We thank Drs. Alison Heffer and Yong Lu for setting up the microinjection apparatus and sharing their invaluable knowledge and experience with insect RNAi. This work was supported by the National Institutes of Health (R01GM113230 to L.P.).

The authors have nothing to disclose.

Mentre un piccolo numero di sistemi modello sofisticati (topi, mosche, vermi) sono stati sviluppati nel corso del 20 ° secolo, il 21 ° secolo ha visto un&#39;ondata di nuovi sistemi di animali in fase di sviluppo nei laboratori di tutto il mondo. Questi nuovi sistemi consentono agli scienziati di affrontare comparativi, domande evolutive che non può essere sondato utilizzando solo gli &#39;standard&#39; sistemi modello. Questa distribuzione di nuovi modelli richiede il rapido sviluppo di metodi per la coltura di laboratorio, l&#39;identificazione del gene, e gli approcci funzionali in nuove specie. Qui, sono state presentate le procedure per l&#39;allevamento di D. maculatus in laboratorio e protocolli passo-passo per embrionali RNAi, genitori RNAi, e l&#39;analisi fenotipica in questo coleottero. L&#39;obiettivo è che queste descrizioni incoraggiare altri ad utilizzare D. maculatus nei loro esperimenti e di utilizzare gli approcci presentati qui di sviluppare ulteriori nuovi specie modello. Mentre D. maculatus lcolonie ab sono incredibilmente facili da mantenere, una limitazione di allevamento di questa specie è l&#39;odore sgradevole del gatto cibo umido dato ai coleotteri come loro fonte di cibo. Per evitare questo, cibi alternativi come polvere di siero / proteine ​​della soia, formaggio, cibo per cani terra, e latte in polvere, sono stati testati con o senza cotone bagnato alterare umidità. cibo per cani Terra era l&#39;alternativa più efficace e può essere utilizzato per regolare l&#39;alimentazione colonia. La sopravvivenza era eccellente (&gt; 90%) da uovo ad adulto in gabbie allevati sul cibo per cani solo secco in 80% di umidità relativa, con o senza aggiunta di cotone bagnato. Tuttavia, integrando questa dieta con cibo per gatti bagnato quando la raccolta delle uova per aumentare la fecondità può essere necessaria quando la raccolta di un gran numero di uova. Se si utilizza il cibo per cani, cibo vecchio deve essere rimosso regolarmente, come cibo per cani condizionata è stato trovato per inibire la deposizione delle uova 54. Crocchette cibo per cani (KR, risultati preliminari), sughero, legno, carta e altri materiali possono essere utilizzati anche come rifugi 71.È interessante notare che, biodegradazione di polistirolo utilizzando mealworm larve di scarabeo stato segnalato 72. Pertanto, questo è stato testato per D. maculatus larve. Giovane D. maculatus larve sono sopravvissuti fino all&#39;età adulta con un solo polistirolo o di materiali contenenti amianto e cotone umido (dati non riportati), ma se mangiare e digerire quei materiali resta da determinare. Questo rapporto è il primo protocollo dettagliato per lo svolgimento di studi genetici funzionali in D. maculatus. L&#39;uso di RNAi qui rappresenta un&#39;espansione di questa tecnica per un nuovo sistema modello. Diverse osservazioni specifiche sono degni di nota per quanto riguarda gli esperimenti atterramento RNAi in D. maculatus e altre specie non-modello. In primo luogo, garantire che RNAi sarà efficace in D. maculatus, lo stesso ceppo di D. maculatus usato qui dovrebbe essere impiegato. Esistono prove fornite da Tribolium castaneum che diversi ceppi mostrano variazioni di RNAi phenotypes 24,73, e fenotipi mutanti mostrano spesso la dipendenza dal background genetico in specie modello 74-76. Inoltre, vi è evidenza aneddotica per strain-dipendenza in altri protocolli, tra cui l&#39;ibridazione in situ. In secondo luogo, appropriata tempi di iniezione è fondamentale per RNAi di successo nel D. maculatus. Un po &#39;counterintuitively, il segmacoria è più facilmente penetrato dopo la cuticola è completamente sclerotizzato, almeno due giorni dopo eclosion. Pertanto, femmine vergini 4 - 8 giorni dopo eclosion devono essere utilizzati. le femmine anziane sperimentano la fecondità più basso rispetto alle femmine di recente eclosed e quindi non sono adatti per l&#39;iniezione. Terzo, iniettato dsRNA può ottenere spinto fuori dalla pressione interna dell&#39;addome femminile. Per minimizzare la possibilità di perdere una grande quantità di dsRNA dopo l&#39;iniezione, tenere l&#39;ago nell&#39;addome per ~ 5 sec dopo l&#39;iniezione e quindi rimuovere lentamente (6.2.8). Nel frattempo, evitare di premere l&#39;addome della femmina durante o subitodopo l&#39;iniezione. Per aggirare risultati distorti causati da questo problema, iniettare almeno 8 femmine per ogni dsRNA per ottenere abbastanza prole (~ 200 embrioni al giorno) per l&#39;analisi fenotipica. Quarto, alta resa uovo è importante per fornire dati imparziali per l&#39;analisi fenotipica dopo l&#39;iniezione. In media, ogni femmina D. maculatus produce circa 35-55 embrioni al giorno. Rendimento Egg dipende dalla dimensione della popolazione, femminile età, l&#39;umidità, la disponibilità di cibo, la temperatura (dati non mostrati), ed altri fattori ambientali 54. Di solito, le femmine depongono più a 30 ° C a 25 ° C. In quinto luogo, gli embrioni non schiuse possono essere cannibalizzati da larve schiuse. Come larve schiuse sono di solito wild-type-simile o solo leggermente influenzato, mentre gli embrioni non schiuse sono di solito più gravemente colpiti, questa abitudine di D. maculatus larve possono causare risultati distorti in un&#39;analisi quantitativa fenotipica. Pertanto, la rimozione di larve schiuse il più presto possibile è fortemente raccomandato. Il nostro laboratorio si è concentrato su D. maculatus segmentazione, anche se molti aspetti di questa specie, tra cui la fisiologia, l&#39;ecologia, e dei parassiti controllo sono di grande interesse. Per studiare l&#39;embriogenesi e la segmentazione, una serie di strisce scuro pigmentate sul lato dorsale del D. maculatus larve può servire come marker naturale per lo sviluppo anormale. Inoltre, caratteristica setole radicata sulle strisce pigmentate di larve può essere usato come indicazione di segmenti. Queste caratteristiche morfologiche, insieme con la constatazione che gli embrioni affetti lievemente o moderatamente possono sopravvivere alla schiusa, sono vantaggi del modello D. maculatus per studiare i meccanismi coinvolti nel patterning il piano di base del corpo. Infine, l&#39;importanza di effettuare esperimenti, tra cui un controllo negativo altamente controllati come la GFP dsRNA e testare due regioni obiettivo non sovrapposte per ogni gene-è fondamentale per evitare errori di interpretazione a causa di effects di iniezione per sé e gli effetti la porta. Per D. maculatus, 4 - 6 mg (2 ml di 2 o 3 mg / mL) dsRNA sono stati iniettati in ogni femmina e il dsRNA era 200-250 bp lungo. Gli importi e altri dettagli del protocollo possono avere bisogno di essere ottimizzato se il targeting dei geni che funzionano in seguito in fase di sviluppo o in diversi processi fisiologici / metabolici. Scoperte precedenti hanno mostrato che gli effetti RNAi possono essere trasmesse alle generazioni successive al di là della generazione F1 in C. elegans 15. Una minoranza di ordito larve D. maculatus con difetti dovuti alla segmentazione RNAi può sopravvivere fino all&#39;età adulta e in grado di riprodurre. Esperimenti preliminari non è riuscito a rivelare i difetti evidenti nella generazione F2. Studi futuri possono rivelare effetti transgenerazionali di RNAi in questa specie.

Nel 1998, Fuoco e Mello hanno riferito che a doppio filamento di RNA (dsRNA) può indurre inibizione della funzione del gene in Caenorhabditis elegans 1. Questa risposta innescato da dsRNA è stato chiamato interferenza dell&#39;RNA (RNAi), e tale silenziamento genico RNAi-mediata è stato segnalato per essere conservato in animali, piante e funghi 2-7. In piante e alcuni animali, funzioni RNAi sistemica, il che significa che l&#39;effetto può diffondersi ad altre cellule / tessuti dove dsRNA non viene introdotto direttamente (rivisto nel 8-10). Gli scienziati hanno fatto uso di questo endogena risposta RNAi cellulare progettando dsRNAs di indirizzare i geni di interesse, battendo così giù la funzione del gene senza manipolare direttamente il genoma (rivisto nel 11-14). RNAi è un potente strumento per studi funzionali causa dei seguenti vantaggi. In primo luogo, anche con il minimo informazioni sequenza del gene, un gene può essere mirata utilizzando RNAi. Ciò è particolarmente importante per studies di organismi non-modello privi di dati genomici e trascrittomica. In secondo luogo, negli organismi dove la risposta RNAi è robusta sistemica RNAi mediata knockdown gene può essere effettuata in quasi ogni stadio di sviluppo. Questa funzione è molto utile per studiare la funzione dei geni pleiotropici. In terzo luogo, in alcuni casi, effetti RNAi diffuso ai gonadi e discendenti, in modo tale che i fenotipi si osservano nella prole 15,16. Questo fenomeno, noto come genitori RNAi (pRNAi), è particolarmente vantaggioso per i geni che influenzano lo sviluppo embrionale, come numerosa prole prodotta da un solo genitore iniettato può essere esaminato, senza manipolazione diretta di uova. Per queste ragioni, pRNAi è il metodo di scelta. Tuttavia, se pRNAi è inefficace, ad esempio per i geni necessari per la oogenesi, allora embrionale RNAi (eRNAi) deve essere utilizzato. Quarto, RNAi può essere utilizzato per generare l&#39;equivalente di una serie allelica dal fatto che la quantità di dsRNA consegnato può essere variata su un intervallo di produrre debole per difetti forti. Tale gradazione di fenotipi può essere utile per comprendere la funzione del gene quando il gene è coinvolto in un processo complesso e / o completa perdita di funzione è letale. In quinto luogo, la consegna di dsRNA è generalmente facile e fattibile, soprattutto negli animali che mostrano solide risposte RNAi sistemiche. dsRNA può essere introdotto da microiniezione 1,5, alimentazione / ingestione 17,18, ammollo, 19,20 e il virus / batteri-mediata consegna 21,22. Sesto, a differenza di alcuni metodi di targeting / modifica dei geni, non vi è alcuna necessità di screening per gli organismi che trasportano la mutazione o di effettuare incroci genetici per generare omozigoti quando si usa RNAi. Pertanto, rispetto a molte altre tecniche per studiare la funzione del gene, RNAi è veloce, poco costoso, e può essere applicato per schermi di grandi dimensioni 23-25. L&#39;ampio programma di utilità di RNAi fornisce i mezzi per effettuare studi funzionali in una vasta gamma di organismi, ampliando la gamma di specie disponibili per lo studio beyond i sistemi modello tradizionali per i quali sono stati sviluppati strumenti genetici. Ad esempio, gli studi che utilizzano sistemi non-modello sono tenuti a dare intuizioni l&#39;evoluzione dei geni e reti geniche confrontando le funzioni di ortologhi da specie che rappresentano diverse modalità di sviluppo o esporre distinte caratteristiche morfologiche 26-29. Questi tipi di studi forniranno una migliore comprensione della diversità biologica, con conseguenze per la ricerca sia applicata e di base. Essendo il più grande gruppo di animali sul pianeta, gli insetti offrono una grande opportunità per esplorare i meccanismi alla base della diversità. Inoltre, gli insetti sono in genere piccole, hanno cicli di vita brevi, ad alta fecondità, e sono facili da dietro in laboratorio. Negli ultimi due decenni, RNAi è stato applicato con successo negli insetti che abbracciano gli ordini, tra cui Ditteri (vere mosche) 5, lepidotteri (farfalle e falene) 30, Coleotteri (coleotteri) 16,31, Imenotteri (sawfbugie, vespe, formiche e api) 32, Hemiptera (veri insetti), Isotteri (termiti) 34, Blattodea (scarafaggi) 35, ortotteri (grilli, cavallette, locuste e grilli) 36 e Phthiraptera (pidocchi) 37. Applicazione di successo di RNAi ha fornito dati funzionali per gli studi di patterning in embriogenesi precoce (asse anteriore-posteriore 32, dorso-ventrale asse 28, la segmentazione 26,38), determinazione del sesso, 39,40 chitina / cuticola biosintesi 41, ecdysone segnalazione 42, comportamento sociale 43, e altro ancora. Metodi RNAi sviluppati per diverse specie di insetti possono essere di ulteriore vantaggio in quanto sono suscettibili di essere utile per il controllo dei parassiti (rivisto nel 44-46). effetti RNAi saranno nonché specie-specifico gene-specifico, purché regioni non conservate sono scelti per il targeting. Per le specie di insetti utili come le api e bachi da seta, di targeting dei geni vitali per la sopravvivenza divirus o parassiti per controllare l&#39;infezione possono fornire una nuova strategia per proteggere queste specie 47,48. Dermestes maculatus (D. maculatus), comune nome nascondere coleottero, è distribuito in tutto il mondo tranne che per l&#39;Antartide. Come un insetto olometaboli, il ciclo di vita D. maculatus comprende embrionale, larvale, pupa, e stadi adulti (Figura 1). Perché si nutre di carne, D. maculatus è utilizzato nei musei per skeletonize animali morti e entomologi forensi può essere utilizzato per stimare momento della morte 49,50. D. maculatus si nutre di prodotti di origine animale, tra cui carcasse, carne secca, formaggio e le pupe / bozzoli di altri insetti e provoca così danni alle famiglie, alimenti conservati, e la seta, il formaggio, e industrie della carne 51,52. L&#39;applicazione di RNAi in questo coleottero potrebbe fornire un modo efficiente ed ecologico per ridurre al minimo il suo impatto economico. Il nostro laboratorio ha utilizzato D. maculatus come nuovo model insetto per studiare la segmentazione 53. Oltre ad essere suscettibili di laboratorio allevamento, D. maculatus è di interesse per la ricerca di base in quanto è uno sviluppatore intermedio di germi, che lo rende una specie utili per studiare la transizione tra breve e di sviluppo a lungo germe. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54976/54976fig1.jpg" /> Figura 1: Ciclo di vita di D. maculatus. Fotografie di D. maculatus in diverse fasi della vita, come indicato. Il ciclo di vita da uovo ad adulto dura tre settimane a 30 ° C, ma più a lungo a temperature più basse. (A, F) embrioni appena deposte sono di colore bianco a giallo chiaro e ovali, circa 1,5 mm di lunghezza. Embriogenesi prende ~ 55 ore a 30 ° C. (B, C e G) larve hanno le strisce pigmentate scure e sono ricoperte di setole. Le larve passano attraverso diversi stadi a seconda dell&#39;ambiente e la loro lunghezza può estendersi fino a oltre 1 centimetro. (D, H) </strong&gt; Giovani pupe sono giallo chiaro. Pupation prende ~ 5 - 7 giorni a 30 ° C. (E, I) Poco dopo eclosion, pigmentazione scura appare sopra il corpo adulto coleottero. Gli adulti possono vivere fino a diversi mesi e una femmina può deporre centinaia di embrioni sopra il suo ciclo di vita. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54976/54976fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> In precedenza, abbiamo dimostrato che RNAi è efficace nel abbattendo la funzione del gene in D. maculatus 53. Qui la nostra esperienza di allevamento colonie D. maculatus in laboratorio è condiviso con i protocolli passo-passo sia embrionale e genitori RNAi set-up, iniezione, cura post-iniezione, e l&#39;analisi fenotipica. Il silenziamento genico e analisi metodi dsRNA-mediate introdotti qui non solo di fornire informazioni dettagliate per affrontare questioni in D. maculatus, ma hanno anche un significato potenziale foR applicazione di RNAi in altre specie non-modello scarabeo / insetto.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="642">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dermestes maculatus live beetles</td>
			<td style="width:140px;">Our lab or Carolina Biological Supply</td>
			<td style="width:119px;">#144168</td>
			<td style="width:167px;">Our lab strain was verified by COI barcoding; strain variation from Carolina cannot be ruled out</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Wet cat food</td>
			<td style="width:140px;">Fancy Feast</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Chunks of meat with gravy. Can buy at most pet food and grocery stores</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dry dog food</td>
			<td style="width:140px;">Purina Puppy Chow</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Can buy at most pet food and grocery stores</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Insect cage (size medium, 30.5x19x20.3 cm)</td>
			<td style="width:140px;">Exo Terra</td>
			<td>PT2260</td>
			<td>For colony maintenance. Can use larger cage if needed</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Insect cage (size mini, 17.8x10.2x12.7 cm)</td>
			<td style="width:140px;">Exo Terra</td>
			<td>PT2250</td>
			<td>For embryo collection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish</td>
			<td style="width:140px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89038-968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cotton ball</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">22-456-883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Megascript T7 transcription kit</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">AM1334</td>
			<td>For 40 reactions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pneumatic pump</td>
			<td style="width:140px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;">PV830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Capillary holder</td>
			<td style="width:140px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:140px;">NARISHIGE</td>
			<td style="width:119px;">MN-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Black filter paper (90 mm)</td>
			<td style="width:140px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">28342-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Food coloring (green)</td>
			<td>McCormick</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Borosilicate glass capillary</td>
			<td style="width:140px;">Hilgenberg</td>
			<td style="width:119px;">1406119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Needle puller (micropipette puller)</td>
			<td style="width:140px;">Sutter Instrument Co.</td>
			<td style="width:119px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microscope glass slide</td>
			<td>WorldWide Life Sciences Division</td>
			<td style="width:119px;">41351157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sealing film (Parafilm M)</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Model 801 Syringe (10 &#181;l )</td>
			<td style="width:140px;">Hamilton</td>
			<td style="width:119px;">7642-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Needle (32-gauge)&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Hamilton</td>
			<td style="width:119px;">7762-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fixation Solution (Pampel&#39;s)</td>
			<td>BioQuip Products, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">1184C</td>
			<td>Toxic, needs to be handled in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Forcep (DUMONT #5)</td>
			<td style="width:140px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cover slip (24X50 mm, No. 1.5)</td>
			<td style="width:140px;">Globe Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1415-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Eppendorf Femtotips Microloader pipette tip</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">E5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dissecting microscopy for embryo injection</td>
			<td style="width:140px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">M420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dissecting microscopy for larval phenotypic visualization</td>
			<td style="width:140px;">Zeiss</td>
			<td colspan="2">SteREO Discover. V12</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DIC microscopy</td>
			<td style="width:140px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">AXIO Imager. M1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rearing and double-stranded rna-mediated gene knockdown in the hide beetle, dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Laboratorio degli autori ha utilizzato la tecnologia RNAi per studiare l&#39;evoluzione funzionale dei geni che regolano la segmentazione negli insetti 53,55. Mentre tutti gli insetti sono segmentati, i geni che regolano questo processo sembrano aver discostato durante radiazioni insetti 26,38,56-63. Schermi genetiche in Drosophila hanno identificato una serie di nove geni di segmentazione coppia-di regole che sono responsabili per promuovere la formazione di segmenti corporei 64-70. Qui, l&#39;ortologo di uno di questi geni, abbinato (PRD), viene utilizzato per documentare l&#39;utilità di RNAi per studiare la funzione del gene in D. maculatus. eRNAi e pRNAi erano ogni efficaci nel dimostrare ruoli per DMAC - PRD nella formazione segmento in questa specie. 2 - 3 mg / mL di dsRNA progettato per indirizzare DMAC - PRD (figure 8B, 8D e 8F </strong&gt;) è stato confrontato con GFP dsRNA, iniettato come controllo negativo (figure 8A, 8C e 8E). prole di controllo covato con una striscia pigmentato per segmento. Strisce pigmentate confinanti sono stati separati da uno spazio non pigmentato (Figura 8A). Dopo PRD pRNAi, figli affetti covato con fuse strisce pigmentate vicini, che indicano i confini segmentale erano difettose (Figura 8B). A seconda della gravità fenotipica, uno o più fusioni sono stati rilevati nelle larve interessata. Tuttavia, fusioni costantemente apparso nelle regioni di confine tra T2 / T3, A1 / A2, A3 / A4, A5 / A6, A7 / A8, indicando i difetti coppia-regola-like. Fenotipi cuticole dopo atterramento PRD hanno mostrato la perdita di segmenti addominali, così come la lunghezza del corpo ridotto (Figura 8D). Engrailed (En) colorazione anticorpo è stato eseguito per esaminare i difetti molecolari nei primi mesi delembrioni dopo atterramento PRD. Mentre gli embrioni di controllo ha mostrato strisce En espressione con la stessa intensità in tutti i segmenti (Figura 8E), ridotta espressione En è stato rilevato in strisce alternate nella prole di DMAC-PRD dsRNA iniettato femmine (asterischi nella Figura 8F). Il pattern di espressione ridotta En è coerente con il modello della cuticola difettoso osservato nelle larve schiuse interessato. Per i risultati più dettagliati di fenotipi dopo atterramento PRD in D. maculatus, vedere Xiang et al. 2015 53. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54976/54976fig3.jpg" /> Figura 3: Apparato di iniezione. È mostrato fotografia del microscopio dissezione e micromanipolatore utilizzato per iniettare gli embrioni D. maculatus. fornitura di azoto è collegata alla porta di ingresso pressione di una pompa pneumatica. titolare capillare di vetro è collegato al eject bocca premente della pompa. interruttore a pedale è collegato alla pompa. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54976/54976fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54976/54976fig4.jpg" /> Figura 4: un diagramma di flusso per D. maculatus embrionali RNAi. (AD) di raccolta di embrioni per l&#39;iniezione. Le femmine depongono embrioni (arancione) a batuffoli di cotone (cerchio grigio). embrioni separati da batuffoli di cotone e lasciarli cadere su un pezzo di cartoncino nero. Le barre bianche indicano le lacrime agli batuffolo di cotone. Trasferimento degli embrioni per un coperchio capsula di Petri raccolta, rivestite con carta nera. (E, F) Iniettare dsRNA in embrioni. Allineare gli embrioni su diapositive su nastro doppio bastone e li inietta individualmente sotto un microscopio da dissezione. è mostrato Ago con colorante alimentare verde. (GJ) post-iniezione recupero e incubzione. Mettere un batuffolo di cotone bagnato nella scatola di Petri per fornire umidità. Coprire la piastra di Petri e avvolgerlo con pellicola (azzurro) di tenuta. Posizionare la piastra di Petri in un incubatore e rimuovere le larve schiuse per l&#39;analisi fenotipica. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54976/54976fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54976/54976fig5.jpg" /> Figura 5: Good vs Bad embrionali Esempi di iniezione. Embrione (A) uninjected. (B) Embrione iniettato con troppo poco dsRNA. (C) Embrione iniettato con adeguata quantità di dsRNA. (D) embrione rotto con traboccante dsRNA causata da un eccesso di iniezione. colorante alimentare è stato aggiunto al dsRNA per la visualizzazione. (E) Esempi di tubi capillari trainati usati come aghi per iniezione. Si noti la conicità e lunghezza della punta fo due esempi di aghi funzionali. Barre di scala per AD rappresentano 200 micron. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54976/54976fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54976/54976fig6.jpg" /> Figura 6: maschio e femmina adulti e pupe. (A) Vista ventrale di una pupa di sesso maschile. (A &#39;) Ingrandimento della parte posteriore A. (A &quot;) Illustrazione del maschio genitali pupa. (B) Vista ventrale di una pupa femminile. (B&#39;) ingrandimento della parte posteriore del pupe B. femminili hanno due papille genitali (bianco frecce). (B &quot;) Illustrazione dei genitali femminili pupa. (C) Vista ventrale di un maschio adulto. (C &#39;) Visualizzazione ingrandita della parte posteriore del C. Si noti che gli adulti di sesso maschile sono tridente, come i genitali e unastruttura circolare lobi simile al 4 ° sternite (frecce bianche e nere, rispettivamente). (D) Vista ventrale di una femmina adulta. (D &#39;) Visualizzazione ingrandita della parte posteriore del D. Per tutti i pannelli, le barre di scala indicano 1 mm. Per i dettagli, vedere Xiang et al. 2015 53. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54976/54976fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/54976/54976fig7.jpg" /> Figura 7: A femmina durante l&#39;iniezione. Le femmine sono anestetizzati e poste ventrale verso l&#39;alto. Viene mostrato un ago che penetra le segmacoria tra il 2 ° e 3 ° sterniti per iniettare dsRNA. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54976/54976fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Figura 8: fenotipi rappresentante, previa pRNAi DMAC-PRD. Iniezione (A) Controllo. Vista laterale di un tipo simile GFP pRNAi prole selvaggio ordito con tre segmenti toracici e dieci segmenti addominali. Ogni segmento ha setole e strisce pigmentate. (B) Vista laterale di un tratteggiata PRD prole pRNAi. Il divario fra bande pigmentate vicini etichettati è ridotto o del tutto mancante. (C) cuticola fenotipo di un controllo unhatched embrione di tipo simil-selvaggio. (D) per cuticole fenotipo di un unhatched PRD prole pRNAi con un minor numero di segmenti addominali. (E, F) Dissected germband da: (E) di controllo, GFP pRNAi è uniformemente espresso En in ogni segmento, (F) PRD espressione pRNAi, En viene ridotto in segmenti alternati (asterischi). Per tutti riquadroLS, barre di scala indicano 500 micron. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54976/54976fig8large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Qui, vi presentiamo i protocolli per l&#39;allevamento di un coleottero intermedio di germi, Dermestes maculatus (D. maculatus) in laboratorio. Condividiamo anche protocolli per embrionale e genitori RNAi e metodi per l&#39;analisi dei fenotipi embrionali per studiare la funzione dei geni in questa specie.

Allevamento e RNA a doppio filamento mediata silenziamento genico nel Hide Beetle,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

rearing-double-stranded-rna-mediated-gene-knockdown-hide-beetle

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

10.5K Views.  University of Maryland.  Qui, vi presentiamo i protocolli per l'allevamento di un coleottero intermedio di germi, Dermestes maculatus (D. maculatus) in laboratorio. Condividiamo anche protocolli per embrionale e genitori RNAi e metodi per l'analisi dei fenotipi embrionali per studiare la funzione dei geni in questa specie. 

Video: Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental changes. Considerable progress in our understanding of the tight connection between the circadian clock and most aspects of physiology has been made in the field over the last decade. However, unraveling the molecular basis that underlies the function of the circadian oscillator in humans stays of highest technical challenge. Here, we provide a detailed description of an experimental approach for long-term (2-5 days) bioluminescence recording and outflow medium collection in cultured human primary cells. For this purpose, we have transduced primary cells with a lentiviral luciferase reporter that is under control of a core clock gene promoter, which allows for the parallel assessment of hormone secretion and circadian bioluminescence. Furthermore, we describe the conditions for disrupting the circadian clock in primary human cells by transfecting siRNA targeting CLOCK. Our results on the circadian regulation of insulin secretion by human pancreatic islets, and myokine secretion by human skeletal muscle cells, are presented here to illustrate the application of this methodology. These settings can be used to study the molecular makeup of human peripheral clocks and to analyze their functional impact on primary cells under physiological or pathophysiological conditions.

Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.

Misura parallela di circadiano Clock espressione genica e la secrezione dell&#39;ormone in colture cellulari primarie umane

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Ricerca

Genetica

Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts

Controlling the expression or activity of specific genes through the myocardial delivery of genetic materials in murine models permits the investigation of gene functions. Their therapeutic potential in the heart can also be determined. There are limited approaches for in vivo molecular intervention in the mouse heart. Recombinant adeno-associated virus (rAAV)-based genome engineering has been utilized as an essential tool for in vivo cardiac gene manipulation. The specific advantages of this technology include high efficiency, high specificity, low genomic integration rate, minimal immunogenicity, and minimal pathogenicity. Here, a detailed procedure to construct, package, and purify the rAAV9 vectors is described. Subcutaneous injection of rAAV9 into neonatal pups results in robust expression or efficient knockdown of the gene(s) of interest in the mouse heart, but not in the liver and other tissues. Using the cardiac-specific TnnT2 promoter, high expression of GFP gene in the heart was obtained. Additionally, target mRNA was inhibited in the heart when a rAAV9-U6-shRNA was utilized. Working knowledge of rAAV9 technology may be useful for cardiovascular investigations.

In this manuscript, a method to prepare recombinant adeno-associated virus 9 (rAAV9) vectors to manipulate gene expression in the mouse heart is described.

Preparazione di rAAV9 per iperespressione o Knockdown geni in Cuori mouse

Controlling the expression or activity of specific genes through the myocardial delivery of genetic materials in murine models permits the investigation ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such as cancer. Cell cycle-regulated gene expression analysis depends on cell synchronization into specific phases. Here we describe a method utilizing two complementary synchronization protocols that is commonly used for studying periodic variation of gene expression during the cell cycle. Both procedures are based on transiently blocking the cell cycle in one defined point. The synchronization protocol by hydroxyurea (HU) treatment leads to cellular arrest in late G1/early S phase, and release from HU-mediated arrest provides a cellular population uniformly progressing through S and G2/M. The synchronization protocol by thymidine and nocodazole (Thy-Noc) treatment blocks cells in early mitosis, and release from Thy-Noc mediated arrest provides a synchronized cellular population suitable for G1 phase and S phase-entry studies. Application of both procedures requires monitoring of the cell cycle distribution profiles, which is typically performed after propidium iodide (PI) staining of the cells and flow cytometry-mediated analysis of DNA content. We show that the combined use of two synchronization protocols is a robust approach to clearly determine the transcriptional profiles of genes that are differentially regulated in the cell cycle (i.e. E2F1 and E2F7), and consequently to have a better understanding of their role in cell cycle processes. Furthermore, we show that this approach is useful for the study of mechanisms underlying drug-based therapies (i.e. mitomycin C, an anticancer agent), because it allows to discriminate genes that are responsive to the genotoxic agent from those solely affected by cell cycle perturbations imposed by the agent.

We report two cell synchronization protocols that provide a context for studying events related to specific phases of the cell cycle. We show that this approach is useful for analyzing the regulation of specific genes in an unperturbed cell cycle or upon exposure to agents affecting the cell cycle.

Studiare l&#39;espressione del gene regolamentata mediante ciclo cellulare da due protocolli complementari di sincronizzazione delle cellule

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

Una metodologia Standard per esaminare in loco mutagenicità in funzione della mutazione di punto riparazione catalizzata da CRISPR/Cas9 e SsODN in cellule umane

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands for the recognition of RNA sequence and structure. Chemically modified Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomers have been recently developed that can recognize RNA duplexes in a sequence-specific manner. PNAs are chemically stable with a neutral peptide-like backbone. PNAs can be synthesized relatively easily by the manual Boc-chemistry solid-phase peptide synthesis method. PNAs are purified by reverse-phase HPLC, followed by molecular weight characterization by matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF). Non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) technique facilitates the imaging of the triplex formation, because carefully designed free RNA duplex constructs and PNA bound triplexes often show different migration rates. Non-denaturing PAGE with ethidium bromide post staining is often an easy and informative technique for characterizing the binding affinities and specificities of PNA oligomers. Typically, multiple RNA hairpins or duplexes with single base pair mutations can be used to characterize PNA binding properties, such as binding affinities and specificities. 2-Aminopurine is an isomer of adenine (6-aminopurine); the 2-aminopurine fluorescence intensity is sensitive to local structural environment changes, and is suitable for the monitoring of triplex formation with the 2-aminopurine residue incorporated near the PNA binding site. 2-Aminopurine fluorescence titration can also be used to confirm the binding selectivity of modified PNAs towards targeted double-stranded RNAs (dsRNAs) over single-stranded RNAs (ssRNAs). UV-absorbance-detected thermal melting experiments allow the measurement of the thermal stability of PNA-RNA duplexes and PNA&#183;RNA2 triplexes. Here, we describe the synthesis and purification of PNA oligomers incorporating modified residues, and describe biochemical and biophysical methods for characterization of the recognition of RNA duplexes by the modified PNAs.

We report the protocols for the synthesis and purification of Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomers incorporating modified residues. The biochemical and biophysical methods for the characterization of the recognition of RNA duplexes by the modified PNAs are described.

Riconoscimento di sequenza-specifico e selettivo di Double-stranded RNA sopra Single-stranded RNA da modificati chimicamente acidi peptido nucleici

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development of a customizable platform to rapidly generate gene modifications in a wide variety of organisms, including zebrafish. CRISPR-based genome editing uses a single guide RNA (sgRNA) to target a CRISPR-associated (Cas) endonuclease to a genomic DNA (gDNA) target of interest, where the Cas endonuclease generates a double-strand break (DSB). Repair of DSBs by error-prone mechanisms lead to insertions and/or deletions (indels). This can cause frameshift mutations that often introduce a premature stop codon within the coding sequence, thus creating a protein-null allele. CRISPR-based genome engineering requires only a few molecular components and is easily introduced into zebrafish embryos by microinjection. This protocol describes the methods used to generate CRISPR reagents for zebrafish microinjection and to identify fish exhibiting germline transmission of CRISPR-modified genes. These methods include in vitro transcription of sgRNAs, microinjection of CRISPR reagents, identification of indels induced at the target site using a PCR-based method called a heteroduplex mobility assay (HMA), and characterization of the indels using both a low throughput and a powerful next-generation sequencing (NGS)-based approach that can analyze multiple PCR products collected from heterozygous fish. This protocol is streamlined to minimize both the number of fish required and the types of equipment needed to perform the analyses. Furthermore, this protocol is designed to be amenable for use by laboratory personal of all levels of experience including undergraduates, enabling this powerful tool to be economically employed by any research group interested in performing CRISPR-based genomic modification in zebrafish.

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Targeted genome editing in the model system Danio rerio (zebrafish) has been greatly facilitated by the emergence of CRISPR-based approaches. Herein, we describe a streamlined, robust protocol for generation and identification of CRISPR-derived nonsense alleles that incorporates the heteroduplex mobility assay and identification of mutations using next-generation sequencing.

Produzione efficiente e identificazione di CRISPR/Cas9-generato Gene Ko nel sistema modello Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a promising vector for gene therapy application. Here, baculovirus is produced by transient transfection of the baculovirus plasmid DNA (bacmid) in an adherent culture of Sf9 cells. Baculovirus is subsequently expanded in Sf9 cells in a serum-free suspension culture until the desired volume is obtained. It is then purified from the culture supernatant using heparin affinity chromatography. Virus supernatant is loaded onto the heparin column which binds baculovirus particles in the supernatant due to the affinity of heparin for baculovirus envelop glycoprotein. The column is washed with a buffer to remove contaminants and baculovirus is eluted from the column with a high-salt buffer. The eluate is diluted to an isotonic salt concentration and baculovirus particles are further concentrated using ultracentrifugation. Using this method, baculovirus can be concentrated up to 500-fold with a 25% recovery of infectious particles. Although the protocol described here demonstrates the production and purification of the baculovirus from cultures up to 1 L, the method can be scaled-up in a closed-system suspension culture to produce a clinical-grade vector for gene therapy application.

In this protocol, baculovirus is produced by transient transfection of baculovirus plasmid into Sf9 cells and amplified in a serum-free suspension culture. The supernatant is purified by heparin affinity chromatography and further concentrated by ultracentrifugation. This protocol is useful for the production and purification of baculovirus for gene therapy application.

Produzione e purificazione di Baculovirus per applicazione di terapia genica

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

A Method to Study the C924T Polymorphism of the Thromboxane A2 Receptor Gene

The thromboxane A2 receptor (TBXA2R) gene is a member of the G-protein coupled superfamily with seven-transmembrane regions. It is involved in atherogenesis progression, ischemia, and myocardial infarction. Here we present a methodology of patient genotyping to investigate the post-transcriptional role of the C924T polymorphism (rs4523) situated at the 3&#39; region of the TBXA2 receptor gene. This method relies on DNA extraction from whole blood, polymerase chain reaction (PCR) amplification of the TBXA2 gene portion containing the C924T mutation, and identification of wild type and/or mutant genotypes using a restriction digest analysis, specifically a restriction fragment length polymorphism (RFLP) on agarose gel. In addition, the results were confirmed by sequencing the TBXA2R gene. This method features several potential advantages, such as high efficiency and the rapid identification of the C924T polymorphism by PCR and restriction enzyme analysis. This approach allows a predictive study for plaque formation and atherosclerosis progression by analyzing patient genotypes for the TBXA2R C924T polymorphism. Application of this method has the potential to identify subjects who are more susceptible to atherothrombotic processes, in particular subjects in a high-risk, aspirin-treated group.

In the present study, we describe a methodology to analyze the C924T genotype. The protocol consists of three phases: DNA extraction, amplification by polymerase chain reaction (PCR), and analysis of the restriction fragment length polymorphism (RFLP) on agarose gel.

Un metodo per studiare il polimorfismo C924T del Gene del ricevitore di trombossano A2

The thromboxane A2 receptor (TBXA2R) gene is a member of the G-protein coupled superfamily with seven-transmembrane regions. It is involved in ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

Esplorare il microbioma radice: estrazione dei dati di comunità batteriche dal suolo e la rizosfera radice Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives each year. Effective treatment options able to halt disease progression are lacking. Despite the extensive sequencing efforts in large patient populations, the majority of ALS and PD cases remain unexplained by genetic mutations alone. Epigenetics mechanisms, such as the post-translational modification of histone proteins, may be involved in neurodegenerative disease etiology and progression and lead to new targets for pharmaceutical intervention. Mammalian in vivo and in vitro models of ALS and PD are costly and often require prolonged and laborious experimental protocols. Here, we outline a practical, fast, and cost-effective approach to determining genome-wide alterations in histone modification levels using Saccharomyces cerevisiae as a model system. This protocol allows for comprehensive investigations into epigenetic changes connected to neurodegenerative proteinopathies that corroborate previous findings in different model systems while significantly expanding our knowledge of the neurodegenerative disease epigenome.

This protocol outlines experimental procedures to characterize genome-wide changes in the levels of histone post-translational modifications (PTM) occurring in connection with the overexpression of proteins associated with ALS and Parkinson&#39;s disease in Saccharomyces cerevisiae models. After SDS-PAGE separation, individual histone PTM levels are detected with modification-specific antibodies via Western blotting.

Alterazioni di modificazione post-traduzionale istone caratterizzante nel lievito Neurodegenerative Proteinopathy modelli

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...