Questo protocollo descrive i metodi per visualizzare le morfologie della colonna vertebrale dendritica e i transitori di calcio nei neuroni di C.elegans. Il nostro approccio dovrebbe facilitare gli approcci genetici per scoprire i determinanti della morfogenesi e della funzione della colonna vertebrale. Il nostro protocollo presenta spine dendritiche nei neuroni GABAergici.
Anche le spine in altre classi di neuroni di C.elegans possono essere studiate con questi metodi. Il nostro protocollo descrive i metodi per immobilizzare i C.elegans viventi. È particolarmente importante prevenire il movimento degli animali durante l'acquisizione delle immagini e scegliere le giuste configurazioni laser per eccitare e registrare l'attività neuronale.
Per acquisire immagini ad alta risoluzione, aggiungere tre microlitri di soluzione anestetica e quantità da 15 a 20 giovani vermi adulti su tamponi di agarosio al 10%. Quindi applicare il coprislip per immobilizzare i vermi e sigillare i bordi del coprislip con una miscela sigillante adesiva fusa. Per un'acquisizione a super-risoluzione, utilizzare un microscopio confocale a scansione laser dotato di microscopia a super-risoluzione.
Acquisisci Z-stack utilizzando la dimensione del passo consigliata dal software del produttore. Raccogli una serie di sezioni ottiche che coprono il volume totale del processo ventrale Dorsale D o DD. Invia gli Z-stack per l'elaborazione delle immagini utilizzando il software del produttore e analizza le immagini con un punteggio superiore a sette.
Per l'acquisizione Nyquist, utilizzare un microscopio confocale a scansione laser e selezionare la dimensione ottimale dei pixel per la lunghezza d'onda della luce e l'apertura numerica dell'obiettivo. Quindi invia lo stack per la deconvoluzione 3D utilizzando un algoritmo automatico. Per l'analisi delle immagini, utilizzare un software di elaborazione delle immagini appropriato per creare proiezioni di massima intensità degli stack Z.
E contare manualmente le sporgenze sul dendrite DD. Quindi determinare la lunghezza del dendrite DD segnato per calcolare la densità delle spine per 10 micrometri di dendrite DD. Quindi classificare le spine come sottili o funghi, filopodiali, tozze o ramificate.
Utilizzando tecniche convenzionali come la microiniezione, creare vermi transgenici che esprimono il sensore di calcio GCaMP nei neuroni DD e Chrimson, una rodopsina canale spostata verso il rosso nei neuroni VA presinaptici. Successivamente, sotto un cappuccio laminare, preparare tutte le piastre transretiniche o ATR aggiungendo 300 microlitri di coltura batterica OP50 coltivata durante la notte e 0,25 microlitri di ATR a ciascuna piastra di agar nutriente da 60 millimetri di crescita dei nematodi. Quindi distribuire la cultura con una bacchetta di vetro sterile.
Per le piastre di controllo, aggiungere 300 microlitri di batteri OP50 e 0,25 microlitri di etanolo. Per consentire la crescita batterica, incubare le piastre a temperatura ambiente per 24 ore, al riparo dalla luce ambientale. Per impostare l'esperimento, posizionare cinque larve dello stadio L4 su ATR o piastre di controllo con semi OP50 e incubare le piastre al buio a 23 gradi Celsius.
Dopo tre giorni, utilizzare un microscopio da dissezione stereo per confermare lo sviluppo della vulva e scegliere la progenie dello stadio L4 dall'ATR e dalle piastre di controllo per l'imaging. Quindi, posizionare due microlitri di poliperline da 0,05 micrometri su un vetrino da microscopio. E metti circa 10 larve di L4 nella soluzione.
Utilizzando un filo di platino, aggiungere un piccolo globulo di super colla alla soluzione. Ruotare delicatamente la soluzione per generare fili filamentosi di colla. Quindi aggiungere tre microlitri di tampone M9.
Quindi applicare una vetrina di copertura e sigillarne i bordi come dimostrato in precedenza. Per registrare i transitori di calcio evocati nelle spine dendritiche, utilizzare un microscopio confocale a disco rotante e regolare lo stadio del microscopio per posizionare le spine DD nel piano focale. Quindi impostare l'acquisizione time-lapse per illuminare il campione con una linea laser a 488 nanometri in ogni fotogramma per rilevare la fluorescenza GCaMP e una linea laser a 561 nanometri a intervalli periodici per l'eccitazione Chrimson.
Per l'imaging del calcio in vivo, utilizzare la deconvoluzione 2D e l'allineamento dell'immagine per correggere deviazioni minori dal movimento del verme durante l'acquisizione. Quindi definisci la colonna vertebrale dendritica DD come la regione di interesse o ROI. Duplicare il ROI e spostarlo in una regione vicina all'interno del worm per raccogliere il segnale di background.
Quindi, utilizzando il software appropriato, esportare le intensità GFP in Excel per ogni punto temporale e sottrarre la fluorescenza di fondo dalla fluorescenza del ROI della colonna vertebrale. Determinare la variazione della fluorescenza sottraendo la fluorescenza GFP nel fotogramma immediatamente prima dell'eccitazione a 561 nanometri o a zero da ciascun punto temporale dopo l'eccitazione o Delta F.Quindi dividere per F zero per determinare Delta F su F zero. E rappresentare graficamente le tracce normalizzate.
Innanzitutto, determinare se i dati sono normalmente distribuiti utilizzando un test di Shapiro-Wilk. Per i dati che non sono normalmente distribuiti, utilizzare un ANOVA non parametrico con correzione post-hoc per test multipli. In alternativa, per le misurazioni che mostrano la distribuzione normale o gaussiana, eseguire un test ANOVA parametrico accoppiato per ogni misurazione della fluorescenza GCaMP prima e dopo ogni impulso a 561 nanometri.
E correggere per più confronti in ciascuno dei due gruppi. L'etichettatura delle spine dendritiche DD con tre marcatori indipendenti, citosolici mCherry, MYR: mRuby e LifeAct: GFP ha prodotto una densità media di 3,4 spine dendritiche DD per 10 micron di dendrite DD in giovani adulti wild-type. Il marcatore GFP:Utrophin è stato escluso da questa analisi perché ha prodotto una densità della colonna vertebrale significativamente inferiore, potenzialmente a causa delle interazioni dell'utrofina con il citoscheletro di actina che guida la morfogenesi della colonna vertebrale.
L'approccio di imaging delle cellule vive ha confermato che la sottile morfologia a forma di fungo delle spine DD predomina nell'adulto rispetto alle forme alternative della colonna vertebrale come filopodiale, tozza e ramificata. L'attivazione delle spine dendritiche DD è stata valutata mediante segnalazione colinergica presinaptica nei vermi transgenici che esprimono GCaMP nei neuroni DD e Chrimson nei neuroni VA presinaptici. Esplosioni transitorie di segnale GCaMP sono state rilevate nelle spine DD immediatamente dopo l'attivazione optogenetica di Chrimson nei neuroni VA presinaptici.
Un esperimento di controllo in assenza di ATR ha confermato che la misura del segnale GCaMP dipende dall'attivazione optogenetica di Chrimson che è strettamente ATR-dipendente. Per visualizzare le spine DD, è meglio immaginare gli animali che giacciono su un fianco come le spine che sporgono sono ad angolo retto rispetto al percorso della luce. Con questo metodo, gli scienziati possono anche utilizzare manipolazioni farmacologiche per comprendere i meccanismi che guidano i transitori di calcio nelle spine DD.
