Ce protocole se concentre sur l’utilisation de la cytométrie en flux et des billes de comptage pour quantifier les spores bactériennes marquées au bromure d’éthidium. La méthode est également efficace pour analyser le couplage covalent des protéines à la surface des spores intactes.

Les spores de Bacillus subtilis ont déjà été proposées pour différentes applications biotechnologiques et immunologiques ; Cependant, il est de plus en plus nécessaire de développer des méthodologies qui améliorent la détection des antigènes immobilisés à la surface des spores ainsi que leur quantification. Les analyses basées sur la cytométrie en flux ont déjà été proposées comme des approches rapides, fiables et spécifiques pour détecter les cellules marquées de B. subtilis. Ici, nous proposons l’utilisation de la cytométrie en flux pour évaluer l’efficacité d’affichage d’un anticorps fluorescent (FA) à la surface de la spore et quantifier le nombre de spores à l’aide de billes de comptage.

Pour cela, nous avons utilisé le bromure d’éthidium comme marqueur d’ADN et un anticorps marqué à l’allophycocyanine (APC), qui a été couplé aux spores, comme marqueur de surface. La quantification des spores a été réalisée à l’aide de billes de comptage car cette technique démontre une grande précision dans la détection des cellules. Les spores marquées ont été analysées à l’aide d’un cytomètre en flux, ce qui a confirmé le couplage. En conséquence, il a été démontré que le marquage de l’ADN améliorait la précision de la quantification par cytométrie en flux, pour la détection des spores germées. On a observé que le bromure d’éthidium n’était pas en mesure de marquer les spores dormantes ; Cependant, cette technique permet de déterminer plus précisément le nombre de spores avec des protéines fluorescentes couplées à leur surface, contribuant ainsi au développement d’études axées sur l’utilisation des spores comme plate-forme biotechnologique dans différentes applications.

Bacillus subtilis est une bactérie gram-positive en forme de bâtonnet qui est capable de produire des spores au repos lorsque les conditions environnementales ne permettent pas la croissance cellulaire¹. Les spores sont des formes cellulaires extrêmement stables et celles de plusieurs espèces, dont B. subtilis, sont largement utilisées comme probiotiques à usage humain et animal². En raison de ses propriétés de résistance et d’innocuité, la spore de B. subtilis, qui présente des protéines hétérologues, a été proposée comme adjuvant muqueux, système d’administration de vaccins et plate-forme d’immobilisation enzymatique ^3,4.

Pour obtenir des spores de B. subtilis, il est nécessaire de l’exposer à une privation de nutriments à l’aide d’un milieu de culture spécial. Après avoir obtenu et purifié ces spores, il faut les quantifier pour améliorer l’efficacité du test ^5,6. Ainsi, certaines méthodes sont appliquées pour analyser la concentration des spores obtenues. Il est possible d’utiliser le comptage des plaques et une chambre Petroff-Hausser, également connue sous le nom de chambre de comptage. Ce dernier a été développé à l’origine pour déterminer la concentration des cellules sanguines ; Cependant, il est possible de l’utiliser dans le domaine de la microbiologie pour le comptage des spores ^7,8. Bien qu’il s’agisse de la méthode standard utilisée pour le comptage cellulaire, la lecture est laborieuse car cette méthode est entièrement manuelle et sa précision dépend de l’expérience de l’opérateur.

Les analyses basées sur la cytométrie en flux (FC) ont déjà été proposées comme des approches rapides, fiables et spécifiques pour détecter les cellules marquées de Bacillus spp. L’utilisation de billes de comptage de cytométrie en flux a permis de garantir la reproductibilité dans le comptage cellulaire, dans les examens de routine (numération absolue des lymphocytes T CD4 et CD8) et dans le développement de la recherche portant sur des particules susceptibles d’être détectées et comptées par cytométrie en flux⁹. Godjafrey et Alsharif ont suggéré l’utilisation de billes de comptage pour la quantification de la FC des spores non marquées¹⁰. L’utilisation de la cytométrie en flux a été décrite pour le suivi de la sporulation chez Bacillus spp. par marquage de l’ADN des spores 10,11,12,13. Une autre étude a utilisé FC pour évaluer la quantité de protéines marquées par fluorescence à la surface des spores¹⁵.

Cette étude visait à utiliser des billes de comptage commerciales pour assurer une norme de reproductibilité en ce qui concerne le comptage d’événements à l’aide de la cytométrie en flux. Dans cet article, nous suggérons l’utilisation de billes de comptage pour le comptage cellulaire dans la FC afin d’affiner le dénombrement des spores et d’évaluer l’efficacité du couplage des anticorps marqués par fluorescence à la surface des spores.

Reportez-vous au tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, instruments et logiciels utilisés dans ce protocole.

1. Réglage de la cytométrie en flux

1. Alignement des paramètres optiques d’un cytomètre en flux couplé à un ordinateur
   1. Connectez-vous au logiciel Cytometer.
   2. Dans l’espace de travail du logiciel, sélectionnez Cytomètre | Démarrez et attendez quelques minutes | Mode de nettoyage | S’asseoir liquides.
      REMARQUE : Les bulles d’air et les obstructions ont été éliminées pendant le processus d’initiation du cytomètre, avant l’acquisition de l’échantillon.
2. Contrôle qualité
   1. Utilisez le réactif de contrôle qualité pour ajuster les tensions des tubes photomultiplicateurs et évaluer leur sensibilité.
      1. Préparez le réactif de contrôle qualité dans un tube en polystyrène.
      2. Pour définir la ligne de base, préparez les billes de suspension en ajoutant 0,5 mL de diluant (10 mM de PBS filtré, pH 7) et 3 gouttes de billes dans le tube étiqueté.
      3. Mélangez le flacon de billes par inversion douce.
   2. Dans l’espace de travail du logiciel, sélectionnez Cytomètre | CST pour se connecter à l’interface CST. Attendez quelques minutes et observez le cytomètre à message déconnecté.
   3. Fixez le tube en polystyrène contenant le réactif de contrôle qualité à la sonde du cytomètre en flux.
3. Vérification de la configuration du cytomètre
   1. Dans la fenêtre Récapitulatif du système , vérifiez que la configuration du cytomètre est adaptée à l’expérience.
   2. Sélectionnez l’ID de lot de perles de configuration correspondant pour vérifier que l’ID de lot de perles de configuration sélectionné correspond au lot actuel de billes de recherche CS&T.
4. Vérification des performances
   1. Sélectionnez l’option Vérifier les performances et cliquez sur Exécuter.
   2. Une fois la vérification des performances terminée, les résultats des performances seront affichés. Consultez le rapport sur les performances du cytomètre. Cliquez sur Terminer pour terminer la vérification des performances ou retirez le tube du cytomètre et examinez les résultats dans la fenêtre Résumé du système .
   3. Observez le résultat final de l’analyse morphométrique et de sensibilité à la fluorescence qui apparaîtra dans le | résumé du système| résultat de la performance du cytomètre| avec l’état : RÉUSSI

2. Préparation des spores

1. Après sporulation, rincez les spores 3 fois avec de l’eau glacée ultra-pure par centrifugation à 17 949 × g pendant 10 min.
2. Remettre en suspension la pastille obtenue lors de la dernière centrifugation avec 10 mL d’eau ultrapure.
3. Autoclaver les spores pendant 45 min à 121 ºC pour l’inactivation des cellules végétatives.
   NOTE : Des tests antérieurs effectués par notre groupe comparant différentes méthodes d’inactivation ont démontré que les conditions mentionnées à l’étape 2.3 présentaient une efficacité élevée, ne montrant aucune formation de colonies dans la méthode d’analyse de placage sur le milieu gélosé LB.

3. Quantification des spores autoclavées par cytométrie en flux

1. Prélever 50 μL de spores autoclavées et les incuber à l’abri de la lumière avec du bromure d’éthidium (EtBr, 10 mg/mL dilué dans de l’eau) à un facteur de dilution de 0,05 % v/v pendant 30 min (Figure 1A).
2. Laver les spores 3 fois avec 1 solution saline tamponnée au phosphate (PBS) par centrifugation à 17 949 × g pendant 10 min et les remettre en suspension dans 1 x PBS.
3. Ajouter 10 μL de billes en suivant les recommandations du fabricant pour la dilution.
4. Analysez l’échantillon à l’aide d’un cytomètre en flux comme décrit à l’étape 4.
   REMARQUE : Il est important de souligner que les billes doivent être pipetées de la manière la plus homogène possible car des disparités ont été observées dans les calculs lorsque cette étape n’a pas été bien exécutée.

4. Analyse par cytométrie en flux

1. Connectez-vous au logiciel Cytometer.
2. Dans l’espace de travail du logiciel, sélectionnez Cytomètre | Mode de nettoyage | S’asseoir liquides.
3. Ajustez à l’espace de travail pour déterminer l’analyse en cytométrie en flux.
   1. Définissez les portes pour les analyses (Figure 2).
      1. Définir la stratégie de déclenchement en fonction des caractéristiques morphométriques et de fluorescence des particules en fonction du témoin négatif (spores non marquées).
   2. Pour déterminer la morphométrie cellulaire, choisissez Dotplot graphic (Graphique en points ) pour l’analyse des paramètres FSC-A sur l’axe des x et SSC-A sur l’axe des y.
   3. Pour déterminer la fluorescence, choisissez FL3 Dotplot plots sur l’axe des ordonnées à l’aide de FL5 sur l’axe des abscisses et créez les portes dans quatre quadrants.
4. Utilisez un tube en polystyrène bouché de 12 x 75 mm contenant des échantillons non étiquetés, préalablement étiquetés avec de l’EtBr unicolore, de l’APC unicolore et de l’EtBr+ APC multicolore.
5. Mélangez très délicatement le tube contenant le témoin négatif et fixez-le à la sonde du cytomètre en flux.
6. Cliquez sur Acquérir.
7. Réglez la puissance des lasers en accédant à Cytomètre | Paramètres | FSC (375) et SSC (275).
8. Réglez le seuil sur (500) Cytomètre | Seuil.
9. Pour éliminer l’autofluorescence, analysez l’échantillon sans colorant contenant uniquement des spores.
10. Ajustez les tensions des détecteurs de filtres : FL3 (603) et FL5 (538) pour discriminer les populations négatives et positives par rapport à la fluorescence choisie dans les témoins. Cytomètre | Paramètres.
11. Cytomètre | Rémunération | Définissez le décalage de configuration FL5/FL3 sur 1,0.
12. Après l’analyse morphométrique et fluorescente, configurez l’appareil pour l’acquisition de 30 000 événements | Expérimentez | Mise en page de l’expérience | Acquisition |30 000 événements....
13. Après avoir ajusté les paramètres, acquérez des données pour les échantillons qui sont étiquetés et contiennent des billes dans le cytomètre en flux.
14. Calculer la concentration de spores telle que décrite dans les instructions du fabricant à l’aide de l’équation (1).
    (1)
    NOTE : Pour cette étude, la méthode de quantification des billes a été comparée à l’analyse de la chambre de comptage de Petroff-Hausser. De plus, le marquage des spores autoclavées a été comparé à celui des spores non autoclavées.

5. Estimation de l’indice de couplage protéique à la surface d’une spore par cytométrie en flux

1. Prélever par centrifugation 50 μL de spores (10³/μL) 17 949 × g pendant 10 min, puis remettre en suspension 25 μL de 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide (EDC) (300 mM)).
2. Incuber pendant 15 min à température ambiante.
3. Ajouter 25 μL de N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) (50 mM) à la suspension de spores et l’incuber à température ambiante pendant 30 minutes.
4. Lavez les spores 3x avec 1x PBS par centrifugation comme décrit à l’étape 5.1.
5. Ajouter les protéines fluorescentes et laisser les échantillons toute la nuit à 15 °C.
   NOTE : La protéine fluorescente utilisée dans ce travail était un anticorps anti-IL-10 humain marqué par APC. Cet anticorps a été utilisé comme modèle pour l’étude, bien que l’application d’autres molécules fluorescentes soit possible puisque l’EDC/NHS favorise une ligature covalente entre les groupes -COOH et -NH₂ présents dans les protéines à la surface des spores.
6. Lavez les spores conformément à l’étape 5.3.
7. Ajouter 10 mg/mL de bromure d’éthidium dilué à 1 :50, puis laisser reposer 1 h sur glace et à l’abri de la lumière (figure 1B).
8. Lavez les spores conformément à l’étape 5.3.
9. Répétez l’étape 4.
10. Pour déterminer la fluorescence, modifiez les paramètres FL3 sur l’axe X et FL5 sur l’axe Y du diagramme à points.
11. Analysez l’échantillon à l’aide d’un cytomètre en flux avec le laser bleu (488 nm) à FL3 (filtre 670 LP) et le laser rouge (633 nm) en FL5 (filtre 660/20), comme décrit à l’étape 4.
    REMARQUE : Les mêmes échantillons ont été analysés pour l’immunofluorescence sur des lames au microscope, à une plage de grossissement de 1 000 x et à l’aide des filtres suivants : FITC 480/30 nm (vert) et TRITC 540/25 nm (rouge).

Dans les échantillons de spores autoclavées (SA), 2 × 10³ spores/μl et 1 × 10³ spores/μl ont été détectées à l’aide de billes de comptage et de la méthode de Petroff-Hausser, respectivement (figure 2).

Figure 1 : Schéma général de quantification des spores. (A) Spores marquées avec EtBr et (B) Spores doublement marquées. Abréviations : EDC = carbodiimide de 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyle) ; NHS = N-hydroxysulfosuccinimide. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Analyse morphométrique et qualitative des spores de Bacillus subtilis et des billes de comptage par cytométrie en flux. Quantification des spores de B. subtillis à l’aide de billes de comptage (échantillon non dilué). Abréviations : FSC-A = aire de pic de diffusion vers l’avant ; SSC-A = zone de pic de diffusion latérale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La coloration au bromure d’éthidium (EtBr) d’échantillons de spores autoclavées (SA) a montré une intensité de fluorescence moyenne (MFI) plus élevée que la coloration de spores non autoclavées (NAS), ce qui indique une coloration plus importante du matériel génétique dans la première condition. De plus, une IMF plus importante a été observée dans la population AS marquée EtBr que dans la population NAS (Figure 3, pic en rouge et pic en noir). L’échantillon témoin, qui n’a pas été marqué avec l’EtBr, n’a pas montré de fluorescence significative (figure 3, pic en pointillés).

Figure 3 : Histogramme des spores de Bacillus subtillis marquées au bromure d’éthidium, autoclavées et non autoclavées. Pic de l’étiquetage rouge NAS EtBr ; pic dans l’étiquetage noir AS EtBr ; contrôle des pics en pointillés sans marquage EtBr. Abréviations : EtBr = bromure d’éthidium ; NAS = spores non autoclavées ; AS = spores autoclavées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Dans ces expériences, l’IMF sur le couplage de surface de l’AS avec l’anticorps anti-IL-10 humain marqué par APC a montré une plus grande efficacité de couplage par rapport à la NAS (Figure 4). C’est pour cette raison que les expériences doublement marquées ont été réalisées avec de l’AS. Quatre populations de spores ont été identifiées lors de l’analyse par cytométrie en flux : EtBr+/FA+ ; EtBr+/FA- ; EtBr-/FA+ ; EtBr-/FA-. La présence de spores perméables au marqueur moléculaire EtBr indique la présence possible de spores germées dans la population totale. Cela a pu être observé après l’analyse de l’échantillon à l’aide de la microscopie à fluorescence (ce qui a permis d’observer le marquage EtBr/Fluorescent Anti-mouse table 8 et les deux fluorophores individuellement, Figure 5). L’utilisation de la méthode de coloration de Wirtz-Conklin a permis de visualiser l’existence de spores perméables à la safranine (colorées en rose, figure supplémentaire S1). Dans cette même analyse, des spores colorées uniquement au vert malachite ont été observées, ce qui indique une imperméabilité, comme indiqué dans la littérature pour les spores dormantes¹³. L’analyse des spores par microscopie à contraste de phase présente un nombre plus élevé de spores dormantes dans l’échantillon de SA par rapport à la NAS (figure supplémentaire S2)¹⁴.

Figure 4 : Intensité moyenne de fluorescence des anticorps anti-IL-10 humains marqués par APC dans des spores autoclavées et non autoclavées. Abréviations : FA = anticorps fluorescent ; APC = allophycocyanine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Imagerie par immunofluorescence de spores marquées à l’EtBr et à l’anti-souris fluorescente. (A) Spores dont le matériel génétique est marqué d’EtBr (rouge). (B) Spores dont la surface est marquée avec un anti-souris fluorescent (vert). (C) Spores doublement marquées, avec EtBr et anti-souris fluorescent (orange). Barre d’échelle = 10 μm. Abréviations : EtBr = bromure d’éthidium. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les analyses de cytométrie en flux effectuées ici ont indiqué un pourcentage plus élevé de couplage de l’AF aux spores dormantes (EtBr-/FA+) par rapport aux spores germées (EtBr+/FA+). Dans le graphique de la figure 6A,B, on peut observer l’augmentation du pourcentage de spores couplées et d’IFM à mesure que la concentration d’AG augmente. De plus, les populations de ces spores qui ne se sont pas couplées avec la protéine fluorescente (EtBr+/FA- et EtBr-/FA-) ont montré une réduction graduelle avec l’augmentation de la concentration d’AG (tableau supplémentaire S1).

Figure 6 : Analyse du pourcentage de couplage de fluorescence et de l’intensité moyenne de fluorescence des populations EtBr-/FA+ et EtBr+/FA-. (A) L’axe des abscisses représente les différentes concentrations de l’AF, l’axe des ordonnées noir représente l’IFM détectée et l’axe des ordonnées rouge représente le pourcentage de spores marquées par l’AF de la population EtBr - /FA+. (B) L’axe des abscisses représente les différentes concentrations d’AG, l’axe des ordonnées noir représente l’IMF détectée et l’axe des ordonnées rouge représente le pourcentage de spores marquées à l’EtBr et d’AG de la population d’EtBr+/FA+. Abréviations : MFI = intensité moyenne de fluorescence ; EtBr = bromure d’éthidium ; FA = anticorps fluorescent. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire S1 : Image microscopique de spores de B. subtilis autoclavées colorées par la méthode Wirtz-Conklin. Les spores colorées en rose sont des spores germées (perméables à la safranine). En vert se trouvent les spores dormantes (imperméables à la safranine). Barre d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S2 : Comparaison d’images de microscopie à contraste de phase de spores de B. subtilis autoclavées et non autoclavées. (A,B) Images des spores de B. subtilis avant et après le traitement en autoclave. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire S1 : Valeurs des pourcentages de spores marquées, ou non, avec des anticorps fluorescents et du bromure d’éthidium, à différentes concentrations d’AG, observées en cytométrie en flux. Abréviations : EtBr = bromure d’éthidium ; FA = anticorps fluorescent. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Les méthodes traditionnelles, telles que le comptage sur plaque des colonies, prennent non seulement du temps, mais nécessitent également des cellules viables et ne permettent pas de quantifier les spores inactivées⁵. La chambre Petroff-Hausser est une méthodologie alternative, mais elle nécessite un microscopiste expérimenté pour la réaliser. La cytométrie en flux s’est avérée être une alternative utile à cette fin.

Genovese et ^al.12 ont décrit l’utilisation de la cytométrie en flux pour la quantification des cellules viables et des spores de Bacillus sp. à l’aide de deux marqueurs d’acides nucléiques et d’une grande capacité de contrôle du débit (volume/minute) de l’équipement utilisé, ce qui permet de déterminer la quantité numérique à configurer. Tous les équipements de cytométrie n’ont pas un contrôle strict du débit (volume/minutes), et certains ne sont réglables que dans les options minimale, moyenne et maximale. Dans ces cas, des billes de comptage peuvent être utilisées pour assurer la précision du dénombrement cellulaire et la reproductibilité par rapport à d’autres équipements de cytométrie en flux. Grâce à cette méthode, dans cette étude, il a été possible de calculer le nombre de spores (germées et dormantes) par millilitre dans les échantillons.

La population de spores a été dénombrée et analysée selon les paramètres décrits dans le brevet¹⁰ de Godfrey et Alsharif. Ces auteurs décrivent l’utilisation de cette méthodologie pour l’analyse des stades de germination de Bacillus spp. sans décrire l’état de la spore et en utilisant des marqueurs d’ADN commerciaux coûteux 11,12,13. Dans le travail décrit ici, à l’aide de SA, il a été possible d’identifier deux populations de spores (dormantes et germées) à l’aide de l’EtBr, qui est un marqueur largement utilisé et facilement accessible. L’identification de l’état des spores a été possible grâce à la perméabilité des spores germées à l’EtBr. Il est important de souligner que la population de spores non marquées avec l’EtBr peut présenter des artefacts de taille similaire dans le même échantillon. Cette limitation peut être atténuée en lavant et en filtrant les tampons utilisés.

L’analyse par cytométrie en flux d’échantillons d’AS marqués à l’EtBr couplés à l’AF décrite ici a également permis de qualifier et de quantifier le couplage des protéines fluorescentes (FPC). L’analyse des échantillons marqués par fluorescence et couplés doit être effectuée immédiatement pour éviter la perte d’émission de fluorescence. De plus, il a été possible de déduire si la morphologie et la concentration de la population de spores étaient affectées par la procédure de conjugaison, ce qui donne une compréhension globale du processus, ce qui n’est pas obtenu en utilisant la méthode de transfert de points. Isticato et ^al.15 ont également analysé le FPC à la surface des spores et ont démontré sa viabilité en le confirmant par immunofluorescence et cytométrie en flux, selon le type de protéine utilisé pour le couplage. Ici, il a été observé que l’utilisation de l’AS¹¹ est préférable pour le couplage car le processus d’autoclavage est important pour l’inactivation des protéases susceptibles de dégrader la protéine à coupler. Il est important de souligner que les techniques décrites ici ont été réalisées en utilisant uniquement la souche KO7 de B. subtilis , l’application dans d’autres souches restant à tester.

Il n’y a pas de rapports dans la littérature qui comparent la capacité de couplage des spores en fonction de leur stade. Dans les expériences présentées ici, un pourcentage plus élevé de spores dormantes couplées à l’AF a été observé (EtBr-/FA+)¹⁶. En revanche, les spores germées (EtBr+/FA+), malgré leur pourcentage plus faible, ont montré une MFI plus élevée que ce qui a été observé dans les spores dormantes. D’autres études doivent être menées pour évaluer ce comportement pour des concentrations plus élevées d’AG (point de saturation) chez d’autres Bacillus spp.

Pour de futures applications, la méthode présentée ici pourrait être utilisée dans des études sur l’utilisation de spores de B. subtilis comme adjuvant vaccinal, en évaluant le couplage d’un antigène cible initialement marqué par fluorescence. Après avoir déterminé la concentration saturante, la valeur détectée peut être appliquée à l’antigène cible pour une utilisation dans les vaccinations.

Ainsi, cet article présente une méthode pratique et sensible pour le dénombrement des spores germées et dormantes et l’analyse du couplage protéique fluorescent des spores de Bacillus subtilis par cytométrie en flux. L’utilisation de billes de comptage comme paramètre de quantification, en plus du marquage des spores EtBr, permet un comptage affiné des spores germées et la détermination du pourcentage de couplage des protéines fluorescentes. Cette méthode devrait aider à l’élaboration d’études axées sur l’utilisation des spores comme adjuvant.

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Cette étude a été financée en partie par le Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES) - Code de finances 001 ; Governo do Estado do Amazonas avec des ressources de la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas-FAPEAM ; Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Les auteurs remercient le Programme de développement technologique des outils pour la santé PDTIS-FIOCRUZ pour l’utilisation de ses installations.