Die Autoren bedanken sich bei Brogan Gast, Michelle Weber und Kristen Lippert anzuerkennen. Die Finanzierung dieser Studie wurde durch NIH Grant R03EB009237 sowie NIH Ausbildung Grants T32EB001026-06 aus dem National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering und T32HL076124-05 zur Verfügung gestellt.

Ein. Tissue Vorbereitung und Versuchsaufbau <ol><li> Ernte Schweinen Organ unmittelbar nach Euthanasie aus einem Schlachthof oder Forschungseinrichtung und spülen Sie überschüssiges Blut. Schneiden Sie die Herzen von überschüssigem Fett und Gewebe, halten die Vorhöfe und der Aorta intakt. Trim entfernt Fett, um die Lungenarterie aus der Aorta zu trennen. Wenn es irgendwelche Schnitte im Gewebe sind, entsprechend zu verwerfen. </li><li> Wickeln Sie jedes Herz einzeln in Freezer Paper und speichern alle Gewebe in einem -80 ° C Gefrierschrank für mindestens 24 Stunden, um eine vollständige Einfrieren zu gewährleisten. </li><li> Wenn Sie bereit sind für den Einsatz (in der Regel weniger als 3 Monate), Tauwetter ein intaktes gefrorenes Schweinesperma Herz in Type 1 Wasser über Nacht in einem 4-Liter-Becher bei 4 ° C getaucht </li><li> Nachdem das Herz vollständig aufgetaut ist, klopfen die Herzen trockenen, wiegen das Herz, und das Gewicht aufgezeichnet. Das Herz eines Marktes Gewicht Schwein sollte wiegen etwa 375-450 g. </li><li> Schließen Sie Größe 18 Masterflex Schlauch mit dem ¼ &quot;Ende einer Stacheldraht Druckminderer. Legen Sie die Stacheldraht Druckminderer undSchlauch innerhalb der Aorta. Platz 2 Schlauchschellen oder sichere Kabelbinder um die Aorta, knapp unterhalb des Truncus brachiocephalicus. Der Druckminderer und Schlauch muss über der Aortenklappe bleiben, so die Koronararterien perfundiert können (Abbildung 1). </li><li> Verwenden Sie eine 30 oder 60-ml-Spritze, um den Schlauch mit Typ I Wasser zu füllen. Legen Sie den Schlauch in der Patrone eines Masterflex Schlauchpumpe in seiner ungefähren Mittelpunkt. Submerge der Zufluss Ende des Schlauches in den Boden eines 4 L-Becherglas mit 2,5 l Wasser gefüllt und sichern den Schlauch. </li><li> Legen Sie die Herzen im Becher mit Wasser gefüllt, und prime die Pumpe Luftblasen zu entfernen. Wenn Blasen beobachtet werden, die von der Aorta, wo der Schlauch eingelegt wird, kann die Aorta neu positioniert oder mit zusätzlichen Bindungen befestigt werden. Eine luftdichte Dichtung ist wichtig, um eine angemessene Druck während der Dezellularisierung Verfahrens (Abbildung 2) zu halten. </li><li> Legen Sie die 4 L Becherglas mit 3 L einer 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN3 Lösung auf Rührplatte und erwärmen auf 37 ° C bei der Vorbereitung der Dezellularisierung Prozess. </li></ol> 2. Tissue Spülen <ol><li> Die Pumpe auf einer Strömungsgeschwindigkeit von 400 ml / min, wobei auf die korrekte Größe Schlauch ausgewählt ist. Spülen Sie das Herz mit Typ I Wasser für 15-25 min. Da die Pumpe gestartet wird, sollte das Herz anschwellen und effuse Blut aus den Herzkammern. Frische Lösung sollte alle 5-10 min substituiert sein kann, oder als bezogen auf die Menge an Blut aus dem Herzen entnommen benötigt. Wenn Blut nicht vom Herzen ausgegossen, passen die Schläuche und Klemmen wie nötig. </li><li> Stoppen Sie die Pumpe und übertragen das Herz zu einem separaten Becherglas mit 2X Phosphat gepufferten Saline (PBS). Nachdem der Schlauch in der Lösung eingetaucht ist, starten Sie die Pumpe und erhöht den Durchfluss auf 700 ml / min. Das Herz sollte in-Lösung für 15 min bleiben, verändert die Lösung alle 5 min. Jede Lösung Wandel erfordert die Pumpe vorübergehend gestoppt werden, während das Gewebe und Schläuche bewegtauf den neuen Becherglas. </li><li> Übertragen Sie das Herz I Wasser für 10 min Geben und erhöhen den Durchfluss auf 750 ml / min. </li></ol> 3. Dezellularisierung und Solution Perfusion <ol><li> Übertragen Sie die Herzen in das Becherglas mit 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN 3 bei 37 ° C. Erhöhen Sie die Drehzahl der Pumpe bis 1.200 ml / min und starten Sie die Pumpe. Verwenden Sie einen Rührstab am Boden des Bechers zur Lösung im Becherglas zirkulieren platziert. Das Herz sollte im Bereich von 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN 3-Lösung bei 37 ° C für insgesamt drei Stunden bleiben. Nach 1 Stunde erhöht die Drehzahl auf 1500 ml / min. Nach einer weiteren Stunde, erhöhen die Pumpendrehzahl bis 1.800 ml / min. Das Gewebe wird langsam auf erhöhte Geschwindigkeiten Perfusion zur Konditionierung des Gewebes ausgesetzt und verhindern Ruptur der Gefäße. Das Herz wird anschwellen und fast doppelt so groß bei diesem Schritt des Protokolls. Das Gewebe verliert seine natürliche Farbe, fortschreitend von den Vorhöfen zu den Scheitelpunkt gesamten the-Protokoll (Abbildung 3). </li><li> Nach jeder Lösung Perfusion wird ein zweistufiger Spülen durchgeführt wird, um Zelltrümmer, chemischer Rest ist, und Hilfsmittel Zelllyse zu entfernen. Jedes Spülen besteht aus einem 10 min Spülen in Typ I Wasser durch eine 10 min abspülen mit 2X PBS-Lösung bei Raumtemperatur. Jede Wäsche besteht in der Entfernung von Lösung aus dem ursprünglichen Becherglas Zugabe Spüllösungen, und Zirkulieren des Perfusats in den Becher mit dem untergetauchten Herzens. Nach 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN 3-Lösung, Wasser bei perfuse 1900 ml / min und dann perfundieren 2X PBS auf 1950 ml / min. </li><li> Übertragen das Herz zu einer Lösung von 3% Triton X-100/0.05% EDTA/0.05% NaN3 bei Raumtemperatur. Erhöhen Sie die Drehzahl der Pumpe bis 2.000 ml / min und perfuse Lösung für eine Stunde. Entfernen Sie die Lösung aus dem Becherglas und ersetzen mit frischer Lösung, erhöhen Sie die Drehzahl der Pumpe bis 2100 ml / min, und versorgen die frische Lösung für eine weitere Stunde und eine Hälfte, womit sich die gesamte Zeit in3% Triton X-100/0.05% EDTA/0.05% NaN 3 bis 2,5 Stunden. </li><li> Spülen Sie das Gewebe in Typ I Wasser bei 2150 ml / min und 2X PBS bei 2180 ml / min für jeweils 10 Minuten. </li><li> Übertragen das Herz auf eine 4% Natriumdesoxycholat Lösung bei Raumtemperatur. Erhöhen der Pumpgeschwindigkeit, um 2200 ml / min und perfuse Lösung für 3 hr. </li><li> Spülen des Gewebes in Wasser bei Typ I und 2X PBS bei 2200 ml / min für 15 Minuten jeweils, Ändern der Lösungen nach 5-10 min für jede Lösung. Die beschriebenen Schritte Perfusion kann über mehrere Tage durch Durchführen der Spülschritt zweimal und Speichern des Herzens mit aufgesetzter Schlauch über Nacht bei 4 ° C gespalten werden, und eingetaucht in Typ I Wasser. </li><li> Am folgenden Tag, führen Sie eine 5 min mit Typ I Wasser spülen bei 750 ml / min, gefolgt von einer 5 min Spülen in 1X PBS bei 1.500 ml / min. Das Protokoll kann dann bei der beschriebenen Strömungsrate in der richtigen Lösung fortgesetzt. </li></ol> 4. Desinfektion und Endfertigung <ol><li> Übertragen Sie das Herz einer 0,1% peracessigsäure / 4% Ethanol-Lösung und perfuse Lösung für 1,5 h bei 2200 ml / min. </li><li> Die Endspülungen für das Gewebe alle auf 2200 ml / min durchgeführt. Perfundieren des Gewebes mit 1X PBS für 15 min, gefolgt von zwei Waschungen in 5 min Typ I Wasser. Diese Reihe von Spülungen wird noch einmal wiederholt, um die Lösung Perfusion abzuschließen. </li><li> Schalten Sie die Pumpe aus und entfernen Sie das Herz aus der Lösung, um das Herz zu entleeren. Schneiden Sie die Bindungen aus der Aorta, entfernen Sie alle Schläuche, und legen Sie das Herz in ein leeres Becherglas für 1 Stunde abtropfen lassen. Überschüssige Flüssigkeit wird müssen regelmäßig entleert werden. Legen Sie das Herz auf eine saugfähige Unterlage vollständig entleeren das Herz (Abbildung 4). </li><li> Nachdem der größte Teil des Wassers entfernt wird, das Gewicht aufgezeichnet des kardialen extrazellulären Matrix (ECM-C). Das Herz kann erwartet werden ca. 20-25% des ursprünglichen Gewichts während der Dezellularisierung Prozess verliert. </li><li> Sezieren die rechte und linke Herzkammer, sowie die ventrikuläre Septum zur DNA quantificatiauf und histologischen Bearbeitung, um zu bestätigen komplette Dezellularisierung des Gewebes (Abbildung 5). </li><li> Einfrieren der C-ECM bei -80 ° C für mindestens 2 h vor der Lyophilisation. </li></ol>

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Dr. Gilbert war auf dem Scientific Advisory Board bei ACELL, Inc. während der Studie getan wurde, und vor kurzem wurde die VP für Forschung und Entwicklung. ACELL, Inc. vertreibt Harnblase Matrix und hat keine kommerziellen Interessen in der vorliegenden Studie.

Die aktuelle Studie beschriebene Methodik für eine konsistente und effiziente Dezellularisierung eines Schweine Herzen. Das Protokoll war eine Änderung an einem zuvor veröffentlichten Bericht 1 und enthalten längerer Exposition zu fließen und erhöhtem Druck, die mehr wiederholbare Ergebnisse geliefert. Die resultierende dezellularisierten Gewebe erfüllt alle veröffentlichten Kriterien für eine erfolgreiche Dezellularisierung von Gewebe 2. Häufige Änderungen Lösung wurden durchgeführt, um die Wiedereinführung von Zellmaterial auf das Gewebe zu begrenzen, und die Dauer der Exposition gegenüber jedem Dezellularisierung Mittel wurde minimiert, um negative Auswirkungen auf die ECM reduzieren. Während der Anfangsphase des Protokolls wurde die Perfusionsrate allmählich zur Konditionierung des Gewebes erhöht und erlauben höhere Fließgeschwindigkeiten während der späteren Stufen des Protokolls. Ohne Konditionierung des Gewebes in den frühen Stadien kann das Gefäßsystem des Herzens Reißen, wodurch die Durchblutung des Herzens unmöglich. Der Prototypcol wurde aufgrund seiner Leistungsfähigkeit, verwendet und keine Ansprüche an seine Überlegenheit über andere Protokolle gemacht. Die genaue Zusammensetzung der Dezellularisierung Agenten und Preise der Perfusion kann möglicherweise verändert werden, um ein Protokoll mit besseren mechanischen oder biologischen Eigenschaften zu erhalten, aber die allgemeinen Grundsätze für die Lieferung von den Agenten des Herzens gelten. Die Erhaltung der nativen dreidimensionalen Struktur des Herzens wurde auf mehrere Verfahren in der Dezellularisierung Protokoll durchgeführt zugeschrieben. Zuerst wurde das Gewebe zu befreien und eingefroren bei Ankunft. Einfrieren gefördert Zelllyse und war für Vorkonditionieren des Gewebes für die Perfusion Zyklen wichtig. Das Gewebe wurde gründlich Schnitte und 2 cm intakte intakten Aorta überlegen der Aortenklappe inspiziert. Wenn überhaupt Epikard Perikard oder geschnitten wurde, wurde das Organ verworfen, da das Perfusat nicht erreichte stromabwärtigen Regionen des Herzens, und das Herz wurde nicht vollständig dezellularisiert.Als nächstes wurde das Gewebe vollständig in Typ I Wasser vor der Verwendung aufgetaut. Das Wasser erlaubt das Gewebe zu entspannen, wie es aufgetaut und auch begünstigt die Entfernung von restlichem Blutgerinnsel innerhalb des Herzens. Schließlich wird, wie das Rohr eingeführt wurde, wurde darauf geachtet, dass die Aortenklappe intakt blieb so dass er eine wasserdichte Abdichtung rund um den Schlauch gebildet, so dass eine geeignete Druck gehalten wurde und daß die Lösung in die Koronararterien eingesetzt. Nachdem jede Dezellularisierung Protokoll abgeschlossen war, wurden eine Reihe von Maßnahmen zur Qualitätskontrolle durchgeführt, um eine vollständige Entfernung von Zellmaterial gewährleisten. Die derzeitige Studie verifiziert, dass das Protokoll histologischen Färbung für Zellkerne eliminiert, zeigte, dass weniger als 50 ng DNA vorliegenden pro mg Trockengewicht des Gewebes war, und dass eine beliebige DNA weniger als 200 bp in der Größe 6 war. Zuvor veröffentlichte Methoden zur kardialen Dezellularisierung zeigten ähnliche Ebenen Dezellularisierung in DNA-Färbung und Quantifizierung2,5,9,10. Komplette Dezellularisierung wurde in diesen Studien mit ähnlichen Behandlungen von Enzymen und Detergentien erreicht. Jedoch in der vorliegenden Studie, die Dauer der Exposition gegenüber jeder chemischen erhöht wurde, gab es mehr Lösung ändert, und die Strömungsraten wurden erhöht. Das vorliegende Protokoll erhöhte auch die Länge der chemischen Spülungen, was möglicherweise zur effizienteren Entfernung von chemischen Rückständen aus der extrazellulären Matrix. Rezellularisierung dezellularisierten Rattenherzen mit kardialen bestimmte Zellen hat viel versprechende Ergebnisse in vitro 2,5 ergab. Whole Organperfusion Dezellularisierung zur Wartung des nativen Vaskulatur, die kritisch Rezellularisierung des Gewebes erlaubt. Die inhärenten Wachstumsfaktoren, Matrixproteine, und dreidimensionale Faserarchitektur auch ordnungsgemäße Zellanheftung, Migration und Signalisierung zu rekonstituieren kontraktilen Myokardgewebe gefördert. Porcine kardialen extrazellulärenlar Matrix wird schwieriger zu recellularize aufgrund der Größe des Gerüsts und der Anzahl der Zellen die für eine einwandfreie Zellkommunikation und Nährstofftransport. Jedoch kann Patches vom kardialen Matrix geschnitten nützlich für die in vivo-Anwendungen. Mehrere Studien haben den potentiellen Vorteil der Verwendung einer ortsspezifischen Matrix zur Rekonstruktion von beschädigten Gewebes in Tiermodellen 11-13 gezeigt. Somit ist eine extrazelluläre Matrix Gerüst von Herzgewebe abgeleitet wünschenswert myokardialen Rekonstruktion Anwendungen. Die inhärente Architektur des Herzgewebes kann Vorteile gegenüber einer ECM Gerüst aus einem anderen Organ oder einem künstlichen Biomaterial abgeleitet präsentieren. Eine ortsspezifische Gerüst darf unterstützt Host-Zell-Infiltration und fördern eine konstruktive Umgestaltung Antwort, um die Bildung von Narbengewebe entgegen. Bisher wurden kardialen ECM Patches in vivo untersucht, um einen Defekt in dem myokardialen Wand 14 angelegt rekonstruieren. Zukünftige StudierendeGesenke werden in vitro durchgeführt werden, um die Fähigkeit des Gerüsts zu Herzzellen ausgesät und auf der Matrix kultiviert unterstützt untersuchen. Die hierin beschriebenen Verfahren können auch für Dezellularisierung von menschlichen Herzen. Zusammenfassend ist Schweineherz Dezellularisierung möglich und die Methoden sind geradlinig. Fortlaufende Untersuchung dieses Materials wird Einblick in das Potential für den klinischen Einsatz bereitzustellen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Material </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Trypsin </td><td> Gibco </td><td> 15090 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Fischer </td><td> BP120-500 </td><td></td></tr><tr><td> NaN 3 </td><td> Sigma </td><td> S2002-500G </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma </td><td> X100-1L </td><td></td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> Fischer </td><td> BP399-20 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumdesoxycholat </td><td> Sigma </td><td> D6750-500G </td><td></td></tr><tr><td> Peressigsäure </td><td> Pfaltz und Bauer </td><td> P05020 </td><td> 35% CAS # 79-21-0 </td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> Pharmco </td><td> 111000200 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Masterflex Pump Drive </td><td> Cole Parmer </td><td> SI-07.524-50 </td><td></td></tr><tr><td> Masterflex Tubing </td><td> Cole Parmer </td><td> 96400-18 </td><td> Größe 18 </td></tr><tr><td> Barbed Reducer </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-30.612-20 </td><td></td></tr><tr><td> 4L Beaker </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-540T </td><td></td></tr></tbody></table>

procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion

Perfusion-basierte ganzen Organs Dezellularisierung hat kürzlich Interesse im Bereich des Tissue Engineering als Mittel zur ortsspezifischen extrazellulären Matrix Gerüsten erstellen, gewann unter weitgehender Erhaltung der einheimischen Architektur des Gerüsts. Bisher hat dieser Ansatz in einer Vielzahl von Organsysteme verwendet worden, einschließlich Herz, Lunge, Leber und 1-5. Vorherige Verfahren zur Dezellularisierung Gewebe ohne eine leicht zugängliche Gefäßnetz haben bei längerer Exposition von Gewebe, Lösungen von Detergentien, Säuren oder enzymatische Behandlungen als Mittel, um die zellulären und atomare Bestandteile aus dem umgebenden extrazellulären Umgebung 6-8 entfernen gestützt. Allerdings ist die Wirksamkeit dieser Verfahren gelenkig auf der Fähigkeit der Lösungen das Gewebe durch Diffusion eindringen. Im Gegensatz dazu Perfusion von Organen durch die natürliche Gefäßsystem wirksam reduziert den Diffusionsweg und erleichtert den Transport von decellularizatiMittel zum in das Gewebe und zellulären Komponenten aus der Gewebe. Hier beschreiben wir eine Methode, um vollständig decellularize eine intakte Schweine Herzen durch koronare retrograde Perfusion. Das Protokoll ergab ein voll dezellularisierte kardialen extrazellulären Matrix (ECM-c) Gerüst mit der dreidimensionalen Struktur des Herzens intakt. Unser Verfahren verwendet eine Reihe von Enzymen, Detergentien und Säuren mit hypertonischen und hypotonischen Spülungen gekoppelt in der Lyse und Entfernung von Zellen unterstützen. Das verwendete Protokoll eine Trypsin-Lösung, um Zellen von der Matrix durch Triton X-100 und Natriumdesoxycholat Lösungen gefolgt, um die Entfernung von Zellmaterial unterstützen lösen. Die beschriebene Protokoll verwendet auch Perfusion Geschwindigkeiten von mehr als 2 l / min für verlängerte Zeiträume. Die hohe Strömungsgeschwindigkeit, mit der Lösung Änderungen erlaubt den Transport von Agenten des Gewebes ohne Kontamination von Zelltrümmern und gekoppelt gewährleistet effektive Spülung des Gewebes. Das beschriebene Verfahren entfernt alle Kernmaterial von native porcinen Herzgewebe, die Schaffung eines ortsspezifischen kardialen ECM Gerüst, das für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet werden kann.

Die Wirkung der Dezellularisierung auf ganze Schweineherzen variiert natürlich aufgrund der Unterschiede in der Größe, Drücke und Behälteranordnung. Daher wird die genaue Zusammensetzung der extrazellulären Matrix abgeleiteten Gerüsten nicht dasselbe vom Herzen zum Herzen. Der Abschluss der beschriebenen Protokoll erbringt ein Herz, das weiße oder durchscheinende zeigt an, den Verlust an Zellmaterial. Es ist jedoch allgemein anerkannt, dass ein Gewebe angesehen werden &quot;dezellularisierte&quot; auf die Kombination von einigen weiteren quantitativen Parameter 8 basieren. Eine erfolgreiche Dezellularisierung Protokoll wird eine Matrix mit weniger als 50 ng doppelsträngige DNA pro mg Gewebe (Abbildung 6) zu erzeugen. Um eine Immunantwort nach Implantation der Matrix zu vermeiden, sollte die verbliebenen DNA enthalten auch weniger als 200 Basenpaaren (Abbildung 7). Um diese Ergebnisse zu bestätigen, sollten Hämatoxylin und Eosin Färbung zeigen die Abwesenheit von nuklearenAnfärben in repräsentative Abschnitte der Ventrikel und ventrikulären Septums (Abbildung 8). Masson Trichrome bestätigt weiterhin den Verlust von Herzmuskel Bündeln und Retention von Kollagen Netze (Abbildung 9). <img src="/files/ftp_upload/50059/50059fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Widerhaken Ende des Schlauchs in die Aorta des natürlichen Herzens eingefügt. Der Schlauch muss mit Schlauchschellen oder Kabelbinder über der Aortenklappe gesichert werden, um die Perfusion durch die Koronararterien zu gewährleisten. <img src="/files/ftp_upload/50059/50059fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Das Herz wird in Wasser in einem Becherglas 4L und Luftblasen untergetauchten müssen aus der Rohrleitung entfernt werden. Wenn Blasen beobachtet werden, die sich aus der Aorta in der Nähe der Schläuche, müssen zusätzliche Verbindungen verwendet werden, um den Schlauch an t sichern<html> er Aorta, um ausreichenden Druck in dem Gewebe zu halten. <img src="/files/ftp_upload/50059/50059fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Als Lösungen durch die Koronararterien perfundiert werden, wird das Herz verliert seine native Farbe, fortschreitend von den Vorhöfen auf die Herzspitze und lokalisierte um die Koronararterien. <img src="/files/ftp_upload/50059/50059fig4.jpg" alt="Abbildung 4"/> Abbildung 4. Nach Beendigung des Desinfektions-und Spülschritte des Protokolls, der Schlauch wird entfernt und das Herz wird auf einem saugfähigen Kissen platziert, damit das überschüssige Wasser abfließen kann des Herzens. Dies gewährleistet eine präzise Messung beim Wiegen das Gewebe und erlaubt auch das Gewebe vor dem Schneiden zu entspannen. pg &quot;alt =&quot; Bild 5 &quot;/&gt; Abbildung 5. Der linke Ventrikel (LV), rechter Ventrikel (RV) und Ventrikelseptum sind alle aus dem Herzen dezellularisierte zur histologischen Verarbeitung, Gefrieren und Lyophilisierung und DNA-Quantifizierung entfernt. <img src="/files/ftp_upload/50059/50059fig6.jpg" alt="Abbildung 6" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50059/50059fig6highres.jpg"/> Abbildung 6. Quantitative Analyse von DNA-Material mit einem Pico Grün Assay. Die Ventrikel aus CECM Herzen zeigen eine signifikante Abnahme der DNA-Gehalt als in den einheitlichen Ventrikel verglichen. Die DNA-Werte aus diesem Protokoll werden beobachtet bei oder unterhalb der 50 ng / mg Standard für dezellularisiertes Gewebe beobachtet. <img src="/files/ftp_upload/50059/50059fig7.jpg" alt="Abbildung 7"/> Abbildung 7. DNA-Fragment Größe, wie ethidiu ermitteltm bromide Gel, zeigte wenig Rest-DNA in den dezellularisierten Herzkammern, wenn sie einer Harnblase Matrix (UBM) Standard verglichen. <img src="/files/ftp_upload/50059/50059fig8.jpg" alt="Abbildung 8" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50059/50059fig8highres.jpg"/> Abbildung 8. Hämatoxylin und Eosin-Färbung zeigte eine vollständige Entnahme von Kernmaterial aus den Ventrikeln nach Abschluss der Dezellularisierung Protokoll. <img src="/files/ftp_upload/50059/50059fig9.jpg" alt="Abbildung 9" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50059/50059fig9highres.jpg"/> Abbildung 9. Masson Trichromfärbung A) native und B) dezellularisierten Ventrikels.

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Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

Ein Verfahren, um schnell und vollständig zu entfernen zellulären Komponenten aus einer intakten Schweineherz durch retrograde Perfusion wird beschrieben. Dieses Verfahren ergibt eine ortsspezifische kardialen extrazellulären Matrix Gerüst, das das Potential für die Verwendung in einer Vielzahl von klinischen Anwendungen hat.

Verfahren für Dezellularisierung der Porcine Heart von Retrograde Coronary Perfusion

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

23.8K Aufrufe.  McGowan Institute for Regenerative Medicine. Ein Verfahren, um schnell und vollständig zu entfernen zellulären Komponenten aus einer intakten Schweineherz durch retrograde Perfusion wird beschrieben. Dieses Verfahren ergibt eine ortsspezifische kardialen extrazellulären Matrix Gerüst, das das Potential für die Verwendung in einer Vielzahl von klinischen Anwendungen hat.

Serie: Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to recreate or mimic the liver microstructure with grounds up approach using tissue engineering and microfabrication techniques have not been successful so far due to this design challenge. In addition, synthetic biomaterials used to create scaffolds for liver tissue engineering applications have been limited in inducing tissue regeneration and repair in large part due to the lack of specific cell binding motifs that would induce the proper cell functions2. Decellularized native tissues such blood vessels3and skin4on the other hand have found many applications in tissue engineering, and have provided a practical solution to some of the challenges. The advantage of decellularized native matrix is that it retains, to an extent, the original composition, and the microstructure, hence enhancing cell attachment and reorganization5.
In this work we describe the methods to perform perfusion-decellularization of the liver, such that an intact liver bioscaffold that retains the structure of major blood vessels is obtained. Further, we describe methods to recellularize these bioscaffolds with adult primary hepatocytes, creating a liver graft that is functional in vitro, and has the vessel access necessary for transplantation in vivo.

Perfusion decellularization is a novel technique to produce whole liver scaffolds that retains the organ's extracellular matrix composition and microarchitecture. Herein, the method of preparing whole organ scaffolds using perfusion decellularization and subsequent repopulation with hepatocytes is described. Functional and transplantable liver grafts can be generated using this technique.

Dezellularisierung und Recellularization von Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Forschung

Biotechnik

Procedure for Lung Engineering

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths annually; chronic obstructive pulmonary disease is currently the fourth leading cause of death in the United States1. Contributing to this mortality is the fact that lungs do not generally repair or regenerate beyond the microscopic, cellular level. Therefore, lung tissue that is damaged by degeneration or infection, or lung tissue that is surgically resected is not functionally replaced in vivo. To explore whether lung tissue can be generated in vitro, we treated lungs from adult rats using a procedure that removes cellular components to produce an acellular lung extracellular matrix scaffold. This scaffold retains the hierarchical branching structures of airways and vasculature, as well as a largely intact basement membrane, which comprises collagen IV, laminin, and fibronectin. The scaffold is mounted in a bioreactor designed to mimic critical aspects of lung physiology, such as negative pressure ventilation and pulsatile vascular perfusion. By culturing pulmonary epithelium and vascular endothelium within the bioreactor-mounted scaffold, we are able to generate lung tissue that is phenotypically comparable to native lung tissue and that is able to participate in gas exchange for short time intervals (45-120 minutes). These results are encouraging, and suggest that repopulation of lung matrix is a viable strategy for lung regeneration. This possibility presents an opportunity not only to work toward increasing the supply of lung tissue for transplantation, but also to study respiratory cell and molecular biology in vitro for longer time periods and in a more accurate microenvironment than has previously been possible.

We have developed a decellularized lung extracellular matrix and novel biomimetic bioreactor that can be used to generate functional lung tissue. By seeding cells into the matrix and culturing in the bioreactor, we generate tissue that demonstrates effective gas exchange when transplanted in vivo for short periods of time.

Vorgehensweise für Lung Technik

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

Successful tissue engineering involves the combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo. Scaffolds may be synthetic, naturally-derived or derived from tissues/organs. The latter are obtained using a technique called decellularization. Decellularization may involve a combination of physical, chemical, and enzymatic methods. The goal of this technique is to remove all cellular traces whilst maintaining the macro- and micro-architecture of the original tissue.
Intestinal tissue engineering has thus far used relatively simple scaffolds that do not replicate the complex architecture of the native organ. The focus of this paper is to describe an efficient decellularization technique for rat small intestine. The isolation of the small intestine so as to ensure the maintenance of a vascular connection is described. The combination of chemical and enzymatic solutions to remove the cells whilst preserving the villus-crypt axis in the luminal aspect of the scaffold is also set out. Finally, assessment of produced scaffolds for appropriate characteristics is discussed.

The article describes a methodology for the production of an acellular matrix from rat intestine. The derivation of intestinal scaffolds is important for future applications in tissue engineering, stem cell biology and drug testing.

Ein Dezellularisierung Methodik für die Herstellung von Naturdarm Azelluläre Matrix

Successful tissue engineering involves the  combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo.  Scaffolds may be synthetic, ...

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an attractive alternative to classic organ transplantation. This technology utilizes an organ&#39;s natural biological extracellular matrix (ECM) as a scaffold onto which autologous or stem/progenitor cells may be seeded and cultured in such a way that facilitates regeneration of the original tissue. The natural ECM is isolated by a process called decellularization. Decellularization is accomplished by treating tissues with a series of detergents, salts, and enzymes to achieve effective removal of cellular material while leaving the ECM intact. Studies conducted utilizing decellularization and subsequent recellularization of rodent lungs demonstrated marginal success in generating pulmonary-like tissue which is capable of gas exchange in vivo. While offering essential proof-of-concept, rodent models are not directly translatable to human use. Nonhuman primates (NHP) offer a more suitable model in which to investigate the use of bioartificial organ production for eventual clinical use.
The protocols for achieving complete decellularization of lungs acquired from the NHP rhesus macaque are presented. The resulting acellular lungs can be seeded with a variety of cells including mesenchymal stem cells and endothelial cells. The manuscript also describes the development of a bioreactor system in which cell-seeded macaque lungs can be cultured under conditions of mechanical stretch and strain provided by negative pressure ventilation as well as pulsatile perfusion through the vasculature; these forces are known to direct differentiation along pulmonary and endothelial lineages, respectively. Representative results of decellularization and cell seeding are provided.

Whole-organ decellularization produces natural biological scaffolds that may be used for regenerative medicine. The description of a nonhuman primate model of lung regeneration in which whole lungs are decellularized and then seeded with adult stem cells and endothelial cells in a bioreactor that facilitates vascular circulation and liquid media ventilation is presented.

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent liver decellularization have already been published. We aimed to improve the decellularization process by construction of a proprietary perfusion device enabling selective perfusion via the portal vein and/or the hepatic artery. Furthermore, we sought to perform perfusion under oscillating surrounding pressure conditions to improve the homogeneity of decellularization. The homogeneity of perfusion decellularization has been an underestimated factor to date. During decellularization, areas within the organ that are poorly perfused may still contain cells, whereas the extracellular matrix (ECM) in well-perfused areas may already be affected by alkaline detergents. Oscillating pressure changes can mimic the intraabdominal pressure changes that occur during respiration to optimize microperfusion inside the liver. In the study presented here, decellularized rat liver matrices were analyzed by histological staining, DNA content analysis and corrosion casting. Perfusion via the hepatic artery showed more homogenous results than portal venous perfusion did. The application of oscillating pressure conditions improved the effectiveness of perfusion decellularization. Livers perfused via the hepatic artery and under oscillating pressure conditions showed the best results. The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

Verfahren für Dezellularisierung von Rattenlebern in einer oszillierenden Druck Perfusionsvorrichtung

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor biocompatibility, and cost. Plant tissues have favorable characteristics that make them uniquely suited for use as scaffolds, such as high surface area, excellent water transport and retention, interconnected porosity, preexisting vascular networks, and a wide range of mechanical properties. Two successful methods of plant decellularization for tissue engineering applications are described here. The first method is based on detergent baths to remove cellular matter, which is similar to previously established methods used to clear mammalian tissues. The second is a detergent-free method adapted from a protocol that isolates leaf vasculature and involves the use of a heated bleach and salt bath to clear the leaves and stems. Both methods yield scaffolds with comparable mechanical properties and low cellular metabolic impact, thus allowing the user to select the protocol which better suits their intended application.

Here we present, and contrast two protocols used to decellularize plant tissues: a detergent-based approach and a detergent-free approach. Both methods leave behind the extracellular matrix of the plant tissues used, which can then be utilized as scaffolds for tissue engineering applications.

Zwei Methoden zur Decellularization von Pflanzengewebe für Tissue-Engineering-Anwendungen

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and poor patency. Tissue engineering offers a novel solution to generate personalized grafts with a natural extracellular matrix containing the recipient&#39;s cells using the method of decellularization and recellularization. We show a detailed method for performing decellularization of the human saphenous vein and recellularization by perfusion of peripheral blood. The vein was decellularized by perfusing 1% Triton X-100, 1% tri-n-butyl-phosphate (TnBP) and 2,000 Kunitz units of deoxyribonuclease (DNase). Triton X-100 and TnBP were perfused at 35 mL/min for 4 h while DNase was perfused at 10 mL/min at 37 &#176;C for 4 h. The vein was washed in ultrapure water and PBS and then sterilized in 0.1% peracetic acid. It was washed again in PBS and preconditioned in endothelial medium. The vein was connected to a bioreactor and perfused with endothelial medium containing 50 IU/mL heparin for 1 h. Recellularization was performed by filling the bioreactor with fresh blood, diluted 1:1 in Steen solution, and adding endocrine gland-derived vascular endothelial growth factors (80 ng/mL), basic fibroblast growth factors (4 &#181;L/mL), and acetyl salicylic acid (5 &#181;g/mL). The bioreactor was then moved into an incubator and perfused for 48 h at 2 mL/min while maintaining glucose between 3 - 9 mmol/L. Later, the vein was washed with PBS, filled with endothelial medium and perfused for 96 h in the incubator. Treatment with Triton X-100, TnBP and DNase decellularized the saphenous vein in 5 cycles. The decellularized vein looked white in contrast to normal and recellularized veins (light red). The hematoxylin &#38; eosin (H&#38;E) staining showed the presence of nuclei only in normal but not in decellularized veins. In the recellularized vein, H&#38;E-staining showed the presence of cells on the luminal surface of the vein.

Here, we describe a protocol for the saphenous vein decellularization using detergents and recellularization by perfusion of the peripheral blood and the endothelial medium.

Decellularization und Recellularization Methoden für menschliche Saphenous Adern

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and ...

Decellularization of Whole Human Heart Inside a Pressurized Pouch in an Inverted Orientation

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ultimately rejection can occur. Creating a functional, autologous bio-artificial heart could solve these challenges. Biofabrication of a heart comprised of scaffold and cells is one option. A natural scaffold with tissue-specific composition as well as micro- and macro-architecture can be obtained by decellularizing hearts from humans or large animals such as pigs. Decellularization involves washing out cellular debris while preserving 3D extracellular matrix and vasculature and allowing &#34;cellularization&#34; at a later timepoint. Capitalizing on our novel finding that perfusion decellularization of complex organs is possible, we developed a more &#34;physiological&#34; method to decellularize non-transplantable human hearts by placing them inside a pressurized pouch, in an inverted orientation, under controlled pressure. The purpose of using a pressurized pouch is to create pressure gradients across the aortic valve to keep it closed and improve myocardial perfusion. Simultaneous assessment of flow dynamics and cellular debris removal during decellularization allowed us to monitor both fluid inflow and debris outflow, thereby generating a scaffold that can be used either for simple cardiac repair (e.g. as a patch or valve scaffold) or as a whole-organ scaffold.

This method enables decellularization of a complex solid organ using a simple protocol based on osmotic shock and perfusion of ionic detergent with minimal organ matrix disruption. It comprises a novel decellularization technique for human hearts inside a pressurized pouch with real-time monitoring of flow dynamics and cellular debris outflow.

Decellularization des ganzen menschlichen Herz in einem unter Druck stehenden Beutel in eine umgekehrte Orientierung

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ...

Isolation and Decellularization of a Whole Porcine Pancreas

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an allogeneic or xenogeneic source with human cells. A demonstration of methods for the efficient dissection, decellularization, and recellularization of porcine pancreas might benefit the field. Akin to human pancreases, porcine pancreases have a special anatomical arrangement with three lobes (splenic, duodenal, and connection) rounded by the duodenum and small intestine. The duodenal lobe of the pancreas connects to the duodenum by several small blood vessels. Tissue engineering of the pancreas is complicated because of its exocrine and endocrine nature. In this paper, we show a detailed protocol to dissect the whole porcine pancreas and decellularize it with detergents while saving its structure and some extracellular matrix components. To achieve complete perfusion, the aorta is chosen as inlet and the portal vein as outlet. The other blood vessels (hepatic artery, splenic vein, splenic artery,&#160;mesenteric artery and vein tree) and bile duct are ligated. To prevent the formation of thrombus, the pig is heparinized and, immediately after dissection, the organ is flushed with cold heparin. To inhibit the action of exocrine enzymes, the pancreas decellularization is set at 4 &#176;C. The decellularization is performed by perfusion of Triton X-100, sodium deoxycholate, and deoxyribonuclease, with an intermittent and final extensive washing. With a successful decellularization, the pancreas appears white, and a histological evaluation with hematoxylin and eosin shows an absence of nuclei with a preserved extracellular matrix structure. Thus, the proposed method can be used to successfully dissect and decellularize whole porcine pancreas.

Tissue engineering of the whole pancreas is a challenge because of its exocrine and endocrine functions. We show a method for the dissection of an intact porcine pancreas and the process of successful decellularization by perfusion of detergents Triton X-100, sodium deoxycholate, and deoxyribonuclease.

Isolation und Decellularization eine ganze Schweine Pankreas

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.