Vorremmo ringraziare il Professor Anders Jeppsson per aiuto con fornire vasi sanguigni utilizzati negli esperimenti. Questo studio è stato finanziato dalla sovvenzione LUA ALF a SSH.

Il tessuto utilizzato, e il protocollo di questa carta segue le linee guida etiche dell'Università di Göteborg.
1. stoccaggio e preparazione tessuto
<ol><li>Tagliare il tessuto circostante dalla vena safena estratto utilizzando forbici e pinze chirurgiche. Nota: La vena safena viene sezionata da arto inferiore degli esseri umani da chirurghi vascolari. La vena safena utilizzata in questa carta è una parte inutilizzata dopo intervento di bypass.</li>
	<li>Per evitare perdite durante l'aspersione, lega i rami laterali alle loro estremità con suture ed il forcipe.</li>
	<li>Mantenere la vena in una provetta da 50 mL contenente 40 mL di soluzione salina tampone fosfato (PBS). Lavare la vena modificando PBS 2 - 3 volte per rimuovere il sangue in eccesso. Memorizzare la vena di congelamento a-80 ° C.</li>
</ol>2. preparazione di decellularizzazione configurazioni e ricellularizzazione bioreattore
Nota: Utilizzando le forbici, tagliare i tubi in silicone come mostrato in tabella 1.
<ol><li>
Installazione di decellularizzazione 1 (per aspersione Triton X-100 e lavaggio)
	<ol>
<li>A un 2 L da camera (vasca di plastica), nastro tutti i tre pezzi di tubo A come mostrato in Figura 1A. Nota: Nastro una provetta per una parete dove il bordo tocca il fondo della camera (ingresso di detersivo) e gli altri due tubi a parete opposta con una distanza di 5-10 cm in mezzo a seconda della lunghezza della vena. Almeno 5 cm di questi tubi dovrebbe essere registrata anche al piano della camera (di vena ingresso e uscita).</li>
		<li>Utilizzando i connettori Luer maschi e femminili, collegare in serie dell'ingresso di detergente tubo B seguita da tubo F, tubo C e infine verso l'ingresso della vena. Posto il tubo F nel cassetto della peristaltica pompa io.</li>
		<li>Prendere un altro tubo C e collegare un'estremità alla presa di vena. Posizionare l'altra estremità nel vaso di vetro con l'uscita del tubo inferiore che è posto 45 cm sopra la camera (presa di detersivo) e nastro adesivo per fissare. Prendere metropolitana G e inserite un'estremità alla presa del tubo del vaso di vetro e inserire l'altra estremità della camera della vena. Nota: Le immagini di installazione completa (frecce rosse), da camera e direzione di flusso (frecce bianche) sono mostrate in Figura 1A.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Installazione di decellularizzazione 2 (attendersi per aspersione)
	<ol>
<li>Prendete un vasetto di vetro 1L e inserire un'estremità del tubo C (aspirazione detergente) nel barattolo fino a quando il tubo tocca il fondo del vaso.</li>
		<li>Collegare l'altra estremità al tubo F seguita da tubo C. posto l'altra estremità del tubo C nel vaso fino a metà profondità (ingresso di vena). Inserire la cassetta della pompa peristaltica tubo F io.</li>
		<li>Tubo D di prendere e posizionare un'estremità nel vaso (presa di vena) fino a metà profondità e l'altra estremità nel vaso di vetro con il tubo inferiore posizionato ad un'altezza di 45 cm dall'ingresso di vena (presa di detersivo). Per proteggere, nastro tubi di aspirazione e mandata di detersivo.</li>
		<li>Mettere il barattolo di vetro 1L su un agitatore magnetico e tenere il magnete all'interno della bottiglia.</li>
		<li>Prendere metropolitana G e inserite un'estremità sull'uscita del tubo del vaso di vetro e inserire l'altra estremità nel vaso di vetro di 1 L. Nota: L'immagine di installazione completa (frecce rosse), camera e flusso di direzione (frecce bianche) è mostrata in Figura 1B.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Installazione di decellularizzazione 3 (aspersione per DNasi)
	<ol>
<li>Prendere un flacone di vetro da 250 mL e inserire la cassetta della pompa peristaltica II di entrambe le estremità del tubo C. posto l'area centrale del tubo. Nota: Un'estremità del tubo è l'insenatura di soluzione e l'altra estremità del tubo è collegata all'ingresso di vena. Presa di vena è lasciato libero in soluzione.</li>
		<li>Posizionare l'intero setup tra cui pompa a 37 ° C. L'immagine di installazione completa e la direzione del flusso è illustrato nella Figura 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ricellularizzazione bioreattore
	<ol>
<li>Tenere pronto il tutto come mostrato in Figura 2A.</li>
		<li>Come mostrato nella Figura 2B, prendete il tappo 4-port e inserire ogni porta, H (presa di vena) del tubo, tubo I (ingresso media) e J (ingresso di vena) del tubo. Inserire l'altra estremità del tubo H nella porta 4th (organo di stampa). Nota: La visualizzazione della PAC 4 porte dall'alto è illustrata nella Figura 2. Per un facile inserimento dei tubi, tagliare i bordi di una punta acuminata con una forbice.</li>
		<li>Piegare l'altra estremità del tubo di J in una forma di U e legarla con un filo di sutura. Collegare i connettori riducendo all'estremità interna del tubo H & J.</li>
		<li>Inserire il tubo da 60 mL con una base piatta il flacone di vetro da 250 mL e poi inserire la configurazione fatta sopra il tubo come mostrato in Figura 2D. Come illustrato nella Figura 2E, collegare tubi K, E e K in serie. Collegare un tubo K all'ingresso di vena e un altro tubo K all'entrata del media. Nota: Il diagramma schematico della installazione e direzione del flusso è visto in Figura 2F.</li>
		<li>Sterilizzare in autoclave del bioreattore.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. preparazione delle soluzioni
<ol><li>Soluzione 1 (10 x acqua): A 1 L di acqua ultrapura, aggiungere 2 g di sodio azide e 18,6 g di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA). Mescolare fino a quando sali disciolti.</li>
	<li>Soluzione 2 (1 x acqua): prendere 100 mL di soluzione 1 e aggiungere 900 mL di acqua ultrapura.</li>
	<li>Soluzione 3 (5 x Triton X-100): A 950 mL di acqua ultrapura, aggiungere 50 mL di Triton X-100, 1 g di sodio azide e 9,3 g di EDTA. Mescolare fino a scioglimento.</li>
	<li>Soluzione 4 (1 x Triton X-100): prendere 200 mL di soluzione 3 e aggiungere 800 mL di acqua ultrapura.</li>
	<li>Soluzione 5 (1 x TnBP): aggiungere 10 mL di attendersi con una pipetta 10ml a 990 mL di soluzione 2.</li>
	<li>Soluzione 6 (40 Kunitz unità/mL DNasi): aggiungere 2.000 Kunitz unità di DNaseI in 50 mL di tampone fosfato salino di Dulbecco contenente CaCl2 e MgCl2. Preparare fresco e utilizzare immediatamente.</li>
	<li>Soluzione 7 (PBS): Aggiungere 24 g di cloruro di sodio, 0,6 g di cloruro di potassio, 4,32 g di fosfato di sodio e 0,72 g di fosfato di potassio a 3 L di acqua ultrapura. Mescolare fino a scioglimento. Regolare il pH a 7.4. 1 L di PBS in autoclave di sterilizzare e conservare separatamente.</li>
	<li>Soluzione 8 (0,1% acido peracetico): 50 mL di soluzione sterile 7, aggiungere 50 µ l di acido peracetico. Preparare fresco e utilizzare immediatamente.</li>
</ol>4. preparazione del mezzo endoteliale
<ol><li>Aggiungere 5 mL di L-Glutammina, 5 mL di anti-anti, 50 mL di siero umano AB e tutti i componenti del kit di fattore di crescita di EGM-2 tranne siero bovino fetale per 500 mL di terreno MCDB131 sotto una cappa sterile.</li>
</ol>5. decellularizzazione di vena safena
<ol><li>Scongelare la vena safena umana da-80 ° C a temperatura ambiente. Congelare di nuovo a-80 ° C e ancora scongelare a temperatura ambiente.</li>
	<li>Tagliare una biopsia di 2 mm di lunghezza con le forbici e difficoltà in formaldeide per 24-48 h a temperatura ambiente. Fare ogni estremità della vena per gli strali di un connettore Luer maschio e femmina con una sutura.</li>
	<li>Collegare la vena al setup di decellularizzazione 1 e riempire 1 L di soluzione 2. Irrorare per 15 min a 35 mL/min. svuotare il contenuto del setup.</li>
	<li>Aggiungere 1 L di soluzione 4 e irrorare per 4 h a 35 mL/min. svuotare il contenuto del setup.</li>
	<li>Aggiungere 500 mL di soluzione 2 e irrorare per 5 min. svuotare il contenuto del setup. Ripetere questo passaggio. Scollegare la vena dal setup di perfusione 1 e connettersi al programma di installazione di aspersione 2.</li>
	<li>Aggiungere 1 L di soluzione 5, accendere l'agitatore e irrorare per 4 h a 35 mL/min. Nota: La soluzione 5 sembra nuvoloso dopo la svolta sull'agitatore e durante l'aspersione.</li>
	<li>Scollegare la vena dal programma di installazione di aspersione 2 e lavare la vena dentro e fuori con siringa o una pipetta 10ml in 4 cambi di acqua ultrapura per 5-10 min.</li>
	<li>Collegare la vena alla installazione di aspersione 3, aggiungere 50 mL di soluzione 6 e irrorare a 10 mL/min in una camera a 37 ° C per 4 h. svuotare il contenuto del setup e scollegare la vena dal setup.</li>
	<li>Collegare la vena al setup di perfusione 1, riempire 1 L di soluzione 2 e irrorare durante la notte a 35 mL/min. Ripetere il punto 5.4 al passaggio 5.9 4 volte (per un totale di 5 cicli). Prendere una biopsia nuovamente come indicato al punto 5.2. Nota: Ignora passaggio 5,8 seconda parte nei cicli 1 e 3.</li>
	<li>Svuotare il contenuto del setup. Riempire 1 L di soluzione 2 e irrorare per 24 h a 35 mL/min soluzione modifiche 2 dopo 12 h. svuotare il contenuto del setup. Riempire 1L di acqua ultrapura e irrorare per 24 h a 35 mL/min cambia l'acqua ultrapura dopo 12 h.Empty il contenuto del setup. Riempire 1 L di soluzione 7 e irrorare per 24 h a 35 mL/min soluzione modifiche 7 dopo 12 ore.</li>
</ol>6. Verifica di decellularizzazione
<ol><li>Lavare la formalina riparata biopsie in acqua ultrapura per 15 min. di processo in un processatore di tessuti seguendo protocolli standard e incorporare in paraffina22.</li>
	<li>Tagliare 5 µm sezioni utilizzando un microtomo e macchia con hematoxylin e 0,2% alcolica eosina Meyer (H & E) seguire protocolli standard22.</li>
	<li>Mostra al microscopio per verificare la perdita dei nuclei nel tessuto decellularizzato rispetto al tessuto normale.</li>
</ol>7. ricellularizzazione
<ol><li>Sterilizzare la vena collocandolo in un tubo da 50 mL contenente 50 mL di soluzione 8. Agitare a 80 giri al minuto (rpm) nello shaker per 1h a 37 ° C.</li>
	<li>Gestire la vena sotto il flusso laminare (LAF) d'ora in avanti per mantenere la sterilità. Trasferire la vena utilizzando pinze sterili per un nuovo tubo da 50 mL contenente 50 mL di soluzione sterile 7 e 500 µ l di anti-anti. Agitare come sopra per 12 h. Change soluzione 7 almeno due volte in mezzo.</li>
	<li>Utilizzando pinze sterili, la vena di trasferimento ad un nuovo tubo 50 mL ed aggiungere 50 mL di media endoteliale. Agitare come sopra per 11h.</li>
	<li>Assemblare il bioreattore utilizzando guanti sterili sotto la LAF armadietto. Legare la vena a vena entrata e di uscita con sutura sterile ed il forcipe del bioreattore.</li>
	<li>Collegare la vena per il bioreattore e riempire con lo stesso mezzo. Aggiungere eparina a 50 UI/mL e irrorare per 1 h a 2 mL/min a 37 ° C.</li>
	<li>Raccogliere 15-25 mL di sangue fresco (a seconda della lunghezza della vena) dal donatore in provette vacutainer eparina rivestito e diluire 1:1 con soluzione di Steen. Successivamente, aggiungere ghiandola endocrina vascolare endoteliale fattore di crescita derivato (EG-VEGF, 80 ng/mL), fattore di crescita di base del fibroblasto (b-FGF, 4 µ l/mL) e acido acetil salicilico (5 µ g/mL).</li>
	<li>Spostare il bioreattore in incubatore a 37 ° C con 5% CO2 e irrorare per 48 h a 2 mL/min.</li>
	<li>Circa dopo 12 h, spostare il bioreattore in un armadietto, LAF prendere una goccia di sangue e misurare il glucosio utilizzando una dispositivo di monitoraggio della glicemia. Se il livello è inferiore a 3 mmol/L, aggiungere glucosio per portare nella gamma di 7-9 mmol/L. Ripetere questo passaggio ogni 8-12 h.</li>
	<li>Dopo 48 h, spostare il bioreattore nella LAF armadietto e drenare il sangue dal bioreattore. Aggiungere 30 mL di soluzione sterile 7 e irrorare per 5 min, scarico la soluzione. Aggiungere 30 mL di soluzione sterile 7 e irrorare per 5 min, Ripeti due volte o fino a quando il colore rosso sangue è perso. Nota: La biopsia può essere presa per la verifica del collegamento della cella. Scollegare la vena, tagliare i bordi di 5 mm della vena con le forbici e gettarli. Prendere una biopsia come indicato al punto 5.2 e connettersi nuovamente la vena del bioreattore (passaggio facoltativo).</li>
	<li>Aggiungere 30-45 mL di terreno endoteliale e irrorare per 96 h nell'incubatore a 2 mL/min. Nota: Aggiungere endoteliale medio fino a quando la vena è sommerso.</li>
	<li>Spostare il bioreattore nell'armadietto LAF, scollegare la vena recellularized, tagliare i bordi di 5 mm della vena utilizzando forbici e scartare. Prendere una biopsia come indicato al punto 5.2.</li>
</ol>8. Verifica di ricellularizzazione
<ol><li>Seguire le istruzioni nella sezione 6 ed eseguire colorazione H & E. Esaminare i vetrini al microscopio per la presenza di cellule.</li>
</ol>

<ol>
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SSH detiene quote in Verigraft, una società che ha concesso in licenza la tecnologia dei vasi sanguigni di ingegneria tissutale. Gli altri autori non hanno nulla a rivelare.

La tecnica qui presentata per decellularizzazione delle vene safene è un metodo facile, semplice e conveniente che può essere applicato anche a tutte le vene di piccolo diametro come vene ombelicali e mammarie. Le soluzioni di decellularizzazione e le relative concentrazioni utilizzati in questo metodo vengono dal nostro precedente Risultati6,7. Anche se si consiglia di 5 cicli di decellularizzazione, in alcune vene abbiamo anche notato decellularizzazione completa in 3 cicli. Tuttavia, sono stati ottenuti risultati riproducibili utilizzando 5 cicli. Applicazione del presente protocollo, abbiamo decellularized vene di varie lunghezze fino a 30 cm con successo (risultati non pubblicati). Presa della soluzione decellularizzazione di sollevamento da 45 centimetri creerà una pressione di 33 mmHg all'interno della vena. Nella nostra esperienza, abbiamo notato questo come un passo fondamentale in decellularizing la vena tutta in modo uniforme e riproducibile in 5 cicli. La pressione selezionata è 3 volte superiore rispetto alla pressione normale della vena safena (5-10 mmHg), ma è che lo stesso come incompetente vene (vene varicose)23. Inoltre, speculiamo che questa alta pressione creerà una forza significativa sulle pareti della vena e può, pertanto, aiutare nella rimozione delle cellule più veloce ed efficiente.
Poiché attendersi sono un solvente organico e insolubile in acqua, mescolando il detersivo fino a quando diventa nuvoloso è importante; in caso contrario, il detersivo galleggerà. Per lo stesso motivo, per mantenere attendersi miscelati in soluzione, tubo di uscita di detersivo è stato disposto nella parte superiore del vaso di vetro con l'uscita del tubo. Efficiente rimozione di attendersi dalla vena dopo l'utilizzo in ogni ciclo può essere visto dall'assenza di attendersi gocce nell'acqua lavata di galleggiamento. Abbiamo anche notato che saltando il passaggio della dnasi produsse anche un tessuto decellularizzato ma in alcuni casi, è stato notato un relativamente alto contenuto di DNA nel tessuto decellularizzato. Ad alta pressione e portate elevate non è richieste per attività di dnasi efficiente, può essere utilizzato un tasso di bassa perfusione (10 mL/min). Una pompa peristaltica differente è stata usata come relativo più piccolo formato aiuta in maneggevolezza del setup. Poiché abbiamo notato che il danno della maggior parte delle cellule durante risultati di decellularizzazione nel ciclo 2, ti consigliamo di saltare trattamento dnasi durante i cicli di 1 e 3 (risultati non pubblicati). Anche se la caratterizzazione e la quantificazione delle proteine della matrice extracellulare non sono stati eseguiti in questo manoscritto, la nostra esperienza precedente con protocolli simili di decellularizzazione ha mostrato la conservazione delle proprietà biomeccaniche, matrice extracellulare struttura e proteine7. Anche se i nostri esperimenti preliminari quantificazione con queste vene ha prodotto un risultato simile (non pubblicato), i nostri risultati già pubblicati rafforzerà questa fiducia.
Ricellularizzazione usando il sangue è un processo conveniente e facile sopra cellule del midollo osseo espanso come si può evitare lunghi tempi di espansione delle cellule, mutazioni spontanee in cellule espanse, invasione chirurgica ed il disagio per il paziente. Poiché è noto che endotelizzazione può verificarsi anche da circolanti EPCs, abbiamo supposto che l'aspersione con sangue seguita da perfusione con mezzo endoteliale sarà sufficiente per ricellularizzazione. La sicurezza dei tessuti vena progettati utilizzando un metodo simile è visto da risultati di successo del trapianto quando due tali vene sono state impiantate in bambini con l'ostruzione di vena porta extra7. Speculiamo che i fattori di crescita nella matrice extracellulare decellularizzato permetterà l'attaccamento di circolazione EPCs dal sangue24. Ricellularizzazione delle vene seguendo un protocollo simile ha mostrato le cellule positive per VEGF receptor-2 e cluster di differenziazione (CD) 14 sul lume mentre CD45 che esprimono le cellule sono state vedute nel adventitia7. Immaginiamo anche che un continuo dello strato endoteliale non può essere osservato in tutti i casi, soprattutto quando si utilizza sangue dai pazienti più anziani e malati, come è noto che tali individui hanno fatto diminuire i numeri di circolazione di cellule progenitrici25. Tuttavia, postuliamo che l'aspersione con proprie del destinatario sangue può mascherare molti degli antigeni che sono esposti a causa di decellularizzazione e così possono fare diminuire le probabilità di reazioni avverse infiammatorie quando trapiantate al contrario di trapiantare solo vasi sanguigni decellularizzati. Inoltre, aspersione di sangue possa depositare i livelli aumentati di fattori di crescita sul lume e il adventitia che a sua volta può reclutare numeri aumentati delle cellule progenitrici risultante in un rapido processo di ricellularizzazione in vivodi circolazione.
I vantaggi del design bioreattore utilizzato in questo studio sono completa sterilizzazione in autoclave, facilità di montaggio, economicità, maneggevolezza e la minor possibilità di danni. Nella nostra esperienza, utilizzando il design attuale, vene erano recellularized fino a 10 cm di lunghezza. Anche se le vene fino a 25 cm di lunghezza può anche essere recellularized mantenendo la vena a forma di "U" all'interno del bioreattore, questo deve essere convalidato. Il design di bioreattore dimostra che la direzione del flusso nella vena è contro la gravità ed è progettata come tale perché è la direzione normale del flusso per queste vene in esseri umani. La perfusione di 12h del passo medio endoteliale è presupposto la vena e aumentare l'affinità per il fissaggio di EPCs in arrivo. Aggiunta di eparina supplementare e perfusione per 1 h si abbassa il rischio di formare coaguli di sangue nei tubi durante l'aspersione di sangue.
Il volume di sangue necessaria dipende dalla lunghezza della vena. Il principio di base che seguiamo per volume di sangue è che la vena dovrebbe essere immersa nel sangue. Durante la gestione di volumi di sangue superiori a 45 mL, miscelazione occasionale potrebbe essere necessario per prevenire l'accumulo delle cellule nella parte inferiore del bioreattore. Abbiamo aggiunto la soluzione di Steen a sangue perché contiene una quantità elevata di proteine e componenti necessari per mantenere i tessuti sani durante organo trapianto26,27. Aggiunta di VEGF e FGF-b è vantaggioso in quanto si tratta di fattori di crescita angiogenici potente28 e la loro presenza induce la migrazione, proliferazione e differenziazione delle EPCs29,30,31,32 . La quantità di VEGF aggiunto si basa sui nostri precedenti risultati inediti dove la proliferazione delle EPCs è stato visto a 80 ng/mL. Aggiunta di aspirin inibisce l'attivazione delle piastrine33 diminuendo in tal modo le probabilità del loro attaccamento alla strato endoteliale. Monitoraggio continuo e l'aggiunta di glucosio sarà anche utile per la proliferazione cellulare e prevenire l'emolisi dei globuli rossi.
Poiché solo un campione di sangue semplice è richiesto dal destinatario, può essere considerato come una procedura facile e fattibile, che richiedono competenze meno tecniche. Anche se l'intera procedura mostrata qui dall'inizio alla fine dura 20 giorni, memorizzare le vene decellularizzate come un largo della piattaforma prodotto accorcerà la procedura per 8 giorni per i pazienti. Anche se il deposito delle vene decellularizzate tecnicamente non dovrebbe pregiudicare l'efficienza di ricellularizzazione, esso deve essere valutato. Tessutale vene generate seguendo questa procedura possono essere utilizzate in clinica per interventi chirurgici di bypass, sostituendo vene ostruite, insufficienza venosa, che porta alle vene varicose senza la necessità di immunosoppressione e fornendo così una migliore qualità di vita per il paziente.

Condotti vascolari sono necessari per parecchie circostanze cliniche come aneurismi, stenosi dell'arteria carotica e aterosclerosi che porta a gravi problemi vascolari. Per ripristinare l'apporto di sangue funzionale i chirurghi utilizzano condotti vascolari autologhi, trapianto allogeneic o sintetici. Anche se l'uso dei vasi sanguigni autologhi è ancora considerato l'approccio ideale, la disponibilità nei pazienti è majorly limitata. Le alternative quali gli innesti allogeneic o sintetiche hanno profondi problemi con trattamenti immunosoppressivi e scarsa pervietà che conduce il rifunzionamento1,2, conseguente salute maggiori oneri economici ai paesi. Ingegneria dei tessuti dei vasi sanguigni mira a fornire gli innesti con un'omologia naturale e cellule autologhe. Così, il sistema immunitario destinatario riconosce l'innesto trapiantato come lo sé e poiché tali un innesto contiene le proteine naturali e cellule nella configurazione originale, potrebbe funzionare meglio rispetto alle alternative attuali. Ingegneria tessutale organi, come la vescica3, l' uretra4, la trachea5e vene6,7, sono stati utilizzati con successo nella clinica.
Tessuto tecnico per produrre innesti personalizzati richiede un innesto da un donatore seguito da decellularizzazione e ricellularizzazione. Decellularizzazione è una tecnologia promettente per rimuovere le cellule da tessuti ed organi8,9,10. Decellularizzazione può essere eseguita dai metodi fisici, chimici ed enzimatici specifici11 o combinandoli. A un uso ottimale di questi metodi, tessuti decellularizzati possono avere simili proteine strutturali e funzionali in una tabella extracellulare simile ai tessuti nativi. Tali organi possiedono la capacità intrinseca di migliorare allegato, migrazione, proliferazione e differenziazione delle cellule staminali in arrivo.
Ricellularizzazione è un processo dinamico di semina di cellule nell'innesto, e cellule staminali destinatario può essere utilizzate per il trapianto clinico. Cellule staminali attualmente utilizzate per tali finalità includono del midollo osseo, mesenchimale e organo residenti3,5,6. Animale e orientata alla ricerca studi hanno utilizzato cellule staminali mesenchimali origini che sono pluripotenti indotte e fetale12,13,14. Questo processo richiede un bioreattore (una sezione che contiene la vena e fornisce le condizioni necessarie come temperatura, gas, pH e pressione), cellule e terreni di coltura. La sfida di ricellularizzazione è quello di ottenere il numero di cellule di un tipo particolare e una strategia di semina mediante il quale le cellule possono raggiungere intero tessuto o organo. Anche se non completa del tessuto o organo strutturalmente e funzionalmente è stato generato e valutato fino ad ora, diversi avanzamenti in campo ed i risultati iniziali mostrano la possibilità futura di15. La funzione del tasto della vena si trova nell'endotelio luminal che controlla l'infiltrazione delle cellule infiammatorie nei tessuti ed al livello medio del muscolo liscio che aiuta a costrizione e fornisce anche la forza per tenere la pressione sanguigna16. Gli studi hanno dimostrato che durante i danni, endotelizzazione si verifica da anastomosi o da cellule progenitrici endoteliali (EPC) in sangue17,18,19di circolazione. La nostra strategia per ricellularizzazione delle vene si basa sulle EPCs presenti nel sangue circolante.
Ingegneria tissutale di vene e arterie è stata eseguita da diversi gruppi che seguono diversi decellularizzazione e ricellularizzazione strategie20,21. Il nostro gruppo ha anche suonato e sviluppato strategie di decellularizzazione e ricellularizzazione per le vene iliache e mammario6,7. Decellularizzazione è stato effettuato dall'agitazione della vena in Triton X-100, tri-n-butil fosfato (biologicamente) e l'enzima desossiribonucleasi (DNasi). Il ricellularizzazione è stato effettuato utilizzando cellule di derivazione midollare muscolo endoteliale e liscio6 o7di sangue periferico. Le vene recellularized da entrambi i protocolli hanno mostrato promessa clinica nella fornitura di sangue funzionale nel trapianto di pazienti pediatrici con ostruzione extra epatica della vena portale6,7.
Attualmente abbiamo sviluppato una versione modificata dello stesso protocollo per le prestazioni migliorate e facile di decellularizzazione, ricellularizzazione e bioreattore manipolazione delle vene di piccolo diametro. L'attuale protocollo di decellularizzazione necessaria perfusione di detergenti tramite la vena usando pressione invece di agitazione con detergenti. Il protocollo di ricellularizzazione comporta un ulteriore passaggio di precondizionamento per migliorare l'adesione delle cellule e l'aggiunta di fattori di crescita nella circolazione sanguigna per migliorare l'adesione delle cellule, la sopravvivenza e la proliferazione. Inoltre abbiamo migliorato il design del bioreattore utilizzando prodotti disponibili in commercio. In questa carta, presentiamo una descrizione dettagliata del protocollo modificato per l'esecuzione di decellularizzazione e ricellularizzazione delle vene safene umane.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1159px;" width="1158">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:333px;">4-Port Cap</td>
			<td style="width:208px;">CPLabSafety</td>
			<td style="width:119px;">WF-GL45-4Kit</td>
			<td style="width:499px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Acetyl salicylic acid</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Anti-Anti</td>
			<td style="width:208px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">B-FGF</td>
			<td style="width:208px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">cc-4113B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:333px;">Blood Glucose monitoring system - Free style Lite</td>
			<td style="width:208px;">Abbott</td>
			<td style="width:119px;">70808-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">DNase-I</td>
			<td style="width:208px;">Worthington</td>
			<td style="width:119px;">LS0020007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:333px;">Dulbecco&#39;s PBS with CaCl2 and MgCl2</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">EDTA disodium salt dihydrate</td>
			<td style="width:208px;">AlfaAesar</td>
			<td style="width:119px;">A15161.OB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">EGM-2 Growth Factors Kit</td>
			<td style="width:208px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-4176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:333px;">EG-VEGF</td>
			<td style="width:208px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">100-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:333px;">Glass bottle 250ml</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2151593</td>
			<td>Any bottle with GL45 cap can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Glass bottle 1L</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2151595</td>
			<td>Any bottle with GL45 cap can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Glass jar 500ml with bottom hose outlet</td>
			<td style="width:208px;">Kimble Chase Life Science</td>
			<td style="width:119px;">14607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Heparin</td>
			<td style="width:208px;">Leo</td>
			<td style="width:119px;">387107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Heparin Coated Vacutainer Tubes</td>
			<td style="width:208px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">368480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Human AB Serum</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H3667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:208px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Luer Female with 1/8&#34; ID Barb</td>
			<td style="width:208px;">Oina</td>
			<td style="width:119px;">LF-2PP-QC</td>
			<td>For 3X5mm silicon tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Luer Female with 3/32&#34; ID Barb</td>
			<td style="width:208px;">Oina</td>
			<td style="width:119px;">LF-1.5PP-QC</td>
			<td>For 2X4mm silicon tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Luer Male with 3/32&#34; ID Barb</td>
			<td style="width:208px;">Oina</td>
			<td style="width:119px;">LM-1.5PP-QC</td>
			<td>For 2X4mm silicon tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Luer Male with 1/8&#34; ID Barb</td>
			<td style="width:208px;">Oina</td>
			<td style="width:119px;">LM-2PP-QC</td>
			<td>For 3X5mm silicon tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Luer Male with 5/32&#34; ID Barb</td>
			<td style="width:208px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">EW-45518-06</td>
			<td>For 5X8mm silicon tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">MCDB 131</td>
			<td style="width:208px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10372-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Per acetic acid</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">433241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Peristaltic pump I</td>
			<td style="width:208px;">Masterflex</td>
			<td style="width:119px;">7524-45</td>
			<td>For Decellularization setup 1 and 2. The cassette used is 7519-75</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Peristaltic pump II</td>
			<td style="width:208px;">Ismatec</td>
			<td style="width:119px;">ISM941</td>
			<td>For Decellularization setup 3 and Recellularization bioreactor.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Potassium hydrogen phosphate</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Reducing Connector 1.5mmX2.5mm</td>
			<td style="width:208px;">Biotech</td>
			<td style="width:119px;">ISM569A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Shaker</td>
			<td style="width:208px;">Ika</td>
			<td style="width:119px;">KS4000 i&#160; control</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Sodium Azide</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">71290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">13423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Sodium hydrogen phosphate</td>
			<td style="width:208px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">71640-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Steen solution</td>
			<td style="width:208px;">Xvivo</td>
			<td style="width:119px;">19004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Suture</td>
			<td style="width:208px;">Agnthos</td>
			<td style="width:119px;">14817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Tri-n-butyl Phosphate</td>
			<td style="width:208px;">AlfaAesar</td>
			<td style="width:119px;">A16084.AU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Triton-X-100</td>
			<td style="width:208px;">AlfaAesar</td>
			<td style="width:119px;">A16046.OF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Tube 60ml with flat base</td>
			<td style="width:208px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">60596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube A</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280706</td>
			<td>Cut 3 pieces, each of 25 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube B</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280706</td>
			<td>Cut 1 piece of 35 cm length for decellularization perfusion steup</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube C</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280706</td>
			<td>Cut 5 pieces, each of 75 cm length for decellularization perfusion steups 1-3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube D</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280706</td>
			<td>Cut 1 piece of 90 cm length for decellularization perfusion steup 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube E</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280706</td>
			<td>Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube F</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280713</td>
			<td>Cut 2 pieces, each of 15 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube G</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280713</td>
			<td>Cut 2 pieces, each of 15 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube H</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280703</td>
			<td>Cut 1 piece of 15 cm length for recellularization perfusion steup</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube I</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280703</td>
			<td>Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube J</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280703</td>
			<td>Cut 1 piece of 25 cm length for recellularization perfusion steup</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube K</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280703</td>
			<td>Cut 2 pieces, each of 35 cm length for recellularization perfusion steup</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

decellularization and recellularization methodology for human saphenous veins

Vascolare conduttori utilizzati durante le maggior parte delle operazioni chirurgiche vascolari sono innesti allogeneic o sintetici che spesso portano a complicazioni causate da immunosoppressione e scarsa pervietà. Ingegneria tissutale offre una nuova soluzione per generare gli innesti personalizzati con una matrice extracellulare naturale contenente cellule del destinatario utilizzando il metodo di decellularizzazione e ricellularizzazione. Vi mostriamo un metodo dettagliato per l'esecuzione di decellularizzazione della vena safena umana e ricellularizzazione per aspersione del sangue periferico. La vena era decellularized irrorante 1% Triton X-100, 1% tri-n-butil-fosfato (biologicamente) e 2.000 Kunitz unità della desossiribonucleasi (DNasi). X-100 Triton e attendersi sono stati irrorati a 35 mL/min per 4 h, mentre dnasi è stata irrorata a 10 mL/min a 37 ° C per 4 h. La vena è stata lavata in acqua ultrapura e PBS e poi sterilizzata in 0,1% di acido peracetico. Era ancora lavata in PBS e condizionato in mezzo endoteliale. La vena è stata collegata a un bioreattore e irrorata con endoteliale mezzo contenente 50 UI/mL eparina per 1 h. ricellularizzazione è stato effettuato compilando il bioreattore con sangue fresco, diluito 1:1 in soluzione di Steen, e aggiunta di ghiandola endocrina-derivata vascolare fattori di crescita endoteliali (80 ng/mL), fattori di crescita di base del fibroblasto (4 µ l/mL) e acido acetil salicilico (5 µ g/mL). Il bioreattore fu poi spostato in un incubatore e irrorato per 48 h a 2 mL/min mantenendo glucosio tra 3-9 mmol/L. Più tardi, la vena era lavata con PBS, riempita con il mezzo di endoteliale ed irrorata per 96 h nell'incubatrice. Trattamento con Triton X-100, attendersi e dnasi decellularized La vena safena in 5 cicli. La vena decellularizzata sembrava bianca in contrasto con la normale e recellularized vene (rosso chiaro). L'ematossilina ed eosina (H & E) ha mostrato la presenza di nuclei solo nel normale, ma non nelle vene decellularizzate. Nella vena recellularized, H & E-macchiatura ha mostrato la presenza di cellule sulla superficie luminale della vena.

La morfologia lorda di una vena normale è luce rossa (Figura 3A). Il colore rosso si perde nella progressiva decellularizzazione cicli (ciclo 2, Figura 3B; ciclo 3, Figura 3) e dal ciclo 5th , sembra pallido e bianco (Figura 3D). La vena recellularized dopo aspersione del sangue (Figura 3E) e media endoteliale perfusione (Figura 3F) sembra rosso luminoso a colori. I 5 cicli di trattamento di decellularizzazione rimosso con successo le cellule dalla vena come nessun nuclei blu nella macchiatura H & E (fig. 4B) sono stati veduti. Al contrario, parecchi nuclei sono stati veduti nella vena normale (Figura 4A). La presenza di cellule allegate dal lato luminal è visto nella macchiatura di H & E nella vena recellularized con sangue per 48 h (Figura 4, frecce nere) e dopo perfusione con il mezzo endoteliale per 96 h (Figura 3D, frecce nere).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig1.jpg"> Figura 1 : Montaggio delle configurazioni di perfusione per decellularizzati. A) l'immagine mostrando il programma di installazione di decellularizzazione assemblato 1 per Triton X-100 e lavatrice. Le frecce bianche Visualizza il percorso del flusso per le soluzioni e le frecce rosse indicano ingressi e uscite per vena e soluzioni. B) la foto che mostra l'installazione di decellularizzazione assemblato 2 per aspersione di attendersi. Allo stesso modo, come installazione di decellularizzazione 1, frecce bianche indicano il percorso del flusso per le soluzioni e le frecce rosse indicano ingressi e uscite per vena e soluzioni. C) la foto che mostra l'installazione di decellularizzazione assemblato 3 per aspersione desossiribonucleasi. Le frecce bianche Visualizza il percorso del flusso per le soluzioni e le frecce rosse indicano insenature per vena e soluzioni. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57803/57803fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig2.jpg"> Figura 2 : Preparazione e montaggio del bioreattore per ricellularizzazione. A) foto che Mostra materiali necessari per il montaggio del bioreattore. B) foto della parte interna del tappo 4 porte mostrando il posizionamento di ridurre connettori (frecce rosse), punti per connetterti vena entrata e uscita (frecce bianche) e disposizione dei tubi H, I e J. L'estremità libera del tubo H viene inserito nel bioreattore per restituire i supporti. C) i rispettivi tubi andando dentro e fuori possono essere visto dal lato superiore di 4 Porto cap. D) foto che mostra il bioreattore assemblato. E) immagine che mostra l'installazione di bioreattore tutta con la pompa peristaltica. I tubi K estendono le connessioni da bioreattore per la pompa peristaltica. F) rappresentazione schematica del sistema di perfusione del bioreattore intero. Le frecce arancioni indicano la direzione del flusso. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57803/57803fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig3.jpg"> Figura 3 : Lordo morfologia delle vene durante decellularizzazione e ricellularizzazione. A) la morfologia lorda del vena normale sembra rosso luminoso a colori. Il colore viene perso con un numero crescente di decellularizzazione cicli B) ciclo 2 e C) 3 del ciclo. D) By 5 cicli, la vena sembra pallido e bianco. La vena dopo che irrora con E) sangue per 48 h e F) con il mezzo endoteliale per 96 h sembra ancora una volta brillante rosso a colori. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57803/57803fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig4.jpg"> Figura 4 : Caratterizzazione delle vene decellularizzate e recellularized. L'ematossilina ed eosina immagine di A) vena normale contiene molti nuclei blu ma sono assenti in B) vena decellularizzata. Nella vena recellularized con C) sangue per 48 h e con D) endoteliale medium per 96 h, collegamento delle cellule (frecce nere) presso lumen è stato notato. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57803/57803fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins

Decellularizzazione e metodologia di ricellularizzazione per le vene safena umane

Qui, descriviamo un protocollo per la vena safena decellularizzazione utilizzando detergenti e ricellularizzazione tramite aspersione del sangue periferico e del mezzo endoteliale.

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and ...

decellularization-recellularization-methodology-for-human-saphenous

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.1K Views.  University of Gothenburg. Qui, descriviamo un protocollo per la vena safena decellularizzazione utilizzando detergenti e ricellularizzazione tramite aspersione del sangue periferico e del mezzo endoteliale.

Video: Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to recreate or mimic the liver microstructure with grounds up approach using tissue engineering and microfabrication techniques have not been successful so far due to this design challenge. In addition, synthetic biomaterials used to create scaffolds for liver tissue engineering applications have been limited in inducing tissue regeneration and repair in large part due to the lack of specific cell binding motifs that would induce the proper cell functions2. Decellularized native tissues such blood vessels3and skin4on the other hand have found many applications in tissue engineering, and have provided a practical solution to some of the challenges. The advantage of decellularized native matrix is that it retains, to an extent, the original composition, and the microstructure, hence enhancing cell attachment and reorganization5.
In this work we describe the methods to perform perfusion-decellularization of the liver, such that an intact liver bioscaffold that retains the structure of major blood vessels is obtained. Further, we describe methods to recellularize these bioscaffolds with adult primary hepatocytes, creating a liver graft that is functional in vitro, and has the vessel access necessary for transplantation in vivo.

Perfusion decellularization is a novel technique to produce whole liver scaffolds that retains the organ's extracellular matrix composition and microarchitecture. Herein, the method of preparing whole organ scaffolds using perfusion decellularization and subsequent repopulation with hepatocytes is described. Functional and transplantable liver grafts can be generated using this technique.

Decellularization e Recellularization di fegati interi

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Ricerca

Bioingegneria

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use of destructive assessment is not acceptable. A proposed alternative is the use of an imaging process called magnetic resonance elastography. Elastography is a nondestructive method for determining the engineered outcome by measuring local mechanical property values (i.e., complex shear modulus), which are essential markers for identifying the structure and functionality of a tissue. As a noninvasive means for evaluation, the monitoring of engineered constructs with imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) has seen increasing interest in the past decade1. For example, the magnetic resonance (MR) techniques of diffusion and relaxometry have been able to characterize the changes in chemical and physical properties during engineered tissue development2. The method proposed in the following protocol uses microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE) as a noninvasive MR based technique for measuring the mechanical properties of small soft tissues3. MRE is achieved by coupling a sonic mechanical actuator with the tissue of interest and recording the shear wave propagation with an MR scanner4. Recently, &mu;MRE has been applied in tissue engineering to acquire essential growth information that is traditionally measured using destructive mechanical macroscopic techniques5. In the following procedure, elastography is achieved through the imaging of engineered constructs with a modified Hahn spin-echo sequence coupled with a mechanical actuator. As shown in Figure 1, the modified sequence synchronizes image acquisition with the transmission of external shear waves; subsequently, the motion is sensitized through the use of oscillating bipolar pairs. Following collection of images with positive and negative motion sensitization, complex division of the data produce a shear wave image. Then, the image is assessed using an inversion algorithm to generate a shear stiffness map6. The resulting measurements at each voxel have been shown to strongly correlate (R2&gt;0.9914) with data collected using dynamic mechanical analysis7. In this study, elastography is integrated into the tissue development process for monitoring human mesenchymal stem cell (hMSC) differentiation into adipogenic and osteogenic constructs as shown in Figure 2.

The procedure demonstrates the methodology of magnetic resonance elastography for monitoring the engineered outcome of adipose and osteogenic tissue engineered constructs through noninvasive local assessment of the mechanical properties using microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE).

Metodologia Elastografia risonanza magnetica per la valutazione dei Tissue Engineered Construct crescita

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the issue of spectral overlap of fluorophore emissions has limited the number of simultaneous probes. In contrast, the new CyTOF mass cytometer by DVS Sciences couples a liquid single-cell introduction system to an ICP-MS.1 Rather than fluorophores, chelating polymers containing highly-enriched metal isotopes are coupled to antibodies or other specific probes.2-5 Because of the metal purity and mass resolution of the mass cytometer, there is no "spectral overlap" from neighboring isotopes, and therefore no need for compensation matrices. Additionally, due to the use of lanthanide metals, there is no biological background and therefore no equivalent of autofluorescence. With a mass window spanning atomic mass 103-203, theoretically up to 100 labels could be distinguished simultaneously. Currently, more than 35 channels are available using the chelating reagents available from DVS Sciences, allowing unprecedented dissection of the immunological profile of samples.6-7
Disadvantages to mass cytometry include the strict requirement for a separate metal isotope per probe (no equivalent of forward or side scatter), and the fact that it is a destructive technique (no possibility of sorting recovery). The current configuration of the mass cytometer also has a cell transmission rate of only ~25%, thus requiring a higher input number of cells.
Optimal daily performance of the mass cytometer requires several steps. The basic goal of the optimization is to maximize the measured signal intensity of the desired metal isotopes (M) while minimizing the formation of oxides (M+16) that will decrease the M signal intensity and interfere with any desired signal at M+16. The first step is to warm up the machine so a hot, stable ICP plasma has been established. Second, the settings for current and make-up gas flow rate must be optimized on a daily basis. During sample collection, the maximum cell event rate is limited by detector efficiency and processing speed to 1000 cells/sec. However, depending on the sample quality, a slower cell event rate (300-500 cells/sec) is usually desirable to allow better resolution between cells events and thus maximize intact singlets over doublets and debris. Finally, adequate cleaning of the machine at the end of the day helps minimize background signal due to free metal.

The steps necessary for daily tuning and optimization of the performance of a CyTOF mass cytometer are described. Comments on optimal sample preparation and flow rate are discussed

Massa Citometria: Protocollo per l&#39;ottimizzazione giornaliera e campioni di cellule in esecuzione su un citometro Messa CyTOF

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

Perfusion-based whole organ decellularization has recently gained interest in the field of tissue engineering as a means to create site-specific extracellular matrix scaffolds, while largely preserving the native architecture of the scaffold. To date, this approach has been utilized in a variety of organ systems, including the heart, lung, and liver 1-5. Previous decellularization methods for tissues without an easily accessible vascular network have relied upon prolonged exposure of tissue to solutions of detergents, acids, or enzymatic treatments as a means to remove the cellular and nuclear components from the surrounding extracellular environment6-8. However, the effectiveness of these methods hinged upon the ability of the solutions to permeate the tissue via diffusion. In contrast, perfusion of organs through the natural vascular system effectively reduced the diffusion distance and facilitated transport of decellularization agents into the tissue and cellular components out of the tissue. Herein, we describe a method to fully decellularize an intact porcine heart through coronary retrograde perfusion. The protocol yielded a fully decellularized cardiac extracellular matrix (c-ECM) scaffold with the three-dimensional structure of the heart intact. Our method used a series of enzymes, detergents, and acids coupled with hypertonic and hypotonic rinses to aid in the lysis and removal of cells. The protocol used a Trypsin solution to detach cells from the matrix followed by Triton X-100 and sodium deoxycholate solutions to aid in removal of cellular material. The described protocol also uses perfusion speeds of greater than 2 L/min for extended periods of time. The high flow rate, coupled with solution changes allowed transport of agents to the tissue without contamination of cellular debris and ensured effective rinsing of the tissue. The described method removed all nuclear material from native porcine cardiac tissue, creating a site-specific cardiac ECM scaffold that can be used for a variety of applications.

A method to rapidly and completely remove cellular components from an intact porcine heart through retrograde perfusion is described. This method yields a site specific cardiac extracellular matrix scaffold which has the potential for use in multiple clinical applications.

Procedura per decellularizzazione del Cuore di suino da retrograda perfusione coronarica

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

Successful tissue engineering involves the combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo. Scaffolds may be synthetic, naturally-derived or derived from tissues/organs. The latter are obtained using a technique called decellularization. Decellularization may involve a combination of physical, chemical, and enzymatic methods. The goal of this technique is to remove all cellular traces whilst maintaining the macro- and micro-architecture of the original tissue.
Intestinal tissue engineering has thus far used relatively simple scaffolds that do not replicate the complex architecture of the native organ. The focus of this paper is to describe an efficient decellularization technique for rat small intestine. The isolation of the small intestine so as to ensure the maintenance of a vascular connection is described. The combination of chemical and enzymatic solutions to remove the cells whilst preserving the villus-crypt axis in the luminal aspect of the scaffold is also set out. Finally, assessment of produced scaffolds for appropriate characteristics is discussed.

The article describes a methodology for the production of an acellular matrix from rat intestine. The derivation of intestinal scaffolds is important for future applications in tissue engineering, stem cell biology and drug testing.

Un Decellularization Metodologia per la produzione di un naturale acellulare intestinale Matrix

Successful tissue engineering involves the  combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo.  Scaffolds may be synthetic, ...

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an attractive alternative to classic organ transplantation. This technology utilizes an organ&#39;s natural biological extracellular matrix (ECM) as a scaffold onto which autologous or stem/progenitor cells may be seeded and cultured in such a way that facilitates regeneration of the original tissue. The natural ECM is isolated by a process called decellularization. Decellularization is accomplished by treating tissues with a series of detergents, salts, and enzymes to achieve effective removal of cellular material while leaving the ECM intact. Studies conducted utilizing decellularization and subsequent recellularization of rodent lungs demonstrated marginal success in generating pulmonary-like tissue which is capable of gas exchange in vivo. While offering essential proof-of-concept, rodent models are not directly translatable to human use. Nonhuman primates (NHP) offer a more suitable model in which to investigate the use of bioartificial organ production for eventual clinical use.
The protocols for achieving complete decellularization of lungs acquired from the NHP rhesus macaque are presented. The resulting acellular lungs can be seeded with a variety of cells including mesenchymal stem cells and endothelial cells. The manuscript also describes the development of a bioreactor system in which cell-seeded macaque lungs can be cultured under conditions of mechanical stretch and strain provided by negative pressure ventilation as well as pulsatile perfusion through the vasculature; these forces are known to direct differentiation along pulmonary and endothelial lineages, respectively. Representative results of decellularization and cell seeding are provided.

Whole-organ decellularization produces natural biological scaffolds that may be used for regenerative medicine. The description of a nonhuman primate model of lung regeneration in which whole lungs are decellularized and then seeded with adult stem cells and endothelial cells in a bioreactor that facilitates vascular circulation and liquid media ventilation is presented.

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent liver decellularization have already been published. We aimed to improve the decellularization process by construction of a proprietary perfusion device enabling selective perfusion via the portal vein and/or the hepatic artery. Furthermore, we sought to perform perfusion under oscillating surrounding pressure conditions to improve the homogeneity of decellularization. The homogeneity of perfusion decellularization has been an underestimated factor to date. During decellularization, areas within the organ that are poorly perfused may still contain cells, whereas the extracellular matrix (ECM) in well-perfused areas may already be affected by alkaline detergents. Oscillating pressure changes can mimic the intraabdominal pressure changes that occur during respiration to optimize microperfusion inside the liver. In the study presented here, decellularized rat liver matrices were analyzed by histological staining, DNA content analysis and corrosion casting. Perfusion via the hepatic artery showed more homogenous results than portal venous perfusion did. The application of oscillating pressure conditions improved the effectiveness of perfusion decellularization. Livers perfused via the hepatic artery and under oscillating pressure conditions showed the best results. The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

Procedura per Decellularization di Rat Livers in un dispositivo di perfusione oscillante pressione

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent ...

Methodology for Biomimetic Chemical Neuromodulation of Rat Retinas with the Neurotransmitter Glutamate In Vitro

Photoreceptor degenerative diseases cause irreparable blindness through the progressive loss of photoreceptor cells in the retina. Retinal prostheses are an emerging treatment for photoreceptor degenerative diseases that seek to restore vision by artificially stimulating the surviving retinal neurons in the hope of eliciting comprehensible visual perception in patients. Current retinal prostheses have demonstrated success in restoring limited vision to patients using an array of electrodes to electrically stimulate the retina but face substantial physical barriers in restoring high acuity, natural vision to patients. Chemical neurostimulation using native neurotransmitters is a biomimetic alternative to electrical stimulation and could bypass the fundamental limitations associated with retinal prostheses using electrical neurostimulation. Specifically, chemical neurostimulation has the potential to restore more natural vision with comparable or better visual acuities to patients by injecting very small quantities of neurotransmitters, the same natural agents of communication used by retinal chemical synapses, at much finer resolution than current electrical prostheses. However, as a relatively unexplored stimulation paradigm, there is no established protocol for achieving chemical stimulation of the retina in vitro. The purpose of this work is to provide a detailed framework for accomplishing chemical stimulation of the retina for investigators who wish to study the potential of chemical neuromodulation of the retina or similar neural tissues in vitro. In this work, we describe the experimental setup and methodology for eliciting retinal ganglion cell (RGC) spike responses similar to visual light responses in wild-type and photoreceptor-degenerated wholemount rat retinas by injecting controlled volumes of the neurotransmitter glutamate into the subretinal space using glass micropipettes and a custom multiport microfluidic device. This methodology and protocol are general enough to be adapted for neuromodulation using other neurotransmitters or even other neural tissues.

Methodology for Biomimetic Chemical Neuromodulation of Rat Retinas with the Neurotransmitter Glutamate In Vitro

This protocol describes a novel method for investigating a form of chemical neurostimulation of wholemount rat retinas in vitro with the neurotransmitter glutamate. Chemical neurostimulation is a promising alternative to the conventional electrical neurostimulation of retinal neurons for treating irreversible blindness caused by photoreceptor degenerative diseases.

Metodologia per la neuromodulazione Biomimetic chimico di retine del ratto con il neurotrasmettitore glutammato In Vitro

Photoreceptor degenerative diseases cause irreparable blindness through the progressive loss of photoreceptor cells in the retina. Retinal prostheses are ...

Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies

Current knowledge of extracellular matrix (ECM)-cell communication translates to large two-dimensional (2D) in vitro culture studies where ECM components are presented as a surface coating. These culture systems constitute a simplification of the complex nature of the tissue ECM that encompasses biochemical composition, structure, and mechanical properties. To better emulate the ECM-cell communication shaping the cardiac microenvironment, we developed a protocol that allows for the decellularization of the whole fetal heart and adult left ventricle tissue explants simultaneously for comparative studies. The protocol combines the use of a hypotonic buffer, a detergent of anionic surfactant properties, and DNase treatment without any requirement for specialized skills or equipment. The application of the same decellularization strategy across tissue samples from subjects of various age is an alternative approach to perform comparative studies. The present protocol allows the identification of unique structural differences across fetal and adult cardiac ECM mesh and biological cellular responses. Furthermore, the herein methodology demonstrates a broader application being successfully applied in other tissues and species with minor adjustments, such as in human intestine biopsies and mouse lung.

The cardiac extracellular matrix (ECM) is a complex network of molecules that orchestrate key processes in tissues and organs while enduring physiological remodeling throughout life. Standardized decellularization of fetal and adult hearts permits comparative experimental studies of both tissues in a 3D context by capturing native architecture and biomechanical properties.

Paragonabile decellularizzazione degli espianti di tessuto cardiaco fetali ed adulti come 3D-come le piattaforme per studi In Vitro

Current knowledge of extracellular matrix (ECM)-cell communication translates to large two-dimensional (2D) in vitro culture studies where ECM components ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor biocompatibility, and cost. Plant tissues have favorable characteristics that make them uniquely suited for use as scaffolds, such as high surface area, excellent water transport and retention, interconnected porosity, preexisting vascular networks, and a wide range of mechanical properties. Two successful methods of plant decellularization for tissue engineering applications are described here. The first method is based on detergent baths to remove cellular matter, which is similar to previously established methods used to clear mammalian tissues. The second is a detergent-free method adapted from a protocol that isolates leaf vasculature and involves the use of a heated bleach and salt bath to clear the leaves and stems. Both methods yield scaffolds with comparable mechanical properties and low cellular metabolic impact, thus allowing the user to select the protocol which better suits their intended application.

Here we present, and contrast two protocols used to decellularize plant tissues: a detergent-based approach and a detergent-free approach. Both methods leave behind the extracellular matrix of the plant tissues used, which can then be utilized as scaffolds for tissue engineering applications.

Due metodi per decellularizzazione di tessuti vegetali per applicazioni di ingegneria del tessuto

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...