The work is supported by HHMI. We thank our lab members for their help with testing the protocol and revising the manuscript.

1. Construcción de la luz de aviso NOTA: El equipo requerido LED se resume en la Lista de Materiales. Toda la configuración del LED es pequeña y se puede colocar en cualquier lugar en el laboratorio, aunque se recomienda que se coloca en un cuarto oscuro para el control de exposición a la luz de los gusanos 4. <ol><li> Conectar el LED a un controlador con cables (Figura 1 A, D). </li><li> Conectar el controlador a una función de generador / amplificador digital con un cable BNC (Figura 1 A, C, D). </li><li> Fijar los LED de luz de 10 cm por encima del escenario utilizando un soporte personalizado (Figura 1A). NOTA: Se realizó el soporte con piezas metálicas. </li><li> Cubrir la configuración de la iluminación LED en parte, pero evitar la acumulación de calor (Figura 1B), lo que hace que los gusanos enfermos. NOTA: Nosotros usamos una cubierta de plástico duro de la medida con la parte superior abierta e inferior (Figura 1A). La cubierta no se requiere para la propia mutagénesis, pero se utiliza to limitar la exposición innecesaria de la luz azul para el entorno. Aconsejamos de no cubrir totalmente la configuración de LED (Figura 1B) para evitar el sobrecalentamiento de los gusanos. </li><li> Use gafas de protección láser. NOTA: Use gafas de protección láser, porque la luz es muy brillante. Gafas de sol pueden funcionar tan bien. </li><li> Cambiar la palanca del regulador del LED para &#39;Int.&#39; para la iluminación continua (Figura 1D) y programar a 65% de la potencia máxima (Figura 1C). </li><li> Utilice un fotómetro para medir la intensidad de la luz azul en la etapa en la que los gusanos se colocan usando el protocolo del fabricante. La configuración da 2,0 mW / mm2 bajo iluminación continua. </li></ol> 2. El tratamiento de luz azul NOTA: Utilice la cepa CZ20310 juSi164 [pMex-5-SU-72 :: miniSOG-3&#39;UTR (TBB-2) + Cb-UNC-119 (+)] UNC-119 (ed3) III 4 La cepa está disponible. en el Centro de Genética Caenorhabditis (CGC, http: //www.cgc.cbs.umn.edu/). <ol><li> Mantener la cepa Su-MSOG en la oscuridad en medio de crecimiento de nematodos estándar (NGM) placas con E. OP50 coli siguiendo un protocolo estándar de 10,11. NOTA: Bajo la luz ambiente, juSi164 cepas -Con no muestran una tasa de mutación espontánea por encima de una tasa de 4. paso cepa de rutina usando un microscopio de disección con una lámpara halógena generalmente no causa mutaciones también. No obstante, se debe tener cuidado para evitar la exposición innecesaria a la luz, por ejemplo, manteniendo las cepas en una incubadora oscura en el interior estándar, o cubriendo las cepas con papel de aluminio. Se aconseja congelar alícuotas de la cepa después de recibirlo en caso de que las mutaciones se acumulan con el tiempo innecesarias. </li><li> Escoja grávidas adultos jóvenes (12 h post-L4) a unos animales con un gusano recogen 11. NOTA: Los animales más jóvenes muestran un menor efecto mutagénico 4, mientras que los animales más viejos pueden tener menor tamaño de la camada. </li><li> Corte un filtro de paper para adaptarse a una placa de 60 mm con un 25 mm x 25 mm agujero cuadrado y colocarlo sobre una placa de cabeza de serie (Figura 1E). NOTA: Un punzón cuadrado puede ser utilizado, pero el tamaño del punzón no tiene que ser preciso. </li><li> Caída de 100 l de 100 mM CuCl 2 en el papel de filtro de manera uniforme para restringir gusanos dentro del orificio cuadrado en el plato. </li><li> Anotar número deseado de grávidas hermafroditas adultos jóvenes (ver paso 3 para un ejemplo) y traslado al centro de la placa CuCl2. </li><li> Utilice gafas de protección láser. </li><li> Interruptor en el LED y el generador de funciones. </li><li> Cambiar la palanca del regulador del LED para Ext. &#39; para controlar por el generador de funciones (Figura 1D). </li><li> Ajuste el controlador en el 65% de la potencia máxima y el generador de funciones como onda sinusoidal, 4 Hz (Figura 1C). </li><li> Coloque la placa de CuCl 2 de la Etapa 2.5 sin tapa en el escenario bajo el LED (Figura 1A &lt;/ Strong&gt;). </li><li> Iluminar los animales con la luz azul durante 30 minutos. </li><li> Transferir los gusanos de aspecto saludable a una placa sembrada como P 0. NOTA: El número deseado de P 0 depende del tipo de pantalla. Consulte el paso 3 para un ejemplo. Los P 0 gusanos pueden parecer no coordinado inmediatamente después del tratamiento y la luz se recuperarán con el tiempo. </li><li> Mantenga gusanos cubiertos usar papel aluminio en una incubadora o en la oscuridad; y seguir el procedimiento estándar para el tamizaje de fenotipos deseados entre su progenie 2,10. </li></ol> 3. Ejemplo de una pantalla adelante genéticos NOTA:. Este es un ejemplo de la pantalla clonal con 120 genomas haploides para comprobar si el LED y la tensión están trabajando Figura 2 muestra un esquema del procedimiento. <ol><li> [Día 1] Después de tratamiento con luz azul, recoger cinco gusanos de aspecto saludable en una placa de NGM con OP50 como P 0, mantenerlos en un 20 ° C incubadora, y dejar que ellos ponen sus huevos durante 1d (placa &#39;día 1&#39;). </li><li> [Día 2] Transferencia de P0 a una nueva placa de cabeza de serie (placa &#39;Día 2&#39;). </li><li> [Día 3] Escoja y matar P 0 en la placa del &#39;Día 2&#39; quemándolas. </li><li> [Día 4] Recoger 30 grávido adulto joven F 1 de la placa del &#39;día 1&#39; y transferirlos en placas individuales (30 F 1 Placas para &#39;Día 1&#39;). </li><li> [Día 5] Repita el paso 3.4 para la placa de &#39;Día 2&#39; (30 F 1 Placas para &#39;Día 2&#39;). </li><li> [Day7-9] Comprobar las morfologías y / o el comportamiento de F 2 gusanos en comparación con la cepa WT (Figura 3A) anormales bajo un microscopio estereoscópico estándar cuando se convierten en adultos. NOTA: una mutación hereditaria muestras sobre una cuarta parte de los gusanos con el mismo fenotipo entre F2 cuando es recesiva con alta penetrancia. Sin embargo, algunos mutantes pueden crecer lentamente y / o mostrar penetrancia parcial. Por lo tanto, es posible que menos de un cuarto de los mutantes se puede encontrar en unaplato. </li><li> Recoger los gusanos con fenotipos visibles individualmente y comprobar la heredabilidad del fenotipo en la generación siguiente. </li></ol> 4. Ejemplo de integración del transgén Extracromosómica <ol><li> Inyectar el ADN de interés en CZ20310 juSi164 [pMex-5-his-72 :: miniSOG-3&#39;UTR (TBB-2) + Cb-UNC-119 (+)] unc-119 (ed3) y preparar los gusanos transgénicos con una baja tasa de transmisión (10-30%) después de un 12,13 protocolo de inyección estándar. NOTA: Como alternativa, extracromosómicos arrays establecidos pueden ser cruzadas en las cepas juSi164. Para evitar el genotipado para juSi164, heterocigotos juSi164 se pueden usar como el P 0 aunque la eficiencia puede ser disminuida. El método de genotipificación para juSi164 se describe en la Sección 5. </li><li> [Día 1] Tratar ~ 20 animales transgénicos como P 0 con luz azul, como se describe en el paso 2. NOTA: Más P 0 gusanos son necesarias en función de la tr<html> tasa ansmission. Los transgenes pueden ser identificados por fenotipos o 12,13 marcador coinyección. </li><li> Recoger 10 P aspecto saludable 0 en placas individuales, mantenerlos en un 20 ° C incubadora, y dejar que ellos ponen sus huevos durante unos días (P) 0 placas </li><li> [Día 4] singularizar 20 transgénico F1 gusanos de cada placa P 0 en placas individuales y dejar que ellos ponen huevos. (20 F 1 x 10 P = 0 placas 200 F 1 placas en total). </li><li> [Día 7] Encuentra F1 placas con&gt; 75% de F 2 que tienen transgenes. </li><li> Escoja cinco animales transgénicos de la velocidad de transmisión de&gt; 75% de F 1 F 2 placas (placas). </li><li> [Día 10] Mantener F 2 placas con velocidad de transmisión de 100% como líneas integradas potenciales. </li><li> Outcross las posibles líneas integradas, utilizando un procedimiento estándar 10 para comprobar la segregación mendeliana y para eliminar posibles mutaciones de fondo. </li></ol>Le &quot;&gt; 5. Genotipado <ol><li> Lyse 20 outcrossed F 2 gusanos en tampón de lisis utilizando un protocolo estándar 14. </li><li> Realizar PCR usando los cebadores para la inserción MosSCI 9, juSi164, (Tabla 1) con una temperatura de hibridación de 58 ° C siguiendo un protocolo estándar 14. NOTA: No es necesario determinar el genotipo de UNC-119 (ed3) debido a UNC-119 (ed3) puede ser detectado por conducta no coordinada después de retirar el transgén rescate (juSi164) en los siguientes pasos 5.4 y 5.5. </li><li> Ejecutar electroforesis en gel de agarosa 15 y examinar los tamaños de las bandas (Tabla 1) para encontrar el tiempo de acceso a juSi164. </li><li> Examinar si la progenie F 2 ha paralizado gusanos debido a la existencia de UNC-119 (ed3). </li><li> Si se encuentran los gusanos no coordinados en el paso 5.4, solo varios gusanos nonuncoordinated para obtener todos los gusanos nonuncoordinated en la próxima generación. </li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

A continuación, describimos un procedimiento detallado de mutagénesis usando optogenético Su-MSOG expresa en la línea germinal y proporcionar un ejemplo de una pantalla genética hacia delante pequeña escala. En comparación con mutagénesis química estándar, este método de mutagénesis optogenético tiene varias ventajas. En primer lugar, es no tóxico, manteniendo de esta manera el personal de laboratorio fuera de mutágenos químicos tóxicos como el EMS, ENU y trimetilpsoraleno con luz ultravioleta (TMP / UV). En segundo lugar, el procedimiento experimental de la mutagénesis se puede utilizar para un pequeño número de los P 0 animales y se puede acabar en una hora. En tercer lugar, la mutagénesis optogenético produce un amplio espectro de mutaciones incluyendo sustituciones de nucleótidos y deleciones cromosómicas. Finalmente, la mutagénesis optogenético se puede utilizar para la integración de transgenes extracromosómicos. El paso crítico en este protocolo de mutagénesis es asegurarse de que la configuración del LED trabaja en su MSOG-cepas que contienen al exeficiencia esperadas. Se recomienda realizar una pantalla clonal piloto, tal como se describe en la Sección 3 del Protocolo, con cerca de 100 genomas haploides. La mutagénesis es fácilmente escalable de las pequeñas pantallas de piloto a gran escala a las pantallas no clonales mediante el aumento de la cantidad de P 0 para el tratamiento de la luz. Para las pantallas nonclonal a gran escala, se sugiere la sincronización de los gusanos a los adultos jóvenes grávidas y transferir cientos de ellos con solución M9 sobre una placa de CuCl2 para el tratamiento de la luz. La condición estándar descrito en los pasos 2 y 3 se estima que la eficiencia de aproximadamente 4,4 veces menor que el método de mutagénesis ccsme 50 mM ampliamente usado 4. La tasa de mutación puede mejorarse aumentando el tiempo de exposición a la luz y / o el aumento de la intensidad de la luz. Sin embargo, estas modificaciones pueden causar fototoxicidad y conducir a la cría de tamaño pequeño y la enfermedad de los gusanos de luz tratada. Para aumentar la eficiencia, puede ser posible utilizar derivados miniSOG con mayor rendimiento ROS talescomo miniSOG (Q103L) aunque puede aumentar el efecto de fondo mutagénesis y sin tratamiento con luz 16,17. Para la modificación de la construcción de ADN, la (TBB-2) plásmido pMex-5-HIS-72 :: miniSOG-3&#39;UTR (pCZ886) está disponible comercialmente. En las condiciones descritas aquí, los transgenes integrados se generan aproximadamente a una línea por cada 200 F 1 en promedio 4 cuando se utiliza una cepa transgénica extracromosómico con una velocidad de transmisión de 10 a 30%. Esta eficiencia se puede aumentar mediante el uso de cepas transgénicas extracromosómicos con altas tasas de transmisión como se informó anteriormente para un método de radiación UV 18. Su mediada por mutagénesis MSOG optogenético induce mutaciones en una amplia gama de genes. Además, la frecuencia de loci recuperado de la pantalla supresor de rpm-1 usando mutagénesis optogenético es similar a los de la misma pantalla usando EMS 4. Sin embargo, es posible que la mutagénesis optogenético usando un gen de histona puede tener un sesgo hacia ciertos genes, debido a factores desconocidos tales como la estructura de la cromatina. Para hacer frente a este problema, es necesario analizar muchas mutaciones inducidas por optogenetically secuenciación del genoma completo. Su mediada por mutagénesis MSOG optogenético provoca un amplio espectro de mutaciones incluyendo sustituciones de nucleótidos individuales y supresiones van de 1 pb a unos pocos cientos de pares de bases 4. El espectro de variantes de nucleótido único sugiere que las especies reactivas de oxígeno inducidas por miniSOG son la causa de las mutaciones 4. También es posible que miniSOG daños histona proteínas y provoca la inestabilidad de la cromatina porque miniSOG se utiliza para inactivar las proteínas, así 19. Puede ser posible manipular el tipo de mutaciones mediante el uso de luz de diferentes intensidades. Desde mutagénesis optogenético causa deleciones, es importante analizar deleciones así como los cambios de nucleótido único en quearchivo de datos de secuenciación del genoma para el mapeo 20. Se informó previamente que un microscopio de epifluorescencia se utiliza para la ablación de células mediada por miniSOG 21,22. La intensidad de la luz de un microscopio de epifluorescencia estándar compuesto se midió para ser ~ 0,5 mW / mm 2 sin una lente, que es aproximadamente 4 veces menor que la usada en el protocolo de mutagénesis optogenético estándar. Por lo tanto, es altamente recomendable para determinar empíricamente la eficacia cuando se utiliza un microscopio de epi-fluorescencia como fuente de luz. Una de las ventajas de los LED es la estabilidad durante miles de horas. Estudios anteriores han demostrado que miniSOG es más potente en la ablación de células mediada por ROS bajo luz pulsada 22, aunque el mecanismo exacto que queda por determinar. Se utilizó una función de generador / amplificador digital para hacer luz pulsada. Otra opción es conectar la fuente de luz a un ordenador mediante una interfaz USB-TTL (Figura 1A) para regular la li LEDGHT por un programa. El sistema LED se describe aquí también se puede utilizar para otros fines, tales como el control optogenético de células excitables utilizando canalrodopsina 23, la ablación de células usando mitochondria- o miniSOG 17,22 dirigido por células de membrana, y cromóforo asistida Light Inactivación (Cali) de 19 proteínas. Además, esta mutagénesis optogenético tiene el potencial de ser aplicado a otros organismos, tales como bacterias, levaduras, volar, y pez cebra, así como líneas celulares de mamífero.

Pantallas adelante genéticos han sido ampliamente utilizados para generar mutantes genéticos de alteración diversos procesos biológicos en organismos modelo tales como Caenorhabditis elegans (C. elegans) 1. Los análisis de los mutantes de este tipo conducen al descubrimiento de genes funcionalmente importantes y sus vías de señalización 1,2. Tradicionalmente, la mutagénesis en C. elegans se consigue utilizando productos químicos mutagénicos, radiación o transposones 2. Los productos químicos tales como metanosulfonato de etilo (EMS) y N-etil-N -nitrosourea (ESN) son tóxicos para los seres humanos; rayos gamma o ultravioleta (UV) mutagénesis radiación requiere equipo especial; y las cepas de tipo transposón activo, tales como cepas mutantes 3, pueden causar mutaciones innecesarios durante el mantenimiento. Hemos desarrollado un método simple para inducir mutaciones hereditarias utilizando un fotosensibilizador codificado genéticamente-4. Especies reactivas del oxígeno (ROS) pueden dañar el ADN 5.El generador de mini oxígeno singlete (miniSOG) es una proteína verde fluorescente de 106 aminoácidos que fue diseñado a partir de la lista de valores (luz, oxígeno, y voltaje) de dominio de Arabidopsis phototropin 2 6. Tras la exposición a la luz azul (~ 450 nm), miniSOG genera ROS incluyendo oxígeno singlete con fl avin mononucleótido como cofactor 6-8, que está presente en todas las células. Hemos construido una proteína de fusión His-MSOG mediante el etiquetado de miniSOG a la C-terminal de la histona-72, un C. elegans variante de la histona 3. Hemos generado un transgén de una sola copia 9 para expresar Su-MSOG en la línea germinal de C. elegans. En condiciones normales de cultivo en la oscuridad, los gusanos transgénicos Su-MSOG tiene la cría de tamaño normal y duración de la vida 4. Tras la exposición a la luz LED azul, los gusanos Su-MSOG producen mutaciones hereditarias entre su progenie 4. El espectro de mutaciones inducidas incluye cambios de nucleótidos, tales como G: C a T: A y G: C a C: G, y los pequeños chromosoMe supresiones 4. Este procedimiento de mutagénesis es fácil de realizar y requiere una configuración mínima seguridad en el laboratorio. A continuación, se describe la configuración de la iluminación LED y procedimientos para la mutagénesis optogenético.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="626">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Ultra High Power LED light source</td>
			<td style="width:71px;">Prizmatix</td>
			<td style="width:115px;">UHP-mic-LED-460</td>
			<td style="width:184px;">460 &#177; 5 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">LED controller</td>
			<td style="width:71px;">Prizmatix</td>
			<td style="width:115px;">UHPLCC-01</td>
			<td style="width:184px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:256px;">Digital function generator/amplifier</td>
			<td style="width:71px;">PASCO</td>
			<td style="width:115px;">PI-9587C</td>
			<td style="width:184px;">PI-9587C is no longer available. The replacement is PI-8127.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">BNC cable male/male</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td style="width:115px;">CA3136</td>
			<td style="width:184px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">USB-TTL interface</td>
			<td style="width:71px;">Prizmatix</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:184px;">Optional</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Photometer</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td style="width:115px;">PM50 and Model D10MM</td>
			<td style="width:184px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Filter paper</td>
			<td style="width:71px;">Whatman</td>
			<td style="width:115px;">1001-110</td>
			<td style="width:184px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:256px;">Copper chloride dihydrate (CuCl2&#8729;2H2O)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">C6641</td>
			<td style="width:184px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:71px;">Leica</td>
			<td style="width:115px;">MZ95</td>
			<td style="width:184px;"></td>
		</tr>
		<tr height="163">
			<td height="163" style="height:163px;width:256px;">NGM plate</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:184px;">Dissolve 5g NaCl, 2.5g Peptone, 20g Agar, 10 &#181;g/ml cholesterol in 1 L H2O. After autoclaving, add 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM KH2PO4(pH6.0).&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="88">
			<td height="88" style="height:88px;width:256px;">Lysis solution</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:184px;">10 mM Tris(pH8.8), 50 mM KCl, 0.1% Triton X100, 2.5 mM MgCl2, 100 &#181;g/ml Proteinase K</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic random mutagenesis using histone-minisog in c. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Se realizó un rastreo genético adelante con CZ20310 juSi164 UNC-119 (ed3) mediante exposición a la luz 30 min siguiendo el protocolo estándar descrito en las secciones 2 y 3. Entre 60 placas F 1 que corresponden a 120 genomas haploides mutagenizados, encontramos 8 F 1 con placas F 2 gusanos que exhiben fenotipos visibles como defecto el tamaño del cuerpo (Figura 3B), el movimiento no coordinado (Figura 3C), y la letalidad de adultos (Figura 3D). No notamos ninguna diferencia en el número de mutantes entre &#39;día 1&#39; &#39;y las placas Day2&#39;. Toda la progenie de singularizados pequeñas F 2 gusanos y no coordinadas F 2 gusanos mostró los fenotipos correspondientes, lo que sugiere que los mutantes son heredables. La observación completa se resume en la Tabla 2. En promedio, una pantalla clonal con 120 genomas haploides dará lugar a aproximadamente 10 F 1 con placascontienen gusanos con fenotipos visiblemente detectables, tales como la forma del cuerpo y la locomoción que capta fácilmente bajo un microscopio estereoscópico. Más análisis cuantitativo es necesario determinar la tasa de mutación, precisamente, 4. El número esperado de mutantes visibles desde esta pantalla sugiere que la cepa y la configuración están funcionando correctamente para la mutagénesis optogenético. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54810/54810fig1.jpg" /> Figura 1:. La Configuración de LED (A) Todo el sistema. El LED se montó sobre un soporte hecho a medida. Los detalles se encuentran en la Lista de Materiales. (B) La cubierta está hecha de plástico. No cubre por completo el sistema para evitar la acumulación de calor. Controlador y la función del generador (C). (D) El lado posterior del sistema. (E) Una placa no sembrada con CuCl2 papel de filtro para el tratamiento -soaked luz azul.<html> <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54810/54810fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54810/54810fig2.jpg" /> Figura 2:. Procedimiento experimental para una pantalla clonal Después de tratamiento con luz azul, P 0 gusanos se transfieren a una placa sin semillas y permitió a poner huevos. P 0 gusanos son transferidos a una nueva placa de cabeza de serie 1 d después del tratamiento con luz y mataron a 2 días después de tratamiento con luz. F 1 gusanos se escogieron de las placas P 0. Fenotipos de F 2 gusanos se examinan después de que se conviertan en adultos. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54810/54810fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 10fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3: Ejemplo de Mutantes (A) cepa original para la mutagénesis optogenético:. CZ20310 juSi164 UNC-119 (ed3). Esta cepa tiene forma normal del cuerpo, comportamiento y tamaño de la camada. Barra de escala: 0,5 mm. . (B - D) F 2 progenie defecto que muestra el tamaño del cuerpo (B), falta de coordinación (C) y (D) fenotipos letales <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54810/54810fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Tabla 1" src="/files/ftp_upload/54810/54810table1.jpg" /> Tabla 1: Genotipado de juSi164 y UNC-119 (ed3). <img alt="Tabla 2" src="/files/ftp_upload/54810/54810table2.jpg" /> Tabla 2: Ejemplo de fenotipos from una pantalla clonal.

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Mutagénesis aleatoria optogenética mediante histona-miniSOG en C. elegans | Genética | Video

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

codificado genéticamente-histona-miniSOG induce mutaciones hereditarias en todo el genoma de una manera dependiente de la luz azul. Este método de mutagénesis es simple, rápido, libre de productos químicos tóxicos y muy adecuado para la detección genética hacia adelante y la integración del transgén.

Optogenética aleatoria de mutagénesis, utilizando la histona-miniSOG en<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

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Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

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9.0K vistas.  University of California in San Diego and Howard Hughes Medical Institute.  codificado genéticamente-histona-miniSOG induce mutaciones hereditarias en todo el genoma de una manera dependiente de la luz azul. Este método de mutagénesis es simple, rápido, libre de productos químicos tóxicos y muy adecuado para la detección genética hacia adelante y la integración del transgén. 

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Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.

Targeted<em&gt; In situ</em&gt; mutagénesis de histona genes en la levadura en ciernes

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Investigación

Genética

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged as a powerful tool for gene-expression analysis and transcriptome mapping. However, handling RNA-Seq datasets requires sophisticated computational expertise and poses inherent challenges for biology researchers. This bottleneck has been mitigated by the open access Galaxy project that allows users without bioinformatics skills to analyze RNA-Seq data, and the Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery (DAVID), a Gene Ontology (GO) term analysis suite that helps derive biological meaning from large data sets. However, for first-time users and bioinformatics' amateurs, self-learning and familiarization with these platforms can be time-consuming and daunting. We describe a straightforward workflow that will help C. elegans researchers to isolate worm RNA, conduct an RNA-Seq experiment and analyze the data using Galaxy and DAVID platforms. This protocol provides stepwise instructions for using the various Galaxy modules for accessing raw NGS data, quality-control checks, alignment, and differential gene expression analysis, guiding the user with parameters at every step to generate a gene list that can be screened for enrichment of gene classes or biological processes using DAVID. Overall, we anticipate that this article will provide information to C. elegans researchers undertaking RNA-Seq experiments for the first time as well as frequent users running a small number of samples.

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Galaxy and DAVID have emerged as popular tools that allow investigators without bioinformatics training to analyze and interpret RNA-Seq data. We describe a protocol for C. elegans researchers to perform RNA-Seq experiments, access and process the dataset using Galaxy and obtain meaningful biological information from the gene lists using DAVID.

Análisis de transcriptómica<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; elegans</em&gt; ARN secuencia de datos a través de la suite smoking en el Proyecto Galaxy

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged ...

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. Therefore, DNA-protein interactions regulate multiple physiological, pathophysiological, and biological functions, such as cell differentiation, cell proliferation, cell cycle control, chromosome stability, epigenetic gene regulation, and cell transformation. In eukaryotic cells, the DNA interacts with histone and nonhistone proteins and is condensed into chromatin. Several technical tools can be used to analyze DNA-protein interactions, such as the Electrophoresis (gel) Mobility Shift Assay (EMSA) and DNase I footprinting. However, these techniques analyze the protein-DNA interaction in vitro, not within the cellular context. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a technique that captures proteins at their specific DNA binding sites, thereby allowing for the identification of DNA-protein interactions within their chromatin context. It is done by fixation&#160;of the DNA-protein interaction, followed by&#160;immunoprecipitation of the protein of interest. Subsequently, the genomic site that the protein was bound to is characterized. Here, we describe and discuss ChIP and demonstrate its analytical value for the identification of the Transforming Growth Factor-&#946; (TGF-&#946;)-induced binding of the transcription factor SMAD2 to SMAD Binding Elements (SBE) within the promoter region of the tyrosine-protein kinase Kit (c-KIT) receptor ligand Stem Cell Factor (SCF).

DNA-protein interactions are essential for multiple biological processes. During the evaluation of cellular functions, the analysis of DNA-protein interactions is indispensable for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to analyze such interactions in vivo.

Análisis del promotor de ligandos c-KIT usando inmunoprecipitación de cromatina

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Protocols for C-Brick DNA Standard Assembly Using Cpf1

CRISPR-associated protein Cpf1 cleaves double-stranded DNA under the guidance of CRISPR RNA (crRNA), generating sticky ends. Because of this characteristic, Cpf1 has been used for the establishment of a DNA assembly standard called C-Brick, which has the advantage of long recognition sites and short scars. On a standard C-Brick vector, there are four Cpf1 recognition sites &#8211; the prefix (T1 and T2 sites) and the suffix (T3 and T4 sites) &#8211; flanking biological DNA parts. The cleavage of T2 and T3 sites produces complementary sticky ends, which allow for the assembly of DNA parts with T2 and T3 sites. Meanwhile, a short &#34;GGATCC&#34; scar is generated between parts after assembly. As the newly formed plasmid once again contains the four Cpf1 cleavage sites, the method allows for the iterative assembly of DNA parts, which is similar to those of BioBrick and BglBrick standards. A procedure outlining the use of the C-Brick standard to assemble DNA parts is described here. The C-Brick standard can be widely used by scientists, graduate and undergraduate students, and even amateurs.

CRISPR-associated protein Cpf1 can be guided by a specially designed CRISPR RNA (crRNA) to cleave double-stranded DNA at desired sites, generating sticky ends. Based on this characteristic, a DNA assembly standard (C-Brick) was established, and a protocol detailing its use is described here.

Protocolos para el ensamblaje estándar de ADN de C-Brick usando Cpf1

CRISPR-associated protein Cpf1 cleaves double-stranded DNA under the guidance of CRISPR RNA (crRNA), generating sticky ends. Because of this ...

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Sensory systems allow animals to detect, process, and respond to their environment. Food abundance is an environmental cue that has profound effects on animal physiology and behavior. Recently, we showed that modulation of longevity in the nematode Caenorhabditis elegans by food abundance is more complex than previously recognized. The responsiveness of the lifespan to changes in food level is determined by specific genes that act by controlling information processing within a neural circuit. Our framework combines genetic analysis, high-throughput quantitative imaging and information theory. Here, we describe how these techniques can be used to characterize any gene that has a physiological relevance to broad-range dietary restriction. Specifically, this workflow is designed to reveal how a gene of interest regulates lifespan under broad-range dietary restriction; then to establish how the expression of the gene varies with food level; and finally, to provide an unbiased quantification of the amount of information conveyed by gene expression about food abundance in the environment. When several genes are examined simultaneously under the context of a neural circuit, this workflow can uncover the coding strategy employed by the circuit.

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Here, we present a framework to relate broad-range dietary restriction to gene expression and lifespan. We describe protocols for broad-range dietary restriction and for quantitative imaging of gene expression under this paradigm. We further outline computational analyses to reveal underlying information processing features of the genetic circuits involved in food-sensing.

Cuantificación de la información codificada por el Gene expresión niveles durante la vida útil modulación bajo amplia gama dieta restricción en C. elegans

Sensory systems allow animals to detect, process, and respond to their environment. Food abundance is an environmental cue that has profound effects on ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has been associated with both the progression of cancer and the development of drug resistance. Until now, it has not been feasible to easily manipulate the ploidy of a multicellular animal without generating mostly sterile progeny. Presented here is a simple and rapid protocol for generating tetraploid Caenorhabditis elegans animals from any diploid strain. This method allows the user to create a bias in chromosome segregation during meiosis, ultimately increasing ploidy in C. elegans. This strategy relies on the transient reduction of expression of the rec-8 gene to generate diploid gametes. A rec-8 mutant produces diploid gametes that can potentially produce tetraploids upon fertilization. This tractable scheme has been used to generate tetraploid strains carrying mutations and chromosome rearrangements to gain insight into chromosomal dynamics and interactions during pairing and synapsis in meiosis. This method is efficient for generating stable tetraploid strains without genetic markers, can be applied to any diploid strain, and can be used to derive triploid C. elegans. This straightforward method is useful for investigating other fundamental biological questions relevant to genome instability, gene dosage, biological scaling, extracellular signaling, adaptation to stress, development of resistance to drugs, and mechanisms of speciation.

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

This method allows for the generation of tetraploid and triploid Caenorhabditis nematodes from any diploid strain. Polyploid strains generated by this method have been used to study chromosome interactions in meiotic prophase, and this method is useful for examining important basic questions in cell, developmental, evolutionary, and cancer biology.

Manipulación de ploidía en Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve random mutagenesis, error-prone PCR is a convenient and efficient strategy for generating a diverse pool of mutants (i.e., a mutant library). Error-prone PCR is the method of choice when a researcher seeks to mutate a pre-defined region, such as the coding region of a gene while leaving other genomic regions unaffected. After the mutant library is amplified by error-prone PCR, it must be cloned into a suitable plasmid. The size of the library generated by error-prone PCR is constrained by the efficiency of the cloning step. However, in the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, the cloning step can be replaced by the use of a highly efficient one-step fusion PCR to generate constructs for transformation. Mutants of desired phenotypes may then be selected using appropriate reporters. Here, we describe this strategy in detail, taking as an example, a reporter inserted at centromeric heterochromatin.

This article describes a detailed methodology for random mutagenesis of a target gene in fission yeast. As an example, we target rpt4+, which encodes a subunit of the 19S proteasome, and screen for mutations that destabilize heterochromatin.

Gene-dirigido mutagénesis al azar para seleccionar a mutantes de proteasoma desestabilizadoras de la heterocromatina en la levadura de fisión

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been co-opted as a powerful tool for precise eukaryotic genome engineering. Here, we present a rapid and simple method using chimeric single guide RNAs (sgRNA) and CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) for the efficient and precise generation of genomic point mutations in C. elegans. We describe a pipeline for sgRNA target selection, homology-directed repair (HDR) template design, CRISPR-Cas9-RNP complexing and delivery, and a genotyping strategy that enables the robust and rapid identification of correctly edited animals. Our approach not only permits the facile generation and identification of desired genomic point mutant animals, but also facilitates the detection of other complex indel alleles in approximately 4 - 5 days with high efficiency and a reduced screening workload.

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Here, we present a method to engineer the genome of C. elegans using CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins and homology dependent repair templates.

Un rápido y fácil tubería para generar genómica punto mutantes de C. elegans utilizando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant viruses they vector. Despite numerous studies of the biology of these species in different environments, a key life history parameter, offspring sex ratios, has received little attention, yet is important for predicting population dynamics. The primary sex ratio (sex ratio at oviposition) of Bemisia tabaci has never been reported but can be found by determining the egg fertilization rate of this haplodiploid insect. The technique involves the dechorionation of eggs with bleach, a series of fixation steps, and the application of the general DNA fluorescent stain, DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole, a DNA-binding fluorescent dye), to bind to female and male pronuclei. Here, we present the technique, and an example of its application, to test whether an endosymbiotic bacterium, Rickettsia sp. nr. bellii, influenced the primary sex ratio of B. tabaci. This method may assist in population studies of whiteflies, or in determining if sex allocation exists with certain environmental stimuli.

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

We present a simple cytogenetic technique using 4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) to determine the fertilization rate and primary sex ratio of the haplodiploid invasive pest Bemisia tabaci.

Determinar la tasa de fertilización de huevos de Bemisia tabaci mediante una técnica citogenética

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

This paper presents a high-throughput reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) assay for Caenorhabditis elegans that is fast, robust, and highly sensitive. This protocol obtains precise measurements of gene expression from single worms or from bulk samples. The protocol presented here provides a novel adaptation of existing methods for complementary DNA (cDNA) preparation coupled to a nanofluidic RT-qPCR platform. The first part of this protocol, named &#8216;Worm-to-CT&#8217;, allows cDNA production directly from nematodes without the need for prior mRNA isolation. It increases experimental throughput by allowing the preparation of cDNA from 96 worms in 3.5 h. The second part of the protocol uses existing nanofluidic technology to run high-throughput RT-qPCR on the cDNA. This paper evaluates two different nanofluidic chips: the first runs 96 samples and 96 targets, resulting in 9,216 reactions in approximately 1.5 days of benchwork. The second chip type consists of six 12 x 12 arrays, resulting in 864 reactions. Here, the Worm-to-CT method is demonstrated by quantifying mRNA levels of genes encoding heat shock proteins from single worms and from bulk samples. Provided is an extensive list of primers designed to amplify processed RNA for the majority of coding genes within the C. elegans genome.

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

In this article a high-throughput protocol for fast and reliable determination of gene expression levels in single or bulk C. elegans samples is described. This protocol does not require RNA isolation and produces cDNA directly from samples. It can be used together with high-throughput multiplexed nanofluidic real-time qPCR platforms.

RT-PCR cuantitativo de alto rendimiento en muestras de C. elegans individuales y a granel utilizando tecnología nanofluídica

This paper presents a high-throughput reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) assay for Caenorhabditis elegans that is fast, robust, and highly ...