The work is supported by HHMI. We thank our lab members for their help with testing the protocol and revising the manuscript.

1. بناء الصمام المنور ملاحظة: يتم تلخيص معدات LED المطلوبة في قائمة المواد. الإعداد الصمام كامل صغير ويمكن وضعها في أي مكان في المختبر، على الرغم من أننا أوصي به أن توضع في غرفة مظلمة للسيطرة على التعرض للضوء من الديدان 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصيل الصمام إلى وحدة تحكم مع الكابلات (الشكل 1A، D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط وحدة تحكم إلى الرقمي وظيفة مولد / مكبر للصوت مع كابل BNC (الشكل 1A، C، D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الصمام الخفيفة 10 سم فوق خشبة المسرح باستخدام حامل مخصصة (الشكل 1A). ملاحظة: جعلنا حامل مع الأجزاء المعدنية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية الإعداد إضاءة LED جزئيا، ولكن تجنب تراكم الحرارة (الشكل 1B)، الأمر الذي يجعل الديدان المرضى. ملاحظة: نحن نستخدم غطاء من البلاستيك الصلب حسب الطلب مع مكشوفة وأسفل (الشكل 1A). غير مطلوب غطاء لالطفرات نفسها، ولكنها تستخدم رس لحد من التعرض غير الضروري للضوء الأزرق إلى المناطق المحيطة بها. ونحن ننصح بعدم تغطية الإعداد الصمام كليا (الشكل 1B) لمنع الانهاك الديدان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ارتداء نظارات واقية ليزر. ملاحظة: نحن ارتداء نظارات واقية ليزر لأن الضوء هو مشرق جدا. قد تعمل النظارات الشمسية أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبديل رافعة للتحكم ادى الى &quot;كثافة العمليات&quot;. لإضاءة مستمرة (1D الشكل) ووضعه في 65٪ من الطاقة القصوى (الشكل 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مضواء لقياس شدة الضوء الأزرق على المسرح حيث يتم وضع الديدان باستخدام بروتوكول الشركة الصانعة. الإعداد يعطي 2.0 ميغاواط / مم 2 تحت إضاءة مستمرة. </li></ol> 2. الأزرق علاج الخفيفة ملاحظة: استخدم سلالة CZ20310 juSi164 [Pmex-5-HIS-72 :: miniSOG-3&#39;UTR (TBB-2) + CB-UNC-119 (+)] UNC-119 (ED3) الثالث 4 هو السلالة متاح. في انواع معينة مركز علم الوراثة (CGC، http: //: //www.cgc.cbs.umn.edu/). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على سلالة صاحب-mSOG في الظلام على معيار متوسط النمو الخيطية (NGM) لوحات مع E. القولونية OP50 التالية بروتوكول قياسي 10،11. ملاحظة: تحت الضوء المحيط، juSi164 سلالات المحتوية لا يتم عرض معدل الطفرات أعلى معدل عفوية 4. الروتيني سلالة مرور باستخدام نطاق تشريح مع مصابيح الهالوجين عادة لا تسبب الطفرات كذلك. ومع ذلك، ينبغي الحرص على تجنب التعرض غير الضروري إلى النور، على سبيل المثال، والحفاظ على السلالات في معيار الظلام داخل الحاضنة، أو تغطي التوتر مع احباط. ينصح لتجميد aliquots من سلالة بعد الحصول عليها في حالة الطفرات لا لزوم لها تتراكم مع مرور الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار حامل الشباب البالغين (ما يقرب من 12 ساعة بعد L4) الحيوانات مع دودة اختيار 11. ملاحظة: الحيوانات الأصغر سنا تظهر تأثير أقل مطفرة 4، في حين أن الحيوانات الأكبر سنا قد يكون أقل حجم الحضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع مرشح صأبر لتتناسب مع لوحة 60 ملم مع 25 ملم × 25 ملم حفرة مربعة ومكان على لوحة غير المصنف (الشكل 1E). ملاحظة: لكمة مربع يمكن استخدامها ولكن حجم لكمة ليس من الضروري أن يكون دقيقا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إسقاط 100 ميكرولتر من 100 ملي CuCl 2 على ورقة الترشيح بالتساوي للحد من الديدان داخل حفرة مربعة على لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار العدد المطلوب من حامل المنحرفين الشباب البالغين (راجع الخطوة 3 للحصول على مثال) ونقل إلى مركز لوحة CuCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ارتداء النظارات الواقية ليزر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل على الصمام ومولد وظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبديل رافعة للتحكم ادى الى &quot;تحويلة&quot;. للسيطرة عليها من قبل مولد وظيفة (1D الشكل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين تحكم في 65٪ من الطاقة القصوى والمولد وظيفة موجة جيبية، 4 هرتز (الشكل 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة CuCl 2 من الخطوة 2.5 دون غطاء على المسرح تحت الصمام (الشكل 1A &lt;/ قوي&gt;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسليط الضوء على الحيوانات مع الضوء الأزرق لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الديدان صحية يتطلعون إلى لوحة المصنف كما P 0. ملاحظة: العدد المطلوب من P 0 يعتمد على نوع من الشاشة. راجع الخطوة 3 على سبيل المثال. قد تظهر ف 0 الديدان أن تكون غير منسقة فورا بعد العلاج الخفيفة وسوف تتعافى مع مرور الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حافظ على الديدان تغطيتها باستخدام رقائق في حاضنة أو في الظلام. واتبع الإجراء القياسي لبدء فحص الظواهر المطلوب بين ذريتها 2،10. </li></ol> 3. مثال على شاشة الوراثية إلى الأمام ملاحظة: هذا مثال من الشاشة نسيلي مع 120 الجينوم فرداني للتحقق مما إذا كان الصمام وسلالة تعمل يبين الشكل 2 التخطيطي لهذا الإجراء. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> [DAY1] بعد العلاج الضوء الأزرق، واختيار خمسة الديدان صحية تتطلع إلى لوحة NGM مع OP50 كما P 0، والاحتفاظ بها في 20 درجة مئوية الحاضنة، والسماح لهم وضع البيض ل1د (لوحة &quot;DAY1 &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> [DAY2] نقل P 0 على طبق من ذهب المصنفة جديدة (لوحة &quot;DAY2 &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> [DAY3] انتقاء وقتل P 0 على لوحة في &quot;DAY2 عن طريق حرقها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> [DAY4] اختيار 30 شابة حامل الكبار F 1 من لوحة في &quot;DAY1&quot; ونقلها على لوحات فردية (30 F 1 لوحات ل &#39;DAY1&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> [Day5] كرر الخطوة 3.4 لوحة في &quot;DAY2&quot; (30 F 1 لوحات ل &#39;DAY2&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> [Day7-9] التحقق من الأشكال التضاريسية غير طبيعية و / أو سلوك F 2 الديدان مقارنة WT سلالة (الشكل 3A) تحت مجهر تشريحي القياسية عندما يصبحون بالغين. ملاحظة: يعرض طفرة وراثية نحو ربع الديدان مع نفس النمط الظاهري بين F 2 عندما يكون المتنحية مع انتفاذ عالية. ومع ذلك، قد تنمو بعض المسوخ ببطء و / أو إظهار انتفاذ جزئي. لذلك، فمن الممكن أن أقل من ربع المسوخ يمكن العثور علىطبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار الديدان مع الظواهر المرئية على حدة والتحقق من التوريث من النمط الظاهري في الجيل القادم. </li></ol> 4. مثال على التكامل خارج الصبغي التحوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن الحمض النووي من الاهتمام الى CZ20310 juSi164 [Pmex-5-HIS-72 :: miniSOG-3&#39;UTR (TBB-2) + CB-UNC-119 (+)] UNC-119 (ED3) وإعداد الديدان المعدلة وراثيا مع انخفاض معدل انتقال (10-30٪) في أعقاب 12،13 بروتوكول حقن القياسية. ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن تجاوز صفائف خارج الصبغي أنشئت في سلالات juSi164. لتجنب التنميط الجيني لjuSi164، يمكن استخدام الزيجوت juSi164 باسم P 0 على الرغم من كفاءة قد انخفض. يتم وصف أسلوب التنميط الجيني لjuSi164 في القسم 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> [DAY1] علاج ~ 20 الحيوانات المعدلة وراثيا كما P 0 مع الضوء الأزرق كما هو موضح في الخطوة 2. ضرورية عن P 0 الديدان تبعا لآر ملاحظة:<html> معدل ansmission. الجينات المحورة يمكن تحديدها من خلال الظواهر أو 12،13 coinjection علامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار 10 تبحث P صحية 0 على لوحات فردية، والاحتفاظ بها في 20 درجة مئوية الحاضنة، والسماح لهم وضع البيض لبضعة أيام (ف 0 لوحات) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> [DAY4] واحدة من 20 المعدلة وراثيا F 1 الديدان من كل لوحة P 0 على لوحات فردية والسماح لهم وضع البيض. (20 F 1 × 10 ف 0 لوحات = 200 F 1 لوحات في المجموع). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> [Day7] البحث F 1 لوحات مع&gt; 75٪ F 2 وجود الجينات المحورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار خمسة حيوانات معدلة وراثيا من معدل انتقال&gt; 75٪ F 1 لوحات (F لوحات 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> [Day10] حافظ F لوحات 2 مع معدل نقل 100٪ من خطوط متكاملة المحتملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تهجين خطوط متكاملة المحتملة باستخدام الإجراء العادي 10 للتحقق من العزل مندلية ولإزالة الطفرات خلفية محتملة. </li></ol>لو &quot;&gt; 5. انماط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليز 20 outcrossed F 2 الديدان في تحلل العازلة باستخدام بروتوكول قياسي 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء PCR باستخدام بادئات لMosSCI الإدراج 9، juSi164، (الجدول رقم 1) مع درجة الحرارة الصلب من 58 درجة مئوية بعد بروتوكول قياسي 14. ملاحظة: ليس من الضروري الوراثي UNC-119 (ED3) لUNC-119 (ED3) يمكن الكشف عنها بواسطة سلوك غير منسقة بعد إزالة التحوير إنقاذ (juSi164) في خطوات التالية 5.4 و 5.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل الاغاروز الكهربائي للهلام 15 وفحص أحجام الفرقة (الجدول 1) للعثور على WT لjuSi164. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فحص إذا ذرية F 2 شلت الديدان بسبب وجود (ED3) UNC-119. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا تم العثور على الديدان غير منسقة في خطوة 5.4، واحدة عدة الديدان nonuncoordinated الحصول على جميع الديدان nonuncoordinated في الجيل القادم. </li></ol>

<ol>
	<li>Jorgensen, E. M., Mango, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+and+design+of+genetic+screens:+caenorhabditis+elegans.">The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans.</a> Nat Rev Genet. 3 (5), 356-369 (2002).</li><li>Kutscher, L. M., Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+and+reverse+mutagenesis+in+C.+elegans.">Forward and reverse mutagenesis in C. elegans.</a> WormBook. , 1-26 (2014).</li><li>Collins, J., Saari, B., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+a+transposable+element+in+the+germ+line+but+not+the+soma+of+Caenorhabditis+elegans.">Activation of a transposable element in the germ line but not the soma of Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 328 (6132), 726-728 (1987).</li><li>Noma, K., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+mutagenesis+in+Caenorhabditis+elegans.">Optogenetic mutagenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Commun. 6, 8868 (2015).</li><li>Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+DNA+damage:+mechanisms,+mutation,+and+disease.">Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disease.</a> FASEB J. 17 (10), 1195-1214 (2003).</li><li>Shu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+tag+for+correlated+light+and+electron+microscopy+of+intact+cells,+tissues,+and+organisms.">A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms.</a> PLoS Biol. 9 (4), 1001041 (2011).</li><li>Ruiz-Gonzalez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Singlet+oxygen+generation+by+the+genetically+encoded+tag+miniSOG.">Singlet oxygen generation by the genetically encoded tag miniSOG.</a> J Am Chem Soc. 135 (26), 9564-9567 (2013).</li><li>Pimenta, F. M., Jensen, R. L., Breitenbach, T., Etzerodt, M., Ogilby, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-dependent+photochemistry+and+photophysics+of+"miniSOG,"+a+protein-encased+flavin.">Oxygen-dependent photochemistry and photophysics of "miniSOG," a protein-encased flavin.</a> Photochem Photobiol. 89 (5), 1116-1126 (2013).</li><li>Frokjaer-Jensen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+and+targeted+transgene+insertion+in+Caenorhabditis+elegans+using+a+modified+Mos1+transposon.">Random and targeted transgene insertion in Caenorhabditis elegans using a modified Mos1 transposon.</a> Nat Methods. 11 (5), 529-534 (2014).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+worm+lab:+from+culturing+worms+to+mutagenesis.">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> J Vis Exp. (47), (2011).</li><li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection.">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. (18), (2008).</li><li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transformation.">DNA transformation.</a> Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).</li><li>Fay, D., Bender, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mapping+and+manipulation:+chapter+4--SNPs:+introduction+and+two-point+mapping.">Genetic mapping and manipulation: chapter 4--SNPs: introduction and two-point mapping.</a> WormBook. , 1-7 (2006).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li><li>Westberg, M., Holmegaard, L., Pimenta, F. M., Etzerodt, M., Ogilby, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+an+efficient,+genetically+encodable,+protein-encased+singlet+oxygen+photosensitizer.">Rational design of an efficient, genetically encodable, protein-encased singlet oxygen photosensitizer.</a> J Am Chem Soc. 137 (4), 1632-1642 (2015).</li><li>Xu, S., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+optogenetic+cell+ablation+in+C.+elegans+using+membrane-targeted+miniSOG.">Highly efficient optogenetic cell ablation in C. elegans using membrane-targeted miniSOG.</a> Sci Rep. 6, 21271 (2016).</li><li>Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+protocol+for+integrating+extrachromosomal+arrays+with+high+transmission+rate+into+the+C.+elegans+genome.">A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome.</a> J Vis Exp. (82), (2013).</li><li>Lin, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+inhibition+of+synaptic+release+with+chromophore-assisted+light+inactivation+(CALI).">Optogenetic inhibition of synaptic release with chromophore-assisted light inactivation (CALI).</a> Neuron. 79 (2), 241-253 (2013).</li><li>Minevich, G., Park, D. S., Blankenberg, D., Poole, R. J., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CloudMap:+A+Cloud-Based+Pipeline+for+Analysis+of+Mutant+Genome+Sequences.">CloudMap: A Cloud-Based Pipeline for Analysis of Mutant Genome Sequences.</a> Genetics. 192 (>4), 1249-1269 (2012).</li><li>Qi, Y., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiniSOG-mediated+Photoablation+in+Caenorhabdtis+elegans.">MiniSOG-mediated Photoablation in Caenorhabdtis elegans.</a> Bio-protocol. 3 (1), 316 (2013).</li><li>Qi, Y. B., Garren, E. J., Shu, X., Tsien, R. Y., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photo-inducible+cell+ablation+in+Caenorhabditis+elegans+using+the+genetically+encoded+singlet+oxygen+generating+protein+miniSOG.">Photo-inducible cell ablation in Caenorhabditis elegans using the genetically encoded singlet oxygen generating protein miniSOG.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (19), 7499-7504 (2012).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+activation+of+channelrhodopsin-2+in+excitable+cells+of+Caenorhabditis+elegans+triggers+rapid+behavioral+responses.">Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses.</a> Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

هنا، نحن تصف إجراءات تفصيلية من الطفرات علم البصريات الوراثي باستخدام اعرب-mSOG في سلالة الجرثومية وتقديم مثال على شاشة الوراثية إلى الأمام على نطاق صغير. بالمقارنة مع الطفرات الكيميائية القياسية، وهذه الطريقة الطفرات علم البصريات الوراثي لديها العديد من المزايا. أولا، فمن غير سامة، وبالتالي الحفاظ على أفراد المختبر بعيدا عن المطفرة الكيميائية السامة مثل نظم الإدارة البيئية، ENU وtrimethylpsoralen مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية (TMP / الأشعة فوق البنفسجية). ثانيا، إن إجراء التجارب من الطفرات يمكن استخدامها لعدد صغير من ف 0 الحيوانات ويمكن أن تنتهي في غضون ساعة واحدة. ثالثا، الطفرات علم البصريات الوراثي وتنتج مجموعة واسعة من الطفرات بما في ذلك استبدال النوكليوتيدات والحذف كروموسوم. وأخيرا، فإن الطفرات علم البصريات الوراثي يمكن أن تستخدم لدمج الجينات المحورة خارج الصبغي. في خطوة حاسمة في هذا البروتوكول الطفرات هو التأكد من أن إعداد الصمام يعمل على صاحب-mSOG تحتوي على سلالات في السابقكفاءة pected. نوصي أداء شاشة نسيلي التجريبية، كما هو موضح في القسم بروتوكول 3، مع حوالي 100 الجينوم فرداني. الطفرات هي قابلة للتطوير بسهولة من الشاشات على نطاق تجريبي صغيرة لشاشات nonclonal عن طريق زيادة عدد ف 0 لعلاج الخفيفة. لشاشات nonclonal على نطاق واسع، نقترح عليك مزامنة الديدان إلى الشباب حامل ونقل المئات منهم مع حل M9 على طبق من ذهب CuCl 2 للعلاج الخفيفة. الشرط القياسية الموضحة في الخطوات 2 و 3 يقدر أن يكون أقل ما يقرب من 4.4 مرة كفاءة من استخدامها على نطاق واسع 50 ملي EMS طريقة الطفرات 4. يمكن تحسين معدل التحور من خلال زيادة وقت التعرض للضوء و / أو زيادة شدة الضوء. ومع ذلك، يمكن لهذه التعديلات يسبب الضيائية ويؤدي إلى حجم الحضنة الصغيرة ومرض الديدان المعالجة الخفيفة. لزيادة الكفاءة، فإنه قد يكون من الممكن استخدام المشتقات miniSOG مع ارتفاع العائد ROS هذاكما miniSOG (Q103L) على الرغم من أنها قد تزيد من تأثير الخلفية الطفرات دون علاج الخفيفة 16،17. لتعديل التركيبة الحمض النووي، و(TBB-2) البلازميد Pmex-5-HIS-72 :: miniSOG-3&#39;UTR (pCZ886) متاحة تجاريا. وفقا للشروط الموضحة هنا، يتم إنشاؤها الجينات المحورة المتكاملة على خط واحد تقريبا لكل 200 F 1 في المتوسط 4 عند استخدام سلالة المعدلة وراثيا خارج الصبغية مع معدل نقل من 10 - 30٪. ويمكن زيادة هذه الكفاءة باستخدام سلالات معدلة وراثيا خارج الصبغي مع معدلات نقل عالية كما ذكرت سابقا لطريقة الأشعة فوق البنفسجية 18. له بوساطة mSOG-الطفرات علم البصريات الوراثي تحرض الطفرات في مجموعة واسعة من الجينات. أيضا، وتواتر مواضع تعافى من الشاشة القامع دورة في الدقيقة 1 باستخدام الطفرات علم البصريات الوراثي هو مماثلة لتلك التي من نفس الشاشة باستخدام EMS 4. ومع ذلك، فمن possiبليه أن الطفرات علم البصريات الوراثي باستخدام جينة هيستون قد يكون لها انحياز بعض الجينات، وذلك بسبب عوامل غير معروفة مثل هيكل لونين. لمعالجة هذه المسألة، فمن الضروري تحليل العديد من الطفرات المستحثة optogenetically التي كتبها كامل تسلسل الجينوم. تسبب له بوساطة mSOG-الطفرات علم البصريات الوراثي طائفة واسعة من الطفرات بما في ذلك استبدال النووية المنفردة والحذف تتراوح ما بين 1 بي بي لبضع مئات من بي بي 4. الطيف من المتغيرات النووية المنفردة تشير إلى أن أنواع الاكسجين التفاعلية التي يسببها miniSOG-هي سبب الطفرات 4. ومن الممكن أيضا أن الأضرار miniSOG هيستون البروتينات ويسبب عدم الاستقرار لونين لأنه يستخدم miniSOG لتعطيل البروتينات وكذلك (19). قد يكون من الممكن لمعالجة نوع من الطفرات باستخدام ضوء كثافات مختلفة. منذ الطفرات علم البصريات الوراثي يؤدي الحذف، فإنه من المهم تحليل الحذف فضلا عن التغييرات النووية المنفردة في منظمة الصحة العالميةالبيانات جنيه تسلسل الجينوم لرسم الخرائط 20. وقد ذكرت سابقا أن يتم استخدام المجهر epifluorescent للتوسط miniSOG خلايا الاجتثاث 21،22. وقد تم قياس شدة الضوء من المجهر epifluorescent المجمع القياسي لتكون ~ 0.5 ميغاواط / مم 2 دون عدسة، وهي عبارة عن 4X أقل من تلك المستخدمة في بروتوكول قياسي الطفرات علم البصريات الوراثي. وبالتالي، فإنه من المستحسن للغاية لتحديد تجريبيا كفاءة عند استخدام المجهر برنامج التحصين الموسع الفلورسنت كمصدر ضوء. ميزة واحدة من الصمام هو الاستقرار على مدى آلاف ساعة. وقد أظهرت دراسات سابقة أن miniSOG هو أكثر فعالية في استئصال الخلايا بوساطة ROS-تحت ضوء نابض 22، على الرغم من أن الآلية الدقيقة لا تزال يحدد لاحقا. استخدمنا الرقمي وظيفة مولد / مكبر للصوت لجعل ضوء نابض. وثمة خيار آخر هو ربط مصدر الضوء إلى جهاز الكمبيوتر باستخدام واجهة USB-TTL (الشكل 1A) لتنظيم لى LEDGHT بواسطة برنامج. ويمكن أيضا أن تستخدم نظام LED الموصوفة هنا لأغراض أخرى، مثل التحكم في علم البصريات الوراثي للخلايا منفعل باستخدام channelrhodopsin 23، الاجتثاث الخلية باستخدام mitochondria- أو miniSOG 17،22 استهدفت خلية غشاء، وحامل اللون، بمساعدة ضوء التعطيل (كالي) من البروتينات 19. وعلاوة على ذلك، هذه الطفرات علم البصريات الوراثي لديه القدرة على تطبيقها على الكائنات الحية الأخرى، مثل البكتيريا والخميرة، ويطير، والزرد، فضلا عن خطوط خلايا الثدييات.

وقد استخدمت على نطاق واسع شاشات الوراثية إلى الأمام لتوليد طفرات الوراثية تعطيل العمليات البيولوجية المختلفة في الكائنات نموذج مثل ايليجانس انواع معينة (C. ايليجانس) 1. التحاليل التي أجريت على تلك المسوخ تؤدي إلى اكتشاف الجينات مهمة وظيفيا ويشير على مسارات 1،2. تقليديا، الطفرات في C. ويتحقق ايليجانس استخدام المواد الكيميائية تسبب الطفرات الوراثية، الإشعاع، أو الترانسبوزونات 2. المواد الكيميائية مثل methanesulfonate الإيثيلي (EMS) وN -ethyl- N -nitrosourea (ENU) تكون سامة للبشر؛ أشعة جاما أو الأشعة فوق البنفسجية (UV) الطفرات الإشعاع يتطلب معدات خاصة. وسلالات ينقول النشط، مثل سلالات mutator 3، يمكن أن تسبب الطفرات غير الضرورية أثناء الصيانة. لقد قمنا بتطوير مقاربة بسيطة للحث على الطفرات الوراثية باستخدام الضيائي المشفرة وراثيا-4. يمكن أن أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) الحمض النووي من التلف 5.مولد صغير القميص الأوكسجين (miniSOG) هو بروتين الفلورية الخضراء من 106 الأحماض الأمينية التي تم تصميمها من قائمة القيم (الضوء، والأكسجين، والجهد) مجال نبات الأرابيدوبسيس phototropin 2 6. عند التعرض للضوء الأزرق (~ 450 نانومتر)، miniSOG يولد ROS بما في ذلك الأكسجين القميص مع فلوريدا AVIN النوكليوتيد بمثابة العامل المساعد 6-8، التي هي موجودة في جميع الخلايا. بنينا بروتين الانصهار صاحب-mSOG عن طريق وضع علامات miniSOG إلى C-محطة من هيستون-72، وجيم ايليجانس البديل من هيستون 3. نحن إنشاء واحدة في نسخة التحوير 9 في التعبير عن رأيه، mSOG في سلالة الجرثومية من C. ايليجانس تحت ظروف التربية العادية في الظلام، والديدان المعدلة وراثيا صاحب-mSOG لها حجم الحضنة العادي والعمر الافتراضي 4. عند التعرض إلى الضوء الأزرق LED، الديدان صاحب-mSOG تنتج الطفرات الوراثية بين ذريتها 4. الطيف من الطفرات المستحثة يتضمن تغييرات النوكليوتيدات، مثل G: C إلى T: A و G: C إلى C: G، وchromoso صغيرةلي الحذف 4. هذا الإجراء الطفرات بسيط على القيام بها، ويتطلب الحد الأدنى من الإعداد سلامة المختبر. هنا، نحن تصف الإعداد إضاءة LED وإجراءات الطفرات علم البصريات الوراثي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="626">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Ultra High Power LED light source</td>
			<td style="width:71px;">Prizmatix</td>
			<td style="width:115px;">UHP-mic-LED-460</td>
			<td style="width:184px;">460 &#177; 5 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">LED controller</td>
			<td style="width:71px;">Prizmatix</td>
			<td style="width:115px;">UHPLCC-01</td>
			<td style="width:184px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:256px;">Digital function generator/amplifier</td>
			<td style="width:71px;">PASCO</td>
			<td style="width:115px;">PI-9587C</td>
			<td style="width:184px;">PI-9587C is no longer available. The replacement is PI-8127.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">BNC cable male/male</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td style="width:115px;">CA3136</td>
			<td style="width:184px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">USB-TTL interface</td>
			<td style="width:71px;">Prizmatix</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:184px;">Optional</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Photometer</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td style="width:115px;">PM50 and Model D10MM</td>
			<td style="width:184px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Filter paper</td>
			<td style="width:71px;">Whatman</td>
			<td style="width:115px;">1001-110</td>
			<td style="width:184px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:256px;">Copper chloride dihydrate (CuCl2&#8729;2H2O)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">C6641</td>
			<td style="width:184px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:71px;">Leica</td>
			<td style="width:115px;">MZ95</td>
			<td style="width:184px;"></td>
		</tr>
		<tr height="163">
			<td height="163" style="height:163px;width:256px;">NGM plate</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:184px;">Dissolve 5g NaCl, 2.5g Peptone, 20g Agar, 10 &#181;g/ml cholesterol in 1 L H2O. After autoclaving, add 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM KH2PO4(pH6.0).&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="88">
			<td height="88" style="height:88px;width:256px;">Lysis solution</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:184px;">10 mM Tris(pH8.8), 50 mM KCl, 0.1% Triton X100, 2.5 mM MgCl2, 100 &#181;g/ml Proteinase K</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic random mutagenesis using histone-minisog in c. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

أجرينا شاشة الوراثية إلى الأمام مع CZ20310 juSi164 (ED3) UNC-119 باستخدام التعرض للضوء 30 دقيقة بعد بروتوكول قياسي الموصوفة في أقسام 2 و 3. من بين 60 F 1 لوحات الموافق 120 الجينوم فرداني mutagenized، وجدنا 8 F 1 لوحات مع F 2 الديدان التي تظهر الظواهر المرئية مثل عيب حجم الجسم (الشكل 3B)، حركة غير منسقة (الشكل 3C)، والفتك الكبار (الشكل 3D). لم نلاحظ أي اختلاف في عدد من المسوخ بين &quot;DAY1&quot; وألواح &quot;DAY2&quot;. وأظهرت كل ذرية صغيرة F 2 الديدان خص وغير منسقة F 2 الديدان الظواهر المقابلة، مما يشير إلى أنها طفرات وراثية. وتتلخص المراقبة الكاملة في الجدول 2. وفي المتوسط، فإن الشاشة نسيلي مع 120 الجينوم فرداني يؤدي إلى حوالي 10 F 1 لوحات يخدعtaining الديدان مع الظواهر كشف بشكل واضح مثل شكل الجسم والحركة التي رصدت بسهولة تحت مجهر تشريحي. المزيد من التحليل الكمي ضروري لتحديد معدل التحور على وجه التحديد 4. العدد المتوقع من المسوخ وضوحا من هذه الشاشة تشير إلى أن سلالة والإعداد تعمل بشكل صحيح عن الطفرات علم البصريات الوراثي. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54810/54810fig1.jpg" /> الشكل 1: الإعداد الصمام (A) والنظام بأكمله. وقد شنت LED على حامل حسب الطلب. تم العثور على التفاصيل في قائمة المواد. يرصد (B) غطاء من البلاستيك. أنه لا يغطي النظام بشكل كامل لتجنب تراكم الحرارة. (C) وحدة تحكم وظيفة المولد. (D) في الجانب الخلفي للنظام. (E) لوحة غير المصنف مع CuCl 2 -soaked ورق الترشيح للعلاج الضوء الأزرق.<html> <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54810/54810fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54810/54810fig2.jpg" /> الشكل 2: إجراء تجريبي لشاشة نسيلي بعد العلاج الضوء الأزرق، يتم نقل ف 0 الديدان إلى لوحة المصنفة وسمح لوضع البيض. يتم نقل ف 0 الديدان جديدة لوحة المصنفة 1 د بعد العلاج الخفيفة وقتل 2 د بعد العلاج الخفيفة. وخص F 1 الديدان من ف 0 لوحات. يتم فحص الظواهر من F 2 الديدان بعد يصبحون بالغين. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54810/54810fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> 10fig3.jpg &quot;/&gt; الرقم 3: مثال من المسوخ (A) سلالة الأصلي للالطفرات علم البصريات الوراثي: CZ20310 juSi164 UNC-119 (ED3). هذه السلالة لها شكل طبيعي الجسم والسلوك، وحجم الحضنة. شريط مقياس: 0.5 مم. (B - D) F 2 ذرية تظهر حجم الجسم عيب (B)، غير منسقة (C)، وقاتلة (D) الظواهر <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54810/54810fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الجدول 1" src="/files/ftp_upload/54810/54810table1.jpg" /> الجدول 1: انماط من juSi164 وUNC-119 (ED3). <img alt="الجدول 2" src="/files/ftp_upload/54810/54810table2.jpg" /> الجدول 2: مثال من الظواهر الابام شاشة نسيلي.

Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans at JoVE.com

الطفرات العشوائية الضوئية باستخدام Histone-miniSOG في C. elegans | علم الوراثة | فيديو

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

المشفرة وراثيا هيستون-miniSOG يدفع الطفرات الوراثية الجينوم على نطاق بطريقة تعتمد الخفيفة والأزرق. هذه الطريقة الطفرات بسيطة وسريعة وخالية من المواد الكيميائية السامة، ومناسبة تماما للفحص الجيني إلى الأمام والتكامل التحوير.

علم البصريات الوراثي الطفرات عشوائية عن طريق هيستون-miniSOG في<em&gt; C. ايليجانس</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

optogenetic-random-mutagenesis-using-histone-minisog-in-c-elegans

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Genetics

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Classical and Modern Genetics

SCIENTISTS IN ACTION

9.0K Views.  University of California in San Diego and Howard Hughes Medical Institute.  المشفرة وراثيا هيستون-miniSOG يدفع الطفرات الوراثية الجينوم على نطاق بطريقة تعتمد الخفيفة والأزرق. هذه الطريقة الطفرات بسيطة وسريعة وخالية من المواد الكيميائية السامة، ومناسبة تماما للفحص الجيني إلى الأمام والتكامل التحوير. 

Video: Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.

المستهدفة<em&gt; في الموقع</em&gt; الطفرات من هيستون الجينات في مهدها الخميرة

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged as a powerful tool for gene-expression analysis and transcriptome mapping. However, handling RNA-Seq datasets requires sophisticated computational expertise and poses inherent challenges for biology researchers. This bottleneck has been mitigated by the open access Galaxy project that allows users without bioinformatics skills to analyze RNA-Seq data, and the Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery (DAVID), a Gene Ontology (GO) term analysis suite that helps derive biological meaning from large data sets. However, for first-time users and bioinformatics' amateurs, self-learning and familiarization with these platforms can be time-consuming and daunting. We describe a straightforward workflow that will help C. elegans researchers to isolate worm RNA, conduct an RNA-Seq experiment and analyze the data using Galaxy and DAVID platforms. This protocol provides stepwise instructions for using the various Galaxy modules for accessing raw NGS data, quality-control checks, alignment, and differential gene expression analysis, guiding the user with parameters at every step to generate a gene list that can be screened for enrichment of gene classes or biological processes using DAVID. Overall, we anticipate that this article will provide information to C. elegans researchers undertaking RNA-Seq experiments for the first time as well as frequent users running a small number of samples.

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Galaxy and DAVID have emerged as popular tools that allow investigators without bioinformatics training to analyze and interpret RNA-Seq data. We describe a protocol for C. elegans researchers to perform RNA-Seq experiments, access and process the dataset using Galaxy and obtain meaningful biological information from the gene lists using DAVID.

تحليل Transcriptomic من<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; ايليجانس</em&gt; RNA تسلسل البيانات من خلال جناح سهرة على مشروع غالاكسي

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged ...

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. Therefore, DNA-protein interactions regulate multiple physiological, pathophysiological, and biological functions, such as cell differentiation, cell proliferation, cell cycle control, chromosome stability, epigenetic gene regulation, and cell transformation. In eukaryotic cells, the DNA interacts with histone and nonhistone proteins and is condensed into chromatin. Several technical tools can be used to analyze DNA-protein interactions, such as the Electrophoresis (gel) Mobility Shift Assay (EMSA) and DNase I footprinting. However, these techniques analyze the protein-DNA interaction in vitro, not within the cellular context. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a technique that captures proteins at their specific DNA binding sites, thereby allowing for the identification of DNA-protein interactions within their chromatin context. It is done by fixation&#160;of the DNA-protein interaction, followed by&#160;immunoprecipitation of the protein of interest. Subsequently, the genomic site that the protein was bound to is characterized. Here, we describe and discuss ChIP and demonstrate its analytical value for the identification of the Transforming Growth Factor-&#946; (TGF-&#946;)-induced binding of the transcription factor SMAD2 to SMAD Binding Elements (SBE) within the promoter region of the tyrosine-protein kinase Kit (c-KIT) receptor ligand Stem Cell Factor (SCF).

DNA-protein interactions are essential for multiple biological processes. During the evaluation of cellular functions, the analysis of DNA-protein interactions is indispensable for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to analyze such interactions in vivo.

تحليل ج- كيت يجند المروج باستخدام الكروماتين مناعي

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Protocols for C-Brick DNA Standard Assembly Using Cpf1

CRISPR-associated protein Cpf1 cleaves double-stranded DNA under the guidance of CRISPR RNA (crRNA), generating sticky ends. Because of this characteristic, Cpf1 has been used for the establishment of a DNA assembly standard called C-Brick, which has the advantage of long recognition sites and short scars. On a standard C-Brick vector, there are four Cpf1 recognition sites &#8211; the prefix (T1 and T2 sites) and the suffix (T3 and T4 sites) &#8211; flanking biological DNA parts. The cleavage of T2 and T3 sites produces complementary sticky ends, which allow for the assembly of DNA parts with T2 and T3 sites. Meanwhile, a short &#34;GGATCC&#34; scar is generated between parts after assembly. As the newly formed plasmid once again contains the four Cpf1 cleavage sites, the method allows for the iterative assembly of DNA parts, which is similar to those of BioBrick and BglBrick standards. A procedure outlining the use of the C-Brick standard to assemble DNA parts is described here. The C-Brick standard can be widely used by scientists, graduate and undergraduate students, and even amateurs.

CRISPR-associated protein Cpf1 can be guided by a specially designed CRISPR RNA (crRNA) to cleave double-stranded DNA at desired sites, generating sticky ends. Based on this characteristic, a DNA assembly standard (C-Brick) was established, and a protocol detailing its use is described here.

بروتوكولات ل C-بريك دنا الجمعية القياسية باستخدام Cpf1

CRISPR-associated protein Cpf1 cleaves double-stranded DNA under the guidance of CRISPR RNA (crRNA), generating sticky ends. Because of this ...

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Sensory systems allow animals to detect, process, and respond to their environment. Food abundance is an environmental cue that has profound effects on animal physiology and behavior. Recently, we showed that modulation of longevity in the nematode Caenorhabditis elegans by food abundance is more complex than previously recognized. The responsiveness of the lifespan to changes in food level is determined by specific genes that act by controlling information processing within a neural circuit. Our framework combines genetic analysis, high-throughput quantitative imaging and information theory. Here, we describe how these techniques can be used to characterize any gene that has a physiological relevance to broad-range dietary restriction. Specifically, this workflow is designed to reveal how a gene of interest regulates lifespan under broad-range dietary restriction; then to establish how the expression of the gene varies with food level; and finally, to provide an unbiased quantification of the amount of information conveyed by gene expression about food abundance in the environment. When several genes are examined simultaneously under the context of a neural circuit, this workflow can uncover the coding strategy employed by the circuit.

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Here, we present a framework to relate broad-range dietary restriction to gene expression and lifespan. We describe protocols for broad-range dietary restriction and for quantitative imaging of gene expression under this paradigm. We further outline computational analyses to reveal underlying information processing features of the genetic circuits involved in food-sensing.

التحديد الكمي "المعلومات المشفرة" واسطة الجينات التعبير مستويات خلال عمر التحوير تحت نطاق واسع "الغذائية التقييد" في C. ايليجانس

Sensory systems allow animals to detect, process, and respond to their environment. Food abundance is an environmental cue that has profound effects on ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has been associated with both the progression of cancer and the development of drug resistance. Until now, it has not been feasible to easily manipulate the ploidy of a multicellular animal without generating mostly sterile progeny. Presented here is a simple and rapid protocol for generating tetraploid Caenorhabditis elegans animals from any diploid strain. This method allows the user to create a bias in chromosome segregation during meiosis, ultimately increasing ploidy in C. elegans. This strategy relies on the transient reduction of expression of the rec-8 gene to generate diploid gametes. A rec-8 mutant produces diploid gametes that can potentially produce tetraploids upon fertilization. This tractable scheme has been used to generate tetraploid strains carrying mutations and chromosome rearrangements to gain insight into chromosomal dynamics and interactions during pairing and synapsis in meiosis. This method is efficient for generating stable tetraploid strains without genetic markers, can be applied to any diploid strain, and can be used to derive triploid C. elegans. This straightforward method is useful for investigating other fundamental biological questions relevant to genome instability, gene dosage, biological scaling, extracellular signaling, adaptation to stress, development of resistance to drugs, and mechanisms of speciation.

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

This method allows for the generation of tetraploid and triploid Caenorhabditis nematodes from any diploid strain. Polyploid strains generated by this method have been used to study chromosome interactions in meiotic prophase, and this method is useful for examining important basic questions in cell, developmental, evolutionary, and cancer biology.

التلاعب في بلويدي في ايليجانس كاينورهابديتيس

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve random mutagenesis, error-prone PCR is a convenient and efficient strategy for generating a diverse pool of mutants (i.e., a mutant library). Error-prone PCR is the method of choice when a researcher seeks to mutate a pre-defined region, such as the coding region of a gene while leaving other genomic regions unaffected. After the mutant library is amplified by error-prone PCR, it must be cloned into a suitable plasmid. The size of the library generated by error-prone PCR is constrained by the efficiency of the cloning step. However, in the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, the cloning step can be replaced by the use of a highly efficient one-step fusion PCR to generate constructs for transformation. Mutants of desired phenotypes may then be selected using appropriate reporters. Here, we describe this strategy in detail, taking as an example, a reporter inserted at centromeric heterochromatin.

This article describes a detailed methodology for random mutagenesis of a target gene in fission yeast. As an example, we target rpt4+, which encodes a subunit of the 19S proteasome, and screen for mutations that destabilize heterochromatin.

استهداف الجين الطفرات العشوائية لتحديد طفرات بروتوزوم هيتيروتشروماتين-زعزعة الاستقرار في انشطار الخميرة

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been co-opted as a powerful tool for precise eukaryotic genome engineering. Here, we present a rapid and simple method using chimeric single guide RNAs (sgRNA) and CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) for the efficient and precise generation of genomic point mutations in C. elegans. We describe a pipeline for sgRNA target selection, homology-directed repair (HDR) template design, CRISPR-Cas9-RNP complexing and delivery, and a genotyping strategy that enables the robust and rapid identification of correctly edited animals. Our approach not only permits the facile generation and identification of desired genomic point mutant animals, but also facilitates the detection of other complex indel alleles in approximately 4 - 5 days with high efficiency and a reduced screening workload.

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Here, we present a method to engineer the genome of C. elegans using CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins and homology dependent repair templates.

السريع وخط أنابيب سهلة "توليد طفرات نقطة الجينوم" في C. ايليجانس باستخدام كريسبر/Cas9 "ريبونوكليوبروتينس"

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant viruses they vector. Despite numerous studies of the biology of these species in different environments, a key life history parameter, offspring sex ratios, has received little attention, yet is important for predicting population dynamics. The primary sex ratio (sex ratio at oviposition) of Bemisia tabaci has never been reported but can be found by determining the egg fertilization rate of this haplodiploid insect. The technique involves the dechorionation of eggs with bleach, a series of fixation steps, and the application of the general DNA fluorescent stain, DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole, a DNA-binding fluorescent dye), to bind to female and male pronuclei. Here, we present the technique, and an example of its application, to test whether an endosymbiotic bacterium, Rickettsia sp. nr. bellii, influenced the primary sex ratio of B. tabaci. This method may assist in population studies of whiteflies, or in determining if sex allocation exists with certain environmental stimuli.

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

We present a simple cytogenetic technique using 4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) to determine the fertilization rate and primary sex ratio of the haplodiploid invasive pest Bemisia tabaci.

تحديد "معدل إخصاب البيض" من حيث دراسة استخدام "تقنية الخلوية الوراثية"

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

This paper presents a high-throughput reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) assay for Caenorhabditis elegans that is fast, robust, and highly sensitive. This protocol obtains precise measurements of gene expression from single worms or from bulk samples. The protocol presented here provides a novel adaptation of existing methods for complementary DNA (cDNA) preparation coupled to a nanofluidic RT-qPCR platform. The first part of this protocol, named &#8216;Worm-to-CT&#8217;, allows cDNA production directly from nematodes without the need for prior mRNA isolation. It increases experimental throughput by allowing the preparation of cDNA from 96 worms in 3.5 h. The second part of the protocol uses existing nanofluidic technology to run high-throughput RT-qPCR on the cDNA. This paper evaluates two different nanofluidic chips: the first runs 96 samples and 96 targets, resulting in 9,216 reactions in approximately 1.5 days of benchwork. The second chip type consists of six 12 x 12 arrays, resulting in 864 reactions. Here, the Worm-to-CT method is demonstrated by quantifying mRNA levels of genes encoding heat shock proteins from single worms and from bulk samples. Provided is an extensive list of primers designed to amplify processed RNA for the majority of coding genes within the C. elegans genome.

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

In this article a high-throughput protocol for fast and reliable determination of gene expression levels in single or bulk C. elegans samples is described. This protocol does not require RNA isolation and produces cDNA directly from samples. It can be used together with high-throughput multiplexed nanofluidic real-time qPCR platforms.

عالية الإنتاجية الكمية RT-PCR في عينات C. c.

This paper presents a high-throughput reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) assay for Caenorhabditis elegans that is fast, robust, and highly ...