Questo protocollo si concentra sull'uso della citometria a flusso e del conteggio delle microsfere per quantificare le spore batteriche marcate con bromuro di etidio. Il metodo è anche efficiente per analizzare l'accoppiamento covalente di proteine sulla superficie di spore intatte.

Le spore di Bacillus subtilis sono già state proposte per diverse applicazioni biotecnologiche ed immunologiche; Tuttavia, vi è una crescente necessità di sviluppare metodologie che migliorino la rilevazione degli antigeni immobilizzati sulla superficie delle spore insieme alla loro quantificazione. Le analisi basate sulla citometria a flusso sono state precedentemente proposte come approcci veloci, affidabili e specifici per la rilevazione di cellule marcate di B. subtilis. In questo articolo, proponiamo l'uso della citometria a flusso per valutare l'efficienza di visualizzazione di un anticorpo fluorescente (FA) sulla superficie della spora e quantificare il numero di spore utilizzando le perle di conteggio.

Per questo, abbiamo usato il bromuro di etidio come marcatore del DNA e un anticorpo marcato con alloficocianina (APC), che è stato accoppiato alle spore, come marcatore di superficie. La quantificazione delle spore è stata eseguita utilizzando le perle di conteggio poiché questa tecnica dimostra un'elevata precisione nel rilevamento delle cellule. Le spore marcate sono state analizzate utilizzando un citometro a flusso, che ha confermato l'accoppiamento. Di conseguenza, è stato dimostrato che la marcatura del DNA ha migliorato l'accuratezza della quantificazione mediante citometria a flusso, per la rilevazione delle spore germinate. È stato osservato che il bromuro di etidio non era in grado di marcare le spore dormienti; Tuttavia, questa tecnica fornisce una determinazione più precisa del numero di spore con proteina fluorescente accoppiata alla loro superficie, aiutando così nello sviluppo di studi che si concentrano sull'uso delle spore come piattaforma biotecnologica in diverse applicazioni.

Il Bacillus subtilis è un batterio gram-positivo a forma di bastoncino in grado di produrre spore quiescenti quando le condizioni ambientali non consentono la crescita cellulare¹. Le spore sono forme cellulari estremamente stabili e quelle di diverse specie, tra cui B. subtilis, sono ampiamente utilizzate come probiotici per uso umano e animale². Grazie alle sue proprietà di resistenza e sicurezza, la spora di B. subtilis, che presenta proteine eterologhe, è stata proposta come adiuvante della mucosa, sistema di somministrazione di vaccini e piattaforma di immobilizzazione enzimatica ^3,4.

Per ottenere spore da B. subtilis, è necessario esporlo alla privazione di nutrienti utilizzando uno speciale terreno di coltura. Dopo aver ottenuto e purificato queste spore, è necessario quantificarle per migliorare l'efficienza del test ^5,6. Pertanto, vengono applicati alcuni metodi per analizzare la concentrazione delle spore ottenute. È possibile utilizzare il conteggio delle piastre e una camera Petroff-Hausser, nota anche come camera di conteggio. Quest'ultimo è stato originariamente sviluppato per determinare la concentrazione delle cellule del sangue; tuttavia, è possibile utilizzarlo nel campo della microbiologia per il conteggio delle spore ^7,8. Nonostante sia il metodo standard utilizzato per il conteggio delle cellule, la lettura è laboriosa poiché questo metodo è completamente manuale e la sua precisione dipende dall'esperienza dell'operatore.

Le analisi basate sulla citometria a flusso (FC) sono state precedentemente proposte come approcci veloci, affidabili e specifici per rilevare cellule marcate di Bacillus spp. L'uso di microsfere di conteggio con citometria a flusso ha garantito la riproducibilità nella conta cellulare negli esami di routine (conta assoluta dei linfociti T CD4 e CD8) e nello sviluppo della ricerca che coinvolge particelle in grado di essere rilevate e contate utilizzando la citometria a flusso⁹. Godjafrey e Alsharif hanno suggerito l'uso di perline di conteggio per la quantificazione FC di spore non marcate¹⁰. L'uso della citometria a flusso è stato descritto per il monitoraggio della sporulazione in Bacillus spp. tramite l'etichettatura del DNA delle spore 10,11,12,13. Un altro studio ha utilizzato FC per valutare la quantità di proteine marcate in modo fluorescente sulla superficie delle spore¹⁵.

Questo studio ha cercato di utilizzare perle di conteggio commerciali per garantire uno standard di riproducibilità rispetto al conteggio degli eventi utilizzando la citometria a flusso. In questo articolo, suggeriamo l'uso di perline di conteggio per il conteggio delle cellule in FC per perfezionare l'enumerazione delle spore e valutare l'efficienza di accoppiamento di anticorpi marcati con fluorescenza sulla superficie delle spore.

Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, gli strumenti e il software utilizzati in questo protocollo.

1. Impostazione della citometria a flusso

1. Allineamento dei parametri ottici di un citometro a flusso accoppiato ad un computer
   1. Accedere al software del citometro.
   2. Dall'area di lavoro del software, selezionare Citometro | Avviare e attendere qualche minuto | Modalità di pulizia | Liquidi seduti.
      NOTA: Le bolle d'aria e le ostruzioni sono state rimosse durante il processo di avvio del citometro, prima dell'acquisizione del campione.
2. Controllo di qualità
   1. Utilizzare il reagente per il controllo qualità per regolare le tensioni dei tubi fotomoltiplicatori e valutarne la sensibilità.
      1. Preparare il reagente per il controllo qualità in una provetta di polistirolo.
      2. Per definire la linea di base, preparare le perle di sospensione aggiungendo 0,5 mL di diluente (PBS filtrato 10 mM, pH 7) e 3 gocce di microsfere nella provetta marcata.
      3. Mescolare il flaconcino di perline con una leggera inversione.
   2. Dall'area di lavoro del software, selezionare Citometro | CST per connettersi all'interfaccia CST. Attendere qualche minuto e osservare il messaggio citometro disconnesso.
   3. Collegare il tubo di polistirolo contenente il reagente per il controllo qualità alla sonda del citometro a flusso.
3. Verifica della configurazione del citometro
   1. Nella finestra Riepilogo sistema , verificare che la configurazione del citometro sia appropriata per l'esperimento.
   2. Selezionare l'ID del lotto di perline di setup corrispondente per verificare che l'ID del lotto di perline di setup selezionato corrisponda al lotto corrente di perline di ricerca CS&T.
4. Controllo delle prestazioni
   1. Selezionare l'opzione Controlla prestazioni e fare clic su Esegui.
   2. Al termine del controllo delle prestazioni, verranno visualizzati i risultati delle prestazioni. Visualizza il rapporto sulle prestazioni del citometro. Fare clic su Fine per completare il controllo delle prestazioni oppure rimuovere la provetta dal citometro ed esaminare i risultati nella finestra Riepilogo sistema .
   3. Osservare il risultato finale dell'analisi morfometrica e di sensibilità alla fluorescenza che apparirà nel | riepilogo del sistema| risultato delle prestazioni del citometro| con lo stato: SUPERATO

2. Preparazione delle spore

1. Dopo la sporulazione, sciacquare le spore 3 volte con acqua ghiacciata ultrapura mediante centrifugazione a 17.949 × g per 10 min.
2. Risospendere il pellet ottenuto dall'ultima centrifugazione con 10 mL di acqua ultrapura.
3. Autoclavare le spore per 45 minuti a 121 ºC per l'inattivazione delle cellule vegetative.
   NOTA: Precedenti test effettuati dal nostro gruppo confrontando diversi metodi di inattivazione hanno dimostrato che le condizioni menzionate nel passaggio 2.3 presentavano un'elevata efficienza, non mostrando formazione di colonie nel metodo di analisi della placcatura sul terreno di agar LB.

3. Quantificazione delle spore sterilizzate in autoclave mediante citometria a flusso

1. Prelevare 50 μL di spore sterilizzate in autoclave e incubarle al riparo dalla luce con bromuro di etidio (EtBr, 10 mg/mL diluito in acqua) con un fattore di diluizione dello 0,05% v/v per 30 minuti (Figura 1A).
2. Lavare le spore 3 volte con 1 soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) mediante centrifugazione a 17.949 × g per 10 minuti e risospendere in 1x PBS.
3. Aggiungere 10 μL di perline, seguendo le raccomandazioni del produttore per la diluizione.
4. Analizzare il campione utilizzando un citometro a flusso come descritto al punto 4.
   NOTA: È importante sottolineare che le perle devono essere pipettate nel modo più omogeneo possibile poiché sono state osservate disparità nei calcoli quando questo passaggio non è stato eseguito correttamente.

4. Analisi mediante citometria a flusso

1. Accedere al software del citometro.
2. Dall'area di lavoro del software, selezionare Citometro | Modalità di pulizia | Liquidi seduti.
3. Regolare l'area di lavoro per determinare l'analisi nella citometria a flusso.
   1. Definire i gate per le analisi (Figura 2).
      1. Definire la strategia di gating in base alle caratteristiche morfometriche e di fluorescenza delle particelle in base al controllo negativo (spore non marcate).
   2. Per determinare la morfometria cellulare, scegliere Dotplot graphic per le analisi dei parametri FSC-A sull'asse x e SSC-A sull'asse y.
   3. Per determinare la fluorescenza, scegliete i grafici FL3 Dotplot sull'asse y utilizzando FL5 sull'asse x e create i gate in quattro quadranti.
4. Utilizzare una provetta in polistirene con tappo da 12 x 75 mm contenente campioni non etichettati, precedentemente etichettati con EtBr monocolore, APC monocolore e APC EtBr+ multicolore.
5. Mescolare molto delicatamente la provetta contenente il controllo negativo e collegarla alla sonda del citometro a flusso.
6. Fare clic su Acquisisci.
7. Imposta la potenza dei laser navigando su Citometro | Parametri | FSC (375) e SSC (275).
8. Impostare la soglia su (500) Citometro | Soglia.
9. Per rimuovere l'autofluorescenza, analizzare il campione privo di coloranti contenente solo spore.
10. Regolare le tensioni per i rivelatori filtro: FL3 (603) e FL5 (538) per discriminare le popolazioni negative e positive rispetto alla fluorescenza scelta nei controlli. Citometro | Parametri.
11. Citometro | Compensazione | Impostare l'offset di impostazione FL5/FL3 su 1.0.
12. Dopo la morfometria e l'analisi fluorescente, configurare il dispositivo per l'acquisizione di 30.000 eventi | Esperimento | Layout dell'esperimento | Acquisizione |30.000 eventi....
13. Dopo aver regolato i parametri, acquisire i dati per i campioni etichettati e contenenti microsfere nel citometro a flusso.
14. Calcolare la concentrazione di spore come descritto dalle istruzioni del produttore utilizzando l'equazione (1).
    (1)
    NOTA: Per questo studio, il metodo di quantificazione delle perle è stato confrontato con l'analisi della camera di conteggio di Petroff-Hausser. Inoltre, l'etichettatura delle spore sterilizzate in autoclave è stata confrontata con l'etichettatura delle spore non sterilizzate in autoclave.

5. Stima dell'indice di accoppiamento proteico sulla superficie di una spora mediante citometria a flusso

1. Raccogliere per centrifugazione 50 μL di spore (10³/μL) 17.949 × g per 10 minuti e quindi risospendere con 25 μL di 1-etil-3-(3-dimetilamminopropil)carbodiimmide (EDC) (300 mM)).
2. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
3. Aggiungere 25 μL di N-idrossisolfosuccinimide (NHS) (50 mM) alla sospensione di spore e incubarla a temperatura ambiente per 30 minuti.
4. Lavare le spore 3 volte con 1x PBS mediante centrifugazione come descritto al punto 5.1.
5. Aggiungere proteine fluorescenti e lasciare i campioni per una notte a 15 °C.
   NOTA: La proteina fluorescente utilizzata in questo lavoro era un anticorpo anti-IL-10 anti-umano marcato con APC. Questo anticorpo è stato utilizzato come modello per lo studio, anche se l'applicazione di altre molecole fluorescenti è possibile poiché EDC/NHS promuovono una legatura covalente tra i gruppi -COOH e -NH₂ presenti nelle proteine sulla superficie della spora.
6. Lavare le spore come da punto 5.3.
7. Aggiungere 10 mg/mL di bromuro di etidio diluito a 1:50, quindi lasciare per 1 ora su ghiaccio e al riparo dalla luce (Figura 1B).
8. Lavare le spore come da punto 5.3.
9. Ripetere il passaggio 4.
10. Per determinare la fluorescenza, modificare i parametri FL3 sull'asse X e FL5 sull'asse Y del dotplot.
11. Analizzare il campione utilizzando un citometro a flusso con il laser blu (488 nm) a FL3 (filtro 670 LP) e il laser rosso (633 nm) in FL5 (filtro 660/20), come descritto al punto 4.
    NOTA: Gli stessi campioni sono stati analizzati per l'immunofluorescenza su vetrini al microscopio, ad un intervallo di ingrandimento di 1.000 x e utilizzando i seguenti filtri: FITC 480/30 nm (verde) e TRITC 540/25 nm (rosso).

Nei campioni di spore autoclavate (AS), sono state rilevate rispettivamente 2 × 10³ spore/μl e 1 ×^{10 3} spore/μl utilizzando le microsfere di conteggio e il metodo Petroff-Hausser (Figura 2).

Figura 1: Schema generale di quantificazione delle spore. (A) spore marcate con EtBr e (B) spore marcate a doppia marcatura. Abbreviazioni: EDC = 1-etil-3-(3-dimetilamminopropil)carbodiimmide; NHS = N-idrossisulfosuccinimide. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Analisi morfometrica e qualitativa delle spore di Bacillus subtilis e conteggio delle perle mediante citometria a flusso. Quantificazione delle spore di B. subtillis mediante microsfere di conteggio (campione non diluito). Abbreviazioni: FSC-A = area di dispersione diretta-picco; SSC-A = area di dispersione-picco laterale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La colorazione con bromuro di etidio (EtBr) dei campioni di spore autoclavate (AS) ha mostrato un'intensità media di fluorescenza (MFI) più elevata rispetto alla colorazione delle spore non autoclavate (NAS), indicando così una maggiore colorazione del materiale genetico nella prima condizione. Inoltre, è stato osservato un MFI maggiore nella popolazione AS marcata con EtBr rispetto alla popolazione NAS (Figura 3, picco in rosso e picco in nero). Il campione di controllo, non marcato con EtBr, non ha mostrato una fluorescenza significativa (Figura 3, picco tratteggiato).

Figura 3: Istogramma di spore di Bacillus subtillis marcate con bromuro di etidio, sterilizzate in autoclave e non sterilizzate in autoclave. Picco nell'etichettatura EtBr rosso-NAS; picco nella marcatura EtBr nero-AS; controllo dei picchi punteggiati senza etichettatura EtBr. Abbreviazioni: EtBr = bromuro di etidio; NAS = spore non sterilizzate in autoclave; AS = spore sterilizzate in autoclave. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

In questi esperimenti, l'MFI sull'accoppiamento superficiale AS con l'anticorpo anti-umano IL-10 marcato con APC ha mostrato una maggiore efficienza di accoppiamento rispetto al NAS (Figura 4). Per questo motivo, gli esperimenti a doppia marcatura sono stati eseguiti con AS. Nell'analisi di citometria a flusso sono state identificate quattro popolazioni di spore: EtBr+/FA+; EtBr+/FA-; EtBr-/FA+; EtBr-/FA-. La presenza di spore permeabili al marcatore molecolare EtBr indica la possibile presenza di spore germinate nella popolazione totale. Ciò è stato possibile dopo l'analisi del campione mediante microscopia a fluorescenza (con la quale è stato possibile osservare la marcatura EtBr/Fluorescent Anti-mouse table 8 ed entrambi i fluorofori singolarmente, Figura 5). L'utilizzo del metodo di colorazione di Wirtz-Conklin ha permesso di visualizzare l'esistenza di spore con permeabilità per la safranina (colorate in rosa, Figura supplementare S1). In questa stessa analisi sono state osservate spore colorate solo con verde malachite, indicando impermeabilità, come riportato in letteratura per le spore dormienti¹³. L'analisi delle spore mediante microscopia a contrasto di fase presenta un numero maggiore di spore dormienti nel campione di AS rispetto al NAS (Figura supplementare S2)¹⁴.

Figura 4: Intensità media di fluorescenza degli anticorpi anti-IL-10 umani marcati con APC in spore sterilizzate in autoclave e non in autoclave. Abbreviazioni: FA = anticorpo fluorescente; APC = alloficocianina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Imaging in immunofluorescenza di spore marcate con EtBr e anti-topo fluorescente. (A) Spore con materiale genetico marcato con EtBr (rosso). (B) Spore con superficie marcata con anti-topo fluorescente (verde). (C) Spore a doppia marcatura, con EtBr e anti-topo fluorescente (arancione). Barra graduata = 10 μm. Abbreviazioni: EtBr = bromuro di etidio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Le analisi di citometria a flusso qui eseguite hanno indicato una percentuale maggiore di accoppiamento della FA alle spore dormienti (EtBr-/FA+) rispetto alle spore germinate (EtBr+/FA+). Nel grafico mostrato in Figura 6A,B, l'aumento della percentuale di spore accoppiate e MFI può essere osservato all'aumentare della concentrazione di FA. Inoltre, le popolazioni di queste spore che non si accoppiavano con la proteina fluorescente (EtBr+/FA- e EtBr-/FA-) mostravano una graduale riduzione con l'aumentare della concentrazione di FA (Tabella supplementare S1).

Figura 6: Analisi della percentuale di accoppiamento della fluorescenza e dell'intensità media della fluorescenza delle popolazioni EtBr-/FA+ ed EtBr+/FA-. (A) L'asse x rappresenta le diverse concentrazioni di FA, l'asse y nero rappresenta l'MFI rilevato e l'asse y rosso rappresenta la percentuale di spore marcate con FA dalla popolazione EtBr - /FA+. (B) L'asse x rappresenta le diverse concentrazioni di FA, l'asse y nero rappresenta l'MFI rilevato e l'asse y rosso rappresenta la percentuale di spore e FA marcate con EtBr dalla popolazione EtBr+/FA+. Abbreviazioni: MFI = intensità media di fluorescenza; EtBr = bromuro di etidio; FA = anticorpo fluorescente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare S1: Immagine al microscopio di spore di B. subtilis sterilizzate in autoclave colorate con metodologia Wirtz-Conklin. Le spore colorate di rosa sono spore germinate (permeabili alla safranina). In verde ci sono spore dormienti (impermeabili alla safranina). Barra della scala = 10 μm. Fare clic qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S2: Confronto delle immagini al microscopio a contrasto di fase di spore di B. subtilis sterilizzate in autoclave e non in autoclave. (A,B) Immagini di spore di B. subtilis prima e dopo il trattamento in autoclave. Fare clic qui per scaricare il file.

Tabella supplementare S1: Valori delle percentuali di spore marcate, o meno, con anticorpi fluorescenti e bromuro di etidio, in diverse concentrazioni di FA, osservati in citometria a flusso. Abbreviazioni: EtBr = bromuro di etidio; FA = anticorpo fluorescente. Fare clic qui per scaricare il file.

I metodi tradizionali, come il conteggio su piastra delle colonie, non solo richiedono molto tempo, ma richiedono anche cellule vitali e non consentono la quantificazione delle spore inattivate⁵. La camera di Petroff-Hausser è una metodologia alternativa, ma richiede un microscopista esperto per eseguirla. La citometria a flusso si è dimostrata un'utile alternativa a questo scopo.

Genovese et ^al.12 hanno descritto l'uso della citometria a flusso per la quantificazione di cellule vitali e spore di Bacillus sp. utilizzando due marcatori di acidi nucleici e un'elevata capacità di controllo della portata (volume/minuto) dell'apparecchiatura utilizzata, che fornisce la possibilità di determinare la quantità numerica da configurare. Non tutte le apparecchiature citometriche hanno un controllo rigoroso sulla portata (volume/minuti) e alcune sono regolabili solo nelle opzioni minima, media e massima. In questi casi, le microsfere di conteggio possono essere utilizzate per garantire l'accuratezza dell'enumerazione cellulare e la riproducibilità rispetto ad altre apparecchiature di citometria a flusso. Tramite questo metodo, in questo studio, è stato possibile calcolare il numero di spore (germinate e dormienti) per millilitro nei campioni.

La popolazione di spore è stata enumerata e analizzata secondo i parametri descritti nel brevetto¹⁰ di Godfrey e Alsharif. Questi autori descrivono l'uso di questa metodologia per l'analisi degli stadi di germinazione di Bacillus spp. senza descrivere lo stato della spora e utilizzando marcatori commerciali del DNA 11,12,13 ad alto costo. Nel lavoro qui descritto, utilizzando AS, è stato possibile identificare due popolazioni di spore (dormienti e germinate) utilizzando EtBr, che è un marcatore ampiamente utilizzato e facilmente accessibile. L'identificazione dello stato delle spore è stata possibile grazie alla permeabilità delle spore germinate all'EtBr. È importante evidenziare che la popolazione di spore non marcate con EtBr può presentare artefatti di dimensioni simili nello stesso campione. Questa limitazione può essere mitigata lavando e filtrando i tamponi utilizzati.

L'analisi di citometria a flusso di campioni di AS marcati con EtBr accoppiati con FA qui descritti ha anche permesso la qualificazione e la quantificazione dell'accoppiamento di proteine fluorescenti (FPC). L'analisi dei campioni marcati e accoppiati con fluorescenza deve essere eseguita immediatamente per evitare la perdita di emissione di fluorescenza. Inoltre, è stato possibile dedurre se la morfologia e la concentrazione della popolazione di spore fossero influenzate dalla procedura di coniugazione, fornendo una comprensione complessiva del processo, che non si ottiene quando si utilizza il metodo dot-blot. Isticato et ^al.15 hanno anche analizzato la FPC sulla superficie della spora e ne hanno dimostrato la vitalità confermandola con immunofluorescenza e citometria a flusso, a seconda del tipo di proteina utilizzata per l'accoppiamento. In questo caso, è stato osservato che l'uso di AS¹¹ è preferibile per l'accoppiamento poiché il processo di sterilizzazione in autoclave è importante per l'inattivazione delle proteasi che possono degradare la proteina da accoppiare. E' importante sottolineare che le tecniche qui descritte sono state eseguite utilizzando solo il ceppo B . subtilis KO7, con l'applicazione in altri ceppi ancora da testare.

Non ci sono rapporti in letteratura che confrontino la capacità di accoppiamento delle spore in base al loro stadio. Negli esperimenti qui presentati, è stata osservata una percentuale più elevata di spore dormienti accoppiate a FA (EtBr-/FA+)¹⁶. Al contrario, le spore germinate (EtBr+/FA+), nonostante la loro percentuale inferiore, hanno mostrato un MFI più elevato rispetto a quello osservato nelle spore dormienti. Sono necessari ulteriori studi per valutare questo comportamento per concentrazioni più elevate di FA (punto di saturazione) in altri Bacillus spp.

Per applicazioni future, il metodo qui presentato potrebbe essere utilizzato in studi sull'uso di spore di B. subtilis come adiuvante del vaccino, valutando l'accoppiamento di un antigene bersaglio inizialmente marcato mediante fluorescenza. Dopo aver determinato la concentrazione di saturazione, il valore rilevato può essere applicato all'antigene bersaglio per l'uso nelle immunizzazioni.

Pertanto, questo articolo presenta un metodo pratico e sensibile per l'enumerazione delle spore germinate e dormienti e l'analisi dell'accoppiamento proteico fluorescente delle spore di Bacillus subtilis utilizzando la citometria a flusso. L'uso delle microsfere di conteggio come parametro per la quantificazione, in aggiunta alla marcatura delle spore EtBr, consente un conteggio raffinato delle spore germinate e la determinazione percentuale dell'accoppiamento proteico fluorescente. Questo metodo dovrebbe aiutare nello sviluppo di studi incentrati sull'uso delle spore come coadiuvante.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Questo studio è stato finanziato in parte dal Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Codice finanziario 001; Governo do Estado do Amazonas con risorse della Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas-FAPEAM; Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Gli autori ringraziano il Programma per lo Sviluppo Tecnologico in Strumenti per la Salute PDTIS-FIOCRUZ per l'uso delle sue strutture.