Questo metodo può essere utilizzato per la dissezione del pancreas suino contenente connessione, lobi duodenali e splenici ed eventuale decellularizzazione attraverso la perfusione di detergenti a temperature fredde. Sebbene questo metodo di decellularizzazione fornisca informazioni sul pancreas suino, può anche essere applicato alla pancreata di altri grandi animali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che facilita il recupero intatto di un organo complicato, come il pancreas, per ulteriori applicazioni di ingegneria tissutale.
Generalmente, individui nuovi a questo metodo, faranno fatica perché la dissezione del pancreas intatto mentre identifica e lega tutti i vasi sanguigni circostanti richiede molta pratica da padroneggiare. Prima di iniziare la procedura, utilizzare un tubo di silicone di tre per cinque millimetri per collegare il contenitore del detergente alla pompa peristaltica e un secondo tubo in silicone da tre per cinque millimetri per collegare la pompa peristaltica alla camera d'organo tramite il degassatore. Collegare un Luer maschio all'estremità libera del secondo tubo e utilizzare un terzo tubo di silicone di tre per cinque millimetri per collegare la camera d'organo al contenitore di raccolta dei detergenti tramite la pompa peristaltica.
Infine, collegare una pipetta senza etichetta di due millimetri alle estremità libere dei tubi nel contenitore del detergente e nel contenitore di raccolta dei detergenti. Quindi, posizionare la configurazione di decellularizzazione a quattro gradi Celsius. Per raccogliere il pancreas, posizionare un maiale femmina eparinizzato di 45 chilogrammi su una tabella di dissezione in posizione supina e utilizzare un bisturi per fare un'incisione della linea mediana di 40 centimetri dal processo xifoide all'osso pubico per esporre gli organi addominali.
Dopo aver identificato i lobi splenici, duodenali e di connessione, individuare la papilla duodenale maggiore e usare due suture individuali per ligare oralmente il duodeno dal sito. Legare l'esofago inferiore con suture aggiuntive e tagliare tra le legature con forbici per facilitare la rimozione dello stomaco. Separare i tessuti connettivi dal colon per raggiungere l'intestino tenue e separare il tessuto connettivo del colon che si attacca al lobo splenico del pancreas.
L'intestino tenue è attaccato al pancreas dal tessuto connettivo al lobo splenico, ma circonda anche il pancreas. Devi seguire attentamente il percorso intestinale per districare e separare il tessuto connettivo tra l'intestino e il pancreas. Dopo aver legato le arterie, rimuovere il colon dall'intestino tenue.
Identificare la vena mesenterica inferiore, l'arteria mesenterica inferiore e ligarare i vasi con una sutura caudale al pancreas e tagliare con le forbici. Ligate l'arteria splenica e la vena insieme nell'ilum, vicino alla milza, e tagliare disstogli con le forbici per rimuovere la milza. Seguire il duodeno fino a quando i lobi duodenali e di connessione non vengono cancellati e ligare il duodeno alla fine con due suture separate.
La parte di duodeno che è a stretto contatto con la connessione e i lobi duodenali viene rimossa con il pancreas, poiché la legatura di tutti i piccoli vasi sanguigni tra i due organi è troppo difficile. Dopo aver sezionato la vena portale, legare il vaso con una sutura per evitare perdite di sangue dal fegato e sezionare e legare il condotto biliare e l'arteria epatica con due suture. Quindi, tagliare la vena portale, l'arteria epatica e il condotto biliare con le forbici.
Individuare l'aorta sotto la vena renale e sezionare l'aorta nella direzione cranica dal muscolo e dal tessuto connettivo fino a quando il vaso raggiunge il pancreas. Ora, capovolgere delicatamente il pancreas e sezionare l'aorta, mantenendo intatti l'arteria mesenterica superiore e il tronco celiaco. Tagliare l'aorta cranial al tronco celiaco e sezionare smussato il tessuto circostante rimanente per consentire la raccolta del pancreas.
Quindi, utilizzare una siringa da 50 millilitri collegata a una cannula di arteriotomia di quattro millimetri per sciacquare l'organo attraverso l'aorta con la soluzione due fino a quando l'intero organo non viene perfuso o fino a quando l'intero organo diventa freddo. Posizionare la soluzione due pancreas perfuso su un vassoio metallico sul ghiaccio, con aorta rivolta verso l'alto, e utilizzare le forbici per tagliare le suture dal duodeno. Utilizzare una pipetta da 25 millilitri per lavare il duodeno con da 50 a 150 millilitri di acqua ultrapura e riligare il tessuto con suture fresche.
Ligate un'estremità dell'aorta e tutti i rami, esclusa l'arteria mesenterica superiore e il tronco celiaco, per evitare perdite, e inserire una cannula di arteriotomia di quattro millimetri nell'altra estremità dell'aorta. Quindi, posizionare il pancreas nella camera dell'organo e collegare la cannula nel pancreas a un Luer maschio. Quindi, perfondere il pancreas con la soluzione tre per un'ora a 20 millilitri al minuto e congelare il pancreas doppio perfuso a meno 20 gradi Celsius nella soluzione quattro fino all'inizio della decellularizzazione.
Il giorno dell'inizio della decellularizzazione, scongelare il pancreas a quattro gradi Celsius e posizionare il pancreas scongelato nella camera dell'organo di decellularizzazione. Collegare il tubo di ingresso del detergente all'aorta del pancreas e lavare il pancreas con la soluzione tre a 20 millilitri al minuto durante la notte a quattro gradi Celsius. La mattina seguente, decantare qualsiasi soluzione rimasta nella camera d'organo e perfondere il pancreas per 30 minuti a 20 millilitri al minuto in soluzione cinque a quattro gradi Celsius.
Alla fine della soluzione cinque perfusioni, perfondere il pancreas per otto ore a 20 millilitri al minuto in soluzione sei e quattro gradi Celsius, seguito da un lavaggio di 96 ore in soluzione fresca cinque a 20 millilitri al minuto e quattro gradi Celsius. Sostituire il lavaggio con 500 millilitri di DPBS integrati con calcio e magnesio per 30 minuti a 37 gradi Celsius, seguito da perfusione con 250 millilitri di soluzione sette per quattro ore a 20 millilitri al minuto e 37 gradi Celsius. Quindi, lavare l'organo per altre 120 ore con soluzione fresca cinque a 20 millilitri al minuto e quattro gradi Celsius e conservare l'organo nella soluzione otto.
Qui, si può osservare la morfologia grossolana di un pancreas normale, che appare rosa chiaro e contiene lobi splenici, di connessione e duodenali. Dopo la decellularizzazione, il colore rosa viene perso e il pancreas elaborato appare di colore bianco pallido. In un pancreas normale, molti nuclei blu sono evidenti dalla colorazione H ed E, mentre in un pancreas decellularizzato i nuclei non possono più essere visualizzati, confermando la loro perdita.
Il pancreas suino intatto isolato, seguendo questa procedura, consentirà una perfusione completa e una decellularizzazione riuscita preservando la struttura e consentendo anche di ottenere alcune proteine della matrice extracellulare. Il pancreas decellularizzato può essere utilizzato per sviluppare strategie di ricellularizzazione di organi interi in sistemi bioreattori con tipi di cellule pertinenti. Dopo la ricellularizzazione con cellule staminali ricevente, il pancreas ingegnerizzato dai tessuti può essere utilizzato per applicazioni cliniche e test farmacologici.
Non dimenticare che lavorare con Triton X-100 e SDC può essere estremamente pericoloso e che le precauzioni, come indossare guanti e preparare le soluzioni sotto il cofano dei fumi, dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.
