Questo lavoro è stato finanziato dalla NSF concedere IOB # 0615996.

Parte 1: Preparazione di terreni di crescita nematode (NGM) piastre Petri Nematodi sperimentali come C. elegans e P. pacificus sono tipicamente coltivate in laboratorio su 6 centimetri piastre Petri contenenti crescita media dei nematodi (NGM) 1. I worm sono mantenuti a 20 ° C, ma può essere incubate a una gamma di temperature (tra i 4 ° C - 25 ° C), a seconda della specie di nematodi e il disegno sperimentale. Per preparare piatti con NGM, tecniche standard di sterili devono essere utilizzati per prevenire la contaminazione da funghi e batteri. In seguito è il protocollo di preparare piatti NGM: <ol><li> Pesare 15 g di agar, 2,4 g NaCl, 2 g Triptone, e 2,72 g di KH 2 PO 4 in 2 beuta conica L, rendono il volume fino a 1 L con acqua, autoclave e lasciarlo raffreddare a 60 ° C a bagnomaria. </li><li> Aggiungere 0,8 ml ciascuna di 1 M CaCl 2, colesterolo (5 mg / ml in etanolo), e 1 M MgSO 4. Per prevenire la contaminazione da funghi e batteri, 1 ml di streptomicina (100 mg / ml) e nistatina 1 ml (10 mg / ml) può essere aggiunto ad ogni litro di terreno. </li><li> Utilizzando una macchina Unispense e il mantenimento di condizioni sterili, versare i media nei piatti desiderato. Le piastre devono essere riempite di circa 2 / 3 ° pieno. Un piatto standard 60 mm di diametro sono necessari circa 10 ml di media. Non spostare le piastre fino a quando l&#39;agar è completamente gelified, altrimenti ci sarà una superficie irregolare di agar, il che rende difficile mettere a fuoco i vermi sul stereomicroscopio. </li><li> Una volta essiccate, le piastre possono essere seminati immediatamente o conservato a 4 ° C fino alla semina con i batteri. </li></ol> Parte 2: Preparazione OP50 batteri e semina NGM piastre Petri P. Pacifico è coltivate in laboratorio per l&#39;alimentazione del ceppo E.coli OP50. OP50 ha una crescita limitata su piastre NGM, formando così un prato sottile che facilita la visualizzazione dei worm 1. Per crescere una cultura di OP50, utilizzare LB-brodo: <ol><li> Aggiungere 5 g bactotryptone, 2,5 g di estratto di lievito e 2,5 g di NaCl ad una bottiglia da 500 ml con tappo a vite, portare al volume di 500 ml con acqua distillata e autoclave. </li><li> Inoculare il brodo con una singola colonia di OP50 dalla piastra di coltura in condizioni di sterilità e lasciarlo crescere overnight a 37 ° C. </li><li> LB-OP50 è pronto per essere utilizzato e può essere conservato a 4 ° C per diversi mesi se la sterilità è mantenuta. Ogni volta che le piastre devono essere testa di serie, versare una piccola quantità di brodo in un bicchiere piccolo sterile e questo aiuterà a prevenire la contaminazione della coltura madre. </li><li> A piastre semi, dispensare 100-120 microlitri della OP50 sul diametro 60 mm NGM Petri e scuotere per diffonderla. </li><li> Incubare le piastre seminate durante la notte a temperatura ambiente per il prato a crescere. Queste piastre seminate ora può essere conservato a 4 ° C per un massimo di 3 settimane. Memorizzandoli in una posizione invertita aiuta a prevenire la rapida essiccazione. </li></ol> Parte 3: Esecuzione di un pick In questa sezione viene descritto come fare un pick per i vermi. Il prelievo è utilizzato per trasferire i vermi da una posizione all&#39;altra. Il prelievo è composto da 30 calibro 90% filo di platino iridio 10%, anche se alcuni ricercatori potrebbero preferire composizioni di metallo leggermente diversa: <ol><li> Tagliare circa 3-4 cm di filo, posto 0,5 cm dentro la punta di una pipetta Pasteur (la cui punta era rotto a una lunghezza più piccola), e poi sigillare nel bicchiere sopra un becco Bunsen. La lunghezza del filo che sporge dal vetro è di circa 3-3,5 cm, ma può variare a seconda delle preferenze individuali. </li><li> Appiattire la fine del filo che è sporgente con un martello o una pinza. Poi piegare verso l&#39;alto parte appiattito a formare uno scoop. </li><li> Levigare gli spigoli del pick con una carta vetrata per evitare di danneggiare il verme o l&#39;agar. </li></ol> Parte 4: vermi Picking <ol><li> Per scegliere i vermi, sterilizzare il filo di platino a fuoco e trascinare la punta appiattita del pick lungo il prato batterica a cappotto con la punta spessa batteri appiccicoso, facendo attenzione a non forare o danneggiare la superficie agar. </li><li> Utilizzando lo stereomicroscopio, molto leggermente pennello la punta appiccicosa contro i vermi verme / essere ritirati fino al worm attacca al batteri sulla scelta. </li><li> Una volta che il worm è sulla punta del plettro, trasferirlo immediatamente alla nuova piastra toccando o scorrere la punta del plettro contro il prato batterica della nuova piastra, e il worm dovrebbe strisciare fuori. Bisogna fare attenzione a non danneggiare la superficie di agar sul piatto altrimenti i vermi strisciare nei fori rendendo difficile recuperarli. Se il worm rimane sul prendere per troppo tempo, potrebbe essiccare. </li></ol> Parte 5: EMS mutagenesi Solfonato metano etile (EMS) induce un ampio spettro di mutazioni nel genoma del 2. Mutanti possono essere identificati da difetti, come la deposizione delle uova, dei difetti muscolaris, la determinazione del sesso, la formazione dauer, il comportamento e la formazione delle gonadi. Il protocollo per EMS mutagenesi è simile a quello descritto per C. elegans 1. <ol><li> Preparare 500 ml (o più) di NaOH 1N. </li><li> Prendere 4-5, 6 cm di diametro piastre Petri pieno di vermi, contenente poche centinaia di vermi al terzo larvale giovanile (J3) stadio e lavare via i vermi utilizzando 2-3 ml di M9 sterile per piastra. </li><li> Raccogliere tutti i vermi in un contenitore sterile, monouso 15 ml di tubo di centrifuga. Centrifugare a 1500 xg per 5-7 minuti o fino a quando i vermi forma una pallina. </li><li> Aspirare il liquido e l&#39;uso 2 ml di M9 per risospendere i vermi. Aggiungere 20 l EMS in una provetta contenente 2 ml di M9 e agitare per dissolverlo. Aggiungere questa soluzione EMS al 2 ml di sospensione a vite senza fine e miscelare delicatamente. La concentrazione finale di EMS sarà 47 mm. Attenzione: EMS è un agente mutageno molto forte e devono essere trattati in una cappa aspirante. Tutto il materiale (guanti, pipette, puntali) che entrano in contatto con questo mutagene devono essere trattati con NaOH 1N a inattivo SME. Indossare i guanti doppio durante l&#39;intera procedura di mutagenesi EMS. Smaltire i rifiuti pericolosi secondo le direttive del tuo istituto. </li><li> Posizionare la provetta e coprire il tappo con parafilm; posto orizzontalmente nella cappa e lasciare che il worm incubare per 3,5 ore. Il tubo può essere posizionato su una sedia a dondolo a bassa velocità. </li><li> Ruotare il tubo e coprire il tappo con parafilm, posto in posizione verticale e incubare fino al lavandino vermi. </li><li> Aspirare il supernatante ed eliminarlo in un bicchiere / pallone contenente NaOH 1N. Questo inattivare la SME. </li><li> Aggiungere 5 ml M9 per i vermi, invertire il tubo di 25-30 volte per lavare i vermi, centrifugare a 1500 xg per 5-7 minuti o fino a quando i vermi forma una pallina. Aspirare il supernatante ed eliminarlo nel becher NaOH 1N. </li><li> Ripetere la fase di lavaggio almeno 3 volte. </li><li> Dopo l&#39;ultimo lavaggio, risospendere il worm pellet in quantità minima (~ 500 microlitri) di M9 e pipetta fuori su piastre NGM contenente un prato di OP50 batteri. A questo punto non hai più bisogno di lavorare nella cappa chimica. </li><li> Lasciate asciugare il liquido per qualche minuto e poi raccogliere e trasferire sano cercando J4 larve di nuove piastre seminato. Scartare la piastra originale secondo le linee guida rifiuti pericolosi del tuo istituto. </li><li> Lasciate l&#39;auto mutagenizzate vermi fertilizzare. Utilizzando uno stereomicroscopio, schermo i fenotipi generazione F2 per mutanti recessivi di interesse. </li></ol> Parte 6: Psoralen mutagenesi In questa sezione sono descritte le procedure per mutagenesi utilizzando TMP in collaborazione con lunghezza d&#39;onda ultraviolette (UV). TMP / UV metodo di mutagenesi è ampiamente usato per indurre mutazioni per delezione all&#39;interno di un genoma 3. <ol><li> Raccogliere i vermi 4-5, 6 piastre di Petri cm di diametro in una provetta da 15 ml per centrifuga, come descritto nella procedura precedente. </li><li> Aggiungere 10 ml di M9, capovolgere 20 volte per lavare i vermi, e centrifugare a 1500 xg per 5 minuti. Eliminare il surnatante e ripetere il lavaggio per un totale di 3 volte. Aspirare il liquido e risospendere i vermi in circa 10 volte il loro volume di M9 contenente 30 mg / ml di TMP. Pipettare 20 ml di TMP (3 mg / ml) in 2 ml di M9. Come lo SME, TMP è un potente cancerogeno e devono essere trattati adottando misure di sicurezza adeguate. Per prevenire dal rischio potenziale della giusta luce UV occhio indossa dovrebbe essere usato. Il monouso devono essere eliminati in sacchetti di corretta rischio biologico. </li><li> Incubare la provetta al buio per 15 minuti a temperatura ambiente su una sedia a dondolo a bassa velocità (40 UPM). La camera d&#39;aria verticalmente coperto per 10 minuti per consentire tutte le lavandino vermi. </li><li> Togliere i vermi dal fondo della provetta con una pipetta Pasteur e trasferirli su un piatto NGM testa di serie. Scartare il sopranatante seguenti linee guida chimici pericolosi del tuo istituto. </li><li> Mantenere la piastra nel buio fino a quando la TMP in eccesso viene assorbito nel piatto. </li><li> Utilizzando un misuratore di raggi UV di intensità, impostare la distanza tra la sorgente di raggi UV onda lunga e la piastra in modo tale che l&#39;intensità sul piatto è di 500 μW / cm 2 4. Togliere il coperchio in alluminio e il coperchio e coprire ed esporre la piastra contenente i vermi TMP trattati per le radiazioni UV a onda lunga per 50 secondi. </li><li> Coprire e lasciare i vermi al buio per 5 ore a temperatura ambiente. </li><li> Raccogliere e trasferire sano cercando J4 larve di nuove piastre seminato. Scartare la piastra originale seguenti linee guida chimici pericolosi del tuo istituto. </li><li> Utilizzando uno stereomicroscopio, schermo i fenotipi generazione F2 per la mutazione di interesse. </li></ol> Parte 7: Risultati Rappresentante Alcuni dei P. pacificus fenotipi mutanti derivanti dalla mutagenesi (sia da EMS o TMP / UV) sono mostrati in figura 1. Ogni mutante ha un fenotipo caratteristica che è facilmente distinguibile dal tipo di animale selvatico. Dal wormche sono stati trattati con il mutageno, 30 J3/J4 larve della generazione dei genitori (P0) sono stati collocati in piatti separati e il permesso di deporre le uova, che sono la generazione F1. Dalle piastre che ha mostrato sana progenie F1, per un totale di 1000 F1S sono stati trasferiti su piatti individuali e la progenie F2 è stato proiettato per i fenotipi. Gli animali con Dumpy 5,6, 6 e non coordinate trasformatore 7 fenotipi sono stati trovati. <img src="/files/ftp_upload/2293/2293fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Pristionchus tipo pacificus selvatici e animali mutanti. A. wt ermafrodita B. peso maschile C. DPY mutante D. unc mutante E. TRA mutante. Prime due pannelli che mostrano selvatici tipo ermafrodita (a sinistra) e maschile (a destra) gli animali da confrontare con i mutanti differenti nei pannelli rimanenti.

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	<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genetics. 77 (1), 71-71 (1974).</li><li>Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods Cell Biol. 48, 31-31 (1995).</li><li>Yandell, M. D., Edgar, L. G., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (4), 1381-1381 (1994).</li><li>Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WormBook. , 1-1 (2005).</li><li>Kenning, C., Kipping, I., Sommer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J. Genesis. 40 (3), 176-176 (2004).</li><li>Sommer, R. J., Carta, L. K., Kim, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fundamental and Applied Nematology. 19 (6), 511-511 (1996).</li><li>Pires-daSilva, A., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genes &#38; development. 18 (10), 1198-1198 (2004).</li><li>Wei, A., Yuan, A., Fawcett, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nucleic acids research. 30 (20), 110-110 (2002).</li><li>Jorgensen, E. M., Mango, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nat Rev Genet. 3 (5), 356-356 (2002).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Mutagenesi è una tecnica ampiamente utilizzata per gli studi genetici in diversi organismi modello sperimentale. Esperimenti di mutagenesi sono spesso utilizzati per identificare la funzione di un gene 2. Le procedure di mutagenesi qui descritto può essere utilizzato non solo per P. Pacifico, ma anche per la C. elegans ed altre specie di nematodi correlati. Qui si descrivono due metodi, EMS e TMP / UV mutagenesi. EMS è una sostanza chimica che induce mutazioni puntiformi o piccole delezioni in tutto il genoma 3,8. Psoralen mutagenesi (TMP / UV) induce la maggior parte mutazioni per delezione nel DNA a causa di possibili rotture indotte dalla luce UV. I frammenti di eliminazione sono tipicamente nel range compreso fra 0,10 e 15 kb di lunghezza 3. Siamo sottoposti a screening per fenotipi che sono relativamente comuni da trovare. In una schermata con EMS, per ogni 400 lastre con gli animali F2, circa un piatto ha avuto un DPY, Unc o Tra. DPY può essere riconosciuto per le sue dimensioni più brevi 7, Unc per i suoi movimenti anomali Tra 6 e per avere un fenotipo maschile e un cariotipo XX 7. TMP / UV mutagenesi ha una frequenza più bassa di generare mutanti rispetto a EMS 3, ma genera più le eliminazioni. Per i nematodi, la larva in ritardo quarta fase o giovane adulto è la fase più efficace di sviluppo di effettuare mutagenesi perché hanno il massimo numero di nuclei della linea germinale. E &#39;quindi utile iniziare l&#39;esperimento con una popolazione sincronizzato dei genitori con molte larve di quarto stadio. Un modo semplice di fare le culture sincronizzato è facendo nuove culture con le uova invece di vermi adulti. Nella generazione successiva, più vermi sarà circa la stessa età. Mutazioni recessive può essere rilevato controllando la progenie di individui F1, che producono circa il 25 per cento di omozigoti. La potenza di schermi genetica nei nematodi può essere ulteriormente sfruttato modificando il disegno dello schermo 9. La combinazione di stile di vita ermafroditi e tempo di generazione rapida nematodi rende ideale per gli studi di genetica.

an introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis

Questo protocollo descrive le procedure per mantenere nematodi in laboratorio e come mutagenize utilizzando due metodi alternativi: metano solfonato etilico (EMS) e 4, 5 &#39;, 8-trimethylpsoralen combinata con la luce ultravioletta (TMP / UV). I nematodi sono potenti sistemi biologici per gli studi di genetica a causa del loro piano di corpo semplice e il sistema di accoppiamento, che è composto di auto-fertilizzazione ermafroditi e maschi in grado di generare centinaia di progenie per animale. I nematodi sono mantenuti in piastre di agar contenente un prato di batteri e può essere facilmente trasferito da un piatto all&#39;altro con un plettro. EMS è un agente alchilante comunemente usato per indurre mutazioni puntiformi e piccole delezioni, mentre TMP / UV induce soprattutto le eliminazioni. A seconda della specie di nematode usato, le concentrazioni di EMS e TMP dovrà essere ottimizzato. Per isolare mutazioni recessive del pacificus nematode Pristionchus, gli animali della generazione F2 erano visivamente sottoposti a screening per fenotipi. Per illustrare questi metodi, abbiamo mutagenizzate worm e cercato non coordinate (Unc), Dumpy (DPY) e trasformatore (Tra) mutanti.

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An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

Screening per mutanti con difetti fenotipici è un metodo semplice per identificare i geni che funzionano in un dato processo biologico. In questo articolo descrivono come i vermi che vivono la cultura libera (ad esempio,<em&gt; Pristionchus pacificus</em&gt;) In laboratorio e mostrano due differenti metodi di mutagenesi, EMS e TMP / UV.

Introduzione al Laboratorio Worm: da Worms coltura a mutagenesi

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane ...

an-introduction-to-worm-lab-from-culturing-worms-to-mutagenesis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

34.3K Views.  University of Texas at Arlington. Screening per mutanti con difetti fenotipici è un metodo semplice per identificare i geni che funzionano in un dato processo biologico. In questo articolo descrivono come i vermi che vivono la cultura libera (ad esempio, Pristionchus pacificus) In laboratorio e mostrano due differenti metodi di mutagenesi, EMS e TMP / UV.

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Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the field of environmental health. This is due in part to the paucity of model systems that can (1) accurately recapitulate keys features of reproductive processes and (2) do so in a medium- to high-throughput fashion, without the need for a high number of vertebrate animals.
We describe here an assay in the nematode C. elegans that allows the rapid identification of germline toxicants by monitoring the induction of aneuploid embryos. By making use of a GFP reporter line, errors in chromosome segregation resulting from germline disruption are easily visualized and quantified by automated fluorescence microscopy. Thus the screening of a particular set of compounds for its toxicity can be performed in a 96- to 384-well plate format in a matter of days. Secondary analysis of positive hits can be performed to determine whether the chromosome abnormalities originated from meiotic disruption or from early embryonic chromosome segregation errors. Altogether, this assay represents a fast first-pass strategy for the rapid assessment of germline dysfunction following chemical exposure.

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

Valutazione completa della linea germinale Chemical Tossicità Utilizzando il nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

Optogenetic caso Mutagenesi Utilizzando istone-miniSOG in<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Genetica

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the intestine the primary location for disease. The nematode intestine structurally and functionally mimics mammalian intestines and is transparent making it amenable to microscopic study of colonization. Here we show that pathogens can cause disease and death. We are able to identify microbial mutants that show altered virulence. Its conserved innate response to biotic stresses makes C. elegans an excellent system to probe facets of host innate immune interactions. We show that hosts with mutations in the dual oxidase gene cannot produce reactive oxygen species and are unable to resist microbial insult. We further demonstrate the versatility of the presented survival assay by showing that it can be used to study the effects of inhibitors of microbial growth. This assay may also be used to discover fungal virulence factors as targets for the development of novel antifungal agents, as well as provide an opportunity to further uncover host-microbe interactions. The design of this assay lends itself well to high throughput whole-genome screens, while the ability to cryo-preserve worms for future use makes it a cost-effective and attractive whole animal model to study.

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Here, we present the nematode Caenorhabditis elegans as a versatile host model to study microbial interaction.

Il Nematode Caenorhabditis Elegans - un modello Versatile In Vivo per studiare le interazioni ospite-microbo

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants

Information about toxicities of chemicals are essential in their application and waste management. For chemicals at low concentrations, the long-term effects are very important in judging their consequences in the environment and on human health. In demonstrating long-term influences, effects of chemicals over generations in recent studies provide new insight. Here, we describe protocols for studying effects of chemicals over multiple generations using free-living nematode Caenorhabditis elegans. Two aspects are presented: (1) trans-generational (TG) and (2) multi-generational effect studies, the latter of which is separated to multi-generational exposure (MGE) and multi-generational residual (MGR) effect studies. The TG effect study is robust with a simple purpose to determine whether chemical exposure to parents can result in any residual consequences on offspring. After the effects are measured on parents, sodium hypochlorite solutions are used to kill the parents and keep the offspring so as to facilitate effect measurement on the offspring. The TG effect study is used to determine whether the offspring are affected when their parent is exposed to the pollutants. The MGE and MGR effect study is systematical used to determine whether continuous generational exposure can result in adaptive responses in offspring over generations. Careful pick-up and transfer are used to distinguish generations to facilitate effect measurement on each generation. We also combined protocols to measure locomotion behavior, reproduction, lifespan, biochemical and gene expression changes. Some example experiments are also presented to illustrate the trans- and multi-generational effect studies.

Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants

Trans- and multi-generational effects of persistent chemicals are essential in judging their long-term consequences in the environment and on the human health. We provide novel detailed methods for studying trans- and multi-generational effects using free-living nematode Caenorhabditis elegans.

Utilizzo di Caenorhabditis elegans per studiare gli effetti trans e multigenerazionali dei tossici

Information about toxicities of chemicals are essential in their application and waste management. For chemicals at low concentrations, the long-term ...

Ambiente

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media (mCeHR). Additionally, the steps for exposing and acclimatizing C. elegans grown on E. coli to axenic liquid media are described. Finally, downstream experiments that utilize axenic C. elegans illustrate the benefits of this procedure. The ability to analyze and determine C. elegans&#160;nutrient requirement was illustrated by growing N2 wild type worms in axenic liquid media with varying heme concentrations. This procedure can be replicated with other nutrients to determine the optimal concentration for worm growth and development or, to determine the toxicological effects of drug treatments. The effects of varied heme concentrations on the growth of wild type worms were determined through qualitative microscopic observation and by quantitating the number of worms that grew in each heme concentration. In addition, the effect of varied nutrient concentrations can be assayed by utilizing worms that express fluorescent sensors that respond to changes in the nutrient of interest. Furthermore, a large number of worms were easily produced for the generation of transgenic C. elegans using microparticle bombardment.

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

C. elegans is usually grown on solid agar plates or in liquid cultures seeded with E. coli. To prevent bacterial byproducts from confounding toxicological and nutritional studies, we utilized an axenic liquid medium, CeHR, to grow and synchronize a large number of worms for a range of downstream applications.

Culturing<em&gt; Caenorhabditis elegans</em &gt; In axeniche Liquid Media e la creazione di transgeniche Worms da microparticelle Bombardamento

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

Biologia

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

Un Screenable<em&gt; In Vivo</em&gt; Saggio per mitocondriale modulatori Uso Transgenic Bioluminescent<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather than individual worm samples to quantify bacterial load in this organism. Here it is argued that the large inter-individual variability seen in bacterial colonization of the C. elegans intestine is informative, and that batch digest methods discard information that is important for accurate comparison across conditions. As describing the variation inherent to these samples requires large numbers of individuals, a convenient 96-well plate protocol for disruption and colony plating of individual worms is established.

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

This protocol describes a 96-well disruption of individual bacterially colonized Caenorhabditis elegans following cold paralysis and surface bleaching&#160;to remove external bacteria. The resulting suspension is plated on agar plates to allow accurate, medium-throughput quantification of bacterial load in large numbers of individual worms.

Utilizzo di dati single-worm per quantificare l'eterogeneità nelle interazioni caenorhabditis elegans-batteriche

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather ...

Compost Microcosms as Microbially Diverse, Natural-like Environments for Microbiome Research in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is emerging as a useful model for studying the molecular mechanisms underlying interactions between hosts and their gut microbiomes. While experiments with well-characterized bacteria or defined bacterial communities can facilitate the analysis of molecular mechanisms, studying nematodes in their natural microbial context is essential for exploring the diversity of such mechanisms. At the same time, the isolation of worms from the wild is not always feasible, and, even when possible, sampling from the wild restricts the use of the genetic toolkit otherwise available for C. elegans research. The following protocol describes a method for microbiome studies utilizing compost microcosms for the in-lab&#160;growth in microbially diverse and natural-like environments.
Locally sourced soil can be enriched with produce to diversify the microbial communities in which worms are raised and from which they are harvested, washed, and surface-sterilized for subsequent analyses. Representative experiments demonstrate the ability to modulate the microbial community in a common soil by enriching it with different produce and further demonstrate that worms raised in these distinct environments assemble similar gut microbiomes distinct from their respective environments, supporting the notion of a species-specific core gut microbiome. Overall, compost microcosms provide natural-like in-lab environments for microbiome research as an alternative to synthetic microbial communities or to the isolation of wild nematodes.

Compost Microcosms as Microbially Diverse, Natural-like Environments for Microbiome Research in Caenorhabditis elegans

Compost microcosms bring the microbial diversity found in nature into the laboratory to facilitate microbiome research in Caenorhabditis elegans. Provided here are protocols for setting up microcosm experiments, with the experiments demonstrating the ability to modulate environmental microbial diversity to explore the relationships between environmental microbial diversity and worm gut microbiome composition.

Microcosmi di compost come ambienti microbicamente diversi e simili a quelli naturali per la ricerca sul microbioma in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is emerging as a useful model for studying the molecular mechanisms underlying interactions between hosts and their ...

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Caenorhabditis elegans are widely used to study aging biology. The standard practice in C. elegans aging studies is to culture groups of worms on solid nematode growth media (NGM), allowing the efficient collection of population-level data for survival and other physiological phenotypes, and periodic sampling of subpopulations for fluorescent biomarker quantification. Limitations to this approach are the inability to (1) follow individual worms over time to develop age trajectories for phenotypes of interest and (2) monitor fluorescent biomarkers directly in the context of the culture environment. Alternative culture approaches use liquid culture or microfluidics to monitor individual animals over time, in some cases including fluorescence quantification, with the tradeoff that the culture environment is contextually distinct from solid NGM. The WorMotel is a previously described microfabricated multi-well device for culturing isolated worms on solid NGM. Each worm is maintained in a well containing solid NGM surrounded by a moat filled with copper sulfate, a contact repellent for C. elegans, allowing longitudinal monitoring of individual animals. We find copper sulfate insufficient to prevent worms from fleeing when subjected to aversive interventions common in aging research, including dietary restriction, pathogenic bacteria, and chemical agents that induce cellular stress. The multi-well devices are also molded from polydimethylsiloxane, which produces high background artifacts in fluorescence imaging. This protocol describes a new approach for culturing isolated roundworms on solid NGM using commercially available polystyrene microtrays, originally designed for human leukocyte antigen (HLA) typing, allowing the measurement of survival, physiological phenotypes, and fluorescence across the lifespan. A palmitic acid barrier prevents worms from fleeing, even in the presence of aversive conditions. Each plate can culture up to 96 animals and easily adapts to a variety of conditions, including dietary restriction, RNAi, and chemical additives, and is compatible with automated systems for collecting lifespan and activity data.

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Here, we present a protocol to culture isolated individual nematodes on solid media for lifelong physiological parameter tracking and fluorescence quantification. This culture system includes a palmitic acid barrier around single-worm wells to prevent animals from fleeing, allowing the use of aversive interventions, including pathogenic bacteria and chemical stressors.

Coltura a lungo termine di singoli Caenorhabditis elegans su terreni solidi per il monitoraggio longitudinale della fluorescenza e interventi avversivi

Caenorhabditis elegans are widely used to study aging biology. The standard practice in C. elegans aging studies is to culture groups of worms on solid ...

Single Worm PCR: A Method to Extract and Amplify Genomic DNA

Source: Prior, H., et al. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/57518/a-rapid-facile-pipeline-for-generating-genomic-point-mutants-c">A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in&#160;C. elegans&#160;Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2018).
This video describes a technique to rapidly screen a single nematode for a genetic marker by PCR screening. In the example protocol, we screen for CRISPR-based genome editing.

Introduzione al Laboratorio Worm: da Worms coltura a mutagenesi

Riepilogo

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Valutazione completa della linea germinale Chemical Tossicità Utilizzando il nematode

Optogenetic caso Mutagenesi Utilizzando istone-miniSOG in

Il Nematode Caenorhabditis Elegans - un modello Versatile In Vivo per studiare le interazioni ospite-microbo

Utilizzo di Caenorhabditis elegans per studiare gli effetti trans e multigenerazionali dei tossici

Culturing

Un Screenable

Utilizzo di dati single-worm per quantificare l'eterogeneità nelle interazioni caenorhabditis elegans-batteriche

Microcosmi di compost come ambienti microbicamente diversi e simili a quelli naturali per la ricerca sul microbioma in Caenorhabditis elegans

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PCR a verme singolo: un metodo per estrarre e amplificare il DNA genomico