Estrazione e purificazione della proteina FAHD1 dal rene suino e dal fegato di topo

Questo protocollo descrive come estrarre la proteina 1 contenente dominio della fumarilacetoacetato idrolasi (FAHD1) dal rene suino e dal fegato di topo. I metodi elencati possono essere adattati ad altre proteine di interesse e modificati per altri tessuti.

La proteina 1 contenente dominio fumarilacetato idrolasi (FAHD1) è il primo membro identificato della superfamiglia FAH negli eucarioti, che agisce come ossalacetato decarbossilasi nei mitocondri. Questo articolo presenta una serie di metodi per l'estrazione e la purificazione di FAHD1 dal rene suino e dal fegato di topo. I metodi coperti sono la cromatografia a scambio ionico con cromatografia liquida proteica veloce (FPLC), la filtrazione preparativa e analitica del gel con FPLC e gli approcci proteomici. Dopo l'estrazione totale delle proteine, sono state esplorate la precipitazione del solfato di ammonio e la cromatografia a scambio ionico e FAHD1 è stato estratto tramite una strategia sequenziale utilizzando lo scambio ionico e la cromatografia ad esclusione dimensionale. Questo approccio rappresentativo può essere adattato ad altre proteine di interesse (espresse a livelli significativi) e modificato per altri tessuti. Le proteine purificate dai tessuti possono supportare lo sviluppo di anticorpi di alta qualità e/o inibitori farmacologici potenti e specifici.

La proteina 1 contenente dominio FAH eucariotico (FAHD1) agisce come ossalacetato bifunzionale (OAA) decarbossilasi (ODx)¹ e idrolasi acilpropurato (ApH)². È localizzato nei mitocondri² e appartiene all'ampia superfamiglia FAH degli enzimi 1,2,3,4,5,6. Mentre la sua attività ApH è solo di minore rilevanza, l'attività ODx di FAHD1 è coinvolta nella regolazione del flusso del ciclo TCA 1,7,8,9. L'OAA non è solo richiesto per la reazione centrale della citrato sintasi nel ciclo dell'acido tricarbossilico, ma agisce anche come inibitore competitivo della succinato deidrogenasi come parte del sistema di trasporto degli elettroni e come metabolita cataplerotico. La downregulation dell'espressione genica di FAHD1 nelle cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) ha determinato una significativa riduzione del tasso di proliferazione cellulare¹⁰ e una significativa inibizione del potenziale di membrana mitocondriale, associata a un concomitante passaggio alla glicolisi. Il modello di lavoro si riferisce alla senescenza associata alla disfunzione mitocondriale (MiDAS)^11-like fenotipo⁸, in cui i livelli di OAA mitocondriale sono strettamente regolati dall'attività FAHD1 ^1,8,9.

La proteina ricombinante è più facile da ottenere attraverso l'espressione e la purificazione dai batteri¹² piuttosto che dai tessuti. Tuttavia, una proteina espressa nei batteri può essere influenzata dalla possibile mancanza di modifiche post-traduzionali, o può semplicemente essere problematica (ad esempio, a causa della perdita di plasmidi, risposte allo stress batterico, legami disolfuro distorti / non formati, nessuna o scarsa secrezione, aggregazione proteica, scissione proteolitica, ecc.). Per alcune applicazioni, le proteine devono essere ottenute dal lisato cellulare o dal tessuto, al fine di includere tali modifiche e/o di escludere possibili artefatti. La proteina purificata dai tessuti supporta lo sviluppo di anticorpi di alta qualità e/o inibitori farmacologici potenti e specifici per enzimi selezionati, come per FAHD1¹³.

Questo manoscritto presenta una serie di metodi per l'estrazione e la purificazione di FAHD1 dal rene suino e dal fegato di topo. I metodi descritti richiedono una cromatografia liquida proteica veloce (FPLC), ma per il resto utilizzano apparecchiature di laboratorio comuni. Metodi alternativi possono essere trovati altrove 14,15,16,17. Dopo l'estrazione totale delle proteine, il protocollo proposto prevede una fase di test, in cui vengono discussi i sottoprotocolli per la precipitazione del solfato di ammonio e la cromatografia a scambio ionico (Figura 1). Dopo aver definito questi sotto-protocolli, la proteina di interesse viene estratta attraverso una strategia sequenziale utilizzando lo scambio ionico e la cromatografia di esclusione dimensionale con FPLC. Sulla base di queste linee guida, il protocollo finale può essere adattato individualmente per altre proteine di interesse.

Figura 1: La strategia generale di questo protocollo. Dall'alto verso il basso: le proteine vengono estratte dai tessuti. L'omogeneizzato tissutale viene preparato, centrifugato e filtrato. Per ogni coppia di campioni surnatante e derivati da pellet, è necessario eseguire test per la precipitazione del solfato di ammonio e la cromatografia a scambio ionico (FPLC) per sondare le condizioni ottimali. Dopo aver stabilito questi sotto-protocolli, la proteina può essere estratta tramite una procedura sequenziale di precipitazione del solfato di ammonio, cromatografia a scambio ionico e cromatografia di esclusione di dimensioni ripetitive (FPLC) a diverse concentrazioni di pH e sale. Tutti i passaggi devono essere controllati da western blot. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti nel rispetto delle linee guida istituzionali. Il rene suino è stato ottenuto fresco dal supermercato locale. I tessuti epatici sono stati raccolti da topi selvatici C57BL6 mantenuti presso l'Istituto per la ricerca sull'invecchiamento biomedico dell'Università di Innsbruck, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Austria sotto la supervisione di Univ.-Doz. Dr. Pidder Jansen-Dürr, coperto da autorizzazione etica come leader del progetto rilasciata nel 2013 (BMWF-66.008/0007-II/3b/2013). La manutenzione e l'uso dei topi per il progetto sono coperti dal permesso etico n. 2020-0.242.978 dal 5 maggio 2020, rilasciato dal Ministero austriaco per l'istruzione, la scienza e la ricerca (BMBWF).

1. Preparativi

NOTA: Prima dell'inizio del protocollo, è necessario preparare diverse cose, ad esempio il tampone di lisi proteica, il campione di tessuto grezzo e un anticorpo specifico, oltre a sostanze chimiche e materiali generali.

1. Preparare 250 mL di tampone di lisi proteica per 100 g di peso netto del tessuto: 250 mL di 1x PBS con 50 mM di NaF, 1 mM di PMSF, 2 μg/mL di aprotinina e 1 mM di orovavanadato attivato (vedere Tabella 1). Filtrare la soluzione utilizzando un'unità filtrante a siringa da 0,22 μm.
   NOTA: L'attivazione dell'ortopvanadato è necessaria prima dell'uso per convertirlo in un inibitore più potente della proteina tirosina fosfatasi¹⁸. L'orovavanadato attivato può essere ottenuto da fornitori commerciali, ma anche preparato come segue.
   1. Preparare una soluzione madre da 200 mM di ortopvanadato (sodio) in ddH₂O. Per preparare 10 mL di soluzione, aggiungere 368 mg di Na₃VO₄ a 9 mL di acqua e sciogliere mescolando. Una volta disciolto, portare il volume a 10 mL con ddH₂O.
      NOTA: il pH iniziale della soluzione di ortovanadato di sodio può variare con la fonte del materiale e il pH deve essere regolato a 10 in un approccio ripetitivo come segue.
   2. A seconda del pH iniziale della soluzione, regolare il pH a 10 con NaOH o HCl. A pH > 10, la soluzione avrà un colore giallo. Far bollire la soluzione fino a quando non diventa incolore, raffreddarla a temperatura ambiente e controllare il pH. Se il pH è >10, aggiungere un piccolo volume di HCl per regolare il pH a 10. A questo punto, la soluzione potrebbe ingiallire di nuovo.
   3. Ripetere l'ebollizione e il raffreddamento fino a quando la soluzione rimane incolore e il pH si stabilizza a 10 (circa 5-7 volte). A questo punto, l'aggiunta di HCl si traduce in un debole aspetto di colore giallo nella soluzione. Conservare l'orovavanadato attivato in aliquote da 1 mL a -20 °C.
2. Preparare i tubi con 2 ml di tampone di lisi per grammo di tessuto e metterli sul ghiaccio.
   NOTA: Questo protocollo utilizzava otto tubi da 50 mL, ciascuno riempito con 30 mL di tampone di lisi in totale per un rene suino (circa 100-150 g), e due tubi ciascuno riempito con 40 mL di tampone di lisi per 20 fegati di topo (ciascuno 1-2 g) in totale.
3. Preparare il tessuto: sezionare il tessuto su una lastra di vetro pre-pulita posta sul ghiaccio in una scatola di polistirene espanso. Tagliare pezzi di tessuto di circa 100 mg ciascuno per essere facilmente trasferiti nei rispettivi tubi per la successiva lisi. Trasferire i pezzi di tessuto nei tubi preparati (fase 1.2).
4. Preparare una soluzione di solfato di ammonio saturo: riscaldare 500 mL di ddH₂O a 70 °C e, mescolando, aggiungere gradualmente solfato di ammonio in polvere (vedere Tabella dei materiali) fino a quando non si dissolve più solfato di ammonio. Raffreddare questa soluzione (sovra)satura a temperatura ambiente e conservarla a 4 °C durante la notte.

2. Estrazione totale delle proteine

NOTA Dopo aver preparato il campione in un tampone di lisi proteica fredda (vedere il punto 1.3), omogeneizzare il tessuto nel miglior modo possibile tramite sonicazione mediante sonda ad ultrasuoni o utilizzando un omogeneizzatore elettrico come segue.

1. Omogeneizzazione dei tessuti
   1. Nel caso di un rene suino, sonicare la sospensione preferibilmente con una sonda ad ultrasuoni mantenendo il campione sul ghiaccio (10 cicli di impulso di 15 s, con intervalli di 30 s tra gli impulsi per raffreddare il campione su ghiaccio, a media ampiezza con ciclo di lavoro del 50%).
   2. Nel caso di organi di topo, omogeneizzare la sospensione utilizzando un omogeneizzatore elettrico (iniziando con una forza bassa e accelerando lentamente a forza media) mantenendo il campione sul ghiaccio. Lavare regolarmente l'omogeneizzatore elettrico in PBS per rimuovere qualsiasi materiale organico che ostruisce il dispositivo.
   3. Prelevare 20 μL dai campioni e verificare al microscopio se le cellule del tessuto omogeneizzato sono correttamente distrutte; altrimenti, ripetere l'omogeneizzazione.
2. Centrifugare i tubi in una centrifuga da tavolo a 10.000 x g per 30 min a 4 °C.
   NOTA: Facoltativamente, centrifugare il surnatante una seconda volta a 20.000 x g per 30 minuti a 4 °C per eliminare piccole frazioni del pellet iniziale che potrebbero essere state trasferite. Ciò semplificherà la successiva filtrazione nella fase 2.3.
3. Raccogliere il surnatante in un tubo fresco e metterlo sul ghiaccio. Filtrare sequenzialmente il surnatante utilizzando unità filtranti a siringa da 0,45 μm e 0,22 μm. Aliquotare il surnatante in lotti da 10 ml e congelarli a -20 °C per la conservazione a breve termine o a -80 °C per una conservazione più lunga.
   NOTA: il prefiltraggio con 0,45 μm rimuove la maggior parte delle particelle prima che una seconda fase di filtraggio con 0,22 μm rimuova le particelle più fini. L'utilizzo diretto del filtro da 0,22 μm può causare il rischio di intasare i filtri.
4. Preparare un campione da 50 μL per l'analisi SDS-PAGE/western blot aggiungendo 10 μL di tampone campione SDS 5x (vedere Tabella 1) a 40 μL del surnatante e quindi bollendo a 95 °C per 10 minuti.
   1. Facoltativamente, risospendere circa 100 μL di pellet ottenuto nella fase 2.2 in 900 μL di ddH₂O e preparare un campione per l'analisi SDS-PAGE/western blot come descritto sopra.
      NOTA: l'inclusione di campioni derivati da pellet nell'analisi western blot, oltre al controllo positivo, indicherà se l'espressione della proteina è bassa o se l'anticorpo è problematico.

3. Analisi SDS-PAGE e western blot

NOTA: l'analisi Western blot è necessaria per verificare la solubilità delle proteine. Di seguito viene descritto un protocollo per l'elettroblotting, utilizzando un sistema di wet/tank blotting (vedi Tabella dei materiali). Un protocollo alternativo per SDS-PAGE può essere trovato altrove¹⁹.

1. Preparare un gel discontinuo al 12,5% di poliacrilammide SDS-PAGE secondo le istruzioni del produttore (ad esempio, un gel impilabile sopra un gel risolutivo; vedere Tabella 1). Eseguire gli esempi preparati in precedenza durante il passaggio 2 (simile ai passaggi 4, 5 e 6; vedere di seguito).
   1. Caricare una scala marcatore proteica nel primo pozzo (vedi Tabella dei materiali). Carico 5 ng della proteina ricombinante hFAHD1 (ottenuta dai batteri¹²; vedi Tabella 1) come controllo positivo nel secondo pozzo.
   2. Successivamente, caricare 20 μL del campione da analizzare e riempire tutti i pozzetti rimanenti con 20 μL di tampone campione SDS-PAGE 1x preparato (cioè 5x tampone campione diluito con ddH₂O). Eseguire i gel SDS-PAGE a 125 V utilizzando il buffer in esecuzione SDS (vedere Tabella 1).
2. Una volta completato SDS-PAGE, eseguire un'analisi western blot e sondare le membrane utilizzando l'anticorpo disponibile sollevato contro FAHD1 (vedere Tabella 1).
   NOTA: Poiché i campioni vengono prelevati da tessuto omogeneizzato grezzo, di solito la qualità della SDS-PAGE e l'analisi western blot a questo punto sono compromesse; tuttavia, è importante verificare se la proteina da estrarre è solubile nel surnatante. Il seguente protocollo è stato testato per il rene suino e diversi organi di topo, tra cui fegato, cuore, cervello e rene.
   1. Preparare il buffer di trasferimento western blot 10x (vedere Tabella 1). Preparare il buffer di trasferimento 1x western blot (vedere Tabella 1) e raffreddarlo a 4 °C.
   2. Attivare una membrana PVDF per 2 minuti in metanolo. Lavare la membrana in ddH₂O per 2 min. Equilibrare la membrana per 15 minuti in 1x tampone di trasferimento western blot.
   3. Lavare il gel SDS con 1x PBS per 10 minuti mentre si agita per rimuovere il buffer in esecuzione SDS, quindi incubare il gel in 1x western blot transfer buffer per 10 min per l'equilibrio. Assemblare la cassetta di elettroblotting (cioè combinando la membrana PVDF attivata e i gel) secondo le istruzioni del produttore.
   4. Eseguire il blot tramite elettroblotting a 300 mA per 1 ora in una scatola di polistirene espanso riempita di ghiaccio o nella cella frigorifera (4 °C). Trasferire la membrana PVDF in un tubo da 50 ml con il lato esposto rivolto verso il lato interno del tubo. Incubare la membrana in 20 mL di tampone di blocco western blot (vedere Tabella 1) durante la notte a 4 °C mentre si rotola su un rullo tubolare (vedere Tabella dei materiali).
   5. Il giorno successivo, lavare la membrana per 5 minuti con 20 ml di tampone di lavaggio Western Blot (PBS con 0,1% (v / v) Tween 20) nello stesso tubo durante la laminazione. Incubare la membrana nello stesso tubo con l'anticorpo primario² (mirato a FAHD1; vedere Tabella 1) diluito 1:500 nel tampone di blocco western blot per 1 ora a temperatura ambiente durante la laminazione.
   6. Lavare la membrana nello stesso tubo tre volte per 10 minuti ciascuno con 20 ml di tampone di lavaggio western blot durante la laminazione. Incubare la membrana per 30 minuti a temperatura ambiente con anticorpo secondario coniugato HRP (vedere Tabella dei materiali) diluito 1:3000 in 5 mL di tampone bloccante western blot.
   7. Lavare la membrana nello stesso tubo tre volte per 10 minuti ciascuno con 20 ml di tampone di lavaggio western blot e due volte per 5 minuti ciascuno con 1x PBS. Asciugare la membrana tenendola con cura con una pinzetta su un bordo e toccando un pezzo di cellulosa o un pezzo di carta Whatman con il bordo opposto (inferiore) della membrana. Mettere la membrana (lato esposto verso l'alto) su una lastra di vetro pulita.
   8. Coprire con cura l'intera membrana con 1 mL di substrato ECL western blot preparato utilizzando una pipetta, facendo attenzione a non creare bolle d'aria. Lasciare incubare la soluzione ECL per 3 minuti e sviluppare immediatamente la membrana utilizzando un film a raggi X o un sistema di imaging.
      NOTA: Se la proteina non è stata rilevata in nessuno dei campioni ma solo nel controllo positivo, ciò può indicare che la proteina è insolubile o non presente in quantità adeguate per essere rilevata dall'anticorpo. Se venissero caricati solo nanogrammi del controllo positivo, il primo scenario è più probabile. Se non è stata rilevata alcuna proteina, controllare la qualità dell'anticorpo e magari passare a un anticorpo policlonale piuttosto che a un anticorpo monoclonale. In rare occasioni, ad esempio per alcune proteine idrofobiche, la proteina può essere rilevabile dopo la centrifugazione, ma non dopo la filtrazione. In tal caso, si consiglia di utilizzare speciali unità filtranti per proteine idrofobiche.
3. Facoltativamente, colorare le membrane PVDF dopo western blot per controllare il successo del trasferimento della proteina dal gel SDS-PAGE alla membrana PVDF.
   NOTA: la colorazione coomassie è consigliata per la risoluzione dei problemi, lo sviluppo del metodo e la documentazione, ma tieni presente che dopo aver applicato questo protocollo, le membrane vengono perse a causa di ulteriori analisi western blot. La colorazione di Ponceau S dà una colorazione più debole, ma può essere utilizzata se le membrane devono essere nuovamente sondate.
   1. Preparare piccoli vassoi contenenti la colorazione (Coomassie o Ponceau S) e le soluzioni di decolorazione.
   2. Usando una pinzetta, mettere la membrana nella soluzione di colorazione e agitare delicatamente fino a quando la membrana è ben macchiata (5-10 min).
   3. Trasferire la membrana nella soluzione di decolorazione e agitare fino a quando la soluzione è satura (5-10 min). Ripetere la fase di detaining fino a quando le bande proteiche possono essere osservate sulla membrana; se non si osserva alcuna banda, ripetere la colorazione con un tempo di incubazione più lungo. Asciugare la membrana posizionandola su una lastra di vetro usando una pinzetta.

4. Test: precipitazione del solfato di ammonio

NOTA: La precipitazione del solfato di ammonio è un metodo di purificazione delle proteine alterando la solubilità della proteina. In un esperimento preliminare, la concentrazione di solfato di ammonio viene aumentata sequenzialmente a un valore che precipita una quantità massima di contaminanti proteici, lasciando FAHD1 in soluzione. La solubilità della proteina viene nuovamente sondata tramite analisi western blot.

1. Procedere dal punto 2.3: scongelare un'aliquota del campione o procedere direttamente dopo l'estrazione delle proteine (cioè senza congelare il campione). Filtrare il campione utilizzando un'unità filtrante da 0,22 μm per escludere possibili precipitati dopo lo scongelamento. Preparare sei tubi da 1,5 ml su ghiaccio e trasferire 250 μL di campione in ciascun tubo.
2. Preparare una serie di diluizione di 5%, 10%, 15%, 20%, 25% e 30% di solfato di ammonio nei tubi preparati sopra e portare il volume finale a 1000 μL con tampone di lisi proteica. Incubare i campioni a 4 °C durante la notte su un rotatore a tubo (vedere Tabella dei materiali).
3. Utilizzando una centrifuga da tavolo, centrifugare a 10.000 x g per 30 minuti a 4 °C e trasferire con cura tutti i supernatanti in tubi separati. Asciugare all'aria i pellet risultanti e risospestarne ciascuno in 1000 μL di ddH₂O.
4. Per ogni coppia di pellet risospeso e surnatante della fase precedente, mescolare 40 μL con 10 μL di tampone campione SDS 5x e far bollire a 95 °C con coperchi aperti fino a quando la maggior parte del liquido non si è vaporizzata. Quindi, risospesciare il pellet in una miscela di DMSO al 50% in ddH₂O.
5. Eseguire SDS-PAGE (passaggio 3) ma eseguire i gel a 80 V per 3 ore. Per ogni concentrazione di solfato di ammonio, caricare i campioni derivati dal pellet risospeso e dal surnatante (fase 4.3) in coppia. Eseguire un'analisi western blot (passaggio 3).
6. Verificare la massima concentrazione di solfato di ammonio, alla quale la proteina da purificare (ad esempio, FAHD1) rimane nel campione derivato dal surnatante. Sulla base dei risultati, definire un protocollo di precipitazione del solfato di ammonio per la proteina di interesse, da utilizzare in esperimenti futuri.
   NOTA: il solfato di ammonio è ben noto per distorcere SDS-PAGE e western blot. Con l'aumentare della concentrazione di solfato di ammonio, la qualità dell'analisi western blot sarà compromessa. Tuttavia, come per la fase 3 precedente, questa analisi viene utilizzata per verificare la solubilità della proteina di interesse a determinate concentrazioni di solfato di ammonio. Questo protocollo ha lo scopo di far precipitare altre proteine, mentre la proteina da purificare deve rimanere solubile.

5. Test: cromatografia a scambio ionico con FPLC

NOTA: Le molecole con gruppi funzionali carichi sono legate a una colonna di particelle di silice per FPLC, consentendo la differenziazione delle proteine in base alla loro carica superficiale. Eseguire questo passaggio due volte, utilizzando la colonna di scambio cationico e la colonna di scambio anionico (vedere Tabella dei materiali). Le fasi del protocollo sono le stesse per la cromatografia a scambio cationico o anionico, ma i buffer da utilizzare sono diversi (vedi Tabella 1); entrambi con condizioni "a basso contenuto di sale" 15 mM NaCl e "ad alto sale" 1 M NaCl. Per le colonne utilizzate si consiglia una portata di 1 mL/min.

1. Impostare il sistema FPLC con la colonna di scambio anionico o cationico. Lavare la colonna con 5 volumi di colonna (CV) del 20% etOH (in H₂O), seguiti da 5 CV di ddH₂O. In alternativa, lavare la colonna con 1 CV di tampone a basso contenuto di sale, tampone ad alto contenuto di sale e di nuovo tampone di sale basso nell'ordine fino a quando non si osservano più picchi nel cromatogramma, ma lavare almeno una volta.
2. Dopo aver determinato il protocollo ottimale per la precipitazione del solfato di ammonio su piccola scala (fase 4), applicare il protocollo di precipitazione a 10 ml di omogeneizzato tissutale originale (fase 2). Facoltativamente, dializzare il campione contro il buffer a basso contenuto di sale.
   1. Applicare il campione sulla colonna (ad esempio, per iniezione o utilizzando una pompa campione) e raccogliere il flusso attraverso. Lavare la colonna con 1 CV del tampone a basso contenuto di sale.
3. Impostare un'eluizione a gradiente lineare da tampone salino basso al 100% / tampone salino alto 0% a tampone salino basso a 0% / tampone salino alto al 100% entro 3 CV. Raccogliere continuamente frazioni da 1 ml. Al termine del gradiente, continuare a funzionare con l'alto tampone salino fino a quando non vengono rilevati più picchi associati alle proteine (assorbimento UV a 280/255 nm) nel cromatogramma nell'intervallo di 1 CV.
4. Applicare 1 mL di SDS al 25% disciolto in 0,5 M NaOH (in ddH₂O) per pulire la colonna. Consecutivamente, lavare la colonna con 3 CV di ddH₂O e 3 CV di EtOH al 20% (in ddH₂O).
5. Raccogliere campioni SDS-PAGE di tutte le frazioni di picco e del flow-through e sondarli tramite western blot per la presenza della proteina di interesse (fase 3). Congelare a scatto le frazioni raccolte in azoto liquido e conservarle a -80 °C.
6. Una volta completata l'analisi western blot, scongelare e raggruppare le frazioni contenenti la proteina di interesse e scartare le altre. Ripetere i passaggi 5.1-5.5 con la colonna alternativa (cioè colonna di scambio cationica o anionica).
7. Dopo che entrambe le colonne sono state sondate, definire un protocollo FPLC per la proteina di interesse, da utilizzare in esperimenti futuri. Ridurre il volume della soluzione proteica utilizzando unità filtranti ultracentranti (10 kDa, vedi Tabella dei materiali) fino a 2 ml.
   NOTA: ci sono due risultati attesi di questa serie di esperimenti. O la proteina di interesse si è attaccata a una delle colonne, e la soluzione proteica è già abbastanza pura dopo l'eluizione, o la proteina è rimasta nel flusso in entrambi i casi. In quest'ultimo scenario, sebbene la proteina sia nel flusso attraverso, l'effetto di pulizia di questo passaggio potrebbe essere ancora significativo. In tal caso, come per FAHD1 nel rene suino e nel fegato di topo, questa fase di scambio ionico verrà comunque eseguita. Se né la colonna di scambio cationico né quella a scambio anionico possono fornire un corretto effetto di pulizia, si può provare a modificare il pH del lisato e del tampone e a dializzare il campione contro il buffer in esecuzione prima dell'applicazione a FPLC.

6. Estrazione di proteine mediante sottoprotocolli definiti per la precipitazione del solfato di ammonio e FPLC

NOTA: Le particelle porose in una colonna di gel di silice per FPLC (Vedi Tabella dei materiali) consentono la differenziazione delle proteine in base al loro raggio idrodinamico. I passaggi descritti devono essere eseguiti con un sistema FPLC, utilizzando la cromatografia di esclusione dimensionale (SEC). Per la colonna SEC utilizzata (vedere Tabella dei materiali), si consiglia una portata di 0,3 ml/min.

1. Preparare tutti i materiali necessari (vedere il passaggio 1) ed estrarre la proteina totale dal tessuto (vedere il passaggio 2). Eseguire una precipitazione del solfato di ammonio con tutto l'omogeneizzato tissutale che non è stato utilizzato per il test (vedere il passaggio 4). Per volumi più grandi, concentrare il lisato utilizzando unità filtranti ultracentrifugabili (10 kDa; vedi Tabella dei materiali) fino a un volume inferiore di 50 ml o meno.
2. Eseguire una prima fase di purificazione utilizzando la cromatografia a scambio ionico (vedere il passaggio 5).
   1. Preparare i campioni per Western Blot, come descritto nei passaggi precedenti. Eseguire l'analisi western blot e raggruppare tutte le frazioni contenenti FAHD1 dalla cromatografia a scambio ionico.
   2. Ridurre il volume della soluzione proteica fino a 2 mL utilizzando unità filtranti ultracentranti (10 kDa). Filtrare sequenzialmente la soluzione con unità filtranti a siringa da 0,45 μm e 0,22 μm per rimuovere eventuali microindurite.
3. Equilibrare la colonna SEC con 1 CV di buffer in esecuzione SEC (vedere Tabella 1), contenente 1 mM DTT. Caricare il campione sulla colonna ed eseguire la cromatografia fino a quando tutte le proteine sono eluite (1-2 CV).
   1. Raccogliere frazioni di 1 mL del flusso passante che corrisponde a picchi significativi nel cromatogramma (assorbimento UV a 280/255 nm) e preparare campioni da 50 μL di ciascuna frazione raccolta per l'analisi SDS-PAGE e western blot, come descritto nei passaggi precedenti. Congelare a scatto tutte le frazioni utilizzando azoto liquido e conservarle a -80 °C.
4. Lavare consecutivamente la colonna SEC con 1 CV di ddH₂O e 1 CV di 20% EtOH (in ddH₂O). Eseguire l'analisi western-Blot e raggruppare tutte le frazioni contenenti FAHD1. Ridurre il volume della soluzione proteica fino a 2 ml utilizzando unità filtranti ultracentranti (10 kDa, vedi Tabella dei materiali).
5. Valutare la concentrazione proteica utilizzando un kit di analisi BCA commerciale (vedere Tabella dei materiali).
   NOTA: Il pH e il contenuto salino della fase mobile possono influenzare il profilo di eluizione delle proteine globulari²⁰. Le condizioni acide o basiche possono comportare picchi meno definiti e un aumento delle interazioni proteina-matrice che porta a una parziale ritenzione di proteine sulla colonna²⁰. Questo effetto può essere sfruttato per un'ulteriore purificazione delle proteine. Una ripetizione della fase 6 con diverse portate, pH e concentrazioni di sale può migliorare la purezza della proteina²⁰.

7. Colorazione dell'argento

NOTA: L'analisi della colorazione dell'argento dei gel SDS-PAGE è necessaria per verificare la presenza di contaminazioni proteiche che potrebbero non essere viste con la colorazione coomassie. Il seguente protocollo è una delle tante versioni che si possono trovare nella letteratura²¹. Eseguire tutte le fasi di incubazione agitando in un vassoio di vetro pulito. Raccogliere tutti i liquidi contenenti argento e formaldeide in un contenitore speciale per rifiuti e scartarli correttamente.

1. Incubare i gel SDS-PAGE in soluzione fissante colorante all'argento (vedere Tabella 1) durante la notte nella cella frigorifera. Incubare i gel in soluzione di incubazione contenente argento (vedere Tabella 1) per 3 ore a temperatura ambiente. Facoltativamente, aggiungere glutaraldeide (vedere Tabella 1) per migliorare il rilevamento di bande deboli. Lavare i gel quattro volte in ddH₂O per 10 minuti ciascuno.
2. Incubare i gel in soluzione di argento colorante argento (vedere Tabella 1) per 1 ora.
   NOTA: Attenzione che d'ora in poi tutti i liquidi e il gel stesso contengono argento e formaldeide che sono tossici.
3. Incubare i gel in una soluzione di sviluppo per la colorazione dell'argento (vedere Tabella 1) con un vigoroso scuotimento fino a quando le bande sono chiaramente visibili. Per arrestare la reazione, scartare la soluzione di sviluppo e incubare immediatamente i gel in soluzione di arresto della colorazione dell'argento (vedere Tabella 1) per un minimo di 10 minuti.
   NOTA: le bande macchiate nei passaggi 7.2 e 7.3 diventeranno costantemente più sviluppate. L'aggiunta di più formaldeide alla soluzione di quanto dichiarato può essere necessaria se la colorazione è debole.

La proteina FAHD1 è stata estratta dal rene suino e dal fegato di topo utilizzando il protocollo presentato. Per il tessuto di topo, sono necessari più organi per ottenere diversi μg dopo la fase finale di purificazione. Per questo motivo, questo articolo si concentra sull'estrazione di FAHD1 dai reni suini, che è un esperimento molto più esemplare. L'estrazione di FAHD1 dal fegato di topo viene eseguita per presentare le difficoltà e le possibili insidie di questo protocollo. Si raccomanda generalmente di utilizzare organi che mostrano un alto livello di espressione della proteina che si vuole purificare. L'Atlante²² delle proteine umane può essere di aiuto per stimare l'espressione nel sistema modello, oppure si possono eseguire esperimenti preliminari di western blot con diversi lisati di tessuto grezzo per valutare questi livelli. Il controllo positivo utilizzato in tutte le analisi western blot era una proteina ricombinante marcata, che funzionava a un peso molecolare leggermente superiore.

Come primo esperimento, viene presentata l'estrazione di FAHD1 dal rene suino. Il processo di omogeneizzazione tissutale (fase 1) e di estrazione totale delle proteine (fase 2) è presentato nella Figura supplementare 1 (vedere la legenda per una descrizione dei singoli passaggi). Un decimo aliquotato del lisato totale è stato utilizzato per i seguenti esperimenti.

La precipitazione del solfato di ammonio è stata testata una volta per questo lisato, aggiungendo solfato di ammonio al lisato in diverse concentrazioni (fase 4) (Figura 2). Dopo la centrifugazione, pellet e supernatanti sono stati campionati e analizzati con western blot utilizzando un anticorpo policlonale^{definito 2} sollevato contro FAHD1 umano. 200 ng di FAHD1 umano ricombinante etichettato His/S ottenuto da E. coli¹² è stato caricato come controllo positivo. La banda proteica FAHD1 può essere vista a 25 kDa, mentre il controllo positivo taggato funziona a 34 kDa. Sulla base di questi dati, è stato definito un protocollo in cui il lisato viene trattato con solfato di ammonio al 25%, cioè condizioni in cui FAHD1 è ancora nel surnatante, mentre la maggior parte delle altre proteine viene precipitata. Questo è un passo importante nella strategia di purificazione. La precipitazione del solfato di ammonio è una fase di pulizia efficace prima di procedere con altri metodi. Da notare, non verranno utilizzate quantità di solfato di ammonio superiori al 30%, perché il solfato di ammonio distorce gradualmente la qualità di SDS-PAGE e Western blot.

Figura 2: Precipitazione del solfato di ammonio e screening western blot per i suini FAHD1. (A) Il solfato di ammonio è stato aggiunto al lisato in diverse concentrazioni (dal 5% al 25% massimo) per precipitare le proteine dalla soluzione. (B) La presenza di FAHD1 suino (25 kDa) è stata determinata nelle singole coppie di pellet e surnatante corrispondenti a concentrazioni variabili di solfato di ammonio tramite western blot utilizzando un anticorpo policlonale generato contro FAHD1 umano. Il surnatante corrispondente al 25% di precipitazione del solfato di ammonio mostra ancora la presenza di FAHD1 suino nel surnatante, precipitando allo stesso tempo una buona quantità di altre proteine. 200 ng di proteina ricombinante his/S-tagged sono stati caricati come controllo positivo (34 kDa). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Dopo aver testato le colonne di scambio ionico con FPLC, è stata definita una strategia in cui fahd1 suina rimane nel flusso attraverso una cromatografia a scambio anionico a pH 9 (fase 5). A partire dal lisato ottenuto dalla precipitazione del solfato di ammonio al 25% (come definito da precedenti esperimenti di test), la cromatografia a scambio anionico è stata utilizzata per eliminare ulteriori proteine dalla soluzione (Figura 3A). Le proteine leganti sono state rimosse per eluizione dalla colonna, mentre il flusso attraverso è stato ulteriormente purificato tramite SEC a pH 7,4 (Figura 3B). Seguendo entrambe le fasi, l'analisi western blot ha identificato tutte le frazioni che contenevano FAHD1 suino, che sono state raggruppate e concentrate a 2 ml.

Figura 3: Purificazione dei suini FAHD1 con FPLC - parte 1. Le frecce rosse nel cromatogramma e nelle macchie indicano la presenza di FAHD1. Nel cromatogramma, "UV" denota l'assorbimento UV a 280 nm, "Cond" denota la conduttività (correlata alla concentrazione di sale nel tampone) e "Conc B" denota la percentuale di tampone salino elevato nel gradiente tampone (0% tampone saline puro basso; 100% puro tampone ad alto contenuto di sale). (A) Purificazione dei suini FAHD1 dal lisato ottenuto mediante precipitazione del solfato di ammonio al 25% con una colonna di scambio anionico (FPLC). Mentre molte proteine si legano alla colonna, i suini FAHD1 si trovano nel flusso attraverso. Lo sporco e i contaminanti non proteici vengono rimossi per eluizione dalla colonna, mentre il flusso attraverso viene ulteriormente elaborato. (B) Il flusso attraverso la precedente cromatografia a scambio anionico in (A) viene ulteriormente purificato mediante cromatografia di esclusione dimensionale (FPLC) a pH 7,4. (A,B) L'analisi Western blot (macchie ritagliate nella parte inferiore) ha identificato frazioni contenenti FAHD1 suino, che sono raggruppate e concentrate. Le macchie complete raffigurano la membrana macchiata di Coomassie dopo l'analisi western blot. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il campione filtrato è stato applicato nuovamente alla SEC, ma in condizioni tampone a pH 9 (vedere Tabella 1) (Figura 4). Il razionale alla base di questo approccio è che il pH e il contenuto di sale della fase mobile possono influenzare il profilo di eluizione delle proteine globulari²⁰ e un profilo di eluizione migliorato per FAHD1 è stato trovato in queste condizioni tampone. Una frazione conteneva proteine di adeguati livelli di purezza per i saggi di attività enzimatica di base¹² per confermare finalmente l'identità della proteina.

Figura 4: Purificazione dei suini FAHD1 con FPLC - parte 2. Le frecce rosse nel cromatogramma e nelle macchie indicano la presenza di FAHD1. I campioni proteici precedentemente purificati con cromatografia a scambio anionico e ad esclusione dimensionale vengono ulteriormente purificati tramite cromatografia di esclusione dimensionale (FPLC) a pH 9 (pannello superiore). L'analisi Western blot raffigurata in basso a destra identifica le frazioni che contengono FAHD1 suino, che sono raggruppate e concentrate (pannelli inferiori). La macchia in basso a sinistra mostra la colorazione Coomassie della membrana dopo la macchia occidentale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Una strategia alternativa (cioè SEC seguita da cromatografia a scambio ionico) è stata testata con 2 ml di lisato ottenuto dopo precipitazione del solfato di ammonio (fase 4) (Figura supplementare 2). Il razionale di questo esperimento è che utilizzando prima SEC, le frazioni contenenti FAHD1 possono essere separate dalla maggior parte delle altre proteine, mentre una successiva cromatografia a scambio ionico può essere utilizzata per purificare ulteriormente la proteina. In primo luogo, il lisato è stato frazionato utilizzando SEC a pH 7,4 (fase 6). L'analisi Western blot ha identificato tutte le frazioni che contenevano FAHD1 suino. In secondo luogo, queste frazioni sono state concentrate e ulteriormente purificate utilizzando una colonna di scambio anionico a pH 9 (fase 5). I cromatogrammi e l'analisi western blot (Figura supplementare 2) mostrano che questa strategia è incoraggiante perché il cromatogramma a scambio ionico mostra un picco stretto definito che è associato a livelli di proteine arricchite nel western blot. Tuttavia, lo svantaggio di questa strategia è che è limitato dal volume iniziale da applicare sulla SEC (2 ml), quindi il throughput di questo metodo è molto basso. L'elaborazione di un rene suino intero, ad esempio, non è pratica.

Come altra modifica a questo protocollo, una colonna di scambio cationico è stata inclusa prima della colonna di scambio anionico quando il suno FAHD1 era presente anche nel flusso-through. In ogni fase del protocollo, campioni di frazioni fahd1 suine contenenti sono stati campionati e testati con un saggio ODx, come descritto altrove¹² (Figura supplementare 3). L'attività enzimatica specifica aumenta insieme al livello di purezza, cioè insieme alla crescente quantità relativa di FAHD1 per proteina totale.

Come secondo esempio, viene presentata l'estrazione di FAHD1 dal fegato di topo, cioè una raccolta di tessuto epatico ottenuto da 20 topi. Rispetto all'estrazione di FAHD1 dal rene suino presentato sopra, questa estrazione si è rivelata più noiosa. I problemi sono stati riscontrati in diverse fasi del protocollo, che verranno presentate di seguito. La proteina totale è stata estratta come descritto nella fase 2 (Figura supplementare 4). Poiché l'omogeneizzato di fegato di topo tende ad essere un'entità molto appiccicosa e viscida, le carte da filtro (simili alle unità filtranti del caffè) sono state utilizzate per pre-filtrare il lisato, che è stato diluito 1: 3 nel tampone di lisi dopo l'estrazione, per rendere la soluzione più simile a un liquido. Questa diluizione ha migliorato la procedura di filtrazione; tuttavia, ha reso più noioso il successivo rilevamento della proteina con western blot. Dopo la filtrazione, il lisato preparato doveva essere concentrato prima di un ulteriore utilizzo. Un decimo aliquotato del lisato totale è stato utilizzato per i seguenti esperimenti.

Una prima fase di prova per la precipitazione del solfato di ammonio (Figura supplementare 4I) ha mostrato un possibile problema che può essere riscontrato. Il solfato di ammonio a concentrazioni più elevate interrompe i gel SDS-PAGE e provoca un effetto sorriso quando viene eseguito a 150 V (Figura supplementare 5A; risultato negativo). La stessa corsa SDS-PAGE a 80 V mostra un risultato positivo (Figura supplementare 5B). In quest'ultimo caso, l'effetto sorriso si forma inizialmente, ma alla fine viene risolto a causa della tensione inferiore applicata. Poiché la soluzione iniziale doveva essere fortemente diluita per poter filtrare il lisato, l'analisi iniziale western blot di questi campioni non ha avuto successo, cioè il controllo positivo è stato rilevato dall'anticorpo, ma non dalla proteina nei campioni applicati. Questo problema è stato risolto utilizzando una maggiore concentrazione sia del lisato (concentrato utilizzando unità filtranti centrifughe) che dell'anticorpo, e applicando l'anticorpo durante la notte nella cella frigorifera durante l'agitazione. In definitiva, l'analisi western blot ha fornito sia le informazioni che la proteina era presente nel lisato, sia che la proteina era ancora presente nel surnatante al 15% di solfato di ammonio (Figura supplementare 5C). Da notare, i campioni SDS contenenti quantità più elevate di solfato di ammonio (>15%) sono precipitati durante il riscaldamento e la proteina è stata persa. Questo può essere visto anche nella colorazione di Coomassie e nella macchia occidentale (Figura supplementare 5C). Questo effetto non è stato osservato per il rene suino, quindi potrebbe essere specifico del tessuto.

Dopo la precipitazione del solfato di ammonio al 15%, 10 mL di lisato sono stati applicati alla cromatografia a scambio cationico a pH 6,8. L'analisi Western blot ha mostrato che la proteina FAHD1 del topo si trovava nel flusso passante (Figura 5A). La frazione proteica eluita sembra essere minore; tuttavia, questo esempio mostra un effetto secondario della cromatografia a scambio ionico. In questa fase del protocollo, la soluzione può ancora contenere molti composti che potrebbero non essere proteine. La cromatografia a scambio ionico è un modo semplice e veloce per sbarazzarsi di tali contaminazioni. Dato che l'esecuzione della cromatografia a scambio ionico richiede alcune ore per essere eseguita (comprese tutte le fasi di lavaggio, l'esperimento stesso richiede mezz'ora), fornisce un metodo semplice per liberare il campione da contaminazioni non proteiche.

Figura 5: Purificazione del mouse FAHD1 con FPLC. Le frecce rosse nel cromatogramma e nelle macchie indicano la presenza di FAHD1. (A) Dopo la precipitazione del solfato di ammonio al 15%, il campione è stato centrifugato, filtrato (0,22 μm) e applicato a una colonna di scambio cationico. L'analisi Western blot mostra che la proteina è nel flusso attraverso e il cromatogramma mostra che non molte delle altre proteine sono state rimosse da questo passaggio. Tuttavia, confrontando l'aspetto e la viscosità dell'input con il flow-through si vede che il flow-through raccolto è molto più chiaro (pannello di destra che confronta input e flow-through). (B) Il flusso passante raccolto dalla colonna di scambio cationico è stato ridotto a 2 mL tramite filtri di centrifugazione e applicato alla cromatografia di esclusione dimensionale a pH 7,4. (C) Le frazioni contenenti FAHD1 sono state raggruppate, concentrate e applicate a un secondo ciclo di cromatografia di esclusione dimensionale a pH 9. (D) Le frazioni contenenti FAHD1 sono state nuovamente raggruppate e applicate a SDS-PAGE con colorazione all'argento, per vedere le contaminazioni rimanenti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il campione è stato ulteriormente applicato alla cromatografia di esclusione dimensionale a pH 7,4 (Figura 5B). L'analisi Western blot ha mostrato frazioni contenenti la proteina FAHD1 del topo, che sono state raggruppate e concentrate a 2 ml. Questo concentrato di 2 mL è stato congelato a -20 °C con 10 μL di β-mercaptoetanolo e scongelato il giorno successivo. Si è formato un precipitato che è stato filtrato tramite unità filtranti a siringa (0,22 μm). Sono stati prelevati campioni per l'analisi SDS-PAGE e western blot per assicurare che la proteina FAHD1 del topo fosse ancora in soluzione.

I campioni contenenti la proteina (dall'analisi western blot) sono stati raggruppati, concentrati tramite filtri di centrifugazione e applicati a SDS-PAGE con colorazione all'argento per vedere le contaminazioni rimanenti (Figura 5D). Ciò ha rivelato che la soluzione proteica non è altamente pura e che le quantità di proteine ottenute tramite questo metodo dal fegato di topo non erano molto elevate (pochi μg in totale come determinato utilizzando il kit di analisi BCA; vedi Tabella dei materiali). La resa proteica era molto più alta nel caso dei suini FAHD1 (circa 1 mg in questa fase). Il livello di purezza della proteina FAHD1 estratta dal rene suino è di circa l'80% (stimato dopo la colorazione dell'argento; dati non mostrati). Questa purezza può essere ulteriormente aumentata attraverso, ad esempio, la cromatografia di affinità utilizzando un anticorpo definito. Tali e altre limitazioni di questo protocollo saranno discusse in dettaglio più avanti.

Tabella 1.

Figura supplementare 1: Estrazione totale di proteine dal rene suino. (A) Il tessuto renale è stato tagliato usando un bisturi su una lastra di vetro adeguatamente pulita preparata messa su polistirene espanso per evitare lo scivolamento; B) 50 mL di tubi contenenti 20 mL di tampone di lisi ghiacciata con inibitori delle proteine/proteasi siano incubati sul ghiaccio; C) i pezzi di tessuto renale sono stati inseriti nel tampone fino a quando il volume ha raggiunto circa 30 ml; (D) il tessuto renale è stato omogeneizzato utilizzando gli ultrasuoni (cioè la sonicazione); E) l'omogeneizzato grezzo è stato centrifugato in una centrifuga da tavolo a velocità media per 30 minuti; F) più campioni sono stati trattati contemporaneamente; (G) dopo la prima centrifugazione, il surnatante è stato trasferito in tubi centrifughi (rispetto a E) e centrifugato ad alta velocità (10.000 x g) per 30 minuti; H) questa fase di centrifugazione produce un altro pellet e un surnatante, che viene trasferito in tubi da 50 ml; (I/J) il prelisato è filtrato sequenzialmente da unità filtranti da 0,45 μm e 0,2 μm, aliquotato in lotti da 10 ml e congelato a scatto con azoto liquido per la successiva conservazione a -80 °C. L'analisi Western blot viene utilizzata per verificare la presenza della proteina in tutti i campioni (pellet, supernatanti, lisato filtrato). Fare clic qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2: Purificazione dei suini FAHD1 con FPLC; strategia alternativa. Le frecce rosse nel cromatogramma e nelle macchie indicano la presenza di FAHD1. (A) Purificazione del suino FAHD1 dal lisato ottenuto mediante precipitazione del solfato di ammonio al 25% con cromatografia ad esclusione dimensionale (FPLC) a pH 7,4. L'analisi Western blot ha identificato frazioni che contengono FAHD1 suino, che sono state raggruppate e concentrate. (B) I campioni proteici precedentemente purificati con cromatografia ad esclusione dimensionale (pannello A) sono stati ulteriormente purificati tramite cromatografia a scambio anionico (FPLC). L'analisi Western blot identifica le frazioni che contengono FAHD1 suino, che sono state raggruppate e concentrate. Fare clic qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 3: Attività enzimatica specifica dei suini FAHD1. Misurata l'attività enzimatica specifica in funzione dell'aumento del livello di purezza. La tabella confronta l'attività enzimatica relativa (nmol/min) con l'attività enzimatica specifica (μmol/min/mg). Il test mostra un'attività in costante aumento di FAHD1 suini dopo ogni fase di purificazione. Rispetto al RICOmbinante His/S-human FAHD1 (verde) ottenuto da E. coli. ¹², i suini FAHD1 hanno mostrato un'attività leggermente superiore (rosso) (n = 3). Fare clic qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 4: Estrazione totale di proteine dal fegato di topo. (A,B,C) Il tessuto epatico congelato a scatto di 20 topi e il tampone di lisi sono stati preparati su ghiaccio in tubi da 50 ml; (D, E, F) il tessuto epatico è stato omogeneizzato utilizzando gli ultrasuoni (cioè la sonicazione); l'omogeneizzato grezzo è stato centrifugato in una centrifuga da tavolo a media velocità per 30 minuti; il surnatante è stato trasferito in tubi centrifughi e centrifugato ad alta velocità (10.000 x g) per 30 minuti; (G,H,I) il prelisato è filtrato sequenzialmente mediante filtri di carta, unità filtranti da 0,45 μm e 0,2 μm, aliquotato in lotti da 10 ml e congelato a scatto con azoto liquido per essere successivamente conservato a -80 °C; J) il solfato di ammonio è stato aggiunto al lisato in diverse concentrazioni (dal 5% al 30% massimo) per precipitare la proteina dalla soluzione; (K) i pellet ottenuti dopo la precipitazione del solfato di ammonio (pannello J) sono stati risospesi in H₂O per prelevare campioni per l'analisi SDS-PAGE e western blot. Fare clic qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 5: Precipitazione del solfato di ammonio e screening western blot per FAHD1 di topo. Le frecce rosse nelle macchie indicano la presenza di FAHD1. (A) SDS-PAGE con campioni ottenuti dopo che la precipitazione del solfato di ammonio è stata eseguita a 125 V. Questo gel ha mostrato un drastico effetto sorriso e un tale gel non può essere valutato. Questo è un esempio di risultato negativo. (B) SDS-PAGE con gli stessi campioni (pannello A) è stato eseguito a 80 V fino al completamento. Non c'è effetto sorriso in questo gel, e questo è un esempio di un risultato positivo. (C) SDS PAGE e western blot analisi dei campioni ottenuti dopo la precipitazione del solfato di ammonio. I campioni a concentrazioni più elevate di solfato di ammonio possono precipitare all'interno del tampone del campione, come indicato. Vengono persi e non possono più essere rilevati, né tramite la colorazione Coomassie (a sinistra) né l'analisi western blot (a destra). La migliore concentrazione di solfato di ammonio, in questo caso, è stata determinata al 15%. Fare clic qui per scaricare questo file.

Passaggi critici nel protocollo
Seguire le linee guida comuni per la manipolazione delle proteine è essenziale, come lavorare sul ghiaccio e in condizioni di pH e sale moderate. L'uso di inibitori della proteasi è benefico per il metodo, mentre l'uso di inibitori del proteasoma è altamente raccomandato. Il congelamento e lo scongelamento del campione possono sempre comportare la precipitazione proteica (almeno parzialmente), pertanto qualsiasi aliquota scongelata del lisato proteico iniziale (fase 2) deve essere elaborata continuamente senza interruzioni. La centrifugazione e la filtrazione dopo lo scongelamento sono generalmente raccomandate per rimuovere la microprecipitazione.

Il lisato proteico iniziale ottenuto da un tessuto contiene ancora molte sostanze oltre alle proteine. Le colonne per cromatografia a scambio ionico possono essere utilizzate per cancellare il lisato. Anche se la proteina che si vuole estrarre non si lega alla colonna di scambio ionico, il flusso può essere molto più chiaro della soluzione di input e più facile da elaborare nelle fasi successive. Questo è mostrato per l'estrazione di FAHD1 dai reni di topo (vedere Figura 5A).

Limitazioni e modifiche del metodo
Questo protocollo descrive un protocollo per l'estrazione di FAHD1 dal tessuto. Sulla base di questa strategia, può essere derivato un approccio generale per l'estrazione delle proteine FAHD (FAHD1, FAHD2) da altri tessuti, mentre possono essere necessari adattamenti specifici per i singoli casi. La limitazione implicita di questo metodo è il livello di espressione relativa di FAHD1 (o proteine FAHD) in un dato tessuto e la disponibilità di questo tessuto in quantità adeguate. Lo schema generale descritto in questo protocollo richiede un'elevata espressione della proteina in una quantità adeguata di tessuto per cominciare. Sono stati forniti esempi per l'estrazione di FAHD1 dal rene suino e dal fegato di topo, che sono due organi che mostrano alti livelli di espressione della proteina. Ad ogni fase descritta in questo protocollo, c'è una perdita implicita di campione, cioè la bassa quantità iniziale di proteine è ulteriormente ridotta. In definitiva, solo basse quantità di proteine possono essere raggiunte utilizzando questo protocollo. Poiché il rene suino è un organo di grandi dimensioni, circa un grammo di proteine (circa l'80% di purezza; stimato) potrebbe essere estratto da questo approccio da due reni. L'applicazione dello stesso protocollo per l'estrazione di FAHD1 dal fegato di topo ha richiesto la raccolta di campioni di fegato da 20 topi, per ottenere solo pochi μg di proteine alla fine. Ottenere una maggiore purezza della proteina usando i metodi delineati può essere noioso, e la colorazione dell'argento rivela che dopo la cromatografia di esclusione delle dimensioni potrebbero esserci ancora molte altre proteine in soluzione. Si potrebbe aumentare questo protocollo tramite cromatografia di affinità (colonne attivate dal NHS), utilizzando un anticorpo monoclonale (ad esempio, CAB025530).

Tutti i protocolli qui elencati richiedono che la proteina che si vuole estrarre sia solubile. Le condizioni ottimali di precipitazione del solfato di ammonio e le regolazioni del pH/sale per la cromatografia devono essere testate e definite. Nel caso in cui la cromatografia a scambio ionico non fornisca buoni risultati di purificazione, la dialisi contro un tampone cromatografico prima di eseguire FPLC può essere un'opzione per migliorare la solubilità della proteina e la risoluzione della cromatografia. Non è consigliabile, tuttavia, dializzare il lisato grezzo, in quanto ciò potrebbe portare a una precipitazione proteica massiccia e incontrollata all'interno del tubo di dialisi. I problemi possono verificarsi se la proteina tende ad essere idrofoba e i protocolli potrebbero non essere applicabili se la proteina è altamente idrofoba (ad esempio, proteine di membrana). Se le proteine FAHD sono parzialmente insolubili come trovato per FAHD2 (dati non mostrati) in un dato lisato tissutale, possono essere esplorati anche altri tipi di cromatografia, ad esempio la cromatografia di interazione idrofobica (HIC)¹².

Due modifiche del protocollo standard sono state mostrate nella sezione dei risultati. Per la purificazione di FAHD1 da un rene suino, la cromatografia di esclusione dimensionale è stata utilizzata prima della cromatografia a scambio ionico (vedere Figura supplementare 2). Un problema con questo metodo è che la cromatografia di esclusione delle dimensioni presenta tracce di corsa più grandi e il volume del campione aumenta fortemente durante l'esecuzione. Il volume del campione non deve superare il 2% del volume del letto per raggiungere un'alta risoluzione²³ e il fattore di diluizione finale dipende anche dal volume di eluizione raccolto. Nell'esempio fornito utilizzando una colonna da 120 mL, si consiglia un volume iniziale di 2 mL. Il campione iniziale può essere prelevato da diversi ml di lisato dopo precipitazione del solfato di ammonio, per concentrazione utilizzando unità filtranti centrifughe, senza artefatti di aggregazione o precipitazione. Un esempio per la purificazione di FAHD1 da un rene suino è fornito come risultato rappresentativo (vedere anche figura supplementare 2). Tuttavia, la limitazione ai soli piccoli volumi di campioni può rendere questo approccio poco pratico.

Applicazioni o indicazioni del metodo
L'espressione e la purificazione di proteine ricombinanti da batteri è un metodo semplice e consolidato, per ottenere quantità fattibili (in grammi) di proteina^24,25. Questo è stato presentato per FAHD1¹². Tuttavia, ci sono diversi possibili inconvenienti nell'utilizzo di questi metodi, come la possibile scarsa crescita dell'ospite, la formazione del corpo di inclusione, la perdita o l'alterata attività proteica e, quindi, la possibilità di non ottenere alcuna proteina o di provocare una forma distorta della proteina (misfolding, cattive modifiche post-traduzionali, ecc.). Lo sviluppo di metodi in grado di estrarre proteine ben piegate e opportunamente modificate direttamente dal tessuto è, quindi, attraente. Il problema principale, tuttavia, è che la maggior parte delle proteine non sono espresse a livelli significativi e, rispetto all'induzione implicita e alla successiva estrazione di proteine dai batteri, la quantità di proteine da ottenere è in genere di diversi ordini di grandezza inferiore. C'è un compromesso tra l'estrazione economica e facile di proteine ricombinanti dai batteri e l'estrazione più costosa e noiosa di proteine dai tessuti. Il principale progresso con quest'ultimo è che si può estrarre la proteina nella sua forma fisiologica che è presente nel tessuto, compresi tutti gli effetti reciproci che possono influire sul suo ripiegamento e / o attività catalitica.

Le proteine estratte e purificate da questo protocollo aiuteranno a identificare inibitori competenti di FAHD1¹³, possibili partner di interazione proteica⁹ e possibili ruoli ancora non scoperti della proteina⁹. Lo studio degli inibitori enzimatici, lo sviluppo di anticorpi monoclonali e lo studio della struttura proteica in primo luogo sono notevolmente supportati quando si hanno proteine ad alta purezza estratte dal tessuto piuttosto che estratte dai batteri.

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

Gli autori sono molto grati per l'assistenza tecnica di Ayse Öztürk ed Eva Albertini. I topi utilizzati per la generazione di tessuto epatico sono stati mantenuti sotto la supervisione di Univ.-Doz. Dr. Pidder Jansen-Dürr (Istituto per la ricerca sull'invecchiamento biomedico presso l'Università di Innsbruck, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Austria).