Method Article
Questo protocollo studia la relazione cervello-comportamento nel CA1 ippocampale nei topi che navigano in un pennacchio di odore. Forniamo un protocollo passo-passo, che include la chirurgia per accedere all'imaging dell'ippocampo, l'allenamento comportamentale, la registrazione e l'elaborazione del cervello con miniscopio GCaMP6f e i dati comportamentali per decodificare la posizione del mouse dall'attività neurale ROI.
I topi navigano in un pennacchio di odori con una complessa struttura spazio-temporale al buio per trovare la fonte degli odori. Questo articolo descrive un protocollo per monitorare il comportamento e registrare i transitori di Ca2+ nei neuroni piramidali dello strato dorsale CA1 nell'ippocampo (dCA1) nei topi che navigano in un pennacchio di odori in un'arena di odori di 50 cm x 50 cm x 25 cm. Un miniscopio per epifluorescenza focalizzato attraverso una lente con indice di gradiente (GRIN) ha ripreso i transienti Ca2+ nei neuroni dCA1 che esprimono il sensore di calcio GCaMP6f nei topi Thy1-GCaMP6f. Il documento descrive il protocollo comportamentale per addestrare i topi a eseguire questo compito di navigazione del pennacchio di odori in un'arena automatizzata per gli odori. I metodi includono una procedura passo-passo per l'intervento chirurgico per l'impianto di lenti GRIN e il posizionamento della piastra di base per l'imaging GCaMP6f in CA1. L'articolo fornisce informazioni sul tracciamento in tempo reale della posizione del mouse per automatizzare l'inizio delle prove e la consegna di una ricompensa in acqua. Inoltre, il protocollo include informazioni sull'utilizzo di una scheda di interfaccia per sincronizzare i metadati che descrivono l'automazione dell'attività di navigazione degli odori e i tempi di fotogramma per il miniscopio e la posizione del mouse di tracciamento della fotocamera digitale. Inoltre, i metodi delineano la pipeline utilizzata per elaborare i film di fluorescenza GCaMP6f mediante correzione del movimento utilizzando l'algoritmo NorMCorre seguito dall'identificazione delle regioni di interesse con EXTRACT. Infine, l'articolo descrive un approccio di rete neurale artificiale per decodificare i percorsi spaziali dall'attività dell'insieme neurale CA1 per prevedere la navigazione del mouse del pennacchio di odore.
Sebbene siano stati compiuti progressi significativi nella comprensione dei circuiti neurali coinvolti nella navigazione olfattiva nei topi con testa fissa 1,2,3 e nelle strategie di navigazione nei topi in movimento libero 4,5,6,7,8, il ruolo dei circuiti neurali nella navigazione in movimento libero etologicamente rilevante di pennacchi di odori turbolenti è ancora sconosciuto. Questo articolo descrive il monitoraggio dell'attività neurale mediante l'imaging di transitori di Ca2+ in cellule che esprimono il sensore di calcio geneticamente codificato GCaMP6f nei topi Thy1-GCaMP6f9 per studiare se la dinamica neurale sequenziale dei neuroni piramidali dello strato dorsale CA1 nell'ippocampo (dCA1) svolge un ruolo nella navigazione del pennacchio odoroso. I metodi forniscono informazioni sulla fluorescenza GCaMP6f attraverso un microscopio a epifluorescenza in miniatura focalizzato attraverso una lente GRIN su dCA1 10,11,12. I metodi spiegano come monitorare simultaneamente la navigazione spaziale e i transienti di calcio GCaMP6f del neurone dCA1 nei topi che eseguono un compito di navigazione del pennacchio di odori in cui hanno ricevuto una ricompensa in acqua quando hanno raggiunto il beccuccio erogando un odorante in un'arena di odori con un flusso d'aria laminare di fondo13,14. Questo articolo descrive i metodi necessari per raggiungere questo obiettivo (Figura 1), tra cui la chirurgia stereotassica per l'impianto di lenti con indice di gradiente (GRIN), il posizionamento di una piastra di base per fissare il miniscopio al cranio in un topo che si muove liberamente, l'imaging con il microscopio in miniatura e il monitoraggio del movimento del mouse con una fotocamera digitale ad alta velocità, la pre-elaborazione dei dati per la rimozione di artefatti di movimento e la ricerca delle regioni di interesse (ROI), e preparazione di set di dati e addestramento e previsione di reti neurali artificiali per la decodifica delle posizioni X e Y del topo nell'arena degli odori dai cambiamenti nella fluorescenza nelle ROI dCA17.
La registrazione con miniscopio dei segnali di calcio nella regione CA1 dell'ippocampo di topi che navigano in un pennacchio di odori è rilevante per comprendere il calcolo dei circuiti neurali coinvolti con l'olfatto e le informazioni spaziali nel complesso compito comportamentale della navigazione odore-pennacchio 2,14,15,16. La regione CA1 dell'ippocampo svolge un ruolo nella navigazione spaziale ed è fondamentale per creare una mappa cognitiva dell'ambiente per una navigazione efficiente 17,18. La registrazione dei segnali di calcio con un miniscopio è un modo prezioso per studiare i neuroni CA1 che codificano le informazioni spaziali durante la navigazione del pennacchio di odore.
Questa tecnica combina i vantaggi della tecnologia miniscope per la registrazione dei segnali di calcio GCaMP con il ruolo ben consolidato dell'ippocampo CA1 nella navigazione spaziale per comprendere meglio come i circuiti neurali guidano comportamenti complessi19. In alternativa, gli approcci che utilizzano la microscopia a 2 fotoni possono registrare i neuroni CA1 9,20, che richiede un topo fissato alla testa e limita la possibilità di muoversi liberamente per navigare in un pennacchio di odore21. Le registrazioni elettrofisiologiche a campo locale dei neuroni CA1 consentono l'indagine di topi che si muovono liberamente navigando nei pennacchi di odore22. Tuttavia, i segnali elettrici di campo locale impongono limitazioni alla stima dell'attivazione intracellulare isolando i segnali di singole unità attraverso tecniche di ordinamento degli spike. I segnali miniscope consentono l'identificazione delle ROI associate direttamente ai segnali intracellulari del calcio in modo affidabile10,11 per studiare con precisione i calcoli neurali alla risoluzione di una singola cellula. La tecnologia Miniscope offre un'opportunità unica per comprendere meglio come la regione CA1 codifica le informazioni spaziali in base ai segnali olfattivi.
Inoltre, questa tecnica studia il modo in cui specifiche popolazioni neuronali elaborano le informazioni sugli odori per la navigazione e la relazione tra i modelli di attività neuronale e il processo decisionale durante il tracciamento del pennacchio di odore. Questo metodo può contribuire a una migliore comprensione di come il cervello elabora gli odori e le informazioni spaziali. Sebbene i miniscopi offrano una risoluzione a singola cellula per registrare il cervello di un topo che si muove liberamente, richiedono competenze chirurgiche specializzate e di analisi dei dati. In questo articolo, forniamo un protocollo completo per aiutare i ricercatori a passare attraverso ogni fase per studiare i meccanismi neurali della navigazione del pennacchio di odore.
L'attività di navigazione degli odori è un quadro promettente per lo studio della codifica neurale e della memoria spaziale dei segnali olfattivi nei topi. I risultati dell'articolo indicano che è possibile decodificare la traiettoria del topo che naviga in un pennacchio di odori sulla base dei segnali di calcio dell'ensemble neuronale in dCA1. Comprendere il ruolo dei segnali di calcio dCA1 nella navigazione dei pennacchi di odori è un passo cruciale per decifrare le basi del circuito neurale per la navigazione guidata dagli odori in ambienti realistici13,14.
Gli studi sono stati condotti su topi transgenici maschi e femmine di 3-6 mesi di Thy1-GCaMP6f23. Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università del Colorado Anschutz Medical Campus in conformità con le linee guida del National Institutes of Health. Le procedure chirurgiche per l'impianto della lente GRIN (Sezione 1) e il posizionamento della piastra di base (Sezione 2) sono state adattate dai lavori precedenti 9,24,25,26,27,28,29.
1. Chirurgia stereotassica per l'impianto di una lente GRIN nell'ippocampo
2. Posizionamento della piastra di base per il miniscopio
NOTA: Le procedure per il fissaggio della testa del topo iniziano 2 settimane dopo che l'animale si è completamente ripreso dall'intervento chirurgico. La procedura per l'imaging dCA1 inizia 3 settimane dopo l'intervento chirurgico, dopo che l'animale si è completamente ripreso e il segnale GCaMP6f diventa fortemente visibile. Una piastra di base è fissata sulla parte superiore della lente GRIN per l'accesso ottico della fluorescenza dCA1 GCaMP6f attraverso la lente GRIN utilizzando un miniscopio. Questo protocollo utilizzava il miniscopio versione 4 -V4 (Miniscope V4; Tabella dei materiali).
3. Costruzione dell'arena degli odori
NOTA: Questo metodo delinea un'arena automatizzata degli odori basata sul design di Connor et al.13 e Gumaste et al.14. L'assemblaggio completo può essere trovato nel link fornito nella Tabella dei materiali (File supplementare 4).
4. Misurazione della velocità dell'aria del pennacchio con un rivelatore a fotoionizzazione (PID) (Figura 5)
NOTA: Questo metodo rileva l'andamento temporale del pennacchio di odore attraverso un PID che espone l'odorizzante gassoso a una luce ultravioletta ad alta intensità che ionizza le molecole odorizzanti. L'output del dispositivo rileva le molecole odorose nel pennacchio di odore. Questa tecnica consente di stimare la velocità dell'aria nell'arena degli odori confrontando il ritardo per rilevare la presenza di odorizzanti che viaggiano attraverso due posizioni utilizzando il PID.
5. Topo di addestramento comportamentale nell'arena degli odori (Figura 6)
NOTA: Questa sezione descrive un compito comportamentale adattato da Findley et al.4. Il topo è limitato all'acqua il giorno prima per motivare la ricerca di una ricompensa in acqua. Il topo naviga il pennacchio di odore (Figura 6B) verso un beccuccio d'acqua situato alla fonte di rilascio dell'odore per ottenere il rinforzo dell'acqua (3 gocce da 10 μl erogate a 1 Hz). Durante il periodo di addestramento, il topo viene mantenuto sotto la restrizione dell'acqua avendo accesso a un massimo di 2 ml al giorno. Il peso corporeo del topo viene monitorato durante il periodo di restrizione idrica e non deve essere inferiore all'85% del peso corporeo originale. Il topo riceve circa 1 ml di acqua al giorno durante l'allenamento nell'arena degli odori e viene integrato con un ulteriore 1 ml di acqua al giorno nella gabbia dopo l'allenamento. Il topo rimane sotto restrizione d'acqua per un periodo massimo di 72 ore. Il software personalizzato (Table of Materials) rileva la posizione del mouse in tempo reale (60 Hz) utilizzando una semplice tecnica di sottrazione dello sfondo e localizzazione di blob. L'utente imposta manualmente i confini della corsia, il confine di casa (la posizione di partenza per il mouse sul retro dell'arena) e il confine di destinazione (vicino alla fonte dell'odore nella parte anteriore). Inoltre, l'utente può decidere in che modo il software utilizza questi limiti. Ad esempio, l'utente può emettere odori solo quando il mouse si trova dietro il confine della casa. Affinché il mouse riceva una ricompensa, l'utente potrebbe richiedere che rimanga all'interno della corsia odorizzata mentre naviga verso la destinazione (la fonte dell'odore). Una volta che il topo attraversa il confine del bersaglio, può ricevere una ricompensa. Durante la formazione, tuttavia, tutti questi requisiti vengono regolati semplicemente modificando un file "yaml" progettato per essere autoesplicativo e facile da usare.
6. Registrazione dell'epifluorescenza di un topo che si muove liberamente nell'arena degli odori
NOTA: Il metodo descrive la registrazione dell'attività neuronale delle cellule dello strato piramidale (SP) nel CA1 dorsale mediante l'imaging del sensore di calcio geneticamente codificato GCaMP6f espresso nei topi Thy19 mediante imaging miniscopico ad ampio campo durante l'attività di navigazione del pennacchio di odore a due beccucci (Filmato supplementare 1 e Filmato supplementare 2). Una tipica sessione di imaging dura 40 minuti, consentendo al mouse di completare circa 20 prove di navigazione degli odori. Questa tecnica registra un topo per diversi mesi.
7. Pre-elaborazione dei dati
NOTA: Questo metodo utilizza una pipeline MATLAB per elaborare i dati. Il codice è disponibile su GitHub (Software di sincronizzazione, Tabella dei materiali). NoRMCorre31 viene utilizzato per la correzione del movimento e EXTRACT32 viene utilizzato per trovare le ROI con segnali di fluorescenza variabili nel tempo riportati come variazioni della fluorescenza normalizzate dalla fluorescenza tra transitori di calcio (δF/F0).
8. Analisi dei dati - Decodifica della posizione spaziale dai segnali cerebrali
NOTA: questo metodo utilizza l'apprendimento automatico per decodificare le posizioni X e Y del mouse nell'arena dai ROI dCA17. Il codice MATLAB è disponibile (Decoding Brain Signals Software, Table of Materials) all'indirizzo https://github.com/restrepd/drgMiniscope.
L'utilizzo di questa procedura consente di visualizzare e registrare i transienti di fluorescenza dCA1 GCaMP6f nei topi che navigano nell'arena degli odori per trovare la fonte degli odori (Figura 6A, B, Filmato supplementare 1 e Filmato supplementare 2). Le immagini a fluorescenza vengono corrette con NoRMCorre e EXTRACT viene utilizzato per estrarre le ROI. Inoltre, la registrazione con una scheda di interfaccia consente la sincronizzazione dei segnali δF/F0 dalle ROI con gli eventi di erogazione di odori e acqua nell'arena degli odori (Figura 7A), nonché con il movimento del mouse nell'arena degli odori (Figura 7B e filmato supplementare 3). Il risultato rappresentativo del mouse che naviga nel pennacchio di odori include un gran numero di transitori di calcio durante l'attività (Figura 7A, B). Inoltre, è possibile ispezionare come le risposte del calcio sono allineate con la presenza di odore e la ricompensa dell'acqua (Figura 7A). La visualizzazione di singole prove con BENTO fornisce informazioni sulle risposte al calcio nelle diverse fasi della prova, tra cui l'inizio della prova, la decisione, la navigazione, il consumo di alcol e il ritorno in fondo all'arena (Figura 7B). Il metodo ha comunicato preziose informazioni sul legame tra le risposte del calcio CA1 e il comportamento dei topi durante un'attività di navigazione orientata agli odori.
Le registrazioni PID possono fornire informazioni cruciali sul pennacchio di odori e sulla velocità dell'aria del pennacchio. Il risultato rappresentativo mostra un aumento della risposta PID dopo l'apertura della valvola per rilasciare il pennacchio di odore all'interno dell'arena degli odori (Figura 5A). Inoltre, il protocollo consente di decodificare le posizioni X e Y del mouse dai segnali δF/F0 delle ROI dCA1 (Figura 8). Questa tecnica prevede la posizione spaziale del topo durante l'attività di navigazione del pennacchio di odore in base alle risposte CA1, il che è rilevante per comprendere meglio come i neuroni CA1 elaborano l'odore e le informazioni spaziali. La decodifica della traiettoria del topo dai segnali di calcio dell'ensemble neuronale in dCA1 è significativa perché rivela come i neuroni nel CA1 dorsale rappresentino una mappa cognitiva di informazioni odorose e spaziali per svolgere il complesso compito di navigazione del pennacchio di odore. Il metodo è stato esteso a diversi ROI che si comportano esclusivamente come cellule di posizione e altre cellule che rispondono allo stimolo dell'odore. Il successo della decodifica della traiettoria del topo dai segnali dell'insieme neuronale può essere confermato dalla forte correlazione tra la previsione di decodifica e le posizioni X e Y reali a terra del topo.
Figura 1: Pipeline di studio. (A) La chirurgia stereotassica consiste nell'impianto di una lente GRIN nello strato CA1 dell'ippocampo e di una piastra sulla testa per il fissaggio della testa del topo. (B) Una piastra di base è posizionata sulla parte superiore della lente GRIN per consentire l'accesso ottico alla fluorescenza dei neuroni CA1 con un miniscopio. (C) Il topo viene addestrato sull'attività di navigazione del pennacchio di odore. (D) Registrazione in movimento libero del comportamento del topo e dei neuroni CA1 che navigano nel pennacchio di odore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Chirurgia stereotassica. (A) Posizionare il topo anestetizzato nell'apparato stereotassico. Regolare il livello di anestesia tra il 2 e il 3% di conseguenza con la risposta riflessa della zampa pizzicante (B) Radere i capelli sopra la testa. (C) Praticare con cura una piccola ammaccatura permanente con un trapano per fare un'ammaccatura permanente sulla parte superiore della posizione target. (D) Utilizzare il trapano dentale per aprire una perforazione circolare di 1,5 mm di diametro per consentire l'impianto di una lente GRIN di 1 mm di diametro e 4 mm di lunghezza nel cervello. (E) Collegare il supporto della lente GRIN al micromanipolatore e accendere l'aspiratore collegato alla pipetta per tenere la lente GRIN. (F) Impiantare lentamente la lente GRIN nella corteccia fino a raggiungere la profondità di -1,25 mm al di sotto della dura materia. (G) Testa fissa post-mortem illustrativa che mostra la piastra della testa e la piastra di base cementate sul cranio con la lente GRIN impiantata. (H) TAC post-mortem della testa che illustra la barra per la testa sulla parte superiore del cranio e la lente GRIN impiantata all'interno del cranio. (I) Progettazione della piastra della testa per consentire il fissaggio della testa del topo. L'animale in questa rappresentazione non è drappeggiato per facilitare una migliore visualizzazione anatomica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Posizionamento della piastra di base del miniscopio. (A) Porta miniscopio stampato in 3D accoppiato a un micromanipolatore. (B) Miniscopio attaccato al supporto. (C) Fissaggio della piastra di base al miniscopio. (D) Serraggio della vite di fermo per il fissaggio della piastra di base al miniscopio. La vite di fermo viene rilasciata dopo aver cementato la piastra di base al cranio del topo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Costruzione dell'arena degli odori. (A) Camera trasparente dell'arena degli odori. C'è una fotocamera digitale superiore per registrare il comportamento del mouse. (B) I motori passo-passo accoppiati a siringhe controllano l'erogazione dell'acqua per premiare il topo. (C) La vista dall'interno dell'arena degli odori che mostra una struttura a nido d'ape viene utilizzata per produrre un flusso laminare e quattro linee di erogazione degli odori. (D) Sistema di erogazione degli odori, inclusi tubi, valvole e bottiglie di odori visti dall'esterno dell'arena degli odori. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Registrazione del pennacchio di odore. (A) Pennacchio di odore registrato con il rivelatore a fotoionizzazione (PID). Media (blu grassetto)±Deviazione standard (azzurro) di cinque tracce PID di un pennacchio di odore che si propaga a 4,23 cm/s nell'arena degli odori. Una fonte di odori a 2 cm dal pavimento dell'arena degli odori. La testa del sensore del PID fornisce un segnale di tensione per la concentrazione di gas del pennacchio di odore. (B) Registrazione laser del pennacchio di odore con flusso illimitato a 20 cm/s. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Formazione comportamentale del topo. (A) Il mouse impara a navigare verso un pennacchio di odore rilasciato sulla corsia di destra. Il topo impara a iniziare una prova andando in fondo all'arena degli odori, decide un lato per navigare verso il pennacchio di odori e beve una ricompensa in acqua. (B) Il mouse impara a navigare verso un pennacchio di odore rilasciato sulla corsia di sinistra. Il mouse viene ricompensato con l'odore se naviga verso la corsia corretta. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Pre-elaborazione dei dati. (A) Tracce di calcio sincronizzate con gli eventi dell'arena degli odori per molte prove. Ogni singola prova inizia con l'erogazione dell'odore in rosso e le prove premiate terminano con un impulso di erogazione dell'acqua in blu. Le tracce di calcio δF/F0 (senza unità) per ogni ROI sono mostrate in nero. Ogni riga indica un ROI. Una scheda di interfaccia viene utilizzata per registrare le uscite TTL della telecamera superiore sull'arena degli odori e della telecamera miniscope per la sincronizzazione dei fotogrammi. NorMCorre viene utilizzato per correggere il rumore di movimento dai fotogrammi del miniscopio e EXTRACT viene utilizzato per trovare le ROI ed estrarre le tracce di calcio δF/F0. (B) Prova singola rappresentativa di un topo che naviga in un pennacchio. La visualizzazione simultanea del comportamento sincronizzato (pannello di sinistra) e delle tracce di calcio δF/F0 (pannello di destra) da ciascun ROI di un singolo studio è osservata con BENTO. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8. Decodifica della posizione del mouse dai segnali CA1. Decodifica della posizione X e Y del mouse dalle ROI CA1. La previsione di decodifica è mostrata in blu e la posizione reale del terreno del mouse è mostrata in rosso. Le tracce previste sono fortemente correlate con la verità di base. (A) Decodificare le posizioni X dalle ROI (coefficiente di correlazione di Pearson = 0,88). (B) Decodifica delle posizioni Y dalle ROI (coefficiente di correlazione di Pearson = 0,88). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Filmato supplementare 1: Esempio rappresentativo di fotogrammi comportamentali e miniscopici sincronizzati di un mouse che naviga verso un pennacchio di odore nella corsia di sinistra. (A) Fotogrammi comportamentali di un topo che indossa un miniscopio e naviga all'interno dell'arena degli odori. (B) Fotogrammi del topo in miniatura che mostrano i transitori di calcio grezzo registrati attraverso la lente GRIN. Clicca qui per scaricare questo filmato.
Filmato supplementare 2: Esempio rappresentativo di fotogrammi comportamentali e miniscopici sincronizzati di un topo che naviga verso un pennacchio di odore nella corsia di destra. (A) Fotogrammi comportamentali di un topo che indossa un miniscopio e naviga all'interno dell'arena degli odori. (B) Fotogrammi del topo in miniatura che mostrano i transitori di calcio grezzo registrati attraverso la lente GRIN. Clicca qui per scaricare questo filmato.
Filmato supplementare 3: Visualizzazione BENTO dei dati elaborati del comportamento del mouse e dei segnali cerebrali. Pannello di sinistra: il mouse sta navigando verso la corsia di destra nell'arena. Le annotazioni del comportamento vengono visualizzate in colori diversi. Pannello di destra: segnali di calcio δF/F0 della navigazione del mouse. Clicca qui per scaricare questo filmato.
Fascicolo supplementare 1: NoseconeRender.png. File per il cono nasale stampato in 3D per eseguire l'anestesia con isoflurano. Clicca qui per scaricare questo file.
Fascicolo supplementare 2: HeadbarRender.png. Lima per la barra della testa per il fissaggio della testa del mouse. Clicca qui per scaricare questo file.
Fascicolo supplementare 3: HeadbarTechnicalDrawing.png. Lima per la barra della testa per il fissaggio della testa del mouse. Clicca qui per scaricare questo file.
Fascicolo supplementare 4: ArenaFig_Draft2.tiff. Layout dettagliato dell'arena degli odori. Clicca qui per scaricare questo file.
Questo protocollo delinea meticolosamente i passaggi per registrare le cellule di posizione e le cellule sensibili agli odori nell'area dCA1 dell'ippocampo dei topi che navigano in un pennacchio di odori. Le fasi critiche del protocollo includono la chirurgia stereotassica, il posizionamento della piastra di base del miniscopio, la costruzione dell'area dell'odore, il controllo del pennacchio nell'arena dell'odore, l'allenamento comportamentale, la registrazione del miniscopio del mouse che si muove liberamente, la pre-elaborazione dei dati e l'analisi dei dati. Inoltre, il protocollo spiega il processo di decodifica della traiettoria del topo dalle registrazioni dCA1.
Un passaggio fondamentale nella chirurgia stereotassica consiste nel seguire le coordinate relative al bregma per posizionare la lente GRIN nella posizione corretta. Una limitazione del metodo è il ritardo tra l'intervento chirurgico e il momento di iniziare a osservare i segnali GCaMP6f, che può richiedere 2-4 settimane. Il mouse dovrebbe essere pronto per l'uso dopo questo periodo critico. Una differenza tra il protocollo attuale e i protocolli precedenti 24,25,26,27 consiste nell'utilizzo di topi Thy1-GCaMP6f che già esprimono GCaMP6f in CA1 invece di iniettare il virus AAV-GCaMP6f nell'ippocampo. Risparmia tempo durante l'intervento chirurgico e non richiede un tempo di attesa per l'espressione del virus AAV nel cervello. Inoltre, questo protocollo non aspira il cervello e utilizza l'isoflurano al posto della ketamina/xilazina, che fornisce un migliore controllo della dose per prevenire il sovradosaggio. Una limitazione del metodo è l'aberrazione ottica della lente GRIN, che limita il campo visivo. Un passaggio cruciale per il posizionamento della piastra di base è quello di mantenere la lente di elettrobagnatura al centro per evitare una limitazione nella regolazione della piastra Z dopo aver cementato la piastra di base sulla testa. Un limite della costruzione dell'arena degli odori è la complessità del sistema, che può richiedere diversi mesi e può richiedere l'assistenza di un ingegnere. Una limitazione dell'addestramento comportamentale è che i topi possono preferire un lato dell'arena degli odori rispetto all'altro. Un modo per superare questo problema è quello di alternare le prove premiando il mouse per la navigazione verso le corsie di sinistra e destra.
Un passaggio fondamentale per il controllo del pennacchio è mantenere l'ago PID allineato con la fonte dell'odore per rilevare il percorso del pennacchio. Un passaggio cruciale nella registrazione del miniscopio di un mouse che si muove liberamente è garantire che il filo mini-coassiale non si aggrovigli durante l'attività, cosa che può essere evitata con un commutatore. I palloncini ad elio possono essere utilizzati per evitare che il filo mini-coassiale arrivi davanti al mouse. È fondamentale per la pre-elaborazione dei dati sincronizzare gli impulsi TTL della fotocamera digitale superiore dell'arena degli odori e della telecamera del miniscopio. Per la procedura EXTRACT, si consiglia di utilizzare l'elaborazione non negativa per estrarre meglio i segnali ROI e δF/F0. EXTRACT produce un'ispezione visiva delle tracce per ogni ROI per escludere quelle errate. È fondamentale decodificare le posizioni X e Y del mouse dalle ROI per avere un ampio set di dati con centinaia di epoche per un migliore addestramento della rete neurale artificiale.
L'importanza di questo metodo di registrazione a movimento libero rispetto ai metodi esistenti fissati con la testa è lo studio del comportamento del topo in un contesto etologicamente rilevante con il movimento corretto della testa per navigare in un pennacchio di odori complesso. Questo metodo è applicabile per studiare il ruolo dinamico dei neuroni dCA1 nella navigazione olfattiva complessa. Inoltre, la procedura non è limitata all'ippocampo o all'olfatto. Altre potenziali applicazioni della tecnica includono lo studio del ruolo di diverse aree cerebrali e modalità sensoriali, comprese le possibili applicazioni nella navigazione visiva utilizzando i LED per indicare le corsie premiate. Inoltre, questo metodo può essere potenzialmente applicato in esperimenti a circuito chiuso in tempo reale in cui la decodifica del calcio neurale dalla popolazione innesca la neurostimolazione o il feedback sensoriale 20,34,35,36.
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Questa ricerca è stata supportata dal National Institutes of Health degli Stati Uniti (NIH UF1 NS116241 e NIH R01 DC000566) e dalla National Science Foundation (NSF BCS-1926676). Gli autori ringraziano Andrew Scallon per aver aiutato a creare la camera dell'Odor Arena.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Arduino Micro | Arduino | Micro | |
Biocompatible Methacrylate Resin | Parkell | S380 | C&B-Metabond Adhesive Luting Cement |
Decoding Brain Signals Software | CU Anschutz | https://github.com/restrepd/drgMiniscope | |
Dental Drill | Osada | LHP-6 | AZ210015 |
Dental Drill Box | Osada | XL-230 | 30000 rotations per minute |
Digital stereotaxic instrument | Stoelting | 51730D | Mouse Stereotaxic Instument, #51904 Digital Manipulator Arm, 3-Axes, Add-On, LEFT |
Drill Bit | FST Fine Science Tools | 19007-05 | Tip diameter 0.5 mm |
Fast Digital Camera | Edmund Optics | BFS-U3-63S4C | FLIR Blackfly S |
Focal Lens | Edmund Optics | C-Series | 3.5 mm |
GRIN lens | Inscopix | 1050-004595 | 1 mm diameter and 4 mm length |
GRIN lens Holder | UCLA | http://miniscope.org/index.php/Surgery_Protocol | |
Liquid Tissue Adhesive | 3M | 1469C | Vetbond Tissue Adhesive |
Low-Flow Anesthesia System for Mice | Kent Scientific Corporation | SomnoSuite | https://www.kentscientific.com/products/somnosuite/ |
Low Toxicity Silicone Adhesive | WPI – World Precision Instruments | Kwik-sil | |
miniPID Controller | ASI – Aurora Scientific Inc. | Model 200B | Fast-Response Miniature Photo-Ionization Detector |
Miniscope V4 Holder | UCLA | NA | https://github.com/Aharoni-Lab/Miniscope-v4/tree/master/Miniscope-v4-Holder |
Miniscope V4 | Labmaker | NA | https://www.labmaker.org/products/miniscope-v4 |
Miniscope Base Plate V2 | Labmaker | NA | https://www.labmaker.org/products/miniscope-v4-base-plates-variant-2-pack-of-10 |
Miniscope DAQ-QT software | UCLA | https://github.com/Aharoni-Lab/Miniscope-DAQ-QT-Software/wiki | |
Motion Correction Software | CU Anschutz | https://github.com/restrepd/drgMiniscope | |
Odor Arena Hardware | Custom Made | 3D Model | https://www.dropbox.com/scl/fo/lwtpqysnpzis32mhrx3cd/ADomsxyhxu42sqDmTBl2O6k?rlkey=b3l4809eradundt5l3iz0gq74& dl=0 |
Odor Arena Software | CUAnschutz | https://github.com/wryanw/odorarena | |
Odorant Isoamyl Acetate | Aldrich Chemical Co | 06422AX | Diluted at 1% in odorless mineral oil |
RHD USB Interface Board | Intan Technologies | C3100 | Product discontinued. Alternatively use another equivalent board. |
ROI Extraction Software | CU Anschutz | https://github.com/restrepd/drgMiniscope | |
Sutter Micromanipulator | Sutter Instrument Company | MP-285 | |
Synchronization Software | CU Anschutz | https://github.com/fsimoesdesouza/Synchronization | |
Thy1-GCaMP6f mice | Jackson Laboratory | IMSR_JAX 028281 | C57BL/6J-Tg(Thy1-GCaMP6f)GP5.12Dkim/J) |
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