저자는 Brogan, 손님 미셸 위버, 그리고 순영이 Lippert을 인정하고 싶습니다. 본 연구를위한 기금은 NIH 그랜트 R03EB009237뿐만 아니라 국민의 생명 이미징 및 생물 공학 연구소와 T32HL076124-05에서 NIH 교육 교부금 T32EB001026-06에 의해 제공되었다.

1. 조직 준비 및 실험 설정 <ol><li> 즉시 도살장 또는 연구 시설에서 안락사 이후 초과 피가 묻은 손을 씻어 수확 돼지의 기관. 심방과 대동맥을 그대로 유지 초과 지방 및 조직의 마음을 잘라. 거리에 대동맥에서 폐동맥을 분리 할 지방 트림. 조직에 상처가있는 경우, 적절하게 폐기하십시오. </li><li> 냉동고 종이에 개별적으로 마음을 정리하고 완전한 냉동을 보장하기 위해 최소 24 시간에 -80 ° C의 냉동고에있는 모든 조직을 저장합니다. </li><li> 할 때 사용 (보통 미만 3 개월), 밤 4 ° C.에서 4 L의 비커에 잠겨 1 형 물에 해동 한 그대로 냉동 돼지의 심장 준비 </li><li> 마음이 완전히 해동 한 후, 심장이 건조 두드려 마음을 무게, 그리고 무게를 기록합니다. 시장 무게 돼지의 심장은 약 3백75-4백50g 무게해야합니다. </li><li> 가시 감속기의 ¼ &quot;끝으로 크기를 18 Masterflex 관을 연결합니다. 가시 감속기를 넣고대동맥 내부 튜브. 단지 팔 머리 트렁크 아래의 장소 2 호스 클램프 또는 대동맥 주위 안전한 우편 관계. 감속기와 튜브는 대동맥 밸브 위에 유지해야하며, 관상 동맥이 (그림 1) perfused 할 수 있도록. </li><li> 유형 I 물 튜브를 채우기 위해 30 또는 60 ML의 주사기를 사용합니다. 대략 중간 지점에 Masterflex 롤러 펌프의 카트리지 내에 튜브를 삽입합니다. 유입 물 2.5 L로 가득 4 L의 비커의 바닥에있는 튜브의 끝과 튜브를 확보 잠기. </li><li> 물이 담겨있는 비커에 심장과 기포를 제거하는 주요 펌프를 놓으십시오. 거품이 튜브가 삽입되어있는 대동맥에서 오는 관찰하는 경우 대동맥 추가 관계로 재배치 또는 보안해야 할 수 있습니다. 밀폐 씰은 decellularization 프로세스 (그림 2)에 적절한 압력을 유지하는 것이 중요합니다. </li><li> 0.2 % Trypsin/0.05 % EDTA/0.05 % 할머니 3 L를 포함하는 4 L의 비커를 놓고판을 저어 37에 따뜻하게에 ° C decellularization 과정의 준비 3 솔루션입니다. </li></ol> 2. 조직 린스 <ol><li> 올바른 튜​​브 크기가 선택되어 있도록, 400 ML / 분의 유량으로 펌프를 설정합니다. 15-25 분 동안 I 물을 입력으로 마음을 플러시. 펌프가 시작되면서 마음은 팽창과 심실에서 혈액을 발산한다. 신선한 솔루션은 모든 5-10 분 대체, 또는 심장에서 제거 혈액의 양에 따라 필요합니다. 혈액은 심장에서 했소하지 않는 경우, 필요에 따라 튜브와 클램프를 조정합니다. </li><li> 펌프를 중지하고 배 인산로 가득 별도의 비커에 마음을 전송할는 식염 (PBS)를 버퍼. 튜브는 솔루션에 잠수 한 후, 펌프를 시작하고 700 ML / 분으로 유량을 향상시킬 수 있습니다. 마음이 솔루션마다 5 분을 변경, 15 분에 대한 솔루션 유지됩니다. 각 솔루션 변경 사항은 조직과 튜브가 이동하는 동안 일시적으로 중지 할 펌프가 필요합니다새로운 비커합니다. </li><li> 10 분에 I 물을 입력하고 750 ML / 분으로 유량을 증가 심장을 전송합니다. </li></ol> 3. Decellularization 및 솔루션 재관류 <ol><li> 37 세 할머니 0.2 % Trypsin/0.05 % EDTA/0.05 %를 포함하는 비커에 마음을 전송 ° C. 1200 ML / 분에 펌프 속도를 증가하고 펌프를 시작합니다. 비커에 솔루션을 순환 할 수있는 비커의 바닥에 배치 저어 줄을 사용하십시오. 마음은 3 시간 총 37 ° C에서 0.2 % Trypsin/0.05 % EDTA/0.05 % 할머니 3 솔루션에 남아 있어야합니다. 1 시간 후, 1500 ML / 분에 펌프 속도를 향상시킬 수 있습니다. 추가 시간 후, 1800 ML / 분에 펌프 속도를 향상시킬 수 있습니다. 조직은 천천히 조건 조직을로 증가 관류 속도를 받게과 혈관의 파열을 방지합니다. 마음은 프로토콜이 단계에서 크기로 팽창 거의 두 번합니다. 조직 회에 걸쳐 심방에서 꼭대기까지 진행, 자연 색상을 잃게됩니다전자 프로토콜 (그림 3). </li><li> 각 솔루션 재관류 후, 린스 두 단계는 세포 파편, 화학 잔류 물, 그리고 원조 세포 용해를 제거하는 수행됩니다. 각 린스은 10 분으로 구성되어 전 10 분 뒤에 물이 상온에서 2 배 PBS 솔루션을 씻어 유형에 씻어. 각 헛된 솔루션을 헹굼 추가, 침수 마음을 포함하고있는 비커 안에 perfusate를 순환, 원래 비커의 용액의 제거로 구성되어 있습니다. 다음 0.2 % Trypsin/0.05 % EDTA/0.05 % 할머니 3 해결책 후, perfuse 1900 ML / 분의 물과 1950 ML / 분에서 2 배 PBS를 perfuse. </li><li> 3퍼센트 상온에서 튼 X-100/0.05 % EDTA/0.05 % 할머니 3의 솔루션으로 마음을 전송합니다. 2000 ML / 1 시간 분, perfuse 솔루션에 펌프 속도를 향상시킬 수 있습니다. 비커의 용액을 제거하고 신선한 솔루션으로 교체 2100 ML / 분에 펌프 속도를 높일 수 있으며, 추가 시간 반 동안 신선한 솔루션을 perfuse, 총 시간을 가져3퍼센트 튼 X-100/0.05 % EDTA/0.05 % 할머니 3 2.5 시간합니다. </li><li> 2180 ML / 10 분 각각에 대한 분에 2150 ML / 분, 배 PBS에서 유형 I 물에 조직을 씻어. </li><li> 실온에서 4 % 나트륨 Deoxycholate 솔루션에 마음을 전송합니다. 2200 ML / 분, 3 시간에 perfuse 솔루션에 펌프 속도를 향상시킬 수 있습니다. </li><li> 에서 유형 I 물에 조직을 씻어 배 PBS 2200에서 각 솔루션 5-10 분 후 솔루션을 변경하는 15 분마다에 대한 ML / 분. 설명 재관류 단계는 두 번 헹굼 단계를 수행, 4 ° C에서 하루 아침에 첨부 된 튜브로 마음을 저장하여 여러 일 동안 분할 및 유형 I 물에 잠겨 할 수 있습니다. </li><li> 다음 날, 5 분 ML / 분 1,500에서 1X PBS로 씻어 5 분 뒤에, 750 ML / 분에서 유형 I 물로 씻어 수행합니다. 프로토콜은 다음 적절한 솔루션에 설명 된 유속으로 계속 될 수 있습니다. </li></ol> 4. 소독 및 최종 처리 <ol><li> 0.1 % perac로 마음을 전송etic 산 / 2200 ML / 분에서 4 %의 에탄올 솔루션과 1.5 시간에 대한 perfuse 솔루션입니다. </li><li> 조직에 대한 최종 린스는 모두 2200 ML / 분에서 수행됩니다. 유형 I 물에 두 개의 5 분 세차 다음 15 분을 위해 1X PBS로 조직을 Perfuse. 린스의이 시리즈는 솔루션 재관류 절차를 완료하기 위해 한번 더 반복됩니다. </li><li> 펌프를 끄고 마음을 배수하는 솔루션에서 마음을 제거합니다. 대동맥의 인연을 끊고, 모든 튜브를 제거하고 1 시간에 소모 할 수있는 빈 비커에 마음을 놓으십시오. 초과 액체는 정기적으로 배수해야합니다. 완전히 마음 (그림 4) 배수하기 위해 흡수 패드에 마음을 놓는다. </li><li> 물 대부분이 제거되면 심장 세포 외 기질 (C-ECM)의 무게를 기록합니다. 심장은 decellularization 과정에서 초기 체중의 약 20~25%을 잃게 할 것으로 예상 할 수 있습니다. </li><li> 오른쪽과 왼쪽 심실뿐만 아니라, DNA quantificati에 대한 심실 중격을 관통 해부와 조직 학적 처리 위해서는 조직 전체 decellularization (그림 5) 확인합니다. </li><li> lyophilization 전에 최소한 2 시간에 -80 ° C에서 C-ECM을 멈춰 봐. </li></ol>

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길버트 박사는 연구가 완료하는 동안 ACell 주식회사에서 과학 자문위원회에 있었는데, 최근 연구 및 개발의 부사장이되었다. ACell, Inc는 방광 매트릭스을 판매하고 본 연구에 상업적 관심이 없습니다.

현재 연구는 돼지의 마음의 일관되고 효율적인 decellularization에 대한 방법론을 설명했다. 프로토콜은 이전에 다음 ID로 출판 보고서 1 변형 등의 반복적 인 결과를 제공 흐름에 더 이상 노출 증가 압력을, 포함되어 있습니다. 그 결과 decellularized 조직은 조직이 성공적으로 decellularization에 게시 된 기준을 모두 만났다. 자주 솔루션으로 변경되며, 변경된 사항은 조직에 세포 물질의 재 도입을 제한하기 위해 수행되었으며, 각 decellularization 에이전트에 노출 기간은 ECM에 부정적 영향을 줄이기 위해 최소화했다. 프로토콜의 시작 단계 동안, 재관류 율이 점차 조건 조직을로 증가하고 프로토콜의 이후 단계에서 높은 유량을 허용했다. 초기 단계에서 에어컨 조직을하지 않고 마음의 vasculature는 심장의 재관류가 불가능하고, 파열 할 수 있습니다. proto열은 그 효율성으로 인해 사용되었고, 어떤 주장이 다른 프로토콜을 통해 그 우수성 변경되지 않습니다. decellularization 에이전트 및 재관류의 속도의 정확한 구성은 이대로 더 나은 기계적 또는 생물학적 특성과 프로토콜을 얻을 수 있도록 다양한,하지만 마음 대리인의 제공을위한 일반 원칙이 적용됩니다 될 수 있습니다. 심장의 기본 입체 구조의 보존은 decellularization 프로토콜을 통해 수행 여러 절차에 기인했다. 첫째, 조직은 트리밍, 도착시 고정되었다. 냉동 세포 용해를 촉진하고 재관류주기위한 사전 에어컨 조직을 위해 중요합니다. 조직은 철저하게 대동맥 밸브에 뛰어난 상처 그대로 그대로 대동맥 2cm에 대해 검사되었습니다. 모든 심장 막 또는 심장 외막을 중단 한 경우, perfusate 마음의 하류 지역에 도달하지 않았기 때문에 장기가 폐기되고, 심장이 완전히 decellularized되지 않았습니다.다음으로, 조직은 완전히 사용하기 전에 유형 I 물에 해동되었다. 물은 심장 내에서 잔여 혈전의 제거를 해동 있으며 왔으며으로 조직 휴식을 취할 수있었습니다. 튜브가 삽입 된 것처럼 마지막으로,주의가 적절한 압력이 솔루션은 관상 동맥를 입력하는 유지되었다 있도록 튜브 주위에 물 - 방수 밀봉을 형성 있도록 대동맥 밸브가 그대로 남아 있도록 촬영했다. 각 decellularization 프로토콜이 완료 된 후, 품질 통제 조치의 일련의 세포 물질의 완전한 제거를 보장하기 위해 완료되었습니다. 프로토콜 세포 핵에 대한 histologic 얼룩을 제거한다는 사실이 확인 현재 연구는 어떤 DNA의 크기가 6 이하 200 BP 있다고 DNA의 50 미만 NG는 조직의 건조 무게의 MG 당 존재라고했다합니다. 심장 decellularization에 대한 이전에 다음 ID로 출판 방법은 DNA의 착색 및 정량화에 decellularization의 유사한 수준을 보여 주었다2,5,9,10. 전체 decellularization는 효소와 세제의 유사한 치료를 사용하여 이러한 연구를 수행했다. 그러나, 본 연구에서 각 화학 물질에 노출의 길이가 증가되었다가 더 많은 솔루션을 변경했고, 흐름 속도가 증가되었습니다. 현재 프로토콜은 또한 잠재적으로 세포 외 기질의 화학 잔류 물을보다 효율적으로 제거로 이어지는, 화학 린스의 길이를 증가했다. 심장 특정 세포로 decellularized 쥐의 마음 Recellularization는 체외 2,5에서 긍정적 인 결과를 굴복했다. 전체 장기 재관류의 decellularization은 조직의 recellularization의 중요 기본 vasculature의 유지 보수를 위해 허용됩니다. 고유 성장 요인, 매트릭스 단백질, 및 3 차원 섬유 아키텍처는 또한 적절한 세포 부착, 마이그레이션 및 reconstitute 수축성 심근 조직에 신호를 홍보했습니다. 돼지 심장 extracellu매트릭스는 골격의 크기와 적절한 세포 커뮤니케이션과 영양소 수송에 필요한 세포의 수에 의해 recellularize하는 것이 더 어려울 것입니다 고맙다. 그러나, 심장 매트릭스에서 잘라 패치는 생체 응용 프로그램에 유용 할 수 있습니다. 여러 연구 11-13 동물 모델에서 손상된 조직을 재건을위한 특정 사이트 매트릭스를 사용하는 잠재적 인 장점을 보여 주었다. 따라서 심장 조직에서 파생 된 세포 외 기질 발판은 심근 재건 응용 프로그램에 바람직하다. 심장 조직의 고유 한 아키텍처는 다른 장기 나 인공 biomaterial에서 파생 된 ECM 발판을 통해 이점을 제공 할 수 있습니다. 특정 사이트 비계는 숙주 세포 침투를 지원하고 반흔 조직 형성은 반대로 건설 리모델링 응답을 홍보 할 수 있습니다. 현재까지, 심장 ECM 패치는 심근 벽 14에서 생성 된 결함을 재구성하기 위해 생체에 조사되었습니다. 미래 스튜다이가 매트릭스에 놓는와 배양 심장 세포를 지원하는 발판의 능력을 조사하는 체외에서 수행됩니다. 여기에 설명 된 방법은 또한 인간의 마음의 decellularization에 적용 할 수 있습니다. 결론적으로, 돼지의 심장 decellularization가 가능하며 방법은 바로 - 앞쪽입니다. 이 자료의 지속적인 조사는 임상 사용의 가능성에 대한 통찰력을 제공 할 것입니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 재료의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 트립신 </td><td> Gibco </td><td> 15,090 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 어부 </td><td> BP120-500 </td><td></td></tr><tr><td> 앤 3 </td><td> 시그마 </td><td> S2002-500G </td><td></td></tr><tr><td> 트리톤 X-100 </td><td> 시그마 </td><td> X100-1L </td><td></td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> 어부 </td><td> BP399-20 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 Deoxycholate </td><td> 시그마 </td><td> D6750-500G </td><td></td></tr><tr><td> Peracetic 산 </td><td> Pfaltz와 바우어 </td><td> P05020 </td><td> 35% CAS # 79-21-0 </td></tr><tr><td> 에탄올 </td><td> Pharmco </td><td> 111000200 </td><td></tD&gt; </tr><tr><td> Masterflex 펌프 드라이브 </td><td> 콜 Parmer </td><td> SI-07524-50 </td><td></td></tr><tr><td> Masterflex 관 </td><td> 콜 Parmer </td><td> 96400-18 </td><td> 크기 18 </td></tr><tr><td> 가시 감속기 </td><td> 콜 Parmer </td><td> EW-30612-20 </td><td></td></tr><tr><td> 4L 비커 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 02-540T </td><td></td></tr></tbody></table>

procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion

크게 비계의 기본 구조를 유지하면서 재관류 기반 전체 오르간 decellularization은 최근, 특정 사이트 세포 외 기질 공사장 공중 발판을 만들 수있는 수단으로 조직 공학 분야에 대한 관심을 얻었습니다. 현재까지이 방식은 심장, 폐, 간 1-5을 포함한 장기 시스템의 다양한 활용되었습니다. 쉽게 접근 할 수 혈관 네트워크가없는 조직에 대한 이전 decellularization 방법은 세제, 산, 또는 주변 세포 환경 6-8에서 세포와 핵 구성 요소를 제거하는 수단으로 효소 트리트먼트 솔루션에 조직의 장시간 노출시 의존하고 있습니다. 그러나, 솔루션의 능력에 따라 이러한 방법 힌지의 효과는 확산을 통해 조직을 침투합니다. 대조적으로, 자연 혈관 시스템을 통해 기관의 재관류 효과적으로 확산 거리와 decellularizati의 촉진 수송을 감소조직에서 조직과 세포의 구성 요소에 에이전트 있습니다. 여기, 우리는 완전히 관상 동맥 재관류 역행을 통해 그대로 돼지의 심장을 decellularize하는 방법을 설명합니다. 프로토콜은 그대로 심장의 3 차원 구조를 완벽하게 decellularized 심장 세포 외 기질 (C-ECM) 비계를 굴복. 우리의 방법은 효소, 세제, 그리고 세포의 용해 및 제거에 도움 hypertonic과 hypotonic 린스와 커플 링 산 일련의를 사용했습니다. 프로토콜은 세포 물질의 제거에 도움 튼 X-100과 나트륨 deoxycholate 솔루션 다음 행렬의 세포를 분리하는 트립신 솔루션을 사용했습니다. 설명 프로토콜은보다 큰 2 L / 오랜 시간 동안 분 재관류 속도를 사용합니다. 세포 파편의 오염없이 조직에 대리인의 교통편을 허용 및 솔루션 변경과 결합 높은 유량은 조직의 린스 효과 보장. 설명 방법은 nati의 모든 핵 물질을 제거응용 프로그램의 다양한 사용할 수있는 특정 사이트 심장 ECM 비계를 만들고, 돼지의 심장 조직이 있어요.

전체 돼지의 마음에 decellularization의 효과는 자연적으로 크기의 차이, 압력 및 선박 배열로 인해 다릅니다. 따라서 파생 된 세포 외 기질 공사장 공중 발판의 정확한 구성은 마음에서 마음으로 동일하지 않습니다. 설명 프로토콜의 완성은 세포 물질의 손실을 나타내는 흰색 또는 반투명 나타납니다 마음을 얻을 것입니다. 그러나, 널리 조직이 몇 양적 매개 변수 팔의 조합에 따라 &quot;decellularized&quot;로 간주 될 수 있다는 가능합니다. 성공적인 decellularization 프로토콜은 조직의 MG 당 두 번 좌초 DNA (그림 6)의 50 미만 NG와 함께 매트릭스를 생성합니다. 매트릭스의 주입시 호스트 면역 반응을 방지하기 위해, 나머지 DNA는 200m 미만의 기본 쌍 (그림 7)를 포함해야합니다. 이러한 연구 결과를 확인하려면 Hematoxylin과 Eosin 염색은 핵의 부재를 공개해야심실과 심실 간 중격 (그림 8)의 대표 섹션에 얼룩. Masson의 Trichrome은 또한 심장 근육의 번들과 콜라겐 네트워크의 유지 (그림 9)의 손실을 확인합니다. <img src="/files/ftp_upload/50059/50059fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. 튜브의 가시 끝은 기본 심장의 대동맥에 삽입됩니다. 튜브는 관상 동맥을 통해 재관류을 보장하기 위해 호스 클램프 또는 대동맥 밸브 위의 우편 유대 관계를 확보해야합니다. <img src="/files/ftp_upload/50059/50059fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. 마음 4L 비커와 기포에 물에 잠겨있다가 튜브에서 제거해야합니다. 거품이 튜브 근처의 대동맥에서 새로운 관찰하는 경우 추가 연결 고리는 t에 튜브를 보호하는 데 사용되어야합니다<html> 조직에 적절한 압력을 유지하기 위해 그는 대동맥. <img src="/files/ftp_upload/50059/50059fig3.jpg" alt="그림 3"/> 솔루션은 관상 동맥을 통해 perfused 아르 그림 3., 심장은 심방에서 coronaries 주변의 마음과 언어의 꼭대기에 진행의 기본 색을 잃게됩니다. <img src="/files/ftp_upload/50059/50059fig4.jpg" alt="그림 4"/> 그림 4. 소독과 프로토콜의 단계를 씻어 완료 후 튜브가 제거되고 마음이 초과 물이 심장에서 배출 할 수 있도록 흡수 패드에 표시됩니다. 이 조직을 무게 때 정확한 측정을 보장하고 또한 조직이 sectioning 전에 휴식을 취할 수 있습니다. PG &quot;ALT =&quot;그림 5 &quot;/&gt; 그림 5는. 왼쪽 심실 (LV), 우심실 (RV) 및 심실 중격은 모든 histologic 처리, 냉동과 lyophilization, 그리고 DNA의 양을 정함에 대한 decellularized 마음에서 제거됩니다. <img src="/files/ftp_upload/50059/50059fig6.jpg" alt="그림 6" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50059/50059fig6highres.jpg"/> 그림 6. 피코 녹색 분석을 사용하여 DNA 내용의 정량 분석. 원시 심실에 비해 cECM의 마음에서 심실은 DNA 내용에 상당한 감소를 보여줍니다. 이 프로토콜에서 발견 된 DNA 값은 decellularized의 조직을위한 50 NG / MG 표준에 또는 아래에 관찰됩니다. <img src="/files/ftp_upload/50059/50059fig7.jpg" alt="그림 7"/> 그림 7. DNA 조각의 크기는 같은 ethidiu에 의해 결정방광 매트릭스 (UBM) 표준에 비해 m 브로마이드 젤은 decellularized 심실에 약간의 잔류 DNA을 보여 주었다. <img src="/files/ftp_upload/50059/50059fig8.jpg" alt="그림 8" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50059/50059fig8highres.jpg"/> 그림 8. Hematoxylin과 Eosin의 착색은 decellularization 프로토콜 완료 후 심실에서 핵 물질의 완전한 제거를 보여 주었다. <img src="/files/ftp_upload/50059/50059fig9.jpg" alt="그림 9" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50059/50059fig9highres.jpg"/> 그림 9.의 Masson의 Trichrome 염색) 기본 및 B) decellularized의 심실.

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Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

신속하고 완벽하게 역행 재관류를 통해 그대로 돼지의 심장에서 세포 구성 요소를 제거하는 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은 여러 임상 응용 프로그램에서 사용하기 위해 가능성이있는 사이트 특정 심장 세포 외 기질 비계를 산출.

퇴행성 관상 재관류에 의한 돼지 심장의 Decellularization 절차

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

23.8K 조회수.  McGowan Institute for Regenerative Medicine. 신속하고 완벽하게 역행 재관류를 통해 그대로 돼지의 심장에서 세포 구성 요소를 제거하는 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은 여러 임상 응용 프로그램에서 사용하기 위해 가능성이있는 사이트 특정 심장 세포 외 기질 비계를 산출.

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Decellularization and Recellularization of Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to recreate or mimic the liver microstructure with grounds up approach using tissue engineering and microfabrication techniques have not been successful so far due to this design challenge. In addition, synthetic biomaterials used to create scaffolds for liver tissue engineering applications have been limited in inducing tissue regeneration and repair in large part due to the lack of specific cell binding motifs that would induce the proper cell functions2. Decellularized native tissues such blood vessels3and skin4on the other hand have found many applications in tissue engineering, and have provided a practical solution to some of the challenges. The advantage of decellularized native matrix is that it retains, to an extent, the original composition, and the microstructure, hence enhancing cell attachment and reorganization5.
In this work we describe the methods to perform perfusion-decellularization of the liver, such that an intact liver bioscaffold that retains the structure of major blood vessels is obtained. Further, we describe methods to recellularize these bioscaffolds with adult primary hepatocytes, creating a liver graft that is functional in vitro, and has the vessel access necessary for transplantation in vivo.

Perfusion decellularization is a novel technique to produce whole liver scaffolds that retains the organ's extracellular matrix composition and microarchitecture. Herein, the method of preparing whole organ scaffolds using perfusion decellularization and subsequent repopulation with hepatocytes is described. Functional and transplantable liver grafts can be generated using this technique.

전체 간은의 Decellularization 및 Recellularization

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

연구

생체공학

Procedure for Lung Engineering

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths annually; chronic obstructive pulmonary disease is currently the fourth leading cause of death in the United States1. Contributing to this mortality is the fact that lungs do not generally repair or regenerate beyond the microscopic, cellular level. Therefore, lung tissue that is damaged by degeneration or infection, or lung tissue that is surgically resected is not functionally replaced in vivo. To explore whether lung tissue can be generated in vitro, we treated lungs from adult rats using a procedure that removes cellular components to produce an acellular lung extracellular matrix scaffold. This scaffold retains the hierarchical branching structures of airways and vasculature, as well as a largely intact basement membrane, which comprises collagen IV, laminin, and fibronectin. The scaffold is mounted in a bioreactor designed to mimic critical aspects of lung physiology, such as negative pressure ventilation and pulsatile vascular perfusion. By culturing pulmonary epithelium and vascular endothelium within the bioreactor-mounted scaffold, we are able to generate lung tissue that is phenotypically comparable to native lung tissue and that is able to participate in gas exchange for short time intervals (45-120 minutes). These results are encouraging, and suggest that repopulation of lung matrix is a viable strategy for lung regeneration. This possibility presents an opportunity not only to work toward increasing the supply of lung tissue for transplantation, but also to study respiratory cell and molecular biology in vitro for longer time periods and in a more accurate microenvironment than has previously been possible.

We have developed a decellularized lung extracellular matrix and novel biomimetic bioreactor that can be used to generate functional lung tissue. By seeding cells into the matrix and culturing in the bioreactor, we generate tissue that demonstrates effective gas exchange when transplanted in vivo for short periods of time.

룽 공학을위한 절차

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

Successful tissue engineering involves the combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo. Scaffolds may be synthetic, naturally-derived or derived from tissues/organs. The latter are obtained using a technique called decellularization. Decellularization may involve a combination of physical, chemical, and enzymatic methods. The goal of this technique is to remove all cellular traces whilst maintaining the macro- and micro-architecture of the original tissue.
Intestinal tissue engineering has thus far used relatively simple scaffolds that do not replicate the complex architecture of the native organ. The focus of this paper is to describe an efficient decellularization technique for rat small intestine. The isolation of the small intestine so as to ensure the maintenance of a vascular connection is described. The combination of chemical and enzymatic solutions to remove the cells whilst preserving the villus-crypt axis in the luminal aspect of the scaffold is also set out. Finally, assessment of produced scaffolds for appropriate characteristics is discussed.

The article describes a methodology for the production of an acellular matrix from rat intestine. The derivation of intestinal scaffolds is important for future applications in tissue engineering, stem cell biology and drug testing.

자연 무 세포 창자 매트릭스의 생산을위한 탈세 포화 방법론

Successful tissue engineering involves the  combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo.  Scaffolds may be synthetic, ...

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an attractive alternative to classic organ transplantation. This technology utilizes an organ&#39;s natural biological extracellular matrix (ECM) as a scaffold onto which autologous or stem/progenitor cells may be seeded and cultured in such a way that facilitates regeneration of the original tissue. The natural ECM is isolated by a process called decellularization. Decellularization is accomplished by treating tissues with a series of detergents, salts, and enzymes to achieve effective removal of cellular material while leaving the ECM intact. Studies conducted utilizing decellularization and subsequent recellularization of rodent lungs demonstrated marginal success in generating pulmonary-like tissue which is capable of gas exchange in vivo. While offering essential proof-of-concept, rodent models are not directly translatable to human use. Nonhuman primates (NHP) offer a more suitable model in which to investigate the use of bioartificial organ production for eventual clinical use.
The protocols for achieving complete decellularization of lungs acquired from the NHP rhesus macaque are presented. The resulting acellular lungs can be seeded with a variety of cells including mesenchymal stem cells and endothelial cells. The manuscript also describes the development of a bioreactor system in which cell-seeded macaque lungs can be cultured under conditions of mechanical stretch and strain provided by negative pressure ventilation as well as pulsatile perfusion through the vasculature; these forces are known to direct differentiation along pulmonary and endothelial lineages, respectively. Representative results of decellularization and cell seeding are provided.

Whole-organ decellularization produces natural biological scaffolds that may be used for regenerative medicine. The description of a nonhuman primate model of lung regeneration in which whole lungs are decellularized and then seeded with adult stem cells and endothelial cells in a bioreactor that facilitates vascular circulation and liquid media ventilation is presented.

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent liver decellularization have already been published. We aimed to improve the decellularization process by construction of a proprietary perfusion device enabling selective perfusion via the portal vein and/or the hepatic artery. Furthermore, we sought to perform perfusion under oscillating surrounding pressure conditions to improve the homogeneity of decellularization. The homogeneity of perfusion decellularization has been an underestimated factor to date. During decellularization, areas within the organ that are poorly perfused may still contain cells, whereas the extracellular matrix (ECM) in well-perfused areas may already be affected by alkaline detergents. Oscillating pressure changes can mimic the intraabdominal pressure changes that occur during respiration to optimize microperfusion inside the liver. In the study presented here, decellularized rat liver matrices were analyzed by histological staining, DNA content analysis and corrosion casting. Perfusion via the hepatic artery showed more homogenous results than portal venous perfusion did. The application of oscillating pressure conditions improved the effectiveness of perfusion decellularization. Livers perfused via the hepatic artery and under oscillating pressure conditions showed the best results. The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

진동 압 관류 장치에서 쥐 간을의 탈세 포화 절차

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor biocompatibility, and cost. Plant tissues have favorable characteristics that make them uniquely suited for use as scaffolds, such as high surface area, excellent water transport and retention, interconnected porosity, preexisting vascular networks, and a wide range of mechanical properties. Two successful methods of plant decellularization for tissue engineering applications are described here. The first method is based on detergent baths to remove cellular matter, which is similar to previously established methods used to clear mammalian tissues. The second is a detergent-free method adapted from a protocol that isolates leaf vasculature and involves the use of a heated bleach and salt bath to clear the leaves and stems. Both methods yield scaffolds with comparable mechanical properties and low cellular metabolic impact, thus allowing the user to select the protocol which better suits their intended application.

Here we present, and contrast two protocols used to decellularize plant tissues: a detergent-based approach and a detergent-free approach. Both methods leave behind the extracellular matrix of the plant tissues used, which can then be utilized as scaffolds for tissue engineering applications.

Decellularization 식물 조직의 조직 공학 응용 프로그램에 대 한 두 가지 방법

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and poor patency. Tissue engineering offers a novel solution to generate personalized grafts with a natural extracellular matrix containing the recipient&#39;s cells using the method of decellularization and recellularization. We show a detailed method for performing decellularization of the human saphenous vein and recellularization by perfusion of peripheral blood. The vein was decellularized by perfusing 1% Triton X-100, 1% tri-n-butyl-phosphate (TnBP) and 2,000 Kunitz units of deoxyribonuclease (DNase). Triton X-100 and TnBP were perfused at 35 mL/min for 4 h while DNase was perfused at 10 mL/min at 37 &#176;C for 4 h. The vein was washed in ultrapure water and PBS and then sterilized in 0.1% peracetic acid. It was washed again in PBS and preconditioned in endothelial medium. The vein was connected to a bioreactor and perfused with endothelial medium containing 50 IU/mL heparin for 1 h. Recellularization was performed by filling the bioreactor with fresh blood, diluted 1:1 in Steen solution, and adding endocrine gland-derived vascular endothelial growth factors (80 ng/mL), basic fibroblast growth factors (4 &#181;L/mL), and acetyl salicylic acid (5 &#181;g/mL). The bioreactor was then moved into an incubator and perfused for 48 h at 2 mL/min while maintaining glucose between 3 - 9 mmol/L. Later, the vein was washed with PBS, filled with endothelial medium and perfused for 96 h in the incubator. Treatment with Triton X-100, TnBP and DNase decellularized the saphenous vein in 5 cycles. The decellularized vein looked white in contrast to normal and recellularized veins (light red). The hematoxylin &#38; eosin (H&#38;E) staining showed the presence of nuclei only in normal but not in decellularized veins. In the recellularized vein, H&#38;E-staining showed the presence of cells on the luminal surface of the vein.

Here, we describe a protocol for the saphenous vein decellularization using detergents and recellularization by perfusion of the peripheral blood and the endothelial medium.

Decellularization 및 Recellularization 방법론을 인간의 Saphenous 정 맥에 대 한

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and ...

Decellularization of Whole Human Heart Inside a Pressurized Pouch in an Inverted Orientation

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ultimately rejection can occur. Creating a functional, autologous bio-artificial heart could solve these challenges. Biofabrication of a heart comprised of scaffold and cells is one option. A natural scaffold with tissue-specific composition as well as micro- and macro-architecture can be obtained by decellularizing hearts from humans or large animals such as pigs. Decellularization involves washing out cellular debris while preserving 3D extracellular matrix and vasculature and allowing &#34;cellularization&#34; at a later timepoint. Capitalizing on our novel finding that perfusion decellularization of complex organs is possible, we developed a more &#34;physiological&#34; method to decellularize non-transplantable human hearts by placing them inside a pressurized pouch, in an inverted orientation, under controlled pressure. The purpose of using a pressurized pouch is to create pressure gradients across the aortic valve to keep it closed and improve myocardial perfusion. Simultaneous assessment of flow dynamics and cellular debris removal during decellularization allowed us to monitor both fluid inflow and debris outflow, thereby generating a scaffold that can be used either for simple cardiac repair (e.g. as a patch or valve scaffold) or as a whole-organ scaffold.

This method enables decellularization of a complex solid organ using a simple protocol based on osmotic shock and perfusion of ionic detergent with minimal organ matrix disruption. It comprises a novel decellularization technique for human hearts inside a pressurized pouch with real-time monitoring of flow dynamics and cellular debris outflow.

거꾸로 방향 가압된 주머니 안에 전체 인간의 마음의 decellularization

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ...

Isolation and Decellularization of a Whole Porcine Pancreas

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an allogeneic or xenogeneic source with human cells. A demonstration of methods for the efficient dissection, decellularization, and recellularization of porcine pancreas might benefit the field. Akin to human pancreases, porcine pancreases have a special anatomical arrangement with three lobes (splenic, duodenal, and connection) rounded by the duodenum and small intestine. The duodenal lobe of the pancreas connects to the duodenum by several small blood vessels. Tissue engineering of the pancreas is complicated because of its exocrine and endocrine nature. In this paper, we show a detailed protocol to dissect the whole porcine pancreas and decellularize it with detergents while saving its structure and some extracellular matrix components. To achieve complete perfusion, the aorta is chosen as inlet and the portal vein as outlet. The other blood vessels (hepatic artery, splenic vein, splenic artery,&#160;mesenteric artery and vein tree) and bile duct are ligated. To prevent the formation of thrombus, the pig is heparinized and, immediately after dissection, the organ is flushed with cold heparin. To inhibit the action of exocrine enzymes, the pancreas decellularization is set at 4 &#176;C. The decellularization is performed by perfusion of Triton X-100, sodium deoxycholate, and deoxyribonuclease, with an intermittent and final extensive washing. With a successful decellularization, the pancreas appears white, and a histological evaluation with hematoxylin and eosin shows an absence of nuclei with a preserved extracellular matrix structure. Thus, the proposed method can be used to successfully dissect and decellularize whole porcine pancreas.

Tissue engineering of the whole pancreas is a challenge because of its exocrine and endocrine functions. We show a method for the dissection of an intact porcine pancreas and the process of successful decellularization by perfusion of detergents Triton X-100, sodium deoxycholate, and deoxyribonuclease.

절연 및 전체 돼지 췌 장 Decellularization

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.