Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Investigación de Ingeniería del Canadá Discovery Grant RGPIN36481-08 a William G. Bendena.

1. Preparación de organismos experimentales <ol><li> Elija 10 L4 de nematodos por cepa 24 h antes de comenzar el ensayo para asegurar que los organismos son adultos jóvenes cuando se prueban. Para cada nematodo mutante o de control ensayado, se seleccionan 10 L4s (10 para el testigo y 10 para el ensayo). <ol><li> Mantener los organismos L4 utilizando métodos estándar 26 , 27 durante 24 h en placas de agar estándar sembradas con OP50 Escherichia coli . Si se pierden organismos durante las etapas de lavado subsiguientes, compensar aumentando el tamaño de la muestra inicial ( es decir, recoger 20 gusanos en lugar de 10). Nota: El comportamiento es un fenotipo innatamente variable. Realizar el método por triplicado para cada cepa en tres días distintos. Incluir cepas de control adicionales y condiciones para cepas nuevas, como se destaca en la sección de discusión. </li></ol></li><li> Inmediatamente antes del ensayo, transferir orga experimentalA una placa de agar sin bacterias y permitir que los nematodos se muevan libremente durante 1 minuto para eliminar el exceso de bacterias. <ol><li> Si los organismos experimentales experimentaron condiciones de contaminación durante las 24 h antes del ensayo, deséchelos. </li></ol></li><li> Pipetee 1 mL de M9 sobre la placa libre de bacterias para lavar los gusanos en un tubo de microcentrífuga. </li><li> Centrifugar a 3.000 xg durante 1 min. Los gusanos deben formar un pellet en la parte inferior del tubo. Aspirar la solución de M9 sin interrumpir el gránulo de gusano. Añadir 1 ml de M9 a la bola de gusano, invertir el tubo para mezclar los gusanos con la solución. </li><li> Repita los pasos 1.4 tres veces más. <ol><li> Si el exceso de bacterias se transfirió inicialmente con los gusanos, repita un total de 5 veces. No se deben transferir bacterias a las placas de alimentación de cobre. Si el alimento se transfiere a la placa de ensayo, interferirá con la recolección exacta de datos. </li></ol></li><li> Después del lavado final, se aspira el sobrenadante hasta 10081; L de M9 y el gránulo permanece. Precaución: Los comportamientos relacionados con el hambre se hacen evidentes después de 30 min. Por consiguiente, los gusanos deben ser inmediatamente transferidos de la solución una vez que se han completado los pasos de lavado. </li></ol> 2. Preparación de placas de ensayo <ol><li> Preparar placas de agar NGM estándar dos días antes del ensayo. <ol><li> Si las placas se mantienen en un ambiente húmedo, hacer placas de agar 3 días antes del ensayo. Como alternativa, retire la tapa de la placa durante 3 - 6 h para asegurar la sequedad adecuada (si en un ambiente estéril). </li></ol></li><li> Con un marcador permanente grueso, hacer una línea en la parte inferior de la placa a lo largo del borde exterior y otro para formar una barrera de línea media ( Figura 1 ). La barrera de línea media debe estar equidistante de cada borde de la placa. Utilice una regla para asegurar mediciones precisas. Estas líneas servirán de guía para la transferencia de bacterias y la solución de cobre. Siempre queE. coli se transfiere antes de la solución de cobre, estas líneas servirán como indicadores. </li><li> Plato de semilla con 50 μL de OP50 E. coli en un solo lado de la barrera de cobre para crear un césped uniforme ( Figura 2 ). La concentración bacteriana debe permanecer consistente en todos los ensayos; Sin embargo, se ha observado poca variabilidad en respuesta a ligeras diferencias en la concentración. <ol><li> Utilice las líneas marcadas en la parte inferior de la placa para asegurar que las bacterias no entren en contacto con la solución de cobre. Siempre que la solución de cobre alinee el borde de la placa y forme una barrera de línea media, transfiera las bacterias para que la solución de cobre no entre en contacto con la fuente de alimento. </li></ol></li><li> Marque un segundo conjunto de placas y no transfiera ninguna E. coli OP50 ( Figura 2 ). Estas placas servirán para evaluar el control negativo. Estas placas también debenMarcando en la mitad de la placa para indicar el origen de la transferencia inicial. </li><li> Dejar secar las bacterias y luego incubar las placas a 37 ° C durante la noche. Asegúrese de que los parches bacterianos no se alteren al transferir a una incubadora o sala de 37 ° C. Una alteración excesiva podría alterar la ubicación o la forma del parche alimenticio. </li></ol> 3. Ensayo de quimiotaxis <ol><li> Preparar de nuevo una solución de sulfato de cobre (II) 0,5 M antes de la hora de inicio del ensayo. Siempre que se utilicen 125 μl de la solución por placa, se aumenta este volumen dependiendo del número de placas de ensayo utilizadas ( por ejemplo, 5 placas de ensayo, 625 μl). </li><li> Pipetear 100 μL de la solución de sulfato de cobre (II) en el borde del agar para crear una barrera externa de cobre. La parte inferior marcada de la placa debe servir de guía. </li><li> Pipetear 25 μl de la solución de sulfato de cobre (II) para crear una barrera de línea media. <ol><li> Asegúrese de que la solución de sulfato de cobre (II)No entra en contacto con el parche bacteriano. Utilice una técnica manchada ya que la formación de rayas puede afectar la locomoción debido a las indentaciones / rasguños en el agar. </li></ol></li><li> Deje que la solución de cobre se seque sobre la placa. El período de tiempo puede variar dependiendo de la placa y las condiciones del laboratorio. Compruebe visualmente la sequedad cada 5 minutos después de la transferencia. Nota: La solución de cobre muestra un matiz azulado y es fácilmente identificable. Utilizar un tejido de laboratorio para mojar ligeramente la solución cerca del borde de la placa para discernir la sequedad. </li><li> Pipetee 20 μL del sedimento de gusano desde el fondo del tubo sobre la mitad libre de bacterias de la placa de ensayo. <ol><li> Asegúrese de que 10 gusanos se transfieren a la placa de ensayo. Si los gusanos adicionales se incluyeron accidentalmente, eliminarlos por la recolección con aceite de halocarbono para asegurar que no se agregan bacterias a la placa. Cada ensayo debe tener un número uniforme de nematodos durante el ensayo. NOTA: Si hay pocos gusanos transfErrado durante los ensayos, el aumento del tamaño de la muestra inicial mitigará las pérdidas potenciales durante los lavados y las transferencias. </li></ol></li><li> Retire el exceso de M9 de la placa con un tejido de laboratorio. M9 no debe entrar en contacto con la solución de sulfato de cobre (II). Precaución: Asegúrese de que los gusanos y la superficie del agar no se vean afectados al realizar este paso. Si se utiliza con demasiada dureza, el tejido de laboratorio puede crear muescas en la superficie de agar de la placa y puede eliminar los gusanos. Los gusanos eliminados accidentalmente a través de KimWipe deben desecharse. </li><li> Una vez que la solución M9 se ha eliminado y todos los gusanos han comenzado patrones locomotores no líquidos, iniciar el cronómetro de ensayo. <ol><li> De manera óptima, retire la solución M9 dentro de un minuto. El parámetro esencial es la identificación de la locomoción sinusoidal. Los gusanos se locomotan de manera diferente, por ejemplo , golpeando en lugar de sinusoidal, cuando están en líquido. Iniciar el ensayo de cronómetro una vez cada uno de los órganos experimentalesIsmos deja de golpear. </li></ol></li><li> Revise las placas de ensayo cada 30 min. <ol><li> Para las placas de ensayo con parches bacterianos, marque positivamente los organismos si alcanzan el parche de alimentos durante un periodo de 4 h. Para las placas de control negativo, marque positivamente los organismos si han cruzado la barrera. </li></ol></li></ol>

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No tenemos nada que revelar.

Este diseño de ensayo modifica el ensayo 24 de raza alimentaria para incluir una solución de cobre para crear una barrera aversiva de línea media y alrededor del borde de la placa para evitar la pérdida de nematodos. Los organismos se ponen a prueba para determinar su capacidad para cruzar la barrera aversiva y alcanzar un parche alimenticio durante un período de 4 h. En el contexto de npr-9 (GF) , hemos utilizado este ensayo para evaluar cómo las condiciones de inanición podrían afectar a las respuestas aversivas y la detección de alimentos. Siempre que hubiéramos caracterizado anteriormente npr-9 (GF) como defectuoso para la capacidad de respuesta a alimentos y señales aversivas, combinamos múltiples señales ambientales con el estado nutricional para evaluar si el hambre podría modular los comportamientos defectuosos del npr-9 (GF) . Este ensayo se basa en la capacidad de un gusano para detectar y responder a los estímulos químicos y las señales alimentarias 3 , 4 . Dadas las diversas variables analizadas, las condiciones de la exLos organismos experimentales deben ser meticulosamente controlados para eliminar los factores de confusión. Para los mutantes no caracterizados, es decir , aquellos con una aversión desconocida o sensibilidad al alimento, tendrían que utilizarse cepas de control adicionales. Las cepas aversivas defectuosas, por ejemplo , che-2 u odr-3 28 , y los mutantes que no alteran los patrones locomotores de los alimentos, por ejemplo , tph-1 29 , también deben evaluarse en paralelo para garantizar que las condiciones de cobre y de inanición se controlan adecuadamente. Además, para destacar más directamente la contribución de la inanición al comportamiento evaluado, también se pueden desarrollar condiciones de ensayo separadas para controles adicionales. Por ejemplo, los nematodos pueden morirse de hambre inmediatamente antes del ensayo y transferirse a la placa de ensayo (con alimento) para identificar la rapidez con que un organismo en una condición de hambre responderá al cobre y alcanzará el parche de alimento. Nuestro ensayo actual destaca avMientras que los organismos experimentales progresan de un estado bien alimentado a un estado de hambre. Nuestro ensayo es una modificación del ensayo de quimiotaxis de C. elegans de uso común 4 en el que se ha incorporado un estímulo más fuerte ( es decir, una concentración alta) para evaluar comportamientos durante un periodo de tiempo más prolongado. En lugar de evaluar las respuestas instantáneas, este ensayo puede utilizarse para medir los cambios en las respuestas aversivas a medida que los organismos progresan hacia un estado de hambre (si se incluyen los controles necesarios). Evaluaciones similares se han utilizado en la ausencia de cobre con el fin de evaluar las respuestas de abstinencia de etanol, es decir , nematodos localización de alimentos, con el tiempo [ 24] . Como es el caso de cualquier ensayo conductual en C. elegans, controlar las variables ambientales es esencial para asegurar resultados consistentemente reproducibles. Los organismos deben ser todos de la mismaE, dado que las respuestas conductuales pueden variar con la edad. Además, la variabilidad en el estado nutricional de los gusanos puede alterar la aclimatación a las condiciones de inanición. Por lo tanto, los gusanos experimentales no deben sufrir hambre en ningún punto antes de este protocolo. La experiencia de inanición de la generación paterna también puede influir en el comportamiento de la progenie 30 ; Por lo tanto, es aconsejable asegurarse de que los organismos experimentales estén bien alimentados durante al menos dos generaciones. Por otra parte, el número de organismos transferidos a las placas de ensayo debe ser coherente dado que la densidad de población local puede influir en las tasas de dispersión [ 31] . Una vez que los gusanos han sido transferidos a las placas, es crítico eliminar la solución M9 en exceso con un tejido de laboratorio sin dañar la superficie del agar. La alteración de la superficie puede interferir con patrones locomotores espontáneos. El exceso de solución debe eliminarse apropiadamente antes de comenzar elEl ensayo para asegurar que no se presente el comportamiento de pandeo, es decir , un patrón locomotor de nematodos observado en líquido. Un indicador claro es buscar el comportamiento de rastreo. Las placas de ensayo deben controlarse de manera que la sequedad de las placas y las bacterias sean consistentes. Las placas excesivamente frescas pueden causar defectos locomotores y también pueden interferir con la detección de estímulos ambientales 6 . La aplicación de las soluciones de cobre debe ser lo más consistente posible para que las barreras aversivas sean apropiadamente gruesas y no entren en contacto con la fuente de alimento. La aplicación de una solución de cobre demasiado pequeña podría disminuir el tiempo de respuesta aversivo tipo salvaje, mientras que demasiado podría resultar letal para los nematodos. El objetivo de un espesor uniforme de la solución de cobre produce los mejores resultados. Si se crean indentaciones en el agar durante la aplicación de la solución de cobre, la placa de ensayo debe desecharse. Los gusanos pueden atravesar estos agujeros 32, Especialmente cuando se enfrentan con una sustancia aversiva o hambre. Para asegurar la uniformidad de la placa entre las muestras, se pudieron medir poblaciones mixtas de gusanos ( es decir, un mutante y tipo salvaje) en la misma placa si se marcaba claramente ( por ejemplo, a través de GFP). Aunque este ensayo se realizó en placas de agar de tamaño estándar, se pueden usar placas más grandes ( por ejemplo, 100 mm de diámetro). En este escenario, la duración del ensayo debe extenderse hasta 6 h para proporcionar tiempo suficiente para el movimiento del gusano. Las placas más grandes podrían permitir la prueba de poblaciones más grandes y podrían ser utilizadas para investigar cómo la densidad de población afecta las respuestas aversivas durante largos períodos de tiempo. También se podrían incorporar procedimientos técnicamente más avanzados con el uso de equipos de seguimiento de gusanos acoplados a una etapa móvil 33 . El rastreo de gusanos permitiría mediciones más precisas y permitiría la recolección de variables adicionales ( por ejemplo, </Em&gt; frecuencia de giro, frecuencia de inversión). Además, la recopilación de datos se registraría continuamente durante el período de 4 h para proporcionar un calendario más preciso de los comportamientos inducidos por el hambre. El ensayo puede adaptarse fácilmente para permitir la medición de fenotipos alternativos. La edad del gusano puede variar para permitir mediciones en los cambios aversivos inducidos por el hambre relacionados con la edad. Además, las variaciones en el estado nutricional de los gusanos experimentales también podrían permitir el análisis de la habituación al hambre en el contexto de la aversión alimentaria y química. Siempre y cuando los protocolos son coherentes entre conjuntos de datos comparables, casi cualquier pre-acondicionamiento de los organismos experimentales podría ser evaluado a través del ensayo de quimiotaxis.

Caenorhabditis elegans se ha utilizado como modelo para el estudio de la neurobiología durante décadas debido a la relativa facilidad en el análisis de los circuitos de un sistema nervioso compuesto por sólo 302 neuronas [ 1] . Siempre que el organismo dependa de responder a señales ambientales, gran parte del sistema nervioso se dedica a regular la integración de las señales ambientales 2 . A pesar de la simplicidad de su sistema nervioso, C. elegans puede detectar y responder a diversas señales ambientales incluyendo repelentes 3 , atrayentes 4 , temperatura 5 e incluso humedad 6 . Un fallo para integrar adecuadamente las señales ambientales se ha relacionado con una serie de trastornos del comportamiento y condiciones neurodegenerativas en los sistemas modelo de mamíferos [ 7 - 9] . Con una gama de modelos disponibles de enfermedad neural<html> 10 en C. elegans y el desarrollo de pantallas farmacéuticas de nematodos 11 , este organismo ha demostrado ser un sistema útil para el estudio de la neurobiología. Dada la disponibilidad de un nematodo asignado 1 y de mutaciones a casi todos los genes del nematodo genoma 12 , nuestra comprensión del sistema nervioso de los nematodos, y por extensión nuestra, está parcialmente limitada por el diseño de ensayos creativamente apropiados. Se han desarrollado varios ensayos de quimiotaxis durante los últimos 40 años para evaluar la respuesta de los nematodos a diversos estímulos aversivos 3 , 4 , 13 , 14 , 15 . La experimentación inicial implicó la introducción de un estímulo ambiental agudo mientras que un solo gusano vagaba sobre una placa de agar= &quot;Xref&quot;&gt; 3 , 14 , 16 . Se registraron cambios inmediatos en las respuestas locomotoras. Por ejemplo, el octanol odorante volátil puede aplicarse a un cabello y ponerse delante de la nariz de un nematodo para estimular el inicio de la locomoción hacia atrás en gusanos de tipo salvaje [ 17] . También se han desarrollado ensayos más complejos para incorporar múltiples variables como medio de evaluar la elección del comportamiento 18 . Una variación de este ensayo implica el uso de una solución de cobre para crear una barrera aversiva de la línea media 4 . Un atrayente, es decir, diacetil, se colocó en un lado de la barrera química con gusanos transferidos lejos de la fuente de diacetilo. Los gusanos defectuosos para las respuestas de aversión al cobre cruzaron inmediatamente la barrera para alcanzar el diacetilo, mientras que los gusanos de tipo silvestre fueron repelidos inicialmente por la barrera. Las respuestas fueron anotadas cuando los gusanos se acercaron por primera vez a la barrera de cobreSin observaciones a largo plazo. Cuando los gusanos son evaluados después de sufrir condiciones de inanición, su sensibilidad a los estímulos ambientales se reduce 19 . Cuando el octanol químico aversivo se deposita frente a la nariz del nematodo, los organismos de tipo silvestre estimulan el movimiento hacia atrás dentro de 3-5 s cuando se alimentan. Después de que estos organismos se han retirado de los alimentos durante 10 min, que muestran una respuesta tardía de 8 - 10 s 20 . Por lo tanto, con el aumento de la inanición, los nematodos muestran una menor respuesta aversiva a las señales ambientales perjudiciales como la búsqueda de alimentos se vuelve más esencial para la supervivencia. Por el contrario, los nematodos que sobreexpresan el receptor neuropéptido 9 ( npr-9) , no responden al octanol en o fuera de los alimentos y muestran una incapacidad para responder a una serie de estímulos aversivos [ 21] . Estos organismos npr-9 (GF) también no modulan su frecuencia de inversión en presencia de alimento, pero puedenInversa en respuesta a los estímulos de tacto áspero que indica que son capaces de locomoción hacia atrás 21 . También hemos evaluado mutantes npr-9 (LF) dado que exhiben una frecuencia anormalmente baja de inversión de la comida, sin embargo, puede modular su comportamiento en la presencia de alimentos [ 21] . El acoplamiento del estado nutricional del gusano con la introducción de estímulos externos agudos ha ayudado a dilucidar los mecanismos por los cuales una vía alimentaria puede modular ampliamente las vías de señalización sensorial 22 , 23 . La presencia de alimentos en el medio ambiente de nematodos también se ha utilizado para evaluar las respuestas de abstinencia de etanol [ 24] . En este experimento, los gusanos se incubaron en diversas concentraciones de etanol y luego se colocaron en una placa de agar con un parche de alimento conocido como un &quot;ensayo de raza alimentaria&quot;. El parche de alimentos se colocó en un borde de la placa, mientras que los nematodos wSe colocan lejos de la fuente de alimento. La retirada de etanol se evaluó midiendo la duración del tiempo requerido para que los gusanos alcanzaran el parche de alimento. Este ensayo de aversión al cobre basado en la nutrición se basa en el ensayo de raza alimentaria para integrar variables ambientales adicionales, a saber, alimentos y cobre, a la vez que se evalúan los cambios de comportamiento a lo largo del tiempo. Esta es una adaptación de un protocolo de uso común en toda la comunidad C. elegans 4 . Este protocolo se ha utilizado para evaluar las respuestas aversivas y la detección de alimentos durante un período de cuatro horas [ 21] . Dado que los gusanos muestran comportamientos de hambre después de 30 minutos de privación de alimentos 25 , también podemos evaluar cómo los cambios en el estado nutricional pueden influir en las respuestas ambientales. Las condiciones de este ensayo miden cómo los organismos experimentales cambian la respuesta a los estímulos aversivos con el tiempo, por lo que se evalúan los cambios de comportamiento comoLos organismos progresan hacia un estado de hambre (y las mediciones continuadas de hambre prolongada). Dado que los animales npr-9 (GF) no alteran su comportamiento en respuesta a alimentos o muchas señales aversivas, buscamos identificar si estos déficits de comportamiento persistirían en el contexto de hambre. En última instancia, este diseño de ensayo se ha formulado para evaluar específicamente los mutantes npr-9 (GF), pero puede adaptarse adicionalmente para caracterizar también cepas nuevas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="689">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;width:332px;">M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.]</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Produced in lab</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:332px;">Cupric Sulfate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C-1297</td>
			<td style="width:167px;">Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a caenorhabditis elegans nutritional-status based copper aversion assay

Para garantizar la supervivencia, los organismos deben ser capaces de evitar los hábitats desfavorables al tiempo que garantizan una fuente de alimento consistente. Caenorhabditis elegans alteran sus patrones locomotores tras la detección de diversos estímulos ambientales y pueden modular su conjunto de respuestas conductuales en respuesta a las condiciones de hambre. Los nematodos presentan típicamente una respuesta aversiva disminuida cuando se eliminan de una fuente de alimento durante más de 30 min. La observación de los cambios de comportamiento en respuesta a un estado nutricional cambiante puede proporcionar una visión de los mecanismos que regulan la transición de un estado bien alimentado a un estado de hambre. Hemos desarrollado un ensayo que mide la capacidad de un nematodo para atravesar una barrera aversiva ( es decir, cobre) y luego alcanzar una fuente de alimento durante un período prolongado de tiempo. Este protocolo se basa en el trabajo previo mediante la integración de múltiples variables de una manera que permite la continua recogida de datos a medida que los organismos se desplazan hacia unN cada vez más hambre. Además, este ensayo permite un aumento del tamaño de la muestra de modo que pueden evaluarse simultáneamente poblaciones mayores de nematodos. Organismos defectuosos para la capacidad de detectar o responder al cobre inmediatamente cruzar la barrera química, mientras que los nematodos de tipo salvaje son inicialmente repelidos. Como gusanos de tipo silvestre son cada vez más hambre, comienzan a cruzar la barrera y llegar a la fuente de alimentos. Hemos diseñado este ensayo para evaluar un mutante que es incapaz de responder a diversas señales ambientales, incluyendo la sensación de alimentos o la detección de productos químicos aversivos. Cuando se evaluaron a través de este protocolo, los organismos defectuosos cruzaron inmediatamente la barrera, pero también fueron incapaces de detectar una fuente de alimento. Por lo tanto, estos mutantes cruzan repetidamente la barrera química a pesar de llegar temporalmente a una fuente de alimento. Este ensayo puede probar directamente las poblaciones de gusanos para evaluar los posibles defectos de la vía relacionados con la aversión y la inanición.

Se utilizaron cepas de tipo salvaje (N2), npr-9 (tm1652) y una cepa de sobreexpresión npr-9 , es decir npr-9 (GF) (IC836 - npr-9 :: npr-9; sur-5 :: gfp; odr -1 :: rfp), para evaluar las respuestas a la inanición y la aversión al cobre. Los organismos de tipo salvaje son capaces de detectar y responder a la barrera aversiva de cobre, mientras que los mutantes npr-9 (GF) no inician una respuesta aversiva al cobre durante el ensayo de 4 h21. Después de 30 minutos de inanición, aproximadamente 50-60% de organismos de tipo salvaje (N2) atraviesan la barrera de cobre y alcanzan el parche alimenticio. En la marca de 2 h, el 75% de los nematodos de tipo salvaje alcanzan la fuente de alimento. Al final del ensayo, el 100% de los organismos N2 se han trasladado a la fuente de alimento. En contraste, la mayoría de los organismos npr-9 (GF) no modulan los patrones locomotores en respuesta a los alimentos y seguirán cruzando la barrera aversiva incluso después de entrar en contacto con un alimentofuente. Los gusanos npr-9 (GF) no dejan de alterar su locomoción en respuesta a los alimentos durante el ensayo de 4 h y sólo un 30% de los organismos de prueba se encuentran en el alimento en un momento dado. Los animales npr-9 (LF) no funcionan tan bien como los organismos N2, pero sí modulan sus patrones locomotores a medida que el hambre aumenta hasta alcanzar el parche alimenticio ( Figura 3 ). Cuando los organismos N2 o npr-9 (LF) se evalúan a través de este ensayo sin alimento, rara vez atraviesan la barrera de cobre. Los mutantes npr-9 (GF) cruzan repetidamente la barrera hacia adelante y hacia atrás ( Figura 4 ). <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55939/55939fig1.jpg" /> Figura 1 : Representación visual de las marcas para indicar la colocación de la solución de cobre en la parte inferior de una placa de Petri de 5 cm. Estas indicaciones sirven paraLas secciones de la placa se han medido apropiadamente y sirven como guía cuando se transfiere el parche bacteriano y después la solución de cobre sobre la superficie del agar. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55939/55939fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55939/55939fig2.jpg" /> Figura 2 : El plato de Petri de 5 cm se divide en dos secciones para encender y apagar las placas de ensayo de alimentos y un césped bacteriano se forma en el centro de una de estas secciones para la placa en la comida. El parche alimentario no debe entrar en contacto con el compuesto de ensayo que recubre los bordes de la placa y forma una barrera de línea media. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55939/55939fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> &lt;P class = &quot;jove_content&quot; para: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55939/55939fig3.jpg" /> Figura 3 : Porcentaje de gusanos N2, npr-9 (tm1652) y npr-9 (GF) que alcanzan la fuente de alimento durante un período de cuatro horas en respuesta al ensayo de aversión al cobre basado en el estado nutricional. Los puntos de datos son promedios de al menos tres experimentos (n&gt; 30 gusanos) realizados en días separados para ambas cepas. Los datos se presentan como media ± error estándar y se analizan con un ANOVA de medidas repetidas de dos vías. ** p &lt;0,01, significativamente diferente de los animales N2 en condiciones idénticas. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55939/55939fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55939/55939fig4.jpg" /> Figura 4 : Porcentaje de N2, npr-9 (tm1652) y npr-9 (GF) W que cruzan la barrera de cobre sin fuente de alimento durante un ensayo de cuatro horas. Las cepas antes mencionadas se evaluaron para la aversión al cobre en ausencia de alimento. Las respuestas positivas se puntúan al cruzar la barrera de cobre y permanecer en la mitad no originaria de la placa. Los puntos de datos son promedios de al menos tres experimentos (n&gt; 30 gusanos) realizados en días separados para ambas cepas. Los datos se presentan como media ± SE y se ensayaron al menos 10 animales en tres experimentos independientes analizados con un ANOVA de medidas repetidas de dos vías. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55939/55939fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

UN<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Ensayo de aversión al cobre basado en el estado nutricional

Aquí, presentamos un ensayo específico de Caenorhabditis elegans diseñado para evaluar los cambios en el comportamiento de aversión al cobre y la capacidad de localizar una fuente de alimento común, a medida que el organismo progresa de un estado nutricional bien alimentado a hambriento.

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their ...

a-caenorhabditis-elegans-nutritional-status-based-copper-aversion

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

6.4K vistas.  Queen's University.  Aquí, presentamos un ensayo específico de Caenorhabditis elegans diseñado para evaluar los cambios en el comportamiento de aversión al cobre y la capacidad de localizar una fuente de alimento común, a medida que el organismo progresa de un estado nutricional bien alimentado a hambriento. 

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Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

La cuantificación automática de la fluorescencia en el Synaptic<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

Investigación

Neurociencias

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

La<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Sistema Modelo para el Estudio Amylopathy

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C. elegans genome includes potential antipsychotic drug (APD) targets conserved in humans, including genes encoding proteins required for neurotransmitter synthesis and for synaptic structure and function. APD exposure produces developmental delay and/or lethality in nematodes in a concentration-dependent manner. These phenotypes are caused, in part, by APD-induced inhibition of pharyngeal pumping1,2. Thus, the developmental phenotype has a neuromuscular basis, making it useful for pharmacogenetic studies of neuroleptics. Here we demonstrate detailed procedures for testing APD effects on nematode development and pharyngeal pumping. For the developmental assay, synchronized embryos are placed on nematode growth medium (NGM) plates containing APDs, and the stages of developing animals are then scored daily. For the pharyngeal pumping rate assay, staged young adult animals are tested on NGM plates containing APDs. The number of pharyngeal pumps per unit time is recorded, and the pumping rate is calculated. These assays can be used for studying many other types of small molecules or even large molecules.

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Approaches for testing the effects of antipsychotic drugs (APDs) in Caenorhabditis elegans are demonstrated. Assays are described for testing drug effects on development and viability and on pharyngeal pumping rate. These methods are also applicable for pharmacogenetic experiments with drug classes other than APDs.

Métodos para el estudio de los mecanismos de acción de los fármacos antipsicóticos en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the development of more effective treatments is the relative lack of understanding of the molecular underpinnings of the effects of ethanol on behavior. The nematode, Caenorhabditis elegans (C.&#160;elegans), provides a useful model in which to generate and test hypotheses about the molecular effects of ethanol. Here, we describe an assay that has been developed and used to examine the roles of particular genes and environmental factors in behavioral responses to ethanol, in which locomotion is the behavioral output. Ethanol dose-dependently causes an acute depression of crawling on an agar surface. The effects are dynamic; animals exposed to a high concentration demonstrate an initial strong depression of crawling, referred to here as initial sensitivity, and then partially recover locomotion speed despite the continued presence of the drug. This ethanol-induced behavioral plasticity is referred to here as the development of acute functional tolerance. This assay has been used to demonstrate that these two phenotypes are distinct and genetically separable. The straightforward locomotion assay described here is suitable for examining the effects of both genetic and environmental manipulations on these acute behavioral responses to ethanol in C.&#160;elegans.

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

C. elegans is a useful model for studying the effects of ethanol on behavior. We present a behavioral assay that quantifies the effects of ethanol on the locomotion speed of crawling worms; both initial sensitivity and the development of acute functional tolerance to ethanol can be measured with this assay.

Un ensayo para medir los efectos del etanol sobre la velocidad de locomoción<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Microcámaras de agarosa para Imagen de calcio a largo plazo de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense organs provide an excellent model system for the study of mechanosensation. This protocol describes a simple touch behavior in fruit flies which can be used to identify mutations that interfere with mechanosensation. The tactile stimulation of a macrochaete bristle on the thorax of flies elicits a grooming reflex from either the first or third leg. Mutations that interfere with mechanotransduction (such as NOMPC), or with other aspects of the reflex arc, can inhibit the grooming response. A traditional screen of adult behaviors would have missed mutants that have essential roles during development. Instead, this protocol combines the touch screen with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) to allow for only limited regions of homozygous mutant cells to be generated and marked by the expression of green fluorescent protein (GFP). By testing MARCM clones for abnormal behavioral responses, it is possible to screen a collection of lethal p-element mutations to search for new genes involved in mechanosensation that would have been missed by more traditional methods.

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

In order to identify novel mutations affecting mechanosensation, we designed an assay that measures the behavioral response to tactile stimulation of fly bristles in mutant clones generated by the MARCM method. The combination of techniques allows for the identification of mechanosensitive mutations that would otherwise be lethal.

Un ensayo de conducta para Mechanosensation de clones en MARCM-basa<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. Embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans is a late developmental stage consisting of the elongation of the embryo along its longitudinal axis. This developmental stage is controlled by intercellular communication between hypodermal cells and underlying body-wall muscles. These signaling mechanisms control the morphology of hypodermal cells by remodeling the cytoskeleton and the cell-cell junctions. Measurement of embryonic lethality and developmental arrest at larval stages as well as alteration of cytoskeleton and cell-cell adhesion structures in hypodermal and muscle cells are classical phenotypes that have been used for more than 25 years to dissect these signaling pathways. Recent studies required the development of novel metrics specifically targeting either early or late elongation and characterizing morphogenic defects along the antero-posterior axis of the embryo. Here, we provide detailed protocols enabling the accurate measurement of the length and the width of the elongating embryos as well as the length of synchronized larvae. These methods constitute useful tools to identify genes controlling elongation, to assess whether these genes control both early and late phases of this stage and are required evenly along the antero-posterior axis of the embryo.

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Here we detail protocols specifically designed to monitor morphogenic defects that occur during early and late phases of embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans. Ultimately, these protocols are designed to identify genes that regulate these phases and to characterize their differential requirements along the antero-posterior axis of the embryo.

Las métricas para caracterizar nuevos embrionarias Alargamiento del nematodo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc superoxide dismutase 1 (SOD1). The structural instability of SOD1 and the detection of SOD1-positive inclusions in familial-ALS patients supports a potential causal role for misfolded and/or aggregated SOD1 in ALS pathology. In this study, we describe the development of a cell-based assay designed to quantify the dynamics of SOD1 aggregation in living cells by high content screening approaches. Using lentiviral vectors, we generated stable cell lines expressing wild-type and mutant A4V SOD1 tagged with yellow fluorescent protein and found that both proteins were expressed in the cytosol without any sign of aggregation. Interestingly, only SOD1 A4V stably expressed in HEK-293, but not in U2OS or SH-SY5Y cell lines, formed aggregates upon proteasome inhibitor treatment. We show that it is possible to quantify aggregation based on dose-response analysis of various proteasome inhibitors, and to track aggregate-formation kinetics by time-lapse microscopy. Our approach introduces the possibility of quantifying the effect of ALS mutations on the role of SOD1 in aggregate formation as well as screening for small molecules that prevent SOD1 A4V aggregation.

We describe a method to quantify the aggregation of misfolded proteins. Our protocol details lentiviral induced stable cell line generation, automated confocal imaging, and image analysis of protein aggregates. As an illustrative application, we studied the effect of small molecules in promoting SOD1 aggregation in a time- and dose-dependent manner.

Desarrollo de ensayos para cuantificación de contenido alto de Sod1 mutante de la proteína total formación en células vivas

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

Imagen radiométrica calcio de neuronas individuales en comportamiento Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are specialized sites of synaptic innervation modulated by activity and serve as substrates for learning and memory. Recently, dendritic spines have been described for DD GABAergic neurons as the input sites from presynaptic cholinergic neurons in the motor circuit of Caenorhabditis elegans. This synaptic circuit can now serve as a powerful new in vivo model of spine morphogenesis and function that exploits the facile genetics and ready accessibility of C. elegans to live-cell imaging. 
This protocol describes experimental strategies for assessing DD spine structure and function. In this approach, a super-resolution imaging strategy is used to visualize the intricate shapes of actin-rich dendritic spines. To evaluate the DD spine function, the light-activated opsin, Chrimson, stimulates the presynaptic cholinergic neurons, and the calcium indicator, GCaMP, reports the evoked calcium transients in postsynaptic DD spines. Together, these methods comprise powerful approaches for identifying genetic determinants of dendritic spines in C. elegans that could also direct spine morphogenesis and function in the brain.

Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are important cellular features of the nervous system. Here live imaging methods are described for assessing the structure and function of dendritic spines in C. elegans.&#160;These approaches support the development of mutant screens for genes that define dendritic spine shape or function.

Imágenes de espinas dendríticas en Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are specialized sites of synaptic innervation modulated by activity and serve as substrates for learning and memory. Recently, dendritic ...