CQS receives a fellowship from the LOEWE Excellence Cluster for Integrative Fungal Research (IPF). The author would like to thank Ida J. van der Klei for the P. chrysogenum strains used in this work and Andreas S. Reichert for the gift of rapamycin.

1. Preparazione di P. chrysogenum per gli esperimenti da fame <ol><li> Se la P. chrysogenum ceppo di interessi è tenuto il riso (&#39;riso verde&#39;), posizionare 2-3 chicchi di riso ricoperti di sporulanti micelio in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Riempire con 500 microlitri YGG (10 g / l KCl, 20 g / l di glucosio, 10 g / l di lievito base di azoto, 5 g / l K 2 HPO 4 estratto di lievito, 20 g / l). <ol><li> Agitare la provetta per 30 sec in modo che le spore possano staccarsi dal riso efficiente. </li><li> Incubare la provetta per 1 giorno a temperatura ambiente (per esempio, tra 20 e 25 ° C). </li><li> Preparare una diluizione 1/50 di questa sospensione di spore in acqua di rubinetto sterile, mescolare bene. </li></ol></li><li> Se la P. chrysogenum ceppo di interesse è mantenuto su una piastra di agar (ad esempio, piastra di agar YGG), trasferire piccoli pezzi di micelio in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga contenente 400 ml di acqua di rubinetto sterile e circa 100 mg glperline culo utilizzando uno stuzzicadenti sterile o punta della pipetta. <ol><li> Vortex la provetta per 2 minuti in modo che il micelio diventa frammentata. Utilizzare immediatamente il contenuto della provetta. </li></ol></li></ol> 2. Operazioni preliminari per la frutticoltura di P. chrysogenum su Pads Starvation <ol><li> Accendere una piastra di riscaldamento e impostarla a circa 60 ° C. </li><li> Sciogliere 2 g di agarosio in 100 ml acqua di rubinetto con la cottura la soluzione in un forno a microonde. Fate attenzione che questa soluzione è del tutto chiaro dopo il riscaldamento. Se non lo è, cuocere di nuovo fino a quando l&#39;agarosio è sciolto completamente. Sia la soluzione di agarosio raffreddare a circa 60 ° C prima dell&#39;uso. </li><li> Riempire 1,5 ml provette da microcentrifuga (2-4, a seconda del numero di campioni) con 400 microlitri di acqua di rubinetto (non sterile ciascuno composti addizionali aggiunti) o 400-x microlitri (aggiunta di x ml di soluzione del composto nella fase 2.5) e collocarli sulla piastra di riscaldamento per almeno 1 minuto in modo che il Water all&#39;interno si riscalda. </li><li> Inserire vetrini contenenti una cavità centrale sulla piastra di riscaldamento per almeno 1 min. </li><li> Aggiungere 400 microlitri 2% agarosio alla soluzione in 1,5 ml provette da microcentrifuga e vortice brevemente. Dopo questo passo se lo si desidera, aggiungere ulteriori composti (ad esempio, 1 micron rapamicina). Se questo è fatto, vortex brevemente dopo ogni sostanza aggiuntiva è pipettato al tubo. Mettere i tubi di nuovo sul tavolo di riscaldamento per evitare la solidificazione prematura. NOTA: Il volume totale della provetta deve essere di 800 ml. </li></ol> 3. Preparazione di micropreparati contenenti Pads Starvation <ol><li> Pipettare 140 ml di soluzione di agarosio nella cavità del vetrino da microscopio (che si trova ancora sulla piastra di riscaldamento). Cercate di evitare di fare le bolle, se possibile. </li><li> Mettere immediatamente un vetrino sul soluzione di agarosio. NOTA: Questo si tradurrà in una superficie piana. </li><li> Mettere il microportata vetrino sul banco di laboratorio per circa 4 minuti per consentire al pad agarosio solidificare. </li><li> Rimuovere con attenzione il vetrino dal pad agarosio sfilandolo con l&#39;aiuto di un pollice o indice (indossare guanti per evitare la contaminazione!). </li><li> Posizionare il vetrino con il pad in una camera bagnato per evitare l&#39;essiccamento. Raccomandazione: utilizzare una scatola vuota punta che ha ancora l&#39;inserto per tenere le punte delle pipette. Aggiungere acqua sterile alla casella in modo che il fondo è coperto. Collocare i vetrini sull&#39;inserto e chiudere la finestra. </li></ol> 4. inoculo dei pad da fame con P. chrysogenum e incubazione <ol><li> Pipettare 5 ml di diluizione 1/50 spore (se le colture sono state coltivate su riso) o 5 ml della soluzione diluita contenente frammenti micelio (se le colture sono state coltivate su una piastra di agar) sul centro del pad inedia. </li><li> Chiudere la camera umida e avvolgerlo in una busta di plastica (questo serve comeprotezione aggiuntiva contro essiccazione dei tamponi fame). Fare attenzione a non spostare la casella di troppo perché altrimenti saranno disturbati le gocce di inoculazione. </li><li> Conservare la scatola avvolta a temperatura ambiente per almeno 20 ore prima di analizzare i campioni. </li></ol> 5. microscopica analisi dei campioni <ol><li> Dopo 20 ore di incubazione i campioni sono pronti per l&#39;analisi al microscopio; mettere il vetrino su carta velina asciutta (fondo tende a diventare bagnato). </li><li> Pipettare una piccola quantità di acqua (circa 50 ml) sul pad fame. Mettere un coprioggetto sul pad e spremere l&#39;acqua in eccesso. Rimuovere l&#39;acqua in eccesso con un fazzolettino di carta. </li><li> Mettere il vetrino sul tavolo di osservazione del microscopio a fluorescenza. Per avere una panoramica di crescita micelio, utilizzare un obiettivo 20X. Obiettivi Utilizzare 63x o 100X per studiare la localizzazione di GFP in ife. Al fine di prevenire il graduale essiccamento del campione non analizzare i campioni perpiù di 15 minuti prima di rimetterli nella camera umida. </li><li> Ripetere 5.3 a intervalli regolari (ad esempio, dopo 40 ore e 60 ore di crescita). NOTA: Il campione può essere rimesso nella camera umida. Non è necessario rimuovere il coprioggetto quanto non influenza la crescita del micelio. </li></ol>

<ol>
	<li>Fischer, F., Hamann, A., Osiewacz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+quality+control:+an+integrated+network+of+pathways.">Mitochondrial quality control: an integrated network of pathways.</a> Trends Biochem. Sci. 37 (7), 284-292 (2012).</li><li>Pollack, J. K., Harris, S. D., Marten, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+filamentous+fungi.">Autophagy in filamentous fungi.</a> Fungal Genet. Biol. 46 (1), 1-8 (2009).</li><li>Scheckhuber, C. Q., Osiewacz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podospora+anserina:+a+model+organism+to+study+mechanisms+of+healthy+ageing.">Podospora anserina: a model organism to study mechanisms of healthy ageing.</a> Mol. Genet. Genomics. 280 (5), 365-374 (2008).</li><li>Pinan-Lucarr&#233;, B., Iraqui, I., Clav&#233;, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podospora+anserina+target+of+rapamycin.">Podospora anserina target of rapamycin.</a> Curr. Genet. 50 (1), 23-31 (2006).</li><li>Kikuma, T., Ohneda, M., Arioka, M., Kitamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+the+ATG8+homologue+Aoatg8+and+role+of+autophagy+in+differentiation+and+germination+in+Aspergillus+oryzae.">Functional analysis of the ATG8 homologue Aoatg8 and role of autophagy in differentiation and germination in Aspergillus oryzae.</a> Eukaryot. Cell. 5 (8), 1328-1336 (2006).</li><li>Pinan-Lucarr&#233;, B., Balguerie, A., Clav&#233;, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+cell+death+in+Podospora+autophagy+mutants.">Accelerated cell death in Podospora autophagy mutants.</a> Eukaryot. Cell. 4 (11), 1765-1774 (2005).</li><li>Veneault-Fourrey, C., Barooah, M., Egan, M., Wakley, G., Talbot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagic+fungal+cell+death+is+necessary+for+infection+by+the+rice+blast+fungus.">Autophagic fungal cell death is necessary for infection by the rice blast fungus.</a> Science. 312 (5773), 580-583 (2006).</li><li>Bartoszewska, M., Kiel, J. A., Bovenberg, R. A., Veenhuis, M., van der Klei, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+deficiency+promotes+beta-lactam+production+in+Penicillium+chrysogenum.">Autophagy deficiency promotes beta-lactam production in Penicillium chrysogenum.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77 (4), 1413-1422 (2011).</li><li>Meijer, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomes+are+required+for+efficient+penicillin+biosynthesis+in+Penicillium+chrysogenum.">Peroxisomes are required for efficient penicillin biosynthesis in Penicillium chrysogenum.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (17), 5702-5709 (2010).</li><li>Cubitt, A. B., Heim, R., Adams, S. R., Boyd, A. E., Gross, L. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding,+improving+and+using+green+fluorescent+proteins.">Understanding, improving and using green fluorescent proteins.</a> Trends Biochem. Sci. 20 (11), 448-455 (1995).</li><li>Jung, C. H., Ro, S. H., Cao, J., Otto, N. M., Kim, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+regulation+of+autophagy.">mTOR regulation of autophagy.</a> FEBS Lett. 584 (7), 1287-1295 (2010).</li><li>Hickey, P. C., Read, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+living+cells+of+Aspergillus+in+vitro.">Imaging living cells of Aspergillus in vitro.</a> Med. Mycol. 47, S110-S119 (2009).</li></ol>

The author has nothing to disclose.

Il metodo qui presentato permette lo studio comoda e riproducibile dell&#39;autofagia in P. chrysogenum. Ad esempio, può essere utilizzata per lo screening l&#39;efficacia di vari composti che siano in grado di modulare la risposta autofagia di questo fungo o meno. I risultati con rapamicina dimostrano che l&#39;inibizione di segnalazione TOR conduce ad una induzione pronunciato dell&#39;autofagia in P. chrysogenum che è stato dimostrato anche per altri organismi 11. È possibile utilizzare miceli cresciuti su cuscinetti fame per analisi in microscopi più sofisticati (ad esempio, microscopi confocali scansione laser). Non importa se il campione è messo sotto l&#39;obiettivo di cui sopra dell&#39;obiettivo (microscopio invertito). Varie proteine ​​fluorescenti mirati a determinati comparti possono essere utilizzati per monitorare il destino di diversi organelli durante autofagia (ad esempio, i mitocondri -&gt; mitophagy; r endoplasmaticoeticulum -&gt; ER-phagy, ecc.). In sintesi, la tecnica qui descritta estende lo spettro di metodi per studiare microscopicamente funghi 12. Il protocollo è generalmente semplice e facile da usare. Tuttavia, è molto importante che le pastiglie fame mai essiccare quanto ciò provocherà artefatti e morte cellulare. Pertanto si suggerisce fortemente che (i) i vetrini contenenti la soluzione di agarosio ancora liquido vengono rimosse immediatamente dalla piastra di riscaldamento (passo 3.3), (ii) che il vetrino per rendere una superficie piana viene rimosso dal pad inedia dopo massimo di 5 min (punti 3.3 e 3.4), (iii) che il vetrino viene sempre mantenuta nella camera umida quando non analizzato (passi 3.5 e 5.4) e (iv) che l&#39;analisi microscopica non richiede più di 15 min (step 5.3). Un altro aspetto importante è che l&#39;importo di base di spore o frammenti miceliari pipettati sul pad fame non dovrebbe essere troppo alto otroppo bassa. Questo può essere facilmente controllato mediante diluizione del titolo utilizzando acqua di rubinetto sterile. La diluizione 1/50 descritto in 1.1.3 funziona bene per P. chrysogenum sospensioni di spore. E &#39;la diluizione raccomandata per l&#39;uso con i nostri funghi, ma potrebbe richiedere qualche aggiustamento. Una limitazione del metodo è che non è consigliabile per esperimenti di imaging time-lapse per più di 15 min. Ciò è dovuto al graduale essiccazione del pad inedia una volta rimosso dalla camera umida. Se sono necessari tempi di osservazione più lunghi è possibile aggiungere piccole quantità di acqua di rubinetto sterile frangia del pad inedia sebbene ciò non impedisce alcune essiccazione in regioni centrali pad. Un&#39;altra limitazione è che il metodo non è strettamente quantitativo. Negli organismi unicellulari è possibile segnare eventi per cella (ad esempio, la quantità di cellule contenenti GFP nel vacuolo). Al contrario, P. chrysogenum come fungo filamentoso è caratterizzato da un&#39;architettura multicellulare. Le cellule sono divise da setti che contengono un poro centrale che permette il passaggio del citoplasma e organelli. Quindi i campioni possono essere analizzati soltanto &#39;semi quantitativamente&#39; (ad esempio, il numero di ife contenente GFP localizzato a vacuoli). Per raggiungere significatività è molto importante che il numero di ife analizzato è sufficientemente elevata (almeno 80 per punto di tempo e condizione verificata ma più definitivamente preferibile). L&#39;utilizzo di pastiglie fame per studiare l&#39;autofagia può essere facilmente adattato per l&#39;uso in altri funghi filamentosi. Pertanto, il protocollo presentato qui non è solo limitato a P. chrysogenum. Dovrebbe anche essere possibile adattare per con funghi unicellulari, cioè lieviti. Trasferimento del protocollo di organismi superiori (ad esempio, nematodi) probabilmente richiede adattamenti più specializzati. Sarà interessante vedere se il metodo descritto in questo lavoro trova ancheil suo uso in altri campi.

Funghi filamentosi sono ottimi sistemi modello per lo studio dei processi di sviluppo. Essi offrono diversi vantaggi sperimentali come la coltivazione a basso costo, un numero elevato di progenie e accessibilità genetica. L&#39;ultimo punto è di particolare rilevanza per la costruzione di trasformanti che permettono di indagare l&#39;importanza dei geni so-far non caratterizzate per diversi meccanismi cellulari. Funghi filamentosi sono stati strumentali per la delucidazione di diversi elementi e meccanismi di controllo della qualità vie cellulari come attività della proteasi per la degradazione delle proteine ​​aberranti, dinamiche mitocondriali per mantenere l&#39;integrità mitocondriale e autophagy per la rimozione di eccedenza e / o componenti cellulari disfunzionali e per mantenere vitalità cellulare in tempi di fame 1,2,3. Ci sono diverse tecniche sperimentali disponibili per lo studio dell&#39;autofagia in filamentose funghi 2: (i) ricerca di vacuoli if contengono organismi autofagiche densi quando proteasi sono inibiti mediante microscopia elettronica a trasmissione 4, (ii) visualizzazione di autophagosomes monitorando GFP-Atg8 foci tramite microscopia a fluorescenza 5,6 e (iii) il rilevamento di strutture autophagosomal acidificati utilizzando il colorante fluorescente monodansyl cadaverina 7. Qui, un nuovo metodo di coltivazione Penicillium chrysogenum per studi autofagia è presentato. L&#39;elemento principale è il &#39;pad fame&#39; che consiste semplicemente di 1% agarosio disciolto in acqua di rubinetto sterilizzata. Composti aggiuntive (ad esempio, stress, spazzini, modulatori autofagia) possono essere aggiunti al pad fino a quando non visualizzano auto-fluorescenza. Il pad si trova in vetrini contenenti una cavità centrale superficiale. Questo pad in inoculati sia con una sospensione di spore o con piccoli frammenti di micelio. Quest&#39;ultimo è consigliabile se il ceppo di interesse non sporulate in modo efficiente (ad esempio, i ceppi atg1 Δ 8). I vetrini sono posizionati in camere umide (questi possono essere facilmente costruiti utilizzando scatole di tip pipetta vuote) per prevenire l&#39;essiccamento del campione e incubate a temperatura ambiente. P. chrysogenum è in grado di crescere per alcuni giorni in queste condizioni. L&#39;autofagia può essere osservato al microscopio dall&#39;allargamento vacuolar che è un indicatore positivo per autofagia fungine. In questo contributo, una P. chrysogenum ceppo (Wisconsin 54-1255) viene utilizzato, che costituisce la proteina fluorescente verde, che si rivolge a perossisomi per la sua sequenza di 9 C-terminale &#39;SKL&#39;. Pertanto è possibile monitorare la degradazione dei perossisomi. E &#39;fattibile etichettare anche altri compartimenti della cellula (ad esempio, mitocondri) utilizzando segnali di localizzazione appropriati ed analizzare la loro degradazione. Anche se i dati di P. chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL) è presentato qui, è certamente possibileper utilizzare il metodo &#39;pad fame&#39; anche per altri funghi filamentosi (es Neurospora crassa, Sordaria macrospora, specie di Aspergillus, etc.).

<table><tbody><tr><td>Microscope slides with central cavity</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany</td><td>H884.1</td><td>These can be used multiple times after cleaning.</td></tr><tr><td>Glass beads</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany</td><td>A553.1</td><td>Diameter: 0.25 - 0.50 mm</td></tr></tbody></table>

analysis of autophagy in penicillium chrysogenum by using starvation pads in combination with fluorescence microscopy

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells possess several lines of defense against damage to biologically relevant molecules like nucleic acids, lipids and proteins. In addition to organelle dynamics (fusion/fission/motility/inheritance) and tightly controlled protease activity, the degradation of surplus, damaged or compromised organelles by autophagy (cellular &#8216;self-eating&#8217;) has received much attention from the scientific community. The regulation of autophagy is quite complex and depends on genetic and environmental factors, many of which have so far not been elucidated. Here a novel method is presented that allows the convenient study of autophagy in the filamentous fungus Penicillium chrysogenum. It is based on growth of the fungus on so-called &#8216;starvation pads&#8217; for stimulation of autophagy in a reproducible manner. Samples are directly assayed by microscopy and evaluated for autophagy induction / progress. The protocol presented here is not limited for use with P. chrysogenum and can be easily adapted for use in other filamentous fungi.

Per dimostrare l&#39;utilità del protocollo sopra descritto degrado perossisoma nel P. chrysogenum ceppo Ws54-1255 (GFP-SKL) è stato analizzato. In questo ceppo GFP-SKL è di solito importato in perossisomi 9. Ciò provoca la comparsa di molteplici forme sferiche quando il campione viene analizzato tramite microscopia a fluorescenza. Se si verifica l&#39;autofagia, vacuoli ingrandire. GFP-SKL viene incorporato nel vacuoli da autofagia (pexophagy). A causa del fatto che la GFP è resistente alla degradazione da proteasi vacuolo essa etichetta questi organelli 10. Pertanto, i due parametri per l&#39;osservazione autofagia (pexophagy) in questo ceppo, l&#39;allargamento vacuoli e localizzazione di GFP-SKL di vacuoli, sono opportunamente monitorate al microscopio a fluorescenza. A 20 ore di incubazione, GFP è mai osservata in vacuoli (Figura 1). Inoltre, l&#39;allargamento vacuolo non sta avvenendo. Tuttavia, a 40 ore di crescita vacuoli GFP-etichettatadiventare visibile in alcune delle ife, indicando autofagia (pexophagy) di attivazione (Figura 1). A 60 ore di crescita della quantità di vacuoli GFP-marcato è ulteriormente aumentata. Come controllo negativo un atg1 mutante Δ di P. chrysogenum è stato utilizzato (Δ atg1 (GFP-SKL)) (Figura 2). Né vacuoli allargata né GFP-etichettata possono essere osservati in questo ceppo. Come controllo positivo, il farmaco rapamicina-autofagia stimolante viene utilizzato (Figura 3). Dopo 40 ore di crescita vacuoli GFP-etichettata diventano visibili. A 60 ore, le ife sono completamente pieni di enormi vacuoli-GFP contenenti (Figura 3). Questa scoperta indica che, come previsto, massiccio autofagia si svolge qui. Collettivamente, questi risultati dimostrano la validità del set-up sperimentale. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52577/52577fig1highres.jpg" /> <strong&gt; Figura 1:. Localizzazione di GFP-SKL in Ws54-1255 (GFP-SKL) durante la coltivazione in pastiglie da fame ai tempi indicati, culture cresciute sui rilievi da fame sono stati analizzati utilizzando la microscopia a fluorescenza. Immagini rappresentative sono indicati per ogni punto di tempo. Corrispondenti aree di campo luminose sono mostrati ogni immagine del canale di fluorescenza di seguito. White &quot;v&quot;: GFP-SKL localizzato a vacuoli che indicano il degrado dei perossisomi. Barre di scala: 10 micron. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52577/52577fig2highres.jpg" /> Figura 2:. Localizzazione di GFP-SKL a Δ atg1 (GFP-SKL) durante la coltivazione in pastiglie da fame ai tempi indicati, culture cresciute sui rilievi da fame sono stati analizzati utilizzando la microscopia a fluorescenza. Immagini rappresentative sono indicati per ogni punto di tempo. Corrispondente zone di campo luminose sono riportati di seguito ogni fluorescenzaimmagine del canale. Barre di scala: 10 micron. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52577/52577fig3highres.jpg" /> Figura 3:. Localizzazione di GFP-SKL in Ws54-1255 (GFP-SKL) trattati con rapamicina per l&#39;induzione di autofagia ai tempi indicati culture cresciute sui rilievi fame integrate con 1 mM rapamicina sono stati analizzati usando la microscopia a fluorescenza. Immagini rappresentative sono indicati per ogni punto di tempo. Corrispondenti aree di campo luminose sono mostrati ogni immagine del canale di fluorescenza di seguito. White &quot;v&quot;: GFP-SKL localizzato a vacuoli che indicano il degrado dei perossisomi. Barre di scala: 10 micron.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.

Analisi di autofagia in<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Utilizzando Starvation Pads in combinazione con microscopia a fluorescenza

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

analysis-autophagy-penicillium-chrysogenum-using-starvation-pads

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

8.5K Views.  Senckenberg Research Institute. A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.

Video: Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is provided to induce sepsis of varying severity in mice using the CLP technique. Autophagy is a fundamental tissue response to stress and pathogen invasion. Two current protocols to assess autophagy in vivo in the context of experimental sepsis are also presented here. (I) Transgenic mice expressing green fluorescence protein (GFP)-LC3 fusion protein are subjected to CLP. Localized enhancement of GFP signal (puncta), as assayed either by immunohistochemical or confocal assays, can be used to detect enhanced autophagosome formation and, thus, altered activation of the autophagy pathway. (II) Enhanced autophagic vacuole (autophagosome) formation per unit tissue area (as a marker of autophagy stimulation) can be quantified using electron microscopy. The study of autophagic responses to sepsis is a critical component of understanding the mechanisms by which tissues respond to infection. Research findings in this area may ultimately contribute towards understanding the pathogenesis of sepsis, which represents a major problem in critical care medicine.

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method. Current protocols to assess autophagy in vivo in the context of CLP-induced sepsis are presented here: A protocol for measuring autophagy using (GFP)-LC3 mice, and a protocol for measuring autophagosome formation by electron microscopy.

Cecal legatura e la puntura indotta da sepsi come modello per studiare autofagia nei topi

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Un saggio microscopia a fluorescenza per Mitophagy monitoraggio nel lievito Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Biologia

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal dysfunction and loss. Fluorescence-based imaging tools and technologies enable unprecedented analysis of subcellular neurobiological processes, yet there is still a need for unbiased, reproducible, and accessible approaches for extracting quantifiable data from imaging studies. We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-based imaging studies using Drosophila models of neurodegeneration. Specifically, we describe an easy-to-follow, semi-automated approach using Fiji/ImageJ to analyze two cellular processes: first, we quantify protein aggregate content and profile in the Drosophila optic lobe using fluorescent-tagged mutant huntingtin proteins; and second, we assess autophagy-lysosome flux in the Drosophila visual system with ratiometric-based quantification of a tandem fluorescent reporter of autophagy. Importantly, the protocol outlined here includes a semi-automated segmentation step to ensure all fluorescent structures are analyzed to minimize selection bias and to increase resolution of subtle comparisons. This approach can be extended for the analysis of other cell biological structures and processes implicated in neurodegeneration, such as proteinaceous puncta (stress granules and synaptic complexes), as well as membrane-bound compartments (mitochondria and membrane trafficking vesicles). This method provides a standardized, yet adaptable reference point for image analysis and quantification, and could facilitate reliability and reproducibility across the field, and ultimately enhance mechanistic understanding of neurodegeneration.

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-imaging-based cell biological studies of protein aggregation and autophagic flux in the central nervous system of Drosophila models of neurodegeneration.

Biologia cellulare quantitativa della neurodegenerazione in Drosophila attraverso analisi imparziale delle proteine fluorescente contrassegnate usando ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

Neuroscienze

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

Analisi quantitativa di autofagia usando 3D avanzato microscopia a fluorescenza

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

Imaging cellulare dal vivo dei primi autofagia Eventi: Omegasomes e oltre

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via the lysosome and are recycled. During autophagy, cytoplasmic LC3 protein is lipidated and recruited to the autophagosomal membranes. The autophagosome then fuses with the lysosome to form the autolysosome, where the breakdown of the autophagosome vesicle and its contents occurs. The ubiquitin-associated protein p62, which binds to LC3, is also used to monitor autophagic flux. Cells undergoing autophagy should demonstrate the co-localization of p62, LC3, and lysosomal markers. Immunofluorescence microscopy has been used to visually identify LC3 puncta, p62, and/or lysosomes on a per-cell basis. However, an objective and statistically rigorous assessment can be difficult to obtain. To overcome these problems, multispectral imaging flow cytometry was used along with an analytical feature that compares the bright detail images from three autophagy markers (LC3, p62 and lysosomal LAMP1) and quantifies their co-localization, in combination with LC3 spot counting to measure autophagy in an objective, quantitative, and statistically robust manner.

Here, multispectral imaging flow cytometry with an analytical feature that compares bright detail images of 3 autophagy markers and quantifies their co-localization, along with LC3 spot counting, was used to measure autophagy in an objective, quantitative, and statistically robust manner.

Valutare il flusso autofagico misurando LC3, p62 e LAMP1 Co-localizzazione usando la citometria del flusso di imaging multispettrale

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. The majority of cellular activities require physical interactions between proteins. To analyze and map these interactions, various experimental techniques as well as bioinformatics tools were developed. Autophagy is a cellular recycling mechanism that allows the cells to cope with different stressors, including nutrient deprivation, chemicals, and hypoxia. In order to better understand autophagy-related signaling events and to discover novel factors that regulate protein complexes in autophagy, we performed protein-protein interaction screens. Validation of these screening results requires the use of immunofluorescence and immunoprecipitation techniques. In this system, specific autophagy-related protein-protein interactions that we discovered were tested in Neuro2A (N2A) and HEK293T cell lines. Details of the technical procedures used are explained in this visualized experiment paper.

Presented here are two antibody-based protein-protein interaction research techniques: immunofluorescence and immunoprecipitation. These techniques are suitable for studying physical interactions between proteins for the discovery of novel components of cellular signaling pathways and for understanding protein dynamics.

Studio delle interazioni proteina-proteina nella ricerca di autofagia

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

Esame della dinamica nucleare del lievito di fissione mitotico e meiotico da fluorescenza microscopia a celle vive

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two decades ago and since then continues to contribute greatly to our understanding of the filamentous fungal lifestyle. This paper provides a practical guide for the utilization of the two membrane dyes FM 1-43 and FM 4-64 and the four cell wall stains Calcofluor White M2R, Solophenyl Flavine 7GFE 500, Pontamine Fast Scarlet 48 and Congo Red. The focus is on their low-dose application to ascertain artefact-free staining, their co-imaging properties, and their quantitative evaluation. The presented methods are applicable to all filamentous fungal samples that can be prepared in the described ways. The fundamental staining approaches can serve as starting points for adaptations to species that might require different cultivation conditions. First, biophysical and biochemical properties are reviewed as their understanding is essential for using these dyes as truly vital fluorescent stains. Secondly, step-by-step protocols are presented that detail the preparation of various fungal sample types for fluorescent live-cell imaging. Finally, example experiments illustrate different approaches to: (1) identify defects in the spatio-temporal organization of endocytosis in genetic mutants, (2) comparatively characterize shared and distinct co-localization of GFP-labeled target proteins in the endocytic pathway, (3) identify morphogenetic cell wall defects in a genetic mutant, and (4) monitor cell wall biogenesis in real time.

Vital fluorescent dyes are essential tools for live-cell imaging analyses in modern fungal cell biology. This paper details the application of established and lesser-known fluorescent dyes for tracking plasma membrane dynamics, endo-/exocytosis and cell wall morphogenesis in filamentous fungi.

Applicazione di coloranti fluorescenti selettivi a membrana e a parete cellulare per l'imaging a celle vive di Filamentous Fungi

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two ...

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

Autophagy is a cellular self-digestion process. It delivers cargo to the lysosomes for degradation in response to various stresses, including starvation. The malfunction of autophagy is associated with aging and multiple human diseases. The autophagy machinery is highly conserved-from yeast to humans.&#160;The larval fat body of Drosophila melanogaster, an analog for vertebrate liver and adipose tissue, provides a unique model for monitoring autophagy in vivo. Autophagy can be easily induced by nutrient starvation in the larval fat body. Most autophagy-related genes are conserved in Drosophila. Many transgenic fly strains expressing tagged autophagy markers have been developed, which facilitates the monitoring of different steps in the autophagy process. The clonal analysis enables a close comparison of autophagy markers in cells with different genotypes in the same piece of tissue. The current protocol details procedures for (1) generating somatic clones in the larval fat body, (2) inducing autophagy via amino acid starvation, and (3) dissecting the larval fat body, aiming to create a model for analyzing differences in autophagy using an autophagosome marker (GFP-Atg8a) and clonal analysis.

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

The present protocol describes the induction of autophagy in the Drosophila melanogaster larval fat body via nutrient depletion and analyzes changes in autophagy using transgenic fly strains.

Analisi dell'autofagia indotta dalla fame nel corpo grasso larvale di Drosophila melanogaster

Autophagy is a cellular self-digestion process. It delivers cargo to the lysosomes for degradation in response to various stresses, including starvation. ...

Analisi di autofagia in

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video