Gli autori desiderano ringraziare Brogan Guest, Michelle Weaver, e Kristen Lippert. Il finanziamento per questo studio sono state fornite dal NIH Grant R03EB009237, così come le borse di formazione NIH T32EB001026-06 dal National Institute of Biomedical Imaging e Bioingegneria e T32HL076124-05.

1. Preparazione di tessuto ed esperimento di installazione <ol><li> Harvest organo suina immediatamente dopo l&#39;eutanasia da un impianto di macellazione o di ricerca e risciacquare sangue in eccesso. Tagliare il cuore di grasso in eccesso e tessuto, mantenendo gli atri e aorta intatto. Tagliare via il grasso per separare l&#39;arteria polmonare dall&#39;aorta. Se ci sono dei tagli nel tessuto, eliminare in modo appropriato. </li><li> Avvolgere ogni cuore singolarmente in carta freezer e memorizzare tutti i tessuti in un congelatore a -80 ° C per almeno 24 ore per garantire congelamento completo. </li><li> Quando si è pronti per l&#39;uso (di solito meno di 3 mesi), scongelare un cuore intatto suino congelato di tipo 1 acqua per una notte immersi in un bicchiere 4 L a 4 ° C. </li><li> Dopo che il cuore è completamente scongelato, accarezzare il cuore arido, pesare il cuore, e registrare il peso. Il cuore di un maiale del peso di mercato dovrebbe pesare circa 375-450 g. </li><li> Collegare taglia 18 tubo Masterflex alla fine ¼ &quot;di un riduttore spinato. Inserire il riduttore spinato etubo dentro l&#39;aorta. Luogo 2 fascette o fascette sicure in tutto il aorta, appena sotto il tronco brachiocefalico. Il riduttore e la tubazione deve rimanere al di sopra della valvola aortica, così le arterie coronarie possono essere perfuso (Figura 1). </li><li> Utilizzare una siringa da 30 o 60 ml per riempire il tubo con acqua di tipo I. Inserire il tubo all&#39;interno della cartuccia di una pompa a rulli Masterflex nel suo punto medio approssimativo. Immergere l&#39;estremità del tubo di afflusso nel fondo di un bicchiere 4 L riempito con 2,5 L di acqua e fissare il tubo. </li><li> Posizionare il cuore nel becher riempito con acqua, e adescare la pompa per rimuovere le bolle d&#39;aria. Se si osservano bolle proveniente dalla aorta dove è inserito il tubo, l&#39;aorta può essere necessario riposizionare o fissato con legami aggiuntivi. Una chiusura ermetica è importante per mantenere la pressione necessaria durante il processo di decellularizzazione (Figura 2). </li><li> Posizionare i 4 becher contenente L 3 L di un 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN3 soluzione sul piatto mescolare e riscaldare a 37 ° C, in preparazione del processo di decellularizzazione. </li></ol> 2. Tissue Risciacqui <ol><li> Impostare la pompa ad una portata di 400 ml / min, assicurando che la misura del tubo sia selezionata. Lavare il cuore di tipo I acqua per 15-25 minuti. Poiché la pompa viene avviata, il cuore deve gonfiarsi e effonderà sangue dai ventricoli. Soluzione fresca dovrebbe essere sostituito ogni 5-10 minuti, o quando necessario sulla base della quantità di sangue prelevato dal cuore. Se il sangue non è effuso dal cuore, regolare il tubo e morsetti sufficiente. </li><li> Arrestare la pompa e trasferire il cuore in un becher separato riempito di 2X Phosphate Buffered Saline (PBS). Dopo il tubo viene immerso in soluzione, avviare la pompa e aumentare il flusso di 700 ml / min. Il cuore dovrebbe rimanere in soluzione per 15 minuti, cambiando la soluzione ogni 5 min. Ogni cambiamento soluzione richiede la pompa da arrestare temporaneamente mentre il tessuto e il tubo viene spostatonel becher nuovo. </li><li> Trasferire il cuore di tipo I di acqua per 10 min e aumentare il flusso di 750 ml / min. </li></ol> 3. Decellularizzazione e soluzione di perfusione <ol><li> Trasferire il cuore nel becher contenente 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN 3 a 37 ° C. Aumentare la velocità della pompa a 1.200 ml / min e avviare la pompa. Utilizzare un agitatore posizionato sul fondo del bicchiere per far circolare la soluzione nel becher. Il cuore deve rimanere nella Trypsin/0.05% 0,2% EDTA/0.05% NaN 3 soluzione a 37 ° C per un totale di tre ore. Dopo 1 h, aumentare la velocità della pompa a 1.500 ml / min. Dopo un&#39;altra ora, aumentare la velocità della pompa a 1800 ml / min. Il tessuto è sottoposto a lenta velocità di perfusione aumento alla condizione del tessuto e prevenire la rottura dei vasi. Il cuore si gonfiano e quasi raddoppia durante questa fase del protocollo. Il tessuto perderà il suo colore naturale, procedendo dagli atri ai all&#39;apice tutto °e protocollo (Figura 3). </li><li> Dopo ogni soluzione di perfusione, in due fasi di risciacquo viene eseguita per rimuovere i detriti cellulari, residui chimici, e lisi cellulare aiuto. Ogni lavaggio è costituito da un risciacquo 10 min in acqua di tipo I seguita da 10 min risciacquo con soluzione 2X PBS a temperatura ambiente. Ogni lavaggio consiste nella rimozione della soluzione dal recipiente originale, aggiungere soluzioni di risciacquo, e la circolazione del perfusato nel becher contenente il cuore sommerso. Dopo il 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN 3 soluzione, acqua profumato a 1.900 ml / min e quindi perfondere 2X PBS a 1950 ml / min. </li><li> Trasferire il cuore ad una soluzione di 3% Triton X-100/0.05% EDTA/0.05% NaN 3 a temperatura ambiente. Aumentare la velocità della pompa a 2.000 ml / min e profumato soluzione per un&#39;ora. Rimuovere la soluzione dal bicchiere e sostituire con soluzione fresca, aumentare la velocità della pompa a 2100 ml / min, e perfondere la soluzione fresca per un&#39;altra ora e mezzo, portando il tempo totale in3% Triton X-100/0.05% EDTA/0.05% NaN 3-2,5 ore. </li><li> Risciacquare il tessuto in acqua di tipo I a 2150 ml / min e 2X PBS a 2180 ml / min per 10 min. </li><li> Trasferire il cuore di una soluzione di sodio desossicolato 4% a temperatura ambiente. Aumentare la velocità della pompa a 2200 ml / min e profumato soluzione per 3 ore. </li><li> Risciacquare il tessuto in acqua a tipo I e 2X PBS a 2.200 ml / min per 15 min ciascuna, cambiando le soluzioni dopo 5-10 minuti per ogni soluzione. Le fasi di perfusione descritti possono essere suddivisi su più giorni eseguendo la fase di lavaggio due volte e memorizzazione del cuore con tubo attaccato notte a 4 ° C e sommersa in acqua Tipo I. </li><li> Il giorno seguente, eseguire un 5 min risciacquo con acqua di tipo I a 750 ml / min, seguito da un risciacquo 5 min in 1X PBS a 1.500 ml / min. Il protocollo può essere continuato con la portata descritto nella soluzione adeguata. </li></ol> 4. Disinfezione e trattamento finale <ol><li> Trasferire il cuore ad un Perac 0,1%ETIC acido / soluzione di etanolo al 4% e la soluzione profumato per 1,5 ore a 2.200 ml / min. </li><li> I risciacqui finali per i tessuti sono tutti eseguiti in 2.200 ml / min. Perfondere il tessuto con 1X PBS per 15 minuti, seguito da due lavaggi 5 min in acqua di tipo I. Questa serie di risciacqui viene ripetuta ancora una volta, per completare la procedura di perfusione soluzione. </li><li> Spegnere la pompa e rimuovere il cuore da soluzione di scendere al cuore. Tagliare i legami della aorta, rimuovere tutti i tubi, e posizionare il cuore in un bicchiere vuoto a sgocciolare per 1 ora. Liquido in eccesso deve essere svuotato periodicamente. Gettare il cuore su un cuscinetto assorbente per drenare completamente il cuore (Figura 4). </li><li> Dopo la maggior parte dell&#39;acqua viene rimossa, registrare il peso della matrice extracellulare cardiaca (C-ECM). Il cuore può aspettare di perdere circa il 20-25% del suo peso iniziale durante il processo di decellularizzazione. </li><li> Sezionare i ventricoli destro e sinistro, così come il setto ventricolare per DNA quantificatie il trattamento istologico per confermare decellularizzazione completa del tessuto (Figura 5). </li><li> Congelare il C-ECM a -80 ° C per almeno 2 ore prima della liofilizzazione. </li></ol>

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	<li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+and+orthotopic+transplantation+of+a+bioartificial+lung.">Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung.</a> Nat. Med. 16, 927-933 (2010).</li><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat. Med. , (2008).</li><li>Petersen, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+lungs+for+in+vivo+implantation.">Tissue-engineered lungs for in vivo implantation.</a> Science. 329, 538-541 (2010).</li><li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix.">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nat. Med. , (2010).</li><li>Wainwright, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+cardiac+extracellular+matrix+from+an+intact+porcine+heart.">Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 16, 525-532 (2010).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).</li><li>Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+tissue+and+organ+decellularization.">Strategies for tissue and organ decellularization.</a> Journal of cellular biochemistry. , (2012).</li><li>Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+tissues+and+organs.">Decellularization of tissues and organs.</a> Biomaterials. 27, 3675-3683 (2006).</li><li>Akhyari, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quest+for+an+optimized+protocol+for+whole-heart+decellularization:+a+comparison+of+three+popular+and+a+novel+decellularization+technique+and+their+diverse+effects+on+crucial+extracellular+matrix+qualities.">The quest for an optimized protocol for whole-heart decellularization: a comparison of three popular and a novel decellularization technique and their diverse effects on crucial extracellular matrix qualities.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 17, 915-926 (2011).</li><li>Weymann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+perfusion+decellularization+porcine+heart+model--generation+of+3-dimensional+myocardial+neoscaffolds.">Development and evaluation of a perfusion decellularization porcine heart model--generation of 3-dimensional myocardial neoscaffolds.</a> Circulation journal : official journal of the Japanese Circulation Society. 75, 852-860 (2011).</li><li>Cortiella, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+acellular+natural+lung+matrix+on+murine+embryonic+stem+cell+differentiation+and+tissue+formation.">Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 2565-2580 (1089).</li><li>Remlinger, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrated+xenogeneic+decellularized+tracheal+matrix+as+a+scaffold+for+tracheal+reconstruction.">Hydrated xenogeneic decellularized tracheal matrix as a scaffold for tracheal reconstruction.</a> Biomaterials. 31, 3520-3526 (2010).</li><li>Sellaro, T. L., Ravindra, A. K., Stolz, D. B., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+hepatic+sinusoidal+endothelial+cell+phenotype+in+vitro+using+organ-specific+extracellular+matrix+scaffolds.">Maintenance of hepatic sinusoidal endothelial cell phenotype in vitro using organ-specific extracellular matrix scaffolds.</a> Tissue Eng. 13, 2301-2310 (2007).</li><li>Wainwright, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Right+ventricular+outflow+tract+repair+with+a+cardiac+biologic+scaffold.">Right ventricular outflow tract repair with a cardiac biologic scaffold.</a> Cells, tissues, organs. 195, 159-170 (2012).</li></ol>

Il dottor Gilbert era sul Scientific Advisory Board a Acell, Inc. mentre lo studio era stato fatto, e recentemente è diventato il VP di Ricerca e Sviluppo. Acell, Inc. vende matrice della vescica urinaria e non ha alcun interesse commerciale in questo studio.

Lo studio attuale metodologia descritta per decellularizzazione coerente ed efficace di un cuore suino. Il protocollo era una modifica a un precedentemente pubblicato con il rapporto 1, e comprendeva più l&#39;esposizione al flusso e aumento della pressione, che ha fornito risultati più ripetibili. Il tessuto risultante decellularizzato soddisfatto tutti i criteri pubblicati per decellularizzazione successo del tessuto 2. Soluzione cambia frequenti sono stati eseguiti per limitare la reintroduzione di materiale cellulare al tessuto, e la durata di esposizione a ciascun agente decellularizzazione stato minimizzato per ridurre gli effetti negativi sulla ECM. Durante le fasi iniziali del protocollo, il tasso di perfusione è stata gradualmente aumentata per condizionare il tessuto e consentire portate superiori durante le fasi successive del protocollo. Senza condizionamento del tessuto nelle fasi iniziali, la vascolarizzazione del cuore possono rompersi, rendendo la perfusione del cuore impossibile. Il protocol è stato usato per la sua efficacia, e non sono fornite indicazioni per la sua superiorità sugli altri protocolli. L&#39;esatta composizione di agenti decellularizzazione e dei tassi di perfusione possono ragionevolmente essere variata per ottenere un protocollo con migliori caratteristiche meccaniche o biologiche, ma i principi generali per la consegna degli agenti al cuore sono applicabili. La conservazione del nativo struttura tridimensionale del cuore è stata attribuita a diverse procedure eseguite durante il protocollo decellularizzazione. Primo, il tessuto è stato tagliato e congelato all&#39;arrivo. Congelamento promosso lisi cellulare ed era importante per pre-condizionamento del tessuto per i cicli di perfusione. Il tessuto è stato completamente ispezionato per tagli e 2 cm intatta aorta intatto superiori alla valvola aortica. Se qualsiasi pericardio o epicardio è stato tagliato, l&#39;organo è stato scartato perché il perfusato non ha raggiunto regioni a valle del cuore, e il cuore non è stato completamente decellularizzato.Successivamente, il tessuto è stato completamente scongelato tipo I in acqua prima dell&#39;uso. L&#39;acqua ha permesso il tessuto di rilassarsi come scongelati e favorito anche la rimozione di coaguli di sangue residui all&#39;interno del cuore. Infine, poiché il tubo è inserito, si è fatto in modo che la valvola aortica rimasta intatta in modo da formare una tenuta stagna attorno al tubo, in modo che una corretta pressione è stata mantenuta e che la soluzione immesso le arterie coronarie. Dopo ogni protocollo decellularizzazione stata completata, una serie di misure di controllo della qualità sono stati completati per assicurare la completa rimozione di materiale cellulare. Il presente studio ha verificato che il protocollo di colorazione istologica eliminato per nuclei delle cellule, ha mostrato che meno di 50 ng di DNA era presente per mg di peso secco del tessuto, e che qualsiasi DNA era meno di 200 bp in dimensione 6. Metodi precedentemente pubblicati per decellularizzazione cardiaca ha mostrato livelli simili di decellularizzazione in colorazione del DNA e la quantificazione2,5,9,10. Decellularizzazione completa è stata compiuta in questi studi con trattamenti simili di enzimi e detergenti. Tuttavia, nel presente studio, la durata di esposizione ad ogni sostanza chimica è stata aumentata, c&#39;erano soluzione cambia più, e le portate sono state aumentate. Il protocollo presente anche aumentato la lunghezza dei risciacqui chimiche, potenzialmente portando a più efficace rimozione dei residui chimici dalla matrice extracellulare. Recellularization di cuori di ratto decellularizzato cardiache con cellule specifiche ha dato risultati promettenti in vitro 2,5. Intero decellularizzazione perfusione dell&#39;organo consentito mantenimento del sistema vascolare nativa, che è fondamentale in recellularization del tessuto. I fattori di crescita intrinseci, proteine ​​della matrice e architettura tridimensionale di fibre anche promosso attaccamento proprio cellulare, la migrazione, e alla segnalazione di ricostituire il tessuto contrattile del miocardio. Suini cardiaca extracellularelar matrice sarà più difficile recellularize a causa delle dimensioni del ponteggio e il numero di cellule necessarie per la corretta comunicazione cellulare e trasporto dei nutrienti. Tuttavia, patch tagliati dalla matrice cardiaca può essere utile per applicazioni in vivo. Diversi studi hanno dimostrato il potenziale vantaggio di utilizzare un sito-specifica matrice per la ricostruzione dei tessuti danneggiati in modelli animali 11-13. Così, una matrice extracellulare scaffold derivati ​​da tessuto cardiaco è desiderabile per applicazioni ricostruzione miocardio. L&#39;architettura intrinseca del tessuto cardiaco può presentare vantaggi rispetto ad un ponteggio ECM derivato da un altro organo o un biomateriale artificiale. Un sito-specifica impalcatura può supportare cellula ospite infiltrazione e promuovere una risposta costruttiva rimodellamento, al contrario di formazione di tessuto cicatriziale. Ad oggi, cardiaci patch ECM sono stati studiati in vivo per ricostruire un difetto creato nel miocardio parete 14. Future stustampi verrà effettuata in vitro per esaminare la capacità del scaffold per supportare cellule cardiache seminate e coltivate sulla matrice. I metodi descritti nel presente documento possono essere applicabili anche a decellularizzazione dei cuori umani. In conclusione, decellularizzazione cuore suino è possibile e i metodi sono straight-forward. Continuazione delle ricerche su questo materiale permettono di percepire il suo potenziale per l&#39;uso clinico.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / materiale </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> Gibco </td><td> 15090 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Pescatore </td><td> BP120-500 </td><td></td></tr><tr><td> NaN 3 </td><td> Sigma </td><td> S2002-500G </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma </td><td> X100-1L </td><td></td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> Pescatore </td><td> BP399-20 </td><td></td></tr><tr><td> Sodio desossicolato </td><td> Sigma </td><td> D6750-500G </td><td></td></tr><tr><td> Acido peracetico </td><td> Pfaltz e Bauer </td><td> P05020 </td><td> 35% CAS # 79-21-0 </td></tr><tr><td> Etanolo </td><td> Pharmco </td><td> 111000200 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Masterflex azionamento della pompa </td><td> Cole Parmer </td><td> SI-07.524-50 </td><td></td></tr><tr><td> Masterflex Tubi </td><td> Cole Parmer </td><td> 96400-18 </td><td> Size 18 </td></tr><tr><td> Riduttore spinato </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-30612-20 </td><td></td></tr><tr><td> Beaker 4L </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-540T </td><td></td></tr></tbody></table>

procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion

Perfusione basata decellularizzazione intero organo ha recentemente guadagnato interesse nel campo dell&#39;ingegneria dei tessuti come mezzo per creare sito-specifici scaffold della matrice extracellulare, mentre gran parte conservando l&#39;architettura nativa del ponteggio. Ad oggi, questo approccio è stato utilizzato in una varietà di sistemi di organi, compreso il cuore, polmone, fegato e 1-5. Decellularizzazione metodi precedenti per tessuti senza una rete facilmente accessibile vascolare hanno invocato esposizione prolungata del tessuto a soluzioni di detergenti, acidi, o trattamenti enzimatici come mezzo per rimuovere i componenti cellulari e nucleari dall&#39;ambiente circostante extracellulare 6-8. Tuttavia, l&#39;efficacia di questi metodi incernierato sulla capacità delle soluzioni di permeare il tessuto tramite diffusione. In contrasto, la perfusione di organi attraverso il sistema vascolare naturale ridotto efficacemente la distanza di diffusione e trasporto facilitato di decellularizatisugli agenti nel tessuto e componenti cellulari dal tessuto. Qui, si descrive un metodo per decellularize pienamente un cuore intatto suino attraverso perfusione coronarica retrograda. Il protocollo ha prodotto completamente decellularizzato cardiaca matrice extracellulare (ECM-c) scaffold con la struttura tridimensionale del cuore intatto. Il nostro metodo utilizzato una serie di enzimi, detergenti e acidi accoppiato con risciacqui ipertoniche e ipotoniche per facilitare la lisi delle cellule e la rimozione. Il protocollo utilizzato una soluzione di tripsina per staccare celle della matrice seguito da Triton X-100 e sodio desossicolato soluzioni per aiutare nella rimozione di materiale cellulare. Il protocollo descritto utilizza anche velocità di perfusione maggiore di 2 L / min per lunghi periodi di tempo. L&#39;elevata portata, accoppiato con soluzione cambia accettati trasporto di agenti al tessuto senza contaminazione di detriti cellulari e assicurato efficace risciacquo del tessuto. Il metodo descritto rimosso tutto il materiale nucleare da native suina tessuto cardiaco, creando un sito-specifico cardiaca ECM scaffold che può essere utilizzato per una varietà di applicazioni.

L&#39;effetto di decellularizzazione sui cuori suina tutto varia naturalmente a causa delle differenze in termini di dimensioni, pressioni, e la disposizione del serbatoio. Pertanto, la composizione esatta degli scaffold derivati ​​matrice extracellulare non sarà lo stesso da cuore a cuore. Il completamento del protocollo descritto produrrà un cuore che appare bianco o traslucido, indicando la perdita di materiale cellulare. Tuttavia, è ampiamente accettato che un tessuto può essere considerata &quot;decellularizzato&quot; basato sulla combinazione di alcuni parametri ulteriori quantitativi 8. Un protocollo decellularizzazione successo produrrà una matrice con meno di 50 ng di DNA a doppio filamento per mg di tessuto (Figura 6). Per evitare una risposta immunitaria dell&#39;ospite Dopo l&#39;impianto della matrice, il DNA rimanente dovrebbe anche contenere meno di 200 paia di basi (Figura 7). Per confermare questi risultati, colorazione ematossilina e eosina dovrebbe rivelare l&#39;assenza di nuclearecolorazione in sezioni rappresentative dei ventricoli e setto ventricolare (Figura 8). Tricromica di Masson conferma ulteriormente la perdita di fasci muscolari cardiache e ritenzione di reti collagene (Figura 9). <img src="/files/ftp_upload/50059/50059fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. L&#39;estremità sagomata del tubo è inserita in aorta del cuore nativo. Il tubo deve essere fissato con fascette o fascette di sopra della valvola aortica per garantire la perfusione attraverso le arterie coronarie. <img src="/files/ftp_upload/50059/50059fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Il cuore è immerso in acqua in un becher 4L e bolle d&#39;aria devono essere rimosse dal tubo. Se si osservano bolle emergendo dall&#39;aorta vicino al tubo, legami aggiuntivi devono essere utilizzati per fissare il tubo di t<html> egli aorta per mantenere una adeguata pressione nel tessuto. <img src="/files/ftp_upload/50059/50059fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Come soluzioni sono perfusi attraverso le arterie coronarie, il cuore perde il suo colore originario, procedendo dagli atri all&#39;apice del cuore e localizzata attorno coronarie. <img src="/files/ftp_upload/50059/50059fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Dopo il completamento della disinfezione e risciacquo fasi del protocollo, il tubo viene rimosso e il cuore è posto su un cuscinetto assorbente per consentire il deflusso dell&#39;acqua in eccesso dal cuore. Questo assicura una misurazione accurata nel valutare il tessuto e permette anche il tessuto per rilassarsi prima sezionamento. pg &quot;alt =&quot; Figura 5 &quot;/&gt; Figura 5. Il ventricolo sinistro (LV), il ventricolo destro (RV), e il setto interventricolare sono tutti rimossi dal cuore decellularizzato istologico per l&#39;elaborazione, il congelamento e liofilizzazione, e la quantificazione del DNA. <img src="/files/ftp_upload/50059/50059fig6.jpg" alt="Figura 6" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50059/50059fig6highres.jpg"/> Figura 6. Analisi quantitativa del contenuto di DNA utilizzando un saggio Pico Verde. I ventricoli del cuore CECM mostrano una significativa diminuzione del contenuto di DNA rispetto ai ventricoli nativi. I valori osservati DNA da questo protocollo sono osservati o inferiore alla ng / mg 50 standard per tessuti decellularizzato. <img src="/files/ftp_upload/50059/50059fig7.jpg" alt="Figura 7"/> Figura 7. Frammento di DNA dimensioni, come determinato da ethidium bromuro gel, mostrava poco DNA residuo nei ventricoli decellularizzato rispetto ad una matrice vescica urinaria (UBM) standard. <img src="/files/ftp_upload/50059/50059fig8.jpg" alt="Figura 8" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50059/50059fig8highres.jpg"/> Figura 8. Ematossilina eosina e colorazione ha mostrato la completa rimozione del materiale nucleare dai ventricoli a seguito del completamento del protocollo decellularizzazione. <img src="/files/ftp_upload/50059/50059fig9.jpg" alt="Figura 9" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50059/50059fig9highres.jpg"/> Figura 9. Colorazione tricromica di Masson di A) nativo e B) ventricolo decellularizzato.

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Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

Un metodo per rimuovere rapidamente e completamente componenti cellulari da un cuore suino intatta attraverso perfusione retrograda viene descritto. Questo metodo fornisce uno specifico sito cardiaca matrice extracellulare ponteggio che ha il potenziale per l&#39;utilizzo in molteplici applicazioni cliniche.

Procedura per decellularizzazione del Cuore di suino da retrograda perfusione coronarica

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

procedure-for-decellularization-porcine-heart-retrograde-coronary

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

23.8K Views.  McGowan Institute for Regenerative Medicine. Un metodo per rimuovere rapidamente e completamente componenti cellulari da un cuore suino intatta attraverso perfusione retrograda viene descritto. Questo metodo fornisce uno specifico sito cardiaca matrice extracellulare ponteggio che ha il potenziale per l'utilizzo in molteplici applicazioni cliniche.

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Decellularization and Recellularization of Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to recreate or mimic the liver microstructure with grounds up approach using tissue engineering and microfabrication techniques have not been successful so far due to this design challenge. In addition, synthetic biomaterials used to create scaffolds for liver tissue engineering applications have been limited in inducing tissue regeneration and repair in large part due to the lack of specific cell binding motifs that would induce the proper cell functions2. Decellularized native tissues such blood vessels3and skin4on the other hand have found many applications in tissue engineering, and have provided a practical solution to some of the challenges. The advantage of decellularized native matrix is that it retains, to an extent, the original composition, and the microstructure, hence enhancing cell attachment and reorganization5.
In this work we describe the methods to perform perfusion-decellularization of the liver, such that an intact liver bioscaffold that retains the structure of major blood vessels is obtained. Further, we describe methods to recellularize these bioscaffolds with adult primary hepatocytes, creating a liver graft that is functional in vitro, and has the vessel access necessary for transplantation in vivo.

Perfusion decellularization is a novel technique to produce whole liver scaffolds that retains the organ's extracellular matrix composition and microarchitecture. Herein, the method of preparing whole organ scaffolds using perfusion decellularization and subsequent repopulation with hepatocytes is described. Functional and transplantable liver grafts can be generated using this technique.

Decellularization e Recellularization di fegati interi

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Ricerca

Bioingegneria

Procedure for Lung Engineering

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths annually; chronic obstructive pulmonary disease is currently the fourth leading cause of death in the United States1. Contributing to this mortality is the fact that lungs do not generally repair or regenerate beyond the microscopic, cellular level. Therefore, lung tissue that is damaged by degeneration or infection, or lung tissue that is surgically resected is not functionally replaced in vivo. To explore whether lung tissue can be generated in vitro, we treated lungs from adult rats using a procedure that removes cellular components to produce an acellular lung extracellular matrix scaffold. This scaffold retains the hierarchical branching structures of airways and vasculature, as well as a largely intact basement membrane, which comprises collagen IV, laminin, and fibronectin. The scaffold is mounted in a bioreactor designed to mimic critical aspects of lung physiology, such as negative pressure ventilation and pulsatile vascular perfusion. By culturing pulmonary epithelium and vascular endothelium within the bioreactor-mounted scaffold, we are able to generate lung tissue that is phenotypically comparable to native lung tissue and that is able to participate in gas exchange for short time intervals (45-120 minutes). These results are encouraging, and suggest that repopulation of lung matrix is a viable strategy for lung regeneration. This possibility presents an opportunity not only to work toward increasing the supply of lung tissue for transplantation, but also to study respiratory cell and molecular biology in vitro for longer time periods and in a more accurate microenvironment than has previously been possible.

We have developed a decellularized lung extracellular matrix and novel biomimetic bioreactor that can be used to generate functional lung tissue. By seeding cells into the matrix and culturing in the bioreactor, we generate tissue that demonstrates effective gas exchange when transplanted in vivo for short periods of time.

Procedura per l&#39;Ingegneria del polmone

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

Successful tissue engineering involves the combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo. Scaffolds may be synthetic, naturally-derived or derived from tissues/organs. The latter are obtained using a technique called decellularization. Decellularization may involve a combination of physical, chemical, and enzymatic methods. The goal of this technique is to remove all cellular traces whilst maintaining the macro- and micro-architecture of the original tissue.
Intestinal tissue engineering has thus far used relatively simple scaffolds that do not replicate the complex architecture of the native organ. The focus of this paper is to describe an efficient decellularization technique for rat small intestine. The isolation of the small intestine so as to ensure the maintenance of a vascular connection is described. The combination of chemical and enzymatic solutions to remove the cells whilst preserving the villus-crypt axis in the luminal aspect of the scaffold is also set out. Finally, assessment of produced scaffolds for appropriate characteristics is discussed.

The article describes a methodology for the production of an acellular matrix from rat intestine. The derivation of intestinal scaffolds is important for future applications in tissue engineering, stem cell biology and drug testing.

Un Decellularization Metodologia per la produzione di un naturale acellulare intestinale Matrix

Successful tissue engineering involves the  combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo.  Scaffolds may be synthetic, ...

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an attractive alternative to classic organ transplantation. This technology utilizes an organ&#39;s natural biological extracellular matrix (ECM) as a scaffold onto which autologous or stem/progenitor cells may be seeded and cultured in such a way that facilitates regeneration of the original tissue. The natural ECM is isolated by a process called decellularization. Decellularization is accomplished by treating tissues with a series of detergents, salts, and enzymes to achieve effective removal of cellular material while leaving the ECM intact. Studies conducted utilizing decellularization and subsequent recellularization of rodent lungs demonstrated marginal success in generating pulmonary-like tissue which is capable of gas exchange in vivo. While offering essential proof-of-concept, rodent models are not directly translatable to human use. Nonhuman primates (NHP) offer a more suitable model in which to investigate the use of bioartificial organ production for eventual clinical use.
The protocols for achieving complete decellularization of lungs acquired from the NHP rhesus macaque are presented. The resulting acellular lungs can be seeded with a variety of cells including mesenchymal stem cells and endothelial cells. The manuscript also describes the development of a bioreactor system in which cell-seeded macaque lungs can be cultured under conditions of mechanical stretch and strain provided by negative pressure ventilation as well as pulsatile perfusion through the vasculature; these forces are known to direct differentiation along pulmonary and endothelial lineages, respectively. Representative results of decellularization and cell seeding are provided.

Whole-organ decellularization produces natural biological scaffolds that may be used for regenerative medicine. The description of a nonhuman primate model of lung regeneration in which whole lungs are decellularized and then seeded with adult stem cells and endothelial cells in a bioreactor that facilitates vascular circulation and liquid media ventilation is presented.

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent liver decellularization have already been published. We aimed to improve the decellularization process by construction of a proprietary perfusion device enabling selective perfusion via the portal vein and/or the hepatic artery. Furthermore, we sought to perform perfusion under oscillating surrounding pressure conditions to improve the homogeneity of decellularization. The homogeneity of perfusion decellularization has been an underestimated factor to date. During decellularization, areas within the organ that are poorly perfused may still contain cells, whereas the extracellular matrix (ECM) in well-perfused areas may already be affected by alkaline detergents. Oscillating pressure changes can mimic the intraabdominal pressure changes that occur during respiration to optimize microperfusion inside the liver. In the study presented here, decellularized rat liver matrices were analyzed by histological staining, DNA content analysis and corrosion casting. Perfusion via the hepatic artery showed more homogenous results than portal venous perfusion did. The application of oscillating pressure conditions improved the effectiveness of perfusion decellularization. Livers perfused via the hepatic artery and under oscillating pressure conditions showed the best results. The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

Procedura per Decellularization di Rat Livers in un dispositivo di perfusione oscillante pressione

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor biocompatibility, and cost. Plant tissues have favorable characteristics that make them uniquely suited for use as scaffolds, such as high surface area, excellent water transport and retention, interconnected porosity, preexisting vascular networks, and a wide range of mechanical properties. Two successful methods of plant decellularization for tissue engineering applications are described here. The first method is based on detergent baths to remove cellular matter, which is similar to previously established methods used to clear mammalian tissues. The second is a detergent-free method adapted from a protocol that isolates leaf vasculature and involves the use of a heated bleach and salt bath to clear the leaves and stems. Both methods yield scaffolds with comparable mechanical properties and low cellular metabolic impact, thus allowing the user to select the protocol which better suits their intended application.

Here we present, and contrast two protocols used to decellularize plant tissues: a detergent-based approach and a detergent-free approach. Both methods leave behind the extracellular matrix of the plant tissues used, which can then be utilized as scaffolds for tissue engineering applications.

Due metodi per decellularizzazione di tessuti vegetali per applicazioni di ingegneria del tessuto

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and poor patency. Tissue engineering offers a novel solution to generate personalized grafts with a natural extracellular matrix containing the recipient&#39;s cells using the method of decellularization and recellularization. We show a detailed method for performing decellularization of the human saphenous vein and recellularization by perfusion of peripheral blood. The vein was decellularized by perfusing 1% Triton X-100, 1% tri-n-butyl-phosphate (TnBP) and 2,000 Kunitz units of deoxyribonuclease (DNase). Triton X-100 and TnBP were perfused at 35 mL/min for 4 h while DNase was perfused at 10 mL/min at 37 &#176;C for 4 h. The vein was washed in ultrapure water and PBS and then sterilized in 0.1% peracetic acid. It was washed again in PBS and preconditioned in endothelial medium. The vein was connected to a bioreactor and perfused with endothelial medium containing 50 IU/mL heparin for 1 h. Recellularization was performed by filling the bioreactor with fresh blood, diluted 1:1 in Steen solution, and adding endocrine gland-derived vascular endothelial growth factors (80 ng/mL), basic fibroblast growth factors (4 &#181;L/mL), and acetyl salicylic acid (5 &#181;g/mL). The bioreactor was then moved into an incubator and perfused for 48 h at 2 mL/min while maintaining glucose between 3 - 9 mmol/L. Later, the vein was washed with PBS, filled with endothelial medium and perfused for 96 h in the incubator. Treatment with Triton X-100, TnBP and DNase decellularized the saphenous vein in 5 cycles. The decellularized vein looked white in contrast to normal and recellularized veins (light red). The hematoxylin &#38; eosin (H&#38;E) staining showed the presence of nuclei only in normal but not in decellularized veins. In the recellularized vein, H&#38;E-staining showed the presence of cells on the luminal surface of the vein.

Here, we describe a protocol for the saphenous vein decellularization using detergents and recellularization by perfusion of the peripheral blood and the endothelial medium.

Decellularizzazione e metodologia di ricellularizzazione per le vene safena umane

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and ...

Decellularization of Whole Human Heart Inside a Pressurized Pouch in an Inverted Orientation

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ultimately rejection can occur. Creating a functional, autologous bio-artificial heart could solve these challenges. Biofabrication of a heart comprised of scaffold and cells is one option. A natural scaffold with tissue-specific composition as well as micro- and macro-architecture can be obtained by decellularizing hearts from humans or large animals such as pigs. Decellularization involves washing out cellular debris while preserving 3D extracellular matrix and vasculature and allowing &#34;cellularization&#34; at a later timepoint. Capitalizing on our novel finding that perfusion decellularization of complex organs is possible, we developed a more &#34;physiological&#34; method to decellularize non-transplantable human hearts by placing them inside a pressurized pouch, in an inverted orientation, under controlled pressure. The purpose of using a pressurized pouch is to create pressure gradients across the aortic valve to keep it closed and improve myocardial perfusion. Simultaneous assessment of flow dynamics and cellular debris removal during decellularization allowed us to monitor both fluid inflow and debris outflow, thereby generating a scaffold that can be used either for simple cardiac repair (e.g. as a patch or valve scaffold) or as a whole-organ scaffold.

This method enables decellularization of a complex solid organ using a simple protocol based on osmotic shock and perfusion of ionic detergent with minimal organ matrix disruption. It comprises a novel decellularization technique for human hearts inside a pressurized pouch with real-time monitoring of flow dynamics and cellular debris outflow.

Decellularizzazione di cuore umano intero all'interno di una custodia pressurizzata in un orientamento invertito

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ...

Isolation and Decellularization of a Whole Porcine Pancreas

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an allogeneic or xenogeneic source with human cells. A demonstration of methods for the efficient dissection, decellularization, and recellularization of porcine pancreas might benefit the field. Akin to human pancreases, porcine pancreases have a special anatomical arrangement with three lobes (splenic, duodenal, and connection) rounded by the duodenum and small intestine. The duodenal lobe of the pancreas connects to the duodenum by several small blood vessels. Tissue engineering of the pancreas is complicated because of its exocrine and endocrine nature. In this paper, we show a detailed protocol to dissect the whole porcine pancreas and decellularize it with detergents while saving its structure and some extracellular matrix components. To achieve complete perfusion, the aorta is chosen as inlet and the portal vein as outlet. The other blood vessels (hepatic artery, splenic vein, splenic artery,&#160;mesenteric artery and vein tree) and bile duct are ligated. To prevent the formation of thrombus, the pig is heparinized and, immediately after dissection, the organ is flushed with cold heparin. To inhibit the action of exocrine enzymes, the pancreas decellularization is set at 4 &#176;C. The decellularization is performed by perfusion of Triton X-100, sodium deoxycholate, and deoxyribonuclease, with an intermittent and final extensive washing. With a successful decellularization, the pancreas appears white, and a histological evaluation with hematoxylin and eosin shows an absence of nuclei with a preserved extracellular matrix structure. Thus, the proposed method can be used to successfully dissect and decellularize whole porcine pancreas.

Tissue engineering of the whole pancreas is a challenge because of its exocrine and endocrine functions. We show a method for the dissection of an intact porcine pancreas and the process of successful decellularization by perfusion of detergents Triton X-100, sodium deoxycholate, and deoxyribonuclease.

Isolamento e decellularizzazione di un Pancreas suino intero

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.