We thank Dr. Zaffar Haque for careful reading of the manuscript. We thank Drs. Masaharu Kataoka and Gengze Wu for discussions and help. Work in the Wang lab is supported by the American Heart Association, Muscular Dystrophy Association, and NIH (HL085635, HL116919, HL125925).

Tutti i passaggi descritti sono stati eseguiti secondo protocolli approvati dal Comitato Biosicurezza e del Comitato Istituzionale cura e l&#39;uso degli animali dell&#39;ospedale dei bambini Boston. All&#39;ospedale dei bambini Boston dispone di strutture di topo esenti da organismi patogeni con cicli giorno / notte regolamentati e climatizzazione. Veterinari e la cura degli animali dello staff di cambiamento gabbie e garantire la salute dei topi. Le strutture sono certificati AAALAC e hanno la certificazione attiva Animal Welfare Assurance (AAALAC accreditamento concesso sulla 1992/02/24 benessere degli animali Assurance numero:. A3303-01). I topi sono stati sacrificati da CO 2 erogata da una sorgente di gas compresso. I campioni di tessuto sono stati raccolti dopo aver verificato che la frequenza cardiaca, il movimento, e la respirazione degli animali era cessato. Roditori neonatali sono resistenti a CO 2 l&#39;eutanasia e sono stati sacrificati per decapitazione usando forbici affilate. Questi metodi sono coerenti con le raccomandazioni del gruppo di eutanasia della American Veterinary Medical associazione. 1. Generazione di rAAV9 costrutti dalla clonazione di un cDNA o shRNA cassetta di espressione nella spina dorsale plasmidi NOTA: Il plasmide rAAV9, contenente le ripetizioni terminali invertite (ITR) di AAV2, utilizzati per il gene sovraespressione è stato modificato per ospitare il TNNT2 pollo promotore (rAAV9.cTNT), che permette l&#39;espressione specifica per cardiomiociti di geni trasdotte 25,26,29. siti unici NheI e KpnI sono stati introdotti nel plasmide, a valle del promotore. I frammenti di cDNA che codificano i geni di interesse possono essere clonati nella spina dorsale rAAV9 utilizzando questi due siti di restrizione 25,26,29. Qui, per esempio, il vettore rAAV9 per la sovraespressione del gene GFP nei cuori di topo è stato generato. Il plasmide risultante contiene la cTnT :: cassetta GFP affiancato da due ITR siti (Figura 1). costrutti rAAV9.U6 :: shRNA sono stati utilizzati per il silenziamento genico 25. Progettazione shRNAs usandoon-line i server di progettazione shRNA. rAAV9.U6 :: shRNA può essere generata sia da ricottura e legando oligonucleotidi contenenti sequenze di DNA shRNA nelle enzima di restrizione-digerito vettori rAAV9 ospitano il promotore U6, o lungo raggio PCR e intra-molecolare Gibson montaggio a base di &quot;senza soluzione di continuità&quot; costruzione di 30. Il plasmide risultante dovrebbe contenere la cassetta U6-shRNA fiancheggiato da due ITR siti (Figura 2). Qui, ad esempio, il vettore rAAV9.U6 :: shRNA è stato costruito per atterramento Trbp mRNA (sequenza Trbp shRNA: GCAGTGATGGATATGCATCTTCTCGAGAAGATGCATATCCATCACTCG). Una corsa shRNA è stato utilizzato come controllo negativo (CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCGCTCGAGCGAGGGCGACTTAACCTTAGG). <ol><li> Clonare la cassetta di espressione cDNA o shRNA nel plasmide spina dorsale rAAV9. Trasformare il DNA in cellule di E. coli competenti 25. NOTA: utilizzare le cellule di E. coli stbl2 o stbl3 per la trasformazione rAAV9 DNA per ridurre al minimo indesiderato ricombinazione ITR. </li><li> Raccogli ilclone positiva da parte delle cellule di E. coli trasformate. Amplificare la cultura in 500 ml di terreno Lilly-Barnett ed estrarre il plasmide rAAV9 dalle cellule batteriche 25-30. NOTA: Midi / Maxi prep plasmide rAAV9 per ottenere una elevata quantità di DNA (&gt; 100 mg). Prima di generare il virus, analizzare sempre l&#39;integrità sequenza dei plasmidi AAV per restrizione digestione e elettroforesi su gel di agarosio, come precedentemente descritto (http://www.vvf.uzh.ch/cloningservice/11bpdeletion/itrintegrity.html). </li></ol> 2. Trasfezione delle cellule HEK293 con rAAV9 Plasmidi <ol><li> Preparare 1 mg / mL di soluzione di polietilenimmina lineare (PEI). Sciogliere PEI in polvere in DH privo di endotossine 2 O che è stato riscaldato a 70-80 ° C. Aftercooling fino a RT, neutralizzare la soluzione a pH 7,0 con 1 M HCl. Filtro sterilizzare (0,22 micron) la soluzione. Aliquota della soluzione di riserva / ml PEI 1 mg (1,400 ml / tubo) e conservare il solutione a -20 ° C. </li><li> HEK293 cellule cultura in Modified Eagle Medium di Dulbecco (DMEM) con il 10% siero fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina. Cultura le cellule in un incubatore a 37 ° con 5 ± 0,5% di anidride carbonica (CO 2). </li><li> Al giorno 0, piastra cellule HEK293 in dieci piatti da 150 mm 18-20 ore prima della trasfezione, dividendo il&gt; 90% delle cellule confluenti in una diluizione 1: 2. NOTA: Al giorno 1, le cellule devono raggiungere il 90% di confluenza. </li><li> Al giorno 1, trasfezione cellule HEK293 con il plasmide rAAV9 (ad esempio, rAAV9.cTNT :: GFP o rAAV6.U6 :: shRNA costruisce), Ad-Helper plasmide, e plasmide AAV-Rep / Cap con PEI 25,26,29. <ol><li> Per 10 piatti a base di cellule al 90% di confluenza, mescolare 70 mg di AAV-Rep / Cap plasmide, 70 mcg pf rAAV9 plasmide, e 200 mg di Ad-Helper plasmide in una provetta da centrifuga da 50 ml. </li><li> Se le cellule sono meno confluenti, regolare la quantità di DNA proporzionalmente. Per esempio, se le cellule sono al 75% confluenti, ridurre laimporto DNA proporzionalmente (75/90 dell&#39;importo indicato al punto 2.4.1): mescolare 70 x 75/90 = 58,3 mg di AAV-Rep / Cap plasmide, 70 x 75/90 = 58,3 mg di rAAV9 plasmide, e 200 x 75/90 = 166,7 mg di Ad-Helper plasmide in una provetta da centrifuga da 50 ml. </li><li> Aggiungere 49 ml di RT DMEM (senza FBS) per il tubo da 50 ml e mescolare bene. </li><li> Aggiungere 1.360 ml di soluzione di PEI per rendere il PEI: rapporto di DNA (v / w) sia 4: 1. Mescolare bene. Incubare a temperatura ambiente per 15 - 30 min. </li><li> Aggiungere 5 ml della miscela preparata al punto 2.4.4 per ogni piatto da 150 mm (50 ml della miscela per dieci piatti di 150 mm). </li></ol></li><li> Cultura le cellule in un incubatore a 37 ° con 5 ± 0,5% di CO 2 per 60-72 ore. </li></ol> 3. Raccolta di transfettati HEK293 cellule e la purificazione di rAAV9 vettori <ol><li> Raccogliere le cellule 60-72 ore dopo la trasfezione. Dislodge e sospendere le cellule in piatti pipettando su e giù con il mezzo di coltura. Trasferire tutte le sospensioni cellulari di sterileprovette da 50 ml. </li><li> Centrifugare le cellule a 500 xg per 5 min. Risospendere il pellet di cellule con 5 ml di PBS in ogni provetta e combinare tutte le sospensioni di cellule in una provetta da 50 ml. </li><li> Centrifugare le cellule a 500 xg per 5 min. Eliminare il surnatante. A questo punto, memorizzare il pellet cellulare a -80 ° C o immediatamente purificare l&#39;AAV dal pellet, come descritto ai punti 3.4-3.15. </li><li> Preparare il tampone di lisi: 150 mm NaCl e 20 mM Tris-HCl, pH 8,0. Filtro sterilizzare (0,22 micron). Conservare il tampone a 4 ° C. </li><li> Risospendere il pellet con 10 ml di tampone di lisi. </li><li> Congelare il lisato a -80 ° C o in bagno di ghiaccio secco / etanolo, poi scongelare a 37 ° C. Vortex per 1 min. Congelare e scongelare il lisato 3 volte. </li><li> Aggiungere la soluzione MgCl 2 al lisato scongelato (rendere la concentrazione finale di MgCl 2 nel lisato essere 1 mM). Aggiungere la nucleasi ad una concentrazione finale di 250 U / ml. Incubare a 37 ° C per 15 minuti per sciogliere il / aggr proteine ​​DNAegation. NOTA: Se l&#39;aggregazione del DNA / proteine ​​non viene sciolta dopo nucleasi o endonucleasi trattamento, Dounce omogeneizzare il lisati 20 volte. </li><li> Centrifugare il campione a 4.800 xg per 20 min a 4 ° C. Raccogliere il surnatante. </li><li> Nel frattempo, preparare la soluzione gradiente Iodixanolo: <ol><li> Preparare il 17% della soluzione gradiente miscelando 5 ml di PBS 10x, 0,05 ml di 1 M MgCl 2, 0,125 ml di 1 M KCl, 10 ml di 5 M NaCl, e 12,5 ml ofdensity dislivello medio. Regolare il volume totale di 50 ml utilizzando H 2 O. </li><li> Preparare la soluzione al 25% miscelando 5 ml di PBS 10x, 0,05 ml di 1 M MgCl 2, 0,125 ml di 1 M KCl, 20 ml di media densità gradiente, e 0,2 ml di 0,5% (w / v) di rosso fenolo. Regolare il volume totale di 50 ml utilizzando H 2 O. </li><li> Preparare la soluzione al 40% mescolando 5 ml di 10x PBS, 0,05 ml di 1 M MgCl 2, 0,125 ml di 1 M KCl, e 33,3 ml di mezzo gradiente di densità. Regolare il volume totale di 50 ml utilizzandoH 2 O. </li><li> Preparare la soluzione al 60% miscelando 0,05 ml di 1 M MgCl 2, 0,125 ml di 1 M KCl, 50 ml di media densità gradiente, e 0,1 ml di 0,5% (w / v) rosso fenolo. </li></ol></li><li> Con un ago e la siringa, caricare la soluzione gradiente Iodixanolo nel tubo di polipropilene dell&#39;ordine di 5 ml di 17%, 5 ml di 25%, 5 ml di 40% e 5 ml di 60%, partendo dal basso. Caricare tutto il lisato ottenuto nella fase 3.8 (14-16 ml) sulla parte superiore del gradiente. Il gradiente, indicato dal basso verso l&#39;alto, è del 60%, 40%, 25%, 17%, e lo strato lisato. Riempire il tubo con tampone di lisi e coprire con il sughero. </li><li> Centrifugare a 185.000 xg per 90 min a 16 ° C. </li><li> Raccogliere la frazione virale (40% layer) con una siringa. Inserire l&#39;ago (21 gauge) nell&#39;intersezione tra le frazioni 40% e 60%, solo aspirando lo strato 40%. NOTA: Evitare di aspirazione QUALSIASI dello strato di 25%. </li><li> Mescolare la frazione virale con sterilizzato poliossietilene-polyoxyprosoluzione blocchi propilene copolimero PBS (10% poliossietilene-poliossipropilene copolimero a blocchi magazzino 1: 10.000 diluito in PBS) fino a un volume totale di 15 ml. Caricare il composto nella provetta filtro (cut-off MW = 100 kD). Centrifugare a 2.000 xg per 30 min a 4 ° C. </li><li> Scartare la soluzione in basso. Riempire il tubo filtro con blocchi poliossietilene-poliossipropilene copolimero soluzione PBS fino ad un volume totale di 15 ml. Centrifugare a 2.000 xg per 20 min a 4 ° C. Ripetere questa operazione altre due volte. Raccogliere il virus rAAV9 purificato (la frazione di sopra del filtro). </li><li> Trasferire il rAAV9 purificato nel tubo filtro per tubi 1.7 mL. Aliquotare il rAAV9 purificato (100 - 400 microlitri / tubo, a seconda del volume e titolo del AAV) e conservare il virus a -80 ° C. NOTA: Evitare ripetuti di congelamento-disgelo. </li></ol> 4. Misura della il titolo di rAAV9 <ol><li> Preparare campioni di DNA standard. <ol><li> Progettare PCR specifica ed efficienteprimer per vettori rAAV9 e ottimizzare la condizione di PCR. NOTA: I primer utilizzati in questo studio sono &quot;Forward: TCGGGATAAAAGCAGTCTGG; Reverse: TCGGACGGAGATACGTGAGT&quot;. La reazione PCR è stata eseguita con le seguenti condizioni: denaturazione iniziale a 95 ° C per 3 min; 35 cicli di 95 ° C per 20 sec, 60 ° C per 15 sec e 72 ° C per 10 sec; e l&#39;estensione finale a 72 ° C per 10 min. Tuttavia, i primer ottimizzati e condizioni di PCR sono specifici plasmide, come la sequenza inserto nel vettore rAAV9 può influenzare la specificità e l&#39;efficienza della PCR 31. </li><li> Eseguire la reazione di PCR con le condizioni indicate al punto 4.1.1. Purificare il prodotto di PCR con un kit di estrazione gel. </li><li> Misurare la concentrazione di DNA purificato utilizzando uno spettrofotometro. Calcolare la concentrazione in numero molecolari di DNA in base al peso molecolare / lunghezza del prodotto PCR. <ol><li> Calcolare la concentrazione molecolare utilizzando la seguente equazione: moconcentrazione lecular (molecole di DNA o di frammenti / ml) = 6,23 x 10 23 mol -1 x Con. x 10 -6 / MW. Nota: (6,23 x 10 23 mol -1 è il numero di Avagadro; concentrazione Con .: DNA in mg / ml; MW .: peso molecolare in g / mol). Per esempio, se la concentrazione ottenuta del prodotto della PCR è di 100 ug / ml e la sua lunghezza è di 200 bp, il peso molecolare del DNA a doppio filamento è 2 x 200 x 310 = 124.000 (il peso molecolare medio di ciascun nucleotide nel DNA a singolo filamento è di circa 310 g / mol). La concentrazione molecolare (molecole DNA / ml) = 6,23 X 10 23 mol -1 x 100 ug / ml x 10 -6 / 124.000 g / mol = 5,18 x 10 14 DNA molecole / ml. </li><li> Effettuare una serie di diluizioni del frammento di DNA e preparare i campioni standard, con concentrazioni di 10 13 molecole / ml, 10 12 molecole / ml, 10 11 molecole / ml, 10 10 molecole / ml, 10 9 molecole / ml, 10 <sup&gt; 8 molecole / ml, e 10 7 molecole / ml. Usare 1 ml di soluzione per ogni campione standard per la PCR quantitativa (qPCR, al punto 4.6). </li></ol></li></ol></li><li> Mescolare 5 ml di soluzione rAAV9 purificata con 5 ml di tampone 10x DNAsi, 1 ml di DNAsi (10.000 U / ml), e 39 ml di DDH 2 O. Il volume totale dovrebbe essere 50 microlitri. </li><li> Incubare il flacone a 37 ° C per 30 minuti per rimuovere residui di DNA plasmide imballati. </li><li> Inattivare i DNAsi a 95 ° C per 10 min. Raffreddare la soluzione, aggiungere 44 ml di H 2 O, 5 ml di 10x tampone DNAsi, e 1 ml di proteinasi K magazzino (10 mg / ml). </li><li> Incubare la soluzione a 50 ° C per 2 ore. Arrestare la reazione e inattivare il Proteinasi K a 95 ° C per 10 min. </li><li> Usare 1 ml di campione per il saggio PCR quantitativa (qPCR). Calcolare il titolo. <ol><li> Eseguire la PCR quantitativa (qPCR) con i primer disegnati nella fase 4.1.1 utilizzando i campioni frpasso om 4.1.4 (campioni standard) e dal punto 4.5 (campioni da misurare). <ol><li> Per ogni reazione, mescolare 10 ml di 2x master mix verde (che contengono Taq polimerasi, mix di dNTP, tampone, MgCl 2, e colorante verde), 0,5 ml di primer forward (5 micron), 0,5 ml di primer reverse (5 micron), 8 ml di H 2 O, e 1 ml di campione da misurare. Eseguire qPCR con le seguenti condizioni: tenere i campioni a 50 ° C per 2 minuti e 95 ° C per 10 min; eseguire 40 cicli a 95 ° C per 15 sec ea 60 ° C per 1 min; per la fase di fusione, incubare i campioni a 95 ° C per 30 sec e 60 ° C per 15 sec. Generare la curva standard basato sul numero C T dei campioni di riferimento (figura 3). </li></ol></li><li> Calcolare la concentrazione molecolare / titolo del campione AAV contro la curva standard. Il rAAV9 ha un genoma a singolo filamento di DNA, quindi la concentrazione molecolare sarà di 2 volte superiore rispetto alvalore calcolato (potenza 2x (10, y), Figura 3B). Inoltre, il titolo del rAAV9 purificato sarà 20 volte superiore rispetto a quanto ottenuto dal calcolo a causa della diluizione 1:20 del virus nelle reazioni DNAsi e proteinasi K (5 ml in 100 l totale). </li></ol></li></ol> 5. rAAV9 iniezione in topi neonati e saggi di espressione genica nel Cuore <ol><li> Preparare le soluzioni di lavoro rAAV9 in poliossietilene-poliossipropilene copolimero a blocchi soluzione PBS. Rendere lo stock di virus con i titoli di 1-7 x 10 12 particelle / ml. NOTA: Deliver 50-70 ml di soluzione di rAAV9 in ogni postnatale giorno 0,5-1,5 topo mediante iniezione sottocutanea. Per raggiungere efficiente sovraespressione del gene o atterramento, si raccomanda di eseguire un test pilota per ogni studio per ottimizzare la quantità di AAV iniettato. Utilizzare la stessa quantità di rAAV9.cTNT :: Luc o controlli rAAV9.U6 :: scramble per ogni studio per ridurre al minimo la distorsione. NOTA: Abbiamo usato 1-1,5x 10 11 particelle / cucciolo per la sovraespressione e 2,5-5 x 10 11 particelle / cucciolo per atterramento in giorno postnatale 0,5-1,5 mi ce). </li><li> Trattare topi neonati con rAAV9 a P0.5-P2.5 per iniezione sottocutanea. <ol><li> Pre-riempire un 29G1 / 2, 0,33 x 12,7 mm siringa da insulina con la soluzione rAAV9. Fate attenzione a rimuovere le bolle d&#39;aria. </li><li> Tenere il cucciolo crio-anestetizzati in una mano con il pollice e l&#39;indice. Prima dell&#39;iniezione, strisciare la pelle posteriore del cucciolo con un bastone tampone saturato con il 70% di alcool isopropilico per mantenere la condizione sterile. Inserire l&#39;ago della siringa nel sottocute antero-dorsale dell&#39;animale con un angolo di 5 a 10 °. Iniettare 50-70 microlitri della soluzione rAAV9 utilizzando la siringa da insulina. NOTA: rAAV9 può anche essere consegnata al mouse tramite iniezione intraperitoneale o endovenosa 26,27. espressione efficace dei geni consegnati nel cuore può essere ottenuto. Tuttavia, iniettare intraperitonealeion volte può causare espressione perde nel fegato. Dopo l&#39;iniezione, la condizione dei cuccioli è stata monitorata ogni giorno. </li></ol></li><li> Il livello di espressione genica nel cuore può essere controllata mediante qPCR, immunofluorescenza, o western blot (risultati rappresentativi sono mostrati nelle figure 4 e 5) 25,26. NOTA: I topi sono stati sacrificati da CO 2 erogata da una sorgente di gas compresso. I campioni di tessuto sono stati raccolti dopo aver verificato che la frequenza cardiaca, il movimento, e la respirazione degli animali erano cessate. Roditori neonatali sono resistenti a CO 2 l&#39;eutanasia e sono stati sacrificati per decapitazione usando forbici affilate. Il metodo è coerente con le raccomandazioni del gruppo sull&#39;eutanasia della American Veterinary Medical Association. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

È importante minimizzare indesiderato ricombinazione ITR durante la costruzione del plasmide. Prima di generare il virus, si deve sempre monitorare l&#39;integrità ITR dei plasmidi AAV utilizzando restrizione digestione e elettroforesi su gel di agarosio. È impossibile ottenere 100% plasmidi intatte, ma il rapporto ricombinazione dovrebbe essere minimizzata il più possibile. Meno del 20% è accettabile per l&#39;imballaggio rAAV9 successo. Da segnalare, la coltura dei batteri, a temperatura più bassa (30 ° C), con una velocità inferiore agitazione (180-200 giri al minuto) può ridurre la possibilità di ITR ricombinazione. È essenziale garantire che le cellule HEK293 sono sani per la trasfezione di successo e confezionamento rAAV9. cellule &quot;sane&quot; di solito sono altamente proliferative e crescono rapidamente. Tuttavia, rapida proliferazione e la crescita delle cellule HEK293 non garantisce necessariamente l&#39;alta efficienza di confezionamento rAAV9. Pertanto, è importante iniziare gli esperimenti con cellule fresche. essosi consiglia di utilizzare a basso passaggio HEK293 cellule (&lt;10 passaggi, le cellule sono diversi passaggi ogni 2-3 giorni) per l&#39;imballaggio rAAV9. Di nota, possono avere bisogno di essere purificati mediante procedure diverse altre 32 sierotipi di rAAV. L&#39;investigatore è concessa flessibilità nella generazione di plasmidi rAAV9. In entrambi i casi la legatura di restrizione sito-mediata o montaggio Gibson può essere utilizzato 30. Per la costruzione rAAV9.U6 :: shRNA, la strategia di assemblaggio basato intra-molecolare Gibson è un metodo efficace (figure 1 e 2). Più plasmidi AAV-shRNA o pool AAV-shRNAs possono essere rapidamente costruiti. Per iperespressione di geni utilizzando rAAV9, esiste un limite di dimensione per le sequenze di cDNA inseriti. Generalmente, il frammento dimensioni tra ITR deve essere inferiore a 5 kb 33. Splicing proteina inteina-catalizzata può essere usato per aggirare il limite di dimensione confezionamento di rAAV9 vettori 34. Altro sistema virales, tra cui retrovirus, lentivirus e adenovirus, sono stati sviluppati e consentire la manipolazione genetica flessibile. Rispetto a questi diversi tipi di vettori virali, rAAV ha vantaggi specifici: ad alta efficienza, alta specificità, basso tasso di integrazione genomica, minimali immunogenicità e patogenicità minima. Così, l&#39;ingegneria del genoma rAAV-based sta emergendo come uno strumento ideale per in vivo manipolazione genetica. Studi precedenti hanno dimostrato che il sistema rAAV9 consente l&#39;efficiente espressione di geni consegnati in vivo. Con il promotore cTnT (pollo TnnT2), genica specifica del cuore è stato ottenuto (Figura 4) 25,26. Sebbene il promotore U6 è ubiquitariamente attivo nei tessuti di topo, un&#39;inibizione più evidente di mRNA (Trbp) da rAAV9.U6 :: shRNA stata osservata nel cuore, ma non in altri organi (Figura 5). Il fegato è l&#39;organo più comune trasdotto da diversi sierotipi dirAAV 35,36. Tuttavia, l&#39;efficienza knockdown (riduzione del 36% del livello di mRNA) nel fegato è molto inferiore a quella nel cuore (riduzione del 68% del livello di mRNA). Questo è coerente con il precedente studio dimostra che, nonostante la crescita presenza genoma virale nel fegato, consegna sistemica di shRNA da rAAV9 fornisce gene più efficiente atterramento nel cuore 35. È possibile che gli epatociti sono più proliferative di cardiomiociti e sono più attivamente in fase di divisione cellulare dopo somministrazione rAAV9 all&#39;età neonatale, che si traduce in una sostanziale diluizione delle genoma vettoriale nel tessuto epatico. Tuttavia, questo suggerisce anche che il sierotipo di rAAV9 può più efficiente trasdurre cardiomiociti in confronto ad altri tipi di cellule. Come dimostrato da Lovric et al., Nei miociti differenziati, la risposta danni al DNA MRN proteine complesse sono repressi. MRN proteine ​​complesse legano genomi AAV e inibiscono AAV trasduzione attraverso silenziamento trascrizionale. Così, permissivity di AAV trasduzione può essere indotta dalla differenziazione terminale dei cardiomiociti 36, rendendo il sistema rAAV9, rispetto ad altri vettori virali, molto adatti per la manipolazione genica nel cuore. Per ridurre ulteriormente gli effetti indesiderati atterramento in altri organi (ad esempio, il fegato), si può anche usare cardio-specifica shmiR a base di miR-30a cTnT promotore-driven per reprimere i geni di interesse nel cuore 29. Questo manoscritto fornisce al lettore le tecniche specifiche per capitalizzare sulla tecnologia rAAV9 nelle indagini cardiovascolari.

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One of the authors names and affiliation was corrected from:
Jian-Ming Jiang3,4 
3 Department of Genetics, Harvard Medical School 
4 Howard Hughes Medical Institute
to:
Jianming Jiang5 
5 Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

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Erratum: Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts

Controllo dell&#39;espressione o dell&#39;attività di geni specifici in vari sistemi biologici è diventato una strategia valida nello studio della funzione genica 1. Un mezzo diretto di realizzazione di questo obiettivo è quello di manipolare sequenze nucleotidiche e generare alleli mutanti. Anche se fare precise, modifiche mirate al genoma delle cellule viventi è ancora un tempo e la pratica alta intensità di lavoro, lo sviluppo di potenti strumenti Talen e CRISPR / Cas9 ha aperto una nuova era di editing genoma 2-5. Un metodo di laboratorio di routine di più per la manipolazione genetica si è concentrata sull&#39;introduzione di materiale genetico (DNA e RNA che contengono sequenze codificanti o siRNA / shRNAs) nelle cellule per esprimere o caduta del gene (s) di interesse 1,6. In molti casi, il principale ostacolo manipolazione genetica è la consegna di DNA, RNA, o proteine ​​nelle cellule. Per quanto riguarda gli studi in vitro, transfecti efficienteNei sistemi sono stati istituiti in molte linee di cellule in coltura. Tuttavia, nel modello murino in particolare, in vivo consegna del gene è più impegnativo. Ci sono una serie di barriere extra-intracellulari e che devono essere bypassato per conseguire efficace assorbimento cellulare dei reagenti esogeni. Ostacoli aggiuntivi includono la rapida clearance e la breve durata dei materiali 7,8 consegnato. Una strategia per aggirare questi problemi è quello di utilizzare vettori virali come &quot;portatori&quot; o &quot;veicoli&quot; per in vivo consegna del gene. Le proprietà di trasduzione naturalmente evoluti di virus consentono la fornitura efficiente di un gene di interesse in cellule 7,9,10. Numerosi tipi di vettori virali sono stati sviluppati e consentire flessibilità nella manipolazione genica in vivo in diversi tipi di cellule e organi topi. I sistemi virali più comunemente utilizzati includono Retrovirus, Lentivirus, Adenovirus, e adeno-associato virus (AAV) <sup&gt; 11. I retrovirus sono virus a singolo filamento di RNA e possono presentare il loro materiale genetico genoma della cellula ospite in modo stabile durante la divisione mitotica, fornendo la possibilità di espressione permanente dei geni trasdotte nelle cellule bersaglio e organi 12-14. Tuttavia, molti tipi di retrovirus infettano solo le cellule in divisione, e la loro efficacia in cellule non-divisione è molto bassa 15. Questo limita la loro utilità per la consegna del gene. Lentivirus è un genere della famiglia Retroviridae. Diverso da altri retrovirus, Lentivirus può infettare sia cellule in divisione e non di divisione ed è stato ampiamente utilizzato per il trasferimento genico in post-mitotico e cellule altamente differenziate-16. Il ciclo di vita di Lentivirus coinvolge anche l&#39;integrazione del DNA vettore nel genoma dell&#39;ospite. Gene delivery Così, Lentivirus-mediata consente espressione stabile e di lunga durata degli elementi genetici trasdotte 16-18. Tuttavia, questa caratteristica può rappresentare un doppio-espada dged nell&#39;uso di questi virus per manipolare l&#39;espressione genica, come integrazione di DNA vettoriale può portare a mutagenesi inserzionale nelle cellule ospiti e può causare effetti artefattuali. Adenovirus è un altro sistema di consegna del gene ampiamente utilizzato. A differenza dei retrovirus e lentivirus, Adenovirus sono non integrati e non interferiscono con l&#39;integrità genomica delle cellule ospiti 8,10,11,19. Inoltre, adenovirus può trasfezione di DNA in molti tipi di cellule, e l&#39;infezione non dipende divisione cellulare attiva 19. Un&#39;altra caratteristica importante di adenovirus è la facilità di purificazione vettoriale, come i vettori virali hanno la capacità di essere replicato 19,20. Tuttavia, l&#39;avvertimento importante di questo sistema è che l&#39;infezione da adenovirus può innescare forti risposte immunitarie cellule bersaglio e organi 19, limitando il suo utilizzo in molte indagini, in particolare studi di terapia genica. Rispetto a queste tipo diversos di vettori virali, virus ricombinante adeno-associato (rAAV) sembra essere il sistema di erogazione del gene ideale 21,22. Esibisce immunogenicità minimale e patogenicità 23,24. Inoltre, rAAV infetta una vasta gamma di tipi di cellule, inclusi sia demarcazione e cellule non-dividendo. Nella maggior parte dei casi, rAAV non si integra nel genoma di accoglienza; in tal modo, il rischio di cambiamenti genetici o genomiche indesiderate nelle cellule bersaglio è bassa 22. Recentemente, i sistemi rAAV sono stati utilizzati con successo per la consegna in vivo di proteine di codifica del DNA, miRNA, shRNAs, e CRISPR-gRNAs in un mouse muscolo cardiaco 23,25-29. Questa metodologia è facilitato ricerche fondamentali e studi di terapia genica nel campo della ricerca cardiovascolare. Qui, la procedura dettagliata per generare vettori rAAV9 che iperesprimono efficiente o Knockdown i geni di interesse nei cuori del mouse è stato descritto. Il protocollo fornisce un metodo semplice ed efficacemanipolazione genica cardiaca in modelli sperimentali murini.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1175">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:575px;">Polyethylenimine, Linear (MW 25,000)</td>
			<td style="width:241px;">Polysciences, Inc.&#160;</td>
			<td style="width:192px;">#23966-2</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:575px;">Tube, Polypropylene, 36.2 mL, 25 x 87 mm, (qty. 56)</td>
			<td style="width:241px;">Beckman Coulter, Inc</td>
			<td style="width:192px;"># 362183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:575px;">Nuclease, ultrapure</td>
			<td style="width:241px;">SIGMA</td>
			<td style="width:192px;">#E8263-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:575px;">Density Gradient Medium(Iodixanol)</td>
			<td style="width:241px;">SIGMA</td>
			<td style="width:192px;">#D1556-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:575px;">Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane</td>
			<td style="width:241px;">EMD Millipore Corporation</td>
			<td style="width:192px;">#UFC910008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:575px;">Laboratory pipetting needle with 90&#176; blunt ends,gauge 14, L 6 in., nickel plated hub</td>
			<td style="width:241px;">SIGMA</td>
			<td style="width:192px;">#CAD7942-12EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:575px;">Poloxamer 188 solution (Pluronic&#174; F-68 solution)</td>
			<td style="width:241px;">SIGMA</td>
			<td style="width:192px;">P5556-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:575px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:241px;">SIGMA</td>
			<td style="width:192px;">3115828001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:575px;">DNase I</td>
			<td style="width:241px;">Roche</td>
			<td style="width:192px;">10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:575px;">Centrifuge machine</td>
			<td style="width:241px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:192px;">75004260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:575px;">Centrifuge System</td>
			<td style="width:241px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:192px;">363118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:575px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:241px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:192px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:575px;">DMEM medium</td>
			<td style="width:241px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:192px;">SH30243FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:575px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:241px;">Atlanta Biologicals&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:192px;">S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:575px;">rAAV9 vector</td>
			<td style="width:241px;">Penn Vector Core</td>
			<td style="width:192px;">P1967</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of raav9 to overexpress or knockdown genes in mouse hearts

Controllare l&#39;espressione o l&#39;attività di specifici geni attraverso la consegna del miocardio del materiale genetico in modelli murini permette l&#39;indagine delle funzioni dei geni. Il loro potenziale terapeutico nel cuore può anche essere determinato. Ci sono approcci limitati di intervento molecolare in vivo nel cuore del mouse. Ricombinante virus adeno-associato (rAAV) ingegneria del genoma basata su è stata utilizzata come uno strumento essenziale per in vivo manipolazione genetica cardiaco. I vantaggi specifici di questa tecnologia sono ad alta efficienza, alta specificità, basso tasso di integrazione genomica, minimal immunogenicità e patogenicità minima. Qui, una procedura dettagliata per la costruzione, il pacchetto, e purificare i vettori rAAV9 è descritto. L&#39;iniezione sottocutanea di rAAV9 in cuccioli neonatali traduce in espressione robusta o efficiente knockdown del gene (s) di interesse nel cuore del mouse, ma non nel fegato e in altri tessuti. Utilizzando la cardiaco-specific TnnT2 promotore, alta espressione del gene GFP nel cuore è stato ottenuto. Inoltre, mRNA è stato inibito nel cuore, quando un rAAV9-U6-shRNA è stato utilizzato. Lavorando conoscenza della tecnologia rAAV9 può essere utile per le indagini cardiovascolari.

Le strategie per la costruzione di rAAV9 rAAV9.cTNT :: plasmidi rAAV9.U6 :: shRNA GFP o sono riportati nelle figure rispettivamente 1 e 2,. Come dimostrano gli esempi, il vettore rAAV9 è stato generato per iperespressione del gene GFP nei cuori del mouse. Il plasmide risultante contiene la cTnT :: cassetta GFP affiancato da due ITR siti (Figura 1). Il vettore rAAV9.U6 :: shRNA è stato costruito per atterramento Trbp mRNA (Figura 2) La curva standard per rAAV9 titolazione è stata generato con i dati qPCR dalla regressione lineare. Il y variabile manipolata rappresenta il valore log 10 del DNA concentrazione molecolare di ogni campione standard, e la corrispondente variabile x rappresenta il valore C T. I 10 valori di registro (concentrazione) (Y) e numeri C T (X) mostrano una bella correlazione lineare (R 2 = 0,9971) e<html> in forma con l&#39;equazione y = -0.2832x + 14,616 (Figura 3A). I titoli di campioni rAAV9 sono stati calcolati sulla base della equazione lineare (Figura 3B). Con il metodo descritto nel protocollo (passo 4.6.2 e Figura 3B), un alto titolo di vettori rAAV9 (50-200 microlitri,&gt; 6 x 10 13 particelle / ml) è stato ottenuto nello studio rappresentativo. Per monitorare l&#39;efficienza e il tessuto specificità dei vettori rAAV9.cTNT, cuccioli P0.5 sono stati trattati con lo stesso importo (1 x 10 11 particelle / pup) di rAAV9.cTNT :: luciferasi (AAV-Luc) o rAAV9.cTNT :: GFP (AAV-GFP) mediante iniezione sottocutanea. Due settimane dopo l&#39;iniezione, il segnale GFP è stata monitorata in vari tessuti di topi. Espressione robusta di GFP è stata rilevata nel cuore, ma non in altri organi (Figura 4, n&gt; 3). Così, l&#39;espressione genica efficace e specifica per il cuore è stato raggiunto con il vettore rAAV9.cTNT. jove_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; Per monitorare l&#39;efficienza atterramento e la specificità del tessuto di vettori rAAV9.U6, topi P0.5 sono stati trattati con lo stesso importo (3 x 10 11 particelle / pup) di rAAV9 .U6 :: Scramble (AAV-Scramble) o rAAV9.U6 :: Trbp shRNA (AAV-shTrbp) mediante iniezione sottocutanea. Due settimane dopo l&#39;iniezione, espressione di Trbp in vari tessuti di stato monitorato da qPCR (Figura 5, n = 3 ). il livello di mRNA del Trbp nel cuore è stato notevolmente ridotto di rAAV9.U6 :: shTrbp (68% down-regulation, P = 0,0004,452 mila). Giù regolazione di Trbp è stato rilevato anche nel tessuto epatico da rAAV9.U6 :: shTrbp trattati topi. Tuttavia, il cambiamento è molto più basso. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54787/54787fig1.jpg" /> Figura 1: Le strategie per costruire il rAAV9.cTNT :: GFP plasmide. (A) il regime della cTnT :: cassetto GFP. (B </strong&gt;) Il plasmide rAAV9 è stato modificato per ospitare il promotore di pollo TNNT2 (rAAV9.cTNT) seguito dai due siti di restrizione unici (NheI e KpnI). La GFP open reading frame è stato clonato nel vettore rAAV9.cTNT per restrizione legatura sito-mediata per generare il plasmide rAAV9.cTNT :: GFP. (B) Il plasmide rAAV9.cTNT :: GFP può essere costruito da Gibson assemblaggio. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54787/54787fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54787/54787fig2.jpg" /> Figura 2: Le strategie per costruire il rAAV9.U6 :: sHRNA plasmidi. (A) il regime del U6 :: è mostrato shRNA cassetta. L&#39;espressione di shRNA è guidata dal promotore U6 (blu). (B) cassette rAAV9-U6-shRNA possono essere generati da ricottura e legando oligonucleotidi DNA contengonosequenze ING shRNA nelle enzima di restrizione-digerito vettori rAAV9 ospitano il promotore U6. (C) rAAV9.U6 :: cassette shRNA possono essere generati da lungo raggio PCR e intra-molecolare Gibson costruzione &quot;senza soluzione di continuità&quot; assemblea-based. Il 5 &#39;del braccio, loop, e 3&#39; braccio di shRNA sono mostrati in verde, arancione e rosso, rispettivamente. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54787/54787fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54787/54787fig3.jpg" /> Figura 3: Calcolo del rAAV9 del titolo. (A) La curva standard per rAAV9 la titolazione è stato generato da un&#39;aggressione lineare utilizzando i dati qPCR. La variabile y manipolata rappresenta il valore log 10 del DNA concentrazione molecolare di ogni campione standard, e la corrispondente variabile xrappresenta il valore C T. (B) I titoli di campioni rAAV9 sono calcolati in base alla equazione lineare della curva standard. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54787/54787fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54787/54787fig4.jpg" /> Figura 4: Espressione del modello di rAAV9.cTNT :: GFP nei tessuti topi. Cuccioli P0.5 sono stati trattati con lo stesso importo (1 x 10 11 particelle / pup) di rAAV9.cTNT :: luciferasi (AAV-Luc, controllo negativo) o rAAV9.cTNT :: GFP (AAV-GFP) mediante iniezione sottocutanea. Due settimane dopo l&#39;iniezione, i campioni di tessuto sono stati raccolti. L&#39;espressione di GFP è stato monitorato in un ambito dissezione fluorescente. Sia sul campo e di fluorescenza immagini luminose sono presentati. Gli esperimenti sono stati ripetuti più di 3 volte (n&gt; 3).Barra di scala = 2,0 mm. SKM, muscolo scheletrico. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54787/54787fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54787/54787fig5.jpg" /> Figura 5: Espressione silenziamento genico con AAV-shRNA. Topi P0.5 sono stati trattati con la stessa quantità (3 x 10 11 particelle / pup) di rAAV9.U6 :: Scramble (AAV-Scramble) o rAAV9.U6 :: Trbp shRNA (AAV-shTrbp) mediante iniezione sottocutanea. Due settimane dopo l&#39;iniezione, i livelli di mRNA di Trbp in vari tessuti sono stati monitorati qPCR (n = 3). I dati sono presentati come media ± SEM. Il valore di cut-off P è 0.05. NS, P&gt; 0,05, non significativo. ** P &lt;0,01. SKM, muscolo scheletrico. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54787/54787fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts

In this manuscript, a method to prepare recombinant adeno-associated virus 9 (rAAV9) vectors to manipulate gene expression in the mouse heart is described.

Preparazione di rAAV9 per iperespressione o Knockdown geni in Cuori mouse

Controlling the expression or activity of specific genes through the myocardial delivery of genetic materials in murine models permits the investigation ...

preparation-of-raav9-to-overexpress-or-knockdown-genes-in-mouse-hearts

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

12.7K Views.  Boston Children's Hospital. In this manuscript, a method to prepare recombinant adeno-associated virus 9 (rAAV9) vectors to manipulate gene expression in the mouse heart is described. 

Video: Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts

The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little is known about the molecular control that governs their development. This is in part due to physical, resource and time limitations often associated with the study of secondary growth processes. A number of in vitro techniques have been used involving either plant part or whole plant system in both woody and non-woody plant species. However, questions about their applicability for the study of secondary stem growth processes, the recalcitrance of certain species and labor intensity are often prohibitive for medium to high throughput applications. Also, when looking at secondary stem development and wood formation the specific traits under investigation might only become measurable late in a tree&#39;s lifecycle after several years of growth. In addressing these challenges alternative in vivo protocols have been developed, named Induced Somatic Sector Analysis, which involve the creation of transgenic somatic tissue sectors directly in the plant&#39;s secondary stem. The aim of this protocol is to provide an efficient, easy and relatively fast means to create transgenic secondary plant tissue for gene and promoter functional characterization that can be utilized in a range of tree species. Results presented here show that transgenic secondary stem sectors can be created in all live tissues and cell types in secondary stems of a variety of tree species and that wood morphological traits as well as promoter expression patterns in secondary stems can be readily assessed facilitating medium to high throughput functional characterization.

The Use of Induced Somatic Sector Analysis ISSA for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

Here we present a protocol that facilitates the medium to high throughput functional characterization of gene and promoter constructs in tree secondary stem tissue within comparatively short time frames. It is efficient, easy to use and widely applicable to a range of tree species.

L&#39;uso di Induced somatica Settore Analisi (ISSA) per studio dei geni e promotori coinvolti nella formazione del legno e Sviluppo secondaria dello stelo

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little ...

Ricerca

Genetica

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as well as new applications in the field of plant biotechnology. Viable methods that currently exist for protein or gene transfer into plant cells, namely Agrobacterium and microprojectile bombardment, have disadvantages of low transformation frequency, limited host range, or a high cost of equipment and microcarriers. The following protocol outlines a simple and versatile method, which employs rationally-designed peptides as delivery agents for a variety of nucleic acid- and protein-based cargoes into plants. Peptides are selected as tools for development of the system due to their biodegradability, reduced size, diverse and tunable properties as well as the ability to gain intracellular/organellar access. The preparation, characterization and application of optimized formulations for each type of the wide range of delivered cargoes (plasmid DNA, double-stranded DNA or RNA, and protein) are described. Critical steps within the protocol, possible modifications and existing limitations of the method are also discussed.

Existing methods for the modification of plants have limited applicability. The novel peptide-derived technology proposed here promises both simplicity and efficiency in the introduction of exogenous protein or genes into the desired intracellular compartments of intact plants.

Peptide di derivazione Metodo di Trasporto geni e proteine ​​Attraverso cellulari e barriere organelli in Piante

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Here, we present protocols for rearing an intermediate-germ beetle, Dermestes maculatus (D. maculatus) in the lab. We also share protocols for embryonic and parental RNAi and methods for analyzing embryonic phenotypes to study gene function in this species.

Allevamento e RNA a doppio filamento mediata silenziamento genico nel Hide Beetle,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.

Mirata<em&gt; In Situ</em&gt; mutagenesi dell&#39;istone geni in germogliamento lievito

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell culture system. This system was developed to express foreign genes under the control of the baculoviral promoter in transient expression plasmids. Furthermore, this system can be applied to a functional assay of either the baculovirus itself or foreign proteins. The most widely and commercially available transient gene expression system is developed based on the immediate-early gene (IE) promoter of Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV). However, a low expression level of foreign genes in insect cells was observed. Therefore, a transient gene expression system was constructed for improving protein expression. In this system, recombinant plasmids were constructed to contain the target sequence under the control of the Drosophila heat shock 70 (Dhsp70) promoter. This protocol presents the application of this heat shock-based pDHsp/V5-His (V5 epitope with 6 histidine)/Spodoptera frugiperda cell (sf9 cell) system; this system is available not only for gene expression but also for evaluating the anti-apoptotic activity of candidate proteins in insect cells. Furthermore, this system can be either transfected with one recombinant plasmid or co-transfected two potentially functionally antagonistic recombinant plasmids in insect cells. The protocol demonstrates the efficiency of this system and provides a practical case of this technique.

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

This protocol describes a heat shock-induced protein expression system (pDHsp/V5-His/sf9 cell system), which can be used for either expressing foreign proteins or evaluating the anti-apoptotic activity of potential foreign proteins and their truncated amino acids in insect cells.

Espressione transiente di geni estranei in cellule di insetto (sf9) per analisi funzionale della proteina

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

Simultaneous Video-EEG-ECG Monitoring to Identify Neurocardiac Dysfunction in Mouse Models of Epilepsy

In epilepsy, seizures can evoke cardiac rhythm disturbances such as heart rate changes, conduction blocks, asystoles, and arrhythmias, which can potentially increase risk of sudden unexpected death in epilepsy (SUDEP). Electroencephalography (EEG) and electrocardiography (ECG) are widely used clinical diagnostic tools to monitor for abnormal brain and cardiac rhythms in patients. Here, a technique to simultaneously record video, EEG, and ECG in mice to measure behavior, brain, and cardiac activities, respectively, is described. The technique described herein utilizes a tethered (i.e., wired) recording configuration in which the implanted electrode on the head of the mouse is hard-wired to the recording equipment. Compared to wireless telemetry recording systems, the tethered arrangement possesses several technical advantages such as a greater possible number of channels for recording EEG or other biopotentials; lower electrode costs; and greater frequency bandwidth (i.e., sampling rate) of recordings. The basics of this technique can also be easily modified to accommodate recording other biosignals, such as electromyography (EMG) or plethysmography for assessment of muscle and respiratory activity, respectively. In addition to describing how to perform the EEG-ECG recordings, we also detail methods to quantify the resulting data for seizures, EEG spectral power, cardiac function, and heart rate variability, which we demonstrate in an example experiment using a mouse with epilepsy due to Kcna1 gene deletion. Video-EEG-ECG monitoring in mouse models of epilepsy or other neurological disease provides a powerful tool to identify dysfunction at the level of the brain, heart, or brain-heart interactions.

Here, we present a protocol to record brain and heart bio signals in mice using simultaneous video, electroencephalography (EEG), and electrocardiography (ECG). We also describe methods to analyze the resulting EEG-ECG recordings for seizures, EEG spectral power, cardiac function, and heart rate variability.

Video-EEG-ECG simultaneo monitoraggio per identificare la disfunzione Neurocardiac in modelli murini di epilessia

In epilepsy, seizures can evoke cardiac rhythm disturbances such as heart rate changes, conduction blocks, asystoles, and arrhythmias, which can ...

qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes

Killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) are a set of inhibitory and activating immune receptors, on natural killer (NK) and T cells, encoded by a polymorphic cluster of genes on chromosome 19. Their best-characterized ligands are the human leukocyte antigen (HLA) molecules that are encoded within the major histocompatibility complex (MHC) locus on chromosome 6. There is substantial evidence that they play a significant role in immunity, reproduction, and transplantation, making it crucial to have techniques that can accurately genotype them. However, high-sequence homology, as well as allelic and copy number variation, make it difficult to design methods that can accurately and efficiently genotype all KIR genes. Traditional methods are usually limited in the resolution of data obtained, throughput, cost-effectiveness, and the time taken for setting up and running the experiments. We describe a method called quantitative KIR semi-automated typing (qKAT), which is a high-throughput multiplex real-time polymerase chain reaction method that can determine the gene copy numbers for all genes in the KIR locus. qKAT is a simple high-throughput method that can provide high-resolution KIR copy number data, which can be further used to infer the variations in the structurally polymorphic haplotypes that encompass them. This copy number and haplotype data can be beneficial for studies on large-scale disease associations, population genetics, as well as investigations on expression and functional interactions between KIR and HLA.

Quantitative killer cell immunoglobulin-like receptor (KIR) semi-automated typing (qKAT) is a simple, high-throughput, and cost-effective method to copy number type KIR genes for their application in population and disease association studies.

qKAT: Quantitative sulla tipizzazione di assassino-cellula immunoglobulina-come geni del ricevitore

Killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) are a set of inhibitory and activating immune receptors, on natural killer (NK) and T cells, encoded by a ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including cancers. These small regulatory RNAs mainly interact with the 3&#8217; untranslated regions (3&#8217; UTR) of their target messenger RNAs (mRNAs) ultimately resulting in the inhibition of decoding processes of mRNAs and the augmentation of target mRNA degradations. Based on the expression levels and intracellular functions, miRNAs are able to serve as regulatory factors of oncogenic and tumor-suppressive mRNAs. Identification of bona fide target genes of a miRNA among hundreds or even thousands of computationally predicted targets is a crucial step to discern the roles and basic molecular mechanisms of a miRNA of interest. Various miRNA target prediction programs are available to search possible miRNA-mRNA interactions. However, the most challenging question is how to validate direct target genes of a miRNA of interest. This protocol describes a reproducible strategy of key methods on how to identify miRNA targets related to the function of a miRNA. This protocol presents a practical guide on step-by-step procedures to uncover miRNA levels, functions, and related target mRNAs using the probe-based real-time polymerase chain reaction (PCR), sulforhodamine B (SRB) assay following a miRNA mimic transfection, dose-response curve generation, and luciferase assay along with the cloning of 3&#8217; UTR of a gene, which is necessary for proper understanding of the roles of individual miRNAs.

This protocol uses a probe-based real-time polymerase chain reaction (PCR), a sulforhodamine B (SRB) assay, 3&#8217; untranslated regions (3&#8217; UTR) cloning, and a luciferase assay to verify the target genes of a miRNA of interest and to understand the functions of miRNAs.

Un protocollo in vitro per la valutazione dei livelli, delle funzioni e dei geni target associati nelle cellule tumorali

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic screening using chemical mutagens is a useful strategy for mapping mutant phenotypes to genes among Drosophila and other model organisms that share conserved cellular pathways with humans. If the mutated gene of interest is not lethal in early developmental stages of flies, a climbing assay can be conducted to screen for phenotypic indicators of decreased brain functioning, such as low climbing rates. Subsequently, secondary histological analysis of brain tissue can be performed in order to verify the neuroprotective function of the gene by scoring neurodegeneration phenotypes. Gene mapping strategies include meiotic and deficiency mapping that rely on these same assays can be followed by DNA sequencing to identify possible nucleotide changes in the gene of interest.

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

We present a protocol using a forward genetic approach to screen for mutants exhibiting neurodegeneration in Drosophila melanogaster. It incorporates a climbing assay, histology analysis, gene mapping and DNA sequencing to ultimately identify novel genes related to the process of neuroprotection.

In Vivo Avanti Schermo Genetico per Identificare Nuovi Geni Neuroprotettivi in Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Modulation of Tau Subcellular Localization as a Tool to Investigate the Expression of Disease-related Genes

Tau is a microtubule binding protein expressed in neurons and its main known function is related to the maintenance of cytoskeletal stability. However, recent evidence indicated that Tau is present also in other subcellular compartments including the nucleus where it is implicated in DNA protection, in rRNA transcription, in the mobility of retrotransposons and in the structural organization of the nucleolus. We have recently demonstrated that nuclear Tau is involved in the expression of the VGluT1 gene, suggesting a molecular mechanism that could explain the pathological increase of glutamate release in the early stages of Alzheimer&#39;s disease. Until recently, the involvement of nuclear Tau in modulating the expression of target genes has been relatively uncertain and ambiguous due to technical limitations that prevented the exclusion of the contribution of cytoplasmic Tau or the effect of other downstream factors not related to nuclear Tau. To overcome this uncertainty, we developed a method to study the expression of target genes specifically modulated by the nuclear Tau protein. We employed a protocol that couples the use of localization signals and the subcellular fractionation, allowing the exclusion of the interference from the cytoplasmic Tau molecules. Most notably, the protocol is easy and is composed of classic and reliable methods that are broadly applicable to study the nuclear function of Tau in other cell types and cellular conditions.

Tau is a neuronal protein present both in the cytoplasm, where it binds microtubules, and in the nucleus, where it exerts unconventional functions including the modulation of Alzheimer&#39;s disease-related genes. Here, we describe a method to investigate the function of nuclear Tau while excluding any interferences coming from cytoplasmic Tau.

Modulazione della localizzazione subcellulare Tau come strumento per studiare l'espressione dei geni correlati alla malattia

Tau is a microtubule binding protein expressed in neurons and its main known function is related to the maintenance of cytoskeletal stability. However, ...