent manner. These phenotypes are caused, in part, by APD-induced inhibition of pharyngeal pumping1,2. Thus, the developmental phenotype has a neuromuscular basis, making it useful for pharmacogenetic studies of neuroleptics. Here we demonstrate detailed procedures for testing APD effects on nematode development and pharyngeal pumping. For the developmental assay, synchronized embryos are placed on nematode growth medium (NGM) plates containing APDs, and the stages of developing animals are then scored daily. For the pharyngeal pumping rate assay, staged young adult animals are tested on NGM plates containing APDs. The number of pharyngeal pumps per unit time is recorded, and the pumping rate is calculated. These assays can be used for studying many other types of small molecules or even large molecules.

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Approaches for testing the effects of antipsychotic drugs (APDs) in Caenorhabditis elegans are demonstrated. Assays are described for testing drug effects on development and viability and on pharyngeal pumping rate. These methods are also applicable for pharmacogenetic experiments with drug classes other than APDs.

שיטות לחקר מנגנוני פעולה של אנטי פסיכוטיות סמים ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the development of more effective treatments is the relative lack of understanding of the molecular underpinnings of the effects of ethanol on behavior. The nematode, Caenorhabditis elegans (C.&#160;elegans), provides a useful model in which to generate and test hypotheses about the molecular effects of ethanol. Here, we describe an assay that has been developed and used to examine the roles of particular genes and environmental factors in behavioral responses to ethanol, in which locomotion is the behavioral output. Ethanol dose-dependently causes an acute depression of crawling on an agar surface. The effects are dynamic; animals exposed to a high concentration demonstrate an initial strong depression of crawling, referred to here as initial sensitivity, and then partially recover locomotion speed despite the continued presence of the drug. This ethanol-induced behavioral plasticity is referred to here as the development of acute functional tolerance. This assay has been used to demonstrate that these two phenotypes are distinct and genetically separable. The straightforward locomotion assay described here is suitable for examining the effects of both genetic and environmental manipulations on these acute behavioral responses to ethanol in C.&#160;elegans.

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

C. elegans is a useful model for studying the effects of ethanol on behavior. We present a behavioral assay that quantifies the effects of ethanol on the locomotion speed of crawling worms; both initial sensitivity and the development of acute functional tolerance to ethanol can be measured with this assay.

Assay למדידת ההשפעות של אתנול במהירות התנועה של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Microchambers agarose לסידן הדמיה לטווח ארוך של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense organs provide an excellent model system for the study of mechanosensation. This protocol describes a simple touch behavior in fruit flies which can be used to identify mutations that interfere with mechanosensation. The tactile stimulation of a macrochaete bristle on the thorax of flies elicits a grooming reflex from either the first or third leg. Mutations that interfere with mechanotransduction (such as NOMPC), or with other aspects of the reflex arc, can inhibit the grooming response. A traditional screen of adult behaviors would have missed mutants that have essential roles during development. Instead, this protocol combines the touch screen with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) to allow for only limited regions of homozygous mutant cells to be generated and marked by the expression of green fluorescent protein (GFP). By testing MARCM clones for abnormal behavioral responses, it is possible to screen a collection of lethal p-element mutations to search for new genes involved in mechanosensation that would have been missed by more traditional methods.

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

In order to identify novel mutations affecting mechanosensation, we designed an assay that measures the behavioral response to tactile stimulation of fly bristles in mutant clones generated by the MARCM method. The combination of techniques allows for the identification of mechanosensitive mutations that would otherwise be lethal.

התנהגות Assay עבור Mechanosensation של MARCM מבוסס משובט ב<em&gt; תסיסנית melanogaster</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. Embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans is a late developmental stage consisting of the elongation of the embryo along its longitudinal axis. This developmental stage is controlled by intercellular communication between hypodermal cells and underlying body-wall muscles. These signaling mechanisms control the morphology of hypodermal cells by remodeling the cytoskeleton and the cell-cell junctions. Measurement of embryonic lethality and developmental arrest at larval stages as well as alteration of cytoskeleton and cell-cell adhesion structures in hypodermal and muscle cells are classical phenotypes that have been used for more than 25 years to dissect these signaling pathways. Recent studies required the development of novel metrics specifically targeting either early or late elongation and characterizing morphogenic defects along the antero-posterior axis of the embryo. Here, we provide detailed protocols enabling the accurate measurement of the length and the width of the elongating embryos as well as the length of synchronized larvae. These methods constitute useful tools to identify genes controlling elongation, to assess whether these genes control both early and late phases of this stage and are required evenly along the antero-posterior axis of the embryo.

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Here we detail protocols specifically designed to monitor morphogenic defects that occur during early and late phases of embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans. Ultimately, these protocols are designed to identify genes that regulate these phases and to characterize their differential requirements along the antero-posterior axis of the embryo.

מדדי רומן לאפיון התארכות עוברית של נמטודות<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc superoxide dismutase 1 (SOD1). The structural instability of SOD1 and the detection of SOD1-positive inclusions in familial-ALS patients supports a potential causal role for misfolded and/or aggregated SOD1 in ALS pathology. In this study, we describe the development of a cell-based assay designed to quantify the dynamics of SOD1 aggregation in living cells by high content screening approaches. Using lentiviral vectors, we generated stable cell lines expressing wild-type and mutant A4V SOD1 tagged with yellow fluorescent protein and found that both proteins were expressed in the cytosol without any sign of aggregation. Interestingly, only SOD1 A4V stably expressed in HEK-293, but not in U2OS or SH-SY5Y cell lines, formed aggregates upon proteasome inhibitor treatment. We show that it is possible to quantify aggregation based on dose-response analysis of various proteasome inhibitors, and to track aggregate-formation kinetics by time-lapse microscopy. Our approach introduces the possibility of quantifying the effect of ALS mutations on the role of SOD1 in aggregate formation as well as screening for small molecules that prevent SOD1 A4V aggregation.

We describe a method to quantify the aggregation of misfolded proteins. Our protocol details lentiviral induced stable cell line generation, automated confocal imaging, and image analysis of protein aggregates. As an illustrative application, we studied the effect of small molecules in promoting SOD1 aggregation in a time- and dose-dependent manner.

פיתוח assay על כימות תוכן גבוהה של היווצרות צבירה של מוטציה בחלבון Sod1 בתאים חיים

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

סידן רציומטרי הדמיה של נוירונים בודדים ב מתנהג Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are specialized sites of synaptic innervation modulated by activity and serve as substrates for learning and memory. Recently, dendritic spines have been described for DD GABAergic neurons as the input sites from presynaptic cholinergic neurons in the motor circuit of Caenorhabditis elegans. This synaptic circuit can now serve as a powerful new in vivo model of spine morphogenesis and function that exploits the facile genetics and ready accessibility of C. elegans to live-cell imaging. 
This protocol describes experimental strategies for assessing DD spine structure and function. In this approach, a super-resolution imaging strategy is used to visualize the intricate shapes of actin-rich dendritic spines. To evaluate the DD spine function, the light-activated opsin, Chrimson, stimulates the presynaptic cholinergic neurons, and the calcium indicator, GCaMP, reports the evoked calcium transients in postsynaptic DD spines. Together, these methods comprise powerful approaches for identifying genetic determinants of dendritic spines in C. elegans that could also direct spine morphogenesis and function in the brain.

Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are important cellular features of the nervous system. Here live imaging methods are described for assessing the structure and function of dendritic spines in C. elegans.&#160;These approaches support the development of mutant screens for genes that define dendritic spine shape or function.

הדמיה של קוצים דנדריטיים בקאנורהבדיטיס אלגנס

Dendritic spines are specialized sites of synaptic innervation modulated by activity and serve as substrates for learning and memory. Recently, dendritic ...