Mejora de la enumeración de esporas de Bacillus subtilis y el análisis de etiquetas en citometría de flujo

Este protocolo se centra en el uso de citometría de flujo y perlas de recuento para cuantificar las esporas bacterianas marcadas con bromuro de etidio. El método también es eficiente para analizar el acoplamiento covalente de proteínas en la superficie de esporas intactas.

Las esporas de Bacillus subtilis ya han sido propuestas para diferentes aplicaciones biotecnológicas e inmunológicas; Sin embargo, cada vez es más necesario desarrollar metodologías que mejoren la detección de antígenos inmovilizados en la superficie de las esporas junto con su cuantificación. Los análisis basados en citometría de flujo se han propuesto previamente como enfoques rápidos, fiables y específicos para detectar células marcadas de B. subtilis. En este trabajo, proponemos el uso de la citometría de flujo para evaluar la eficiencia de visualización de un anticuerpo fluorescente (AF) en la superficie de la espora y cuantificar el número de esporas mediante perlas de recuento.

Para ello, utilizamos bromuro de etidio como marcador de ADN y un anticuerpo marcado con aloficocianina (APC), que se acopló a las esporas, como marcador de superficie. La cuantificación de las esporas se realizó mediante perlas de conteo, ya que esta técnica demuestra una alta precisión en la detección de células. Las esporas marcadas se analizaron con un citómetro de flujo, lo que confirmó el acoplamiento. Como resultado, se demostró que el marcaje de ADN mejoró la precisión de la cuantificación por citometría de flujo, para la detección de esporas germinadas. Se observó que el bromuro de etidio no era capaz de marcar las esporas latentes; Sin embargo, esta técnica proporciona una determinación más precisa del número de esporas con proteína fluorescente acoplada a su superficie, lo que ayuda en el desarrollo de estudios que se centran en el uso de esporas como plataforma biotecnológica en diferentes aplicaciones.

Bacillus subtilis es una bacteria grampositiva en forma de bastoncillo que es capaz de producir esporas quiescentes cuando las condiciones ambientales no permiten el crecimiento celular¹. Las esporas son formas celulares extremadamente estables y las de varias especies, incluida B. subtilis, se utilizan ampliamente como probióticos para uso humano y animal². Debido a sus propiedades de resistencia y seguridad, la espora de B. subtilis, que presenta proteínas heterólogas, ha sido propuesta como adyuvante de la mucosa, sistema de administración de vacunas y plataforma de inmovilización enzimática ^3,4.

Para obtener esporas de B. subtilis, es necesario exponerlo a la privación de nutrientes utilizando un medio de cultivo especial. Después de obtener y purificar estas esporas, se deben cuantificar para mejorar la eficiencia de la prueba ^5,6. Así, se aplican ciertos métodos para analizar la concentración de las esporas obtenidas. Se puede utilizar el conteo de placas y una cámara de Petroff-Hausser, también conocida como cámara de conteo. Este último se desarrolló originalmente para determinar la concentración de células sanguíneas; sin embargo, es posible utilizarlo en el campo de la microbiología para el recuento de esporas ^7,8. A pesar de ser el método estándar utilizado para el conteo de células, la lectura es laboriosa ya que este método es completamente manual y su precisión depende de la experiencia del operador.

Los análisis basados en citometría de flujo (FC) se han propuesto previamente como enfoques rápidos, confiables y específicos para detectar células marcadas de Bacillus spp. El uso de perlas de recuento por citometría de flujo ha garantizado la reproducibilidad en el recuento celular, en los exámenes rutinarios (recuento absoluto de linfocitos T CD4 y CD8) y en el desarrollo de investigaciones con partículas capaces de ser detectadas y contadas mediante citometría de flujo⁹. Godjafrey y Alsharif sugirieron el uso de perlas de conteo para la cuantificación de FC de esporas no marcadas¹⁰. Se describió el uso de citometría de flujo para el monitoreo de la esporulación en Bacillus spp. a través del marcaje del ADN de las esporas 10,11,12,13. Otro estudio utilizó FC para evaluar la cantidad de proteínas marcadas con fluorescencia en la superficie de las esporas¹⁵.

Este estudio buscó utilizar perlas de conteo comerciales para asegurar un estándar de reproducibilidad con respecto al conteo de eventos mediante citometría de flujo. En este artículo, sugerimos el uso de perlas de recuento para el recuento de células en FC para refinar la enumeración de esporas y evaluar la eficiencia de acoplamiento de anticuerpos marcados con fluorescencia en la superficie de las esporas.

Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, instrumentos y software utilizados en este protocolo.

1. Configuración de citometría de flujo

1. Alineación de los parámetros ópticos de un citómetro de flujo acoplado a un ordenador
   1. Inicie sesión en el software Cytometer.
   2. En el espacio de trabajo de software, seleccione Citómetro | Inicie y espere unos minutos | Modo limpio | Siéntese líquidos.
      NOTA: Las burbujas de aire y las obstrucciones se eliminaron durante el proceso de iniciación del citómetro, antes de la adquisición de la muestra.
2. Control de calidad
   1. Utilice el reactivo de control de calidad para ajustar los voltajes de los tubos fotomultiplicadores y evaluar su sensibilidad.
      1. Prepare el reactivo de control de calidad en un tubo de poliestireno.
      2. Para definir la línea de base, prepare las perlas de suspensión agregando 0,5 mL de diluyente (10 mM de PBS filtrado, pH 7) y 3 gotas de perlas al tubo marcado.
      3. Mezcle el vial de perlas invirtiendo suavemente.
   2. En el espacio de trabajo de software, seleccione Citómetro | CST para conectarse a la interfaz CST. Espere unos minutos y observe el mensaje del citómetro desconectado.
   3. Conecte el tubo de poliestireno que contiene el reactivo de control de calidad a la sonda del citómetro de flujo.
3. Verificación de la configuración del citómetro
   1. En la ventana Resumen del sistema , compruebe que la configuración del citómetro es adecuada para el experimento.
   2. Seleccione el ID de lote de cuentas de configuración correspondiente para verificar que el ID de lote de cuentas de configuración seleccionado coincida con el lote actual de cuentas de investigación CS&T.
4. Comprobación del rendimiento
   1. Seleccione la opción Comprobar rendimiento y haga clic en Ejecutar.
   2. Una vez completada la comprobación de rendimiento, se mostrarán los resultados de rendimiento. Vea el informe de rendimiento del citómetro. Haga clic en Finalizar para completar la comprobación de rendimiento o retire el tubo del citómetro y revise los resultados en la ventana Resumen del sistema .
   3. Observe el resultado final del análisis morfométrico y de sensibilidad a la fluorescencia que aparecerá en el | resumen del sistema| resultado del rendimiento del citómetro| con el estado: APROBADO

2. Preparación de las esporas

1. Después de la esporulación, enjuague las esporas 3 veces con agua helada ultrapura por centrifugación a 17.949 × g durante 10 min.
2. Resuspender el pellet obtenido de la última centrifugación con 10 mL de agua ultrapura.
3. Autoclave de las esporas durante 45 min a 121 ºC para la inactivación de las células vegetativas.
   NOTA: Pruebas previas realizadas por nuestro grupo comparando diferentes métodos de inactivación demostraron que las condiciones mencionadas en el paso 2.3 presentaron alta eficiencia, no mostrando formación de colonias en el método de análisis de siembra en el medio agar LB.

3. Cuantificación de esporas esterilizadas en autoclave mediante citometría de flujo

1. Tomar 50 μL de esporas esterilizadas en autoclave e incubarlas protegidas de la luz con bromuro de etidio (EtBr, 10 mg/mL diluido en agua) a un factor de dilución del 0,05% v/v durante 30 min (Figura 1A).
2. Lavar las esporas 3 veces con 1 solución salina tamponada con fosfato (PBS) por centrifugación a 17.949 × g durante 10 minutos y volver a suspender en 1 PBS.
3. Añadir 10 μL de perlas, siguiendo las recomendaciones del fabricante para la dilución.
4. Analice la muestra con un citómetro de flujo como se describe en el paso 4.
   NOTA: Es importante recalcar que las cuentas deben pipetearse de la forma más homogénea posible ya que se observaron disparidades en los cálculos cuando este paso no se ejecutó bien.

4. Análisis mediante citometría de flujo

1. Inicie sesión en el software Cytometer.
2. En el espacio de trabajo de software, seleccione Citómetro | Modo limpio | Siéntese líquidos.
3. Ajústelo al espacio de trabajo para determinar el análisis en citometría de flujo.
   1. Defina las puertas para los análisis (Figura 2).
      1. Definir la estrategia de compuerta en función de las características morfométricas y de fluorescencia de las partículas en función del control negativo (esporas no marcadas).
   2. Para determinar la morfometría celular, elija Gráfico de diagrama de puntos para el análisis de los parámetros FSC-A en el eje x y SSC-A en el eje y.
   3. Para determinar la fluorescencia, elija gráficos de diagrama de puntos FL3 en el eje y utilizando FL5 en el eje x y cree las puertas en cuatro cuadrantes.
4. Utilice un tubo de poliestireno con tapón de 12 x 75 mm que contenga muestras sin etiquetar, previamente etiquetadas con EtBr de un solo color, APC de un solo color y APC EtBr+ multicolor.
5. Mezcle muy suavemente el tubo que contiene el control negativo y conéctelo a la sonda del citómetro de flujo.
6. Haga clic en Adquirir.
7. Configure la potencia de los láseres navegando a Citómetro | Parámetros | FSC (375) y SSC (275).
8. Establezca el umbral en (500) Citómetro | Umbral.
9. Para eliminar la autofluorescencia, analice la muestra sin colorante que contenga solo esporas.
10. Ajustar los voltajes de los detectores de filtros: FL3 (603) y FL5 (538) para discriminar poblaciones negativas y positivas con respecto a la fluorescencia elegida en los controles. Citómetro | Parámetros.
11. Citómetro | Compensación | Establezca el desplazamiento de configuración de FL5/FL3 en 1.0.
12. Después de la morfometría y el análisis fluorescente, configure el dispositivo para eventos de adquisición 30.000 | Experimento | Diseño del experimento | Adquisición |30.000 eventos....
13. Después de ajustar los parámetros, adquiera datos para las muestras que están etiquetadas y contienen perlas en el citómetro de flujo.
14. Calcule la concentración de esporas como se describe en las instrucciones del fabricante utilizando la ecuación (1).
    (1)
    NOTA: Para este estudio, el método de cuantificación de perlas se comparó con el análisis de la cámara de conteo de Petroff-Hausser. Además, se comparó el etiquetado de las esporas esterilizadas en autoclave con el etiquetado de las esporas no esterilizadas en autoclave.

5. Estimación del índice de acoplamiento de proteínas en la superficie de una espora mediante citometría de flujo

1. Cosechar por centrifugación de 50 μL de esporas (10³/μL) 17.949 × g durante 10 min y luego resuspender con 25 μL de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) (300 mM)).
2. Incubar durante 15 min a temperatura ambiente.
3. Añadir 25 μL de N-hidroxisulfosuccinimida (NHS) (50 mM) a la suspensión de esporas e incubar a temperatura ambiente durante 30 min.
4. Lave las esporas 3 veces con 1x PBS por centrifugación como se describe en el paso 5.1.
5. Añadir proteína fluorescente y dejar las muestras durante la noche a 15 °C.
   NOTA: La proteína fluorescente utilizada en este trabajo fue un anticuerpo anti-IL-10 humano marcado con APC. Este anticuerpo se utilizó como modelo para el estudio, aunque es posible la aplicación de otras moléculas fluorescentes ya que EDC/NHS promueve una ligadura covalente entre los grupos -COOH y -NH₂ presentes en las proteínas de la superficie de las esporas.
6. Lave las esporas según el paso 5.3.
7. Añadir 10 mg/mL de bromuro de etidio diluido a 1:50, dejar actuar 1 h en hielo y protegido de la luz (Figura 1B).
8. Lave las esporas según el paso 5.3.
9. Repita el paso 4.
10. Para determinar la fluorescencia, cambie los parámetros FL3 en el eje X y FL5 en el eje Y del diagrama de puntos.
11. Analice la muestra utilizando un citómetro de flujo con el láser azul (488 nm) en FL3 (filtro 670 LP) y el láser rojo (633 nm) en FL5 (filtro 660/20), como se describe en el paso 4.
    NOTA: Las mismas muestras se analizaron para inmunofluorescencia en portaobjetos bajo un microscopio, en un rango de aumento de 1.000 x y utilizando los siguientes filtros: FITC 480/30 nm (verde) y TRITC 540/25 nm (rojo).

En muestras de esporas (AS) esterilizadas en autoclave, se detectaron 2 × 10³ esporas/μl y 1 × 10³ esporas/μl mediante el uso de perlas de recuento y el método de Petroff-Hausser, respectivamente (Figura 2).

Figura 1: Esquema general de cuantificación de esporas. (A) Esporas marcadas con EtBr y (B) esporas doblemente marcadas. Abreviaturas: EDC = 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida; NHS = N-hidroxisulfosuccinimida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Análisis morfométrico y cualitativo de esporas de Bacillus subtilis y perlas de recuento mediante citometría de flujo. Cuantificación de esporas de B. subtillis mediante perlas de recuento (muestra sin diluir). Abreviaturas: FSC-A = área de pico de dispersión hacia adelante; SSC-A = área de pico de dispersión lateral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La tinción con bromuro de etidio (EtBr) de muestras de esporas (AS) esterilizadas en autoclave mostró una mayor intensidad de fluorescencia media (MFI) que la tinción de esporas no esterilizadas en autoclave (NAS), lo que indica una mayor tinción de material genético en la primera condición. Además, se observó una mayor IMF en la población de EA marcada con EtBr que en la población de NAS (Figura 3, pico en rojo y pico en negro). La muestra de control, no marcada con EtBr, no mostró fluorescencia significativa (Figura 3, pico punteado).

Figura 3: Histograma de esporas de Bacillus subtillis marcadas con bromuro de etidio, esterilizadas en autoclave y no esterilizadas en autoclave. Pico en el etiquetado EtBr de NAS rojo; pico en el etiquetado negro-AS EtBr; control de picos punteado sin etiquetado EtBr. Abreviaturas: EtBr = bromuro de etidio; NAS = esporas no esterilizadas en autoclave; AS = esporas esterilizadas en autoclave. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En estos experimentos, la MFI en el acoplamiento de la superficie del AS con el anticuerpo anti-IL-10 humano marcado con APC mostró una mayor eficiencia de acoplamiento en comparación con el NAS (Figura 4). Por esta razón, los experimentos de doble etiqueta se realizaron con AS. En el análisis de citometría de flujo se identificaron cuatro poblaciones de esporas: EtBr+/FA+; EtBr+/FA-; EtBr-/FA+; EtBr-/FA-. La presencia de esporas permeables al marcador molecular EtBr indica la posible presencia de esporas germinadas en la población total. Esto se pudo observar después del análisis de la muestra mediante microscopía de fluorescencia (mediante la cual fue posible observar el marcaje de la tabla 8 de EtBr/Fluorescent Anti-mouse y ambos fluoróforos individualmente, Figura 5). El uso del método de tinción de Wirtz-Conklin permitió visualizar la existencia de esporas con permeabilidad a la safranina (teñidas en rosa, Figura Suplementaria S1). En este mismo análisis, se observaron esporas teñidas solamente con verde de malaquita, lo que indica impermeabilidad, como se reporta en la literatura para esporas latentes¹³. El análisis de esporas por microscopía de contraste de fase presenta un mayor número de esporas latentes en la muestra de EA en comparación con el NAS (Figura suplementaria S2)¹⁴.

Figura 4: Intensidad media de fluorescencia de anticuerpos anti-IL-10 humanos marcados con APC en esporas esterilizadas en autoclave y no esterilizadas en autoclave. Abreviaturas: FA = anticuerpo fluorescente; APC = aloficocianina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Imágenes de inmunofluorescencia de esporas marcadas con EtBr y anti-ratón fluorescente. (A) Esporas con material genético marcado con EtBr (rojo). (B) Esporas con superficie marcada con anti-ratón fluorescente (verde). (C) Esporas de doble marcado, con EtBr y anti-ratón fluorescente (naranja). Barra de escala = 10 μm. Abreviaturas: EtBr = bromuro de etidio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los análisis de citometría de flujo realizados aquí indicaron un mayor porcentaje de acoplamiento de los AG a las esporas latentes (EtBr-/FA+) en comparación con las esporas germinadas (EtBr+/FA+). En el gráfico que se muestra en la Figura 6A, B, se puede observar el aumento en el porcentaje de esporas acopladas y MFI a medida que aumenta la concentración de AG. Además, las poblaciones de estas esporas que no se acoplaron con la proteína fluorescente (EtBr+/FA- y EtBr-/FA-) mostraron una reducción gradual con el aumento de la concentración de AG (Tabla Suplementaria S1).

Figura 6: Análisis del porcentaje de acoplamiento de fluorescencia y de la intensidad media de fluorescencia de las poblaciones de EtBr-/FA+ y EtBr+/FA-. (A) El eje x representa las diferentes concentraciones de AG, el eje y negro representa el MFI detectado y el eje y rojo representa el porcentaje de esporas marcadas con FA de la población de EtBr - /FA+. (B) El eje x representa las diferentes concentraciones de AG, el eje y negro representa el MFI detectado y el eje y rojo representa el porcentaje de esporas marcadas con EtBr y AG de la población de EtBr+/FA+. Abreviaturas: MFI = intensidad media de fluorescencia; EtBr = bromuro de etidio; AG = anticuerpo fluorescente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura suplementaria S1: Imagen microscópica de esporas de B. subtilis teñidas en autoclave por la metodología de Wirtz-Conklin. Las esporas teñidas de rosa son esporas germinadas (permeables a la safranina). En verde están las esporas latentes (impermeables a la safranina). Barra de escala = 10 μm. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S2: Comparación de imágenes de microscopía de contraste de fase de esporas de B. subtilis esterilizadas en autoclave y no esterilizadas en autoclave. (A,B) Imágenes de esporas de B. subtilis antes y después del tratamiento en autoclave. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria S1: Valores de los porcentajes de esporas marcadas, o no, con anticuerpo fluorescente y bromuro de etidio, en diferentes concentraciones de AG, observados en citometría de flujo. Abreviaturas: EtBr = bromuro de etidio; AG = anticuerpo fluorescente. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Los métodos tradicionales, como el recuento en placa de las colonias, no solo consumen mucho tiempo, sino que también necesitan células viables y no permiten la cuantificación de esporas inactivadas⁵. La cámara de Petroff-Hausser es una metodología alternativa, pero requiere de un microscopista experimentado para realizarla. La citometría de flujo ha demostrado ser una alternativa útil para este propósito.

Genovese et ^al.12 describieron el uso de la citometría de flujo para la cuantificación de células viables y esporas de Bacillus sp. utilizando dos marcadores de ácidos nucleicos y una alta capacidad de control del caudal (volumen/minuto) del equipo utilizado, lo que brinda la opción de determinar la cantidad numérica a configurar. No todos los equipos de citometría tienen un control estricto sobre el caudal (volumen/minutos), y algunos son ajustables solo en las opciones mínima, media y máxima. En estos casos, las perlas de recuento se pueden utilizar para garantizar la precisión de la enumeración celular y la reproducibilidad frente a otros equipos de citometría de flujo. A través de este método, en este estudio, fue posible calcular el número de esporas (germinadas e inactivas) por mililitro en las muestras.

La población de esporas fue enumerada y analizada de acuerdo con los parámetros descritos en la patente¹⁰ de Godfrey y Alsharif. Estos autores describen el uso de esta metodología para el análisis de los estadios de germinación de Bacillus spp. sin describir el estado de la espora y utilizando marcadores comerciales de ADN de alto costo 11,12,13. En el trabajo aquí descrito, utilizando AS, fue posible identificar dos poblaciones de esporas (latentes y germinadas) utilizando EtBr, que es un marcador ampliamente utilizado y de fácil acceso. La identificación del estado de las esporas fue posible debido a la permeabilidad de las esporas germinadas al EtBr. Es importante destacar que la población de esporas no marcadas con EtBr puede presentar artefactos de tamaño similar en la misma muestra. Esta limitación se puede mitigar lavando y filtrando los tampones utilizados.

El análisis por citometría de flujo de muestras de EA marcadas con EtBr junto con AF descritas aquí también permitió la calificación y cuantificación del acoplamiento de proteínas fluorescentes (FPC). El análisis de las muestras marcadas y acopladas con fluorescencia debe realizarse inmediatamente para evitar la pérdida de emisión de fluorescencia. Además, fue posible inferir si la morfología y concentración de la población de esporas se vieron afectadas por el procedimiento de conjugación, dando una comprensión global del proceso, que no se obtiene cuando se utiliza el método de dot-blot. Isticato et ^al.15 también analizaron la FPC en la superficie de la espora y demostraron su viabilidad confirmándola con inmunofluorescencia y citometría de flujo, dependiendo del tipo de proteína que se utilice para el acoplamiento. En este trabajo, se observó que el uso de AS¹¹ es preferible para el acoplamiento, ya que el proceso de autoclave es importante para la inactivación de proteasas que pueden degradar la proteína a acoplar. Es importante señalar que las técnicas aquí descritas se realizaron utilizando únicamente la cepa KO7 de B. subtilis , quedando por probar la aplicación en otras cepas.

No existen reportes en la literatura que comparen la capacidad de acoplamiento de las esporas según su estadio. En los experimentos aquí presentados, se observó un mayor porcentaje de esporas latentes acopladas a AF (EtBr-/FA+)¹⁶. Por el contrario, las esporas germinadas (EtBr+/FA+), a pesar de su menor porcentaje, mostraron un IMF más alto que el observado en las esporas latentes. Es necesario realizar más estudios para evaluar este comportamiento para concentraciones más altas de AG (punto de saturación) en otras especies de Bacillus spp.

Para futuras aplicaciones, el método aquí presentado podría ser utilizado en estudios sobre el uso de esporas de B. subtilis como adyuvante vacunal, evaluando el acoplamiento de un antígeno diana inicialmente marcado por fluorescencia. Después de determinar la concentración de saturación, el valor detectado se puede aplicar al antígeno diana para su uso en inmunizaciones.

Por lo tanto, este trabajo presenta un método práctico y sensible para la enumeración de esporas germinadas e inactivas y el análisis del acoplamiento de proteínas fluorescentes de esporas de Bacillus subtilis mediante citometría de flujo. El uso de perlas de conteo como parámetro para la cuantificación, además del marcaje de esporas de EtBr, permite un conteo refinado de las esporas germinadas y la determinación porcentual del acoplamiento de proteínas fluorescentes. Este método debería ayudar en el desarrollo de estudios que se centren en el uso de esporas como adyuvante.

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Este estudio fue financiado en parte por la Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Código de Finanzas 001; Governo do Estado do Amazonas con recursos de la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas-FAPEAM; Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (CNPq). Los autores agradecen al Programa de Desarrollo Tecnológico en Herramientas para la Salud PDTIS-FIOCRUZ por el uso de sus instalaciones.