מיצוי וטיהור של חלבון FAHD1 מכבד כליות ועכבר חזירים

פרוטוקול זה מתאר כיצד לחלץ את החלבון 1 המכיל הידרולאז 1 (FAHD1) מכליות החזירים ומכבד העכברים. השיטות המפורטות עשויות להיות מותאמות לחלבונים אחרים בעלי עניין ולשנות אותן עבור רקמות אחרות.

פומארילאצטואצטט הידרולאז המכיל חלבון 1 (FAHD1) הוא החבר המזוהה הראשון במשפחת העל FAH באאוקריוטים, הפועל כאוקסלואצטט דקרבוקסילאז במיטוכונדריה. מאמר זה מציג סדרה של שיטות למיצוי וטיהור של FAHD1 מכליות חזירים וכבד עכברים. השיטות המכוסות הן כרומטוגרפיית חילופי יונית עם כרומטוגרפיה נוזלית של חלבונים מהירים (FPLC), סינון ג'ל הכנה ואנליטי עם FPLC, וגישות פרוטאומיות. לאחר מיצוי החלבון הכולל, נחקרו משקעי אמוניום סולפט וכרומטוגרפיית חילופים יונית, ו-FAHD1 הופק באמצעות אסטרטגיה רציפה באמצעות חילופי יונים וכרומטוגרפיית אי הכללת גודל. גישה מייצגת זו עשויה להיות מותאמת לחלבונים אחרים בעלי עניין (המתבטאים ברמות משמעותיות) ומשתנה עבור רקמות אחרות. חלבון מטוהר מרקמה עשוי לתמוך בפיתוח נוגדנים איכותיים, ו/או מעכבים פרמקולוגיים חזקים וספציפיים.

החלבון האאוקריוטי המכיל את תחום FAH 1 (FAHD1) פועל כאוקסלואצטט דו-תפקודי (OAA) דקרבוקסילאז (ODx)¹ ואצילפירובט הידרולאז (ApH)². הוא מקומי במיטוכונדריה² ושייך למשפחת העל הרחבה FAH של אנזימים ^1,2,3,4,5,6. בעוד שפעילות ה-ApH שלה רלוונטית רק באופן מינורי, פעילות ה-ODx של FAHD1 מעורבת בוויסות של שטף מחזור TCA 1,7,8,9. OAA נדרש לא רק לתגובת הסינתאז המרכזית של ציטראט ציטראט במחזור החומצה הטריקרבוקסילית, אלא גם פועל כמעכב תחרותי של סוקסינט דהידרוגנאז כחלק ממערכת הובלת האלקטרונים וכמטבוליט קטפלרוטי. הפחתה של ביטוי הגנים FAHD1 בתאי אנדותל של ורידים טבוריים אנושיים (HUVEC) הביאה לירידה משמעותית בקצב התפשטות התא¹⁰, ולעיכוב משמעותי של פוטנציאל הממברנה המיטוכונדרית, הקשורה למעבר מקביל לגליקוליזה. מודל העבודה מתייחס לתפקוד לקוי של מיטוכונדריאלי הקשור^{לפנוטיפ דמוי 11} (MiDAS)11, שבו רמות OAA מיטוכונדריאליות מווסתות באופן הדוק על ידי פעילות FAHD1 ^1,8,9.

קל יותר להשיג חלבון רקומביננטי באמצעות ביטוי וטיהור מחיידקים¹² ולא מרקמה. עם זאת, חלבון המתבטא בחיידקים עשוי להיות מוטה על ידי היעדר אפשרי של שינויים לאחר התרגום, או פשוט עשוי להיות בעייתי (כלומר, עקב אובדן פלסמיד, תגובות עקה חיידקיות, קשרים דיסולפידיים מעוותים/לא מעוצבים, הפרשה ללא או הפרשה לקויה, צבירת חלבונים, ביקוע פרוטאוליטי וכו '). עבור יישומים מסוימים, יש לקבל חלבון מליסאט תאי או מרקמה, על מנת לכלול שינויים כאלה ו/או להחריג ממצאים אפשריים. חלבון מטוהר מרקמה תומך בפיתוח נוגדנים באיכות גבוהה, ו/או מעכבים פרמקולוגיים חזקים וספציפיים עבור אנזימים נבחרים, כגון עבור FAHD1¹³.

כתב יד זה מציג סדרה של שיטות למיצוי וטיהור של FAHD1 מכליות חזירים וכבד עכברים. השיטות המתוארות דורשות כרומטוגרפיה נוזלית מהירה של חלבון (FPLC) אך משתמשות בציוד מעבדה נפוץ. שיטות חלופיות ניתן למצוא במקומות אחרים 14,15,16,17. לאחר מיצוי חלבונים כולל, הפרוטוקול המוצע כולל שלב בדיקה, שבו נדונים תת-פרוטוקולים עבור משקעי אמוניום גופרתיים וכרומטוגרפיית חילופי יונית (איור 1). לאחר הגדרת תת-פרוטוקולים אלה, החלבון המעניין מופק באמצעות אסטרטגיה רציפה באמצעות חילופי יונית וכרומטוגרפיית אי הכללת גודל עם FPLC. בהתבסס על הנחיות אלה, הפרוטוקול הסופי עשוי להיות מותאם בנפרד לחלבונים אחרים בעלי עניין.

איור 1: האסטרטגיה הכוללת של פרוטוקול זה. מלמעלה למטה: חלבון מופק מרקמות. רקמות הומוגנטיות מוכנות, צנטריפוגות ותנוססות. עבור כל זוג של דגימות סופרנטנט ודגימות שמקורן בכדור, יש לבצע בדיקות לאיתור משקעי אמוניום סולפט וכרומטוגרפיית חילופי יונית (FPLC) כדי לחקור תנאים אופטימליים. לאחר קביעת תת-פרוטוקולים אלה, ניתן לחלץ את החלבון באמצעות הליך רציף של משקעי אמוניום סולפט, כרומטוגרפיית חילופי יונית וכרומטוגרפיה חוזרת ונשנית של הרחקת גודל (FPLC) בריכוזי pH ומלח משתנים. כל הצעדים צריכים להיות נשלטים על ידי כתם מערבי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות. כליה חזירית הושגה טרייה מהסופרמרקט המקומי. רקמות כבד נקטפו מעכברים מסוג בר C57BL6 שנשמרו במכון לחקר ההזדקנות הביו-רפואית באוניברסיטת אינסברוק, Rennweg 10, 6020 אינסברוק, אוסטריה תחת פיקוחה של אוניברסיטת דוז. ד"ר פידר יאנסן-דור, מכוסה על ידי אישור אתי כמוביל הפרויקט שהונפק בשנת 2013 (BMWF-66.008/0007-II/3b/2013). תחזוקה ושימוש בעכברים לפרויקט מכוסים תחת אישור אתי מס '2020-0.242.978 מיום 5 במאי 2020, שהונפק על ידי משרד החינוך, המדע והמחקר האוסטרי (BMBWF).

1. הכנות

הערה: לפני שהפרוטוקול מתחיל, יש להכין מספר דברים, כלומר את מאגר החלבון ליזה, דגימת הרקמה הגולמית ונוגדן ספציפי, מלבד כימיקלים וחומרים כלליים.

1. הכינו 250 מ"ל של מאגר ליזה של חלבון לכל 100 גרם של משקל נטו של רקמה: 250 מ"ל של 1x PBS עם 50 mM NaF, 1 mM PMSF, 2 מיקרוגרם/מ"ל אפרוטינין, ואורתובנדט מופעל 1 mM (ראה טבלה 1). סנן את הפתרון באמצעות יחידת מסנן מזרק של 0.22 מיקרומטר.
   הערה: הפעלה של אורתובנדט נדרשת לפני השימוש כדי להמיר אותו למעכב חזק יותר של חלבון טירוזין פוספטזות¹⁸. אורתובנדט מופעל ניתן לקבל מספקים מסחריים, אך גם מוכן כדלקמן.
   1. הכן תמיסת מלאי של 200 mM של (נתרן) אורתובנדט ב- ddH₂O. להכנת 10 מ"ל של תמיסה, להוסיף 368 מ"ג של Na₃VO₄ עד 9 מ"ל של מים ולהמיס על ידי ערבוב. לאחר ההמסה, הוסיפו את הווליום ל-10 מ"ל עם ddH₂O.
      הערה: ה- pH ההתחלתי של תמיסת הנתרן אורתובנדט עשוי להשתנות עם מקור החומר, ויש להתאים את ה- pH ל- 10 בגישה חוזרת באופן הבא.
   2. בהתאם ל- pH הראשוני של הפתרון, התאם את ה- pH ל- 10 עם NaOH או HCl. ב- pH > 10, לתמיסה יהיה צבע צהוב. מרתיחים את התמיסה עד שהיא הופכת חסרת צבע, מקררים אותה לטמפרטורת החדר ובודקים את ה-pH. אם ה- pH הוא >10, הוסף נפח קטן של HCl כדי להתאים את ה- pH ל- 10. בשלב זה, הפתרון עשוי להפוך שוב לצהוב.
   3. חוזרים על הרתיחה והקירור עד שהתמיסה נשארת חסרת צבע וה-pH מתייצב על 10 (בערך 5-7 פעמים). בשלב זה, הוספת HCl גורמת למראה קלוש של צבע צהוב בתמיסה. אחסן אורתובנדט מופעל ב 1 מ"ל aliquots ב -20 °C (76 °F).
2. מכינים צינורות עם 2 מ"ל של חיץ ליזיס לגרם רקמה ומניחים אותם על קרח.
   הערה: פרוטוקול זה השתמש בשמונה צינורות של 50 מ"ל, שכל אחד מהם מלא ב-30 מ"ל של מאגר ליזיס בסך הכל עבור כליה אחת של חזירים (כ-100-150 גרם), ושני צינורות שכל אחד מהם מלא ב-40 מ"ל של מאגר ליזיס עבור 20 כבדי עכברים (כל אחד 1-2 גרם) בסך הכל.
3. להכין את הרקמה: לנתח את הרקמה על צלחת זכוכית מנוקה מראש המונחת על קרח בקופסת קצף פוליסטירן. חותכים חתיכות טישו של כ-100 מ"ג כל אחת כדי לעבור בקלות לצינורות המתאימים לצורך תזה לאחר מכן. מעבירים את חלקי הרקמה לצינורות המוכנים (שלב 1.2).
4. מכינים תמיסת אמוניום גופרתית רוויה: מחממים 500 מ"ל של ddH₂O עד 70 מעלות צלזיוס ותוך כדי ערבוב, מוסיפים בהדרגה אבקת אמוניום גופרתי (ראו טבלת חומרים) עד שלא מומס יותר אמוניום סולפט. קררו את התמיסה הרוויה (יתר על המידה) הזו לטמפרטורת החדר ואחסנו אותה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

2. מיצוי חלבון כולל

הערה לאחר הכנת הדגימה במאגר ליזה של חלבון קר (ראה שלב 1.3), הומוגניזציה של הרקמה בצורה הטובה ביותר האפשרית באמצעות סוניזציה על ידי בדיקה קולית, או באמצעות הומוגנייזר חשמלי כדלקמן.

1. הומוגניזציה של רקמות
   1. במקרה של כליה חזירית, נקו את ההשעיה עדיף על ידי בדיקה קולית תוך שמירה על הדגימה על קרח (10 מחזורים של 15 שניות דופק, עם מרווחים של 30 שניות בין הפולסים כדי לקרר את הדגימה על קרח, באמפליטודה בינונית עם מחזור עבודה של 50%).
   2. במקרה של איברי עכבר, הומוגניזציה של ההשעיה באמצעות הומוגנייזר חשמלי (החל מכוח נמוך, ולאט לאט מאיץ לכוח בינוני) תוך שמירה על הדגימה על קרח. שטפו באופן קבוע את ההומוגנייזר החשמלי ב-PBS כדי להסיר כל חומר אורגני שסותם את המכשיר.
   3. קח 20 μL מתוך הדגימות ובדוק תחת המיקרוסקופ אם התאים של הרקמה ההומוגנית נהרסים כראוי; אחרת, חזור על ההומוגניות.
2. צנטריפוגה את הצינורות בצנטריפוגה שולחנית ב 10,000 x g במשך 30 דקות ב 4 °C (64 °F).
   הערה: לחלופין, צנטריפוגה על ה-supernatant בפעם השנייה ב-20,000 x g למשך 30 דקות ב-4 °C כדי למנוע שברים קטנים של הכדור הראשוני שאולי הועבר. פעולה זו תפשט את הסינון הבא בשלב 2.3.
3. אספו את חומר העל בצינור טרי והניחו אותו על קרח. מסננים ברצף את ה-supernatant באמצעות יחידות מסנן מזרקים של 0.45 μm ו-0.22 μm. Aliquot את supernatant לתוך 10 מ"ל אצוות ולהקפיא אותם ב -20 °C (76 °F) לאחסון לטווח קצר או ב -80 °C (80 °F) לאחסון ארוך יותר.
   הערה: סינון מקדים עם 0.45 מיקרומטר מסיר את רוב החלקיקים לפני ששלב סינון שני עם 0.22 מיקרומטר מסיר את החלקיקים העדינים יותר. שימוש ישיר במסנן 0.22 מיקרומטר עלול לגרום לסיכון של סתימת המסננים.
4. הכן דגימת 50 μL לניתוח SDS-PAGE/כתם מערבי על-ידי הוספת 10 μL של מאגר דגימות SDS 5x (ראה טבלה 1) ל- 40 μL של הסופרנאטנט, ולאחר מכן הרתחה ב- 95 °C למשך 10 דקות.
   1. לחלופין, יש לבצע החייאה בכ-100 μL של גלולה המתקבלת בשלב 2.2 ב-900 μL של ddH₂O, ולהכין דגימה לניתוח SDS-PAGE/כתם מערבי כמתואר לעיל.
      הערה: הכללת דגימות שמקורן בכדור בניתוח הכתמים המערבי, בנוסף לבקרה החיובית, תציין אם הביטוי של החלבון נמוך, או שהנוגדן בעייתי.

3. SDS-PAGE וניתוח כתמים מערביים

הערה: נדרש ניתוח כתם מערבי כדי לבדוק אם יש מסיסות חלבונים. להלן תיאור פרוטוקול להדבקת חשמל, תוך שימוש במערכת כתם רטובה/מיכלית (ראו טבלת חומרים). פרוטוקול חלופי עבור SDS-PAGE ניתן למצוא במקום אחר¹⁹.

1. הכינו ג'ל פוליאקרילאמיד SDS-PAGE רציף של 12.5% על פי הוראות היצרן (כלומר, ג'ל ערימה על גבי ג'ל רזולוציה; ראו טבלה 1). הפעל את הדגימות שהוכנו בעבר במהלך שלב 2 (בדומה לשלבים 4, 5 ו- 6; ראה להלן).
   1. טענו סולם סמן חלבון לבאר הראשונה (ראו טבלת חומרים). טען 5 ננוגרם של חלבון רקומביננטי hFAHD1 (המתקבל מחיידקים¹²; ראה טבלה 1) כבקרה חיובית לבאר השנייה.
   2. לאחר מכן, טען 20 μL של הדגימה לניתוח, ומלא את כל הבארות הנותרות ב- 20 μL של מאגר דגימות SDS-PAGE 1x מוכן (כלומר, 5x מאגר דגימה מדולל עם ddH₂O). הפעל את הג'לים של SDS-PAGE ב- 125 V באמצעות מאגר הריצה של SDS (ראה טבלה 1).
2. לאחר השלמת SDS-PAGE, בצע ניתוח כתם מערבי ובדוק את הממברנות באמצעות הנוגדן הזמין שהועלה כנגד FAHD1 (ראה טבלה 1).
   הערה: מכיוון שהדגימות נלקחות מרקמה גולמית הומוגנטית, בדרך כלל איכות ה- SDS-PAGE וניתוח הכתמים המערבי בשלב זה נפגעת; עם זאת, חשוב לבדוק אם החלבון למיצוי מסיס בסופרנטנט. הפרוטוקול הבא נבדק לאיתור כליות חזירים, ואיברי עכבר שונים, כולל כבד, לב, מוח וכליות.
   1. הכינו את מאגר העברת הכתמים המערבי פי 10 (ראו טבלה 1). הכינו את מאגר העברת הכתמים המערבי 1x (ראו טבלה 1) וקררו אותו ל-4 מעלות צלזיוס.
   2. הפעל קרום PVDF במשך 2 דקות במתנול. לשטוף את הממברנה ב ddH₂O במשך 2 דקות. שיווי משקל הממברנה במשך 15 דקות במאגר העברת כתמים מערבי אחד.
   3. שטפו את ה-SDS-gel עם 1x PBS למשך 10 דקות תוך כדי רעד כדי להסיר את המאגר הפועל על ידי SDS, ולאחר מכן דגירו את הג'ל ב-1x חיץ העברת כתמים מערבי למשך 10 דקות לשיווי משקל. הרכיבו את קלטת האלקטרובלוט (כלומר, שילוב של ממברנת PVDF מופעלת וג'לים) על פי הוראות היצרן.
   4. הפעל את הכתם באמצעות כתם חשמלי ב 300 mA במשך שעה אחת בקופסת קצף פוליסטירן מלאה בקרח או בחדר הקר (4 מעלות צלזיוס). העבר את קרום ה- PVDF לצינור של 50 מ"ל כאשר צדו החשוף פונה לצד הפנימי של הצינור. דגירה של הממברנה ב-20 מ"ל של חיץ חוסם כתם מערבי (ראו טבלה 1) למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס תוך כדי גלגול על גליל צינור (ראו טבלת חומרים).
   5. למחרת, לשטוף את הממברנה במשך 5 דקות עם 20 מ"ל של חיץ שטיפת כתמים מערבי (PBS עם 0.1% (v/v) Tween 20) באותו צינור תוך כדי גלגול. דגירה של הממברנה באותו צינור עם הנוגדן העיקרי² (המכוון ל-FAHD1; ראו טבלה 1) מדולל ב-1:500 ב-1:500 ב-10:500 בחיץ החוסם של הכתם המערבי למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר בזמן הגלגול.
   6. שטפו את הממברנה באותו צינור שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחת עם 20 מ"ל של חיץ שטיפת כתם מערבי בזמן גלגול. דגירה של הממברנה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם נוגדן משני מצומד HRP (ראה טבלת חומרים) מדולל 1:3000 ב-5 מ"ל של חיץ חסימת כתמים מערבי.
   7. שטפו את הממברנה באותו צינור שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחת עם 20 מ"ל של חיץ שטיפת כתמים מערבי ופעמיים במשך 5 דקות כל אחת עם 1x PBS. מייבשים את הממברנה על ידי החזקתה בזהירות עם פינצטה בקצה אחד, ועל ידי נגיעה בפיסת תאית או בפיסת נייר ווטמן עם הקצה הנגדי (התחתון) של הממברנה. שים את הממברנה (צד חשוף למעלה) על צלחת זכוכית מנוקה.
   8. בזהירות לכסות את כל הממברנה עם 1 מ"ל של מצע כתם מערבי ECL מוכן באמצעות פיפטה, תוך הקפדה לא ליצור שום בועות אוויר. תנו לתמיסת ה-ECL לחדור למשך 3 דקות, ומיד לפתח את הממברנה באמצעות סרט רנטגן או באמצעות מערכת הדמיה.
      הערה: אם החלבון זוהה באף אחת מהדגימות אלא רק בבקרה החיובית, הדבר עשוי להצביע על כך שהחלבון אינו מסיס, או שאינו קיים בכמויות מספיקות כדי שיזוהו על ידי הנוגדן. אם רק ננוגרמות של הבקרה החיובית היו נטענות, התרחיש הראשון סביר יותר. אם לא זוהה חלבון כלל, בדקו את איכות הנוגדן, ואולי עברו לנוגדן פוליקלונלי ולא לנוגדן חד שבטי. במקרים נדירים, כלומר, עבור חלבונים הידרופוביים מסוימים, החלבון עשוי להיות ניתן לזיהוי לאחר צנטריפוגה, אך לא לאחר סינון. במקרה כזה, מומלץ להשתמש ביחידות סינון מיוחדות לחלבונים הידרופוביים.
3. לחלופין, הכתימו את ממברנות ה-PVDF לאחר הכתם המערבי כדי לשלוט בהעברה המוצלחת של החלבון מהג'ל SDS-PAGE לממברנת ה-PVDF.
   הערה: צביעת Coomassie מומלצת לפתרון בעיות, פיתוח שיטה ותיעוד, אך יש לזכור כי לאחר החלת פרוטוקול זה, הממברנות הולכות לאיבוד לניתוח נוסף של כתמים מערביים. צביעת Ponceau S מעניקה צביעה חלשה יותר, אך ניתן להשתמש בה אם יש לחקור מחדש את הממברנות.
   1. הכינו מגשים קטנים המכילים את הכתם (Coomassie או Ponceau S) ואת תמיסות ההכתמה.
   2. באמצעות פינצטה, מכניסים את הממברנה לתמיסת הכתם ומנערים בעדינות עד שהממברנה מוכתמת היטב (5-10 דקות).
   3. מעבירים את הממברנה לתוך התמיסה המפרקת ומטלטלים עד שהתמיסה רוויה (5-10 דקות). חזור על שלב ההסרה עד שניתן יהיה לראות את רצועות החלבון על הממברנה; אם לא נצפו רצועות כלל, חזור על הכתם עם זמן דגירה ארוך יותר. מייבשים את הממברנה על ידי הנחתה על צלחת זכוכית באמצעות פינצטה.

4. בדיקה: משקעי אמוניום סולפט

הערה: משקעי אמוניום סולפט הם שיטה לטיהור חלבונים על ידי שינוי המסיסות של החלבון. בניסוי ראשוני, ריכוז האמוניום גופרתי גדל ברצף לערך המזרז כמות מקסימלית של מזהמי חלבון, תוך השארת FAHD1 בתמיסה. המסיסות של החלבון נבדקת שוב באמצעות ניתוח כתמים מערבי.

1. המשך משלב 2.3: או להפשיר את הדגימה או להמשיך ישירות לאחר מיצוי החלבון (כלומר, מבלי להקפיא את הדגימה). סנן את הדגימה באמצעות יחידת מסנן של 0.22 מיקרומטר כדי לא לכלול משקעים אפשריים לאחר ההפשרה. מכינים שישה צינורות של 1.5 מ"ל על קרח, ומעבירים 250 μL של דגימה לכל צינור.
2. מכינים סדרת דילול של 5%, 10%, 15%, 20%, 25% ו-30% אמוניום סולפט בצינורות שהוכנו למעלה, ומרכיבים את הנפח הסופי ל-1000 מיקרול' עם מאגר ליזה של חלבון. דגירה של הדגימות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה על מסובב צינור (ראו טבלת חומרים).
3. באמצעות צנטריפוגה שולחנית, צנטריפוגה ב 10,000 x g במשך 30 דקות ב 4 °C (64 °F) ולהעביר בזהירות את כל supernatants לתוך צינורות נפרדים. מייבשים את הכדורים המתקבלים באוויר ומחזרים כל אחד מהם ב-1000 מיקרול' של ddH₂O.
4. עבור כל זוג של כדוריות וסופרנטנטים שעברו שימוש חוזר מהשלב הקודם, יש לערבב 40 μL עם 10 μL של 5x μL של מאגר דגימת SDS 5x ולרתוח ב-95 °C עם מכסים פתוחים עד שרוב הנוזל התאדה. לאחר מכן, יש לבצע החייאה של הכדור בתערובת של 50% DMSO ב-ddH₂O.
5. בצע SDS-PAGE (שלב 3) אך הפעל את הג'לים ב- 80 וולט במשך 3 שעות. עבור כל ריכוז של אמוניום גופרתי, טענו את הדגימות שמקורן בכדורית ההחייאה ובסופרנטנט (שלב 4.3) בזוגות. בצע ניתוח כתם מערבי (שלב 3).
6. בדוק את הריכוז הגבוה ביותר של אמוניום סולפט, שבו החלבון שיש לטהר (כלומר, FAHD1) נשאר בדגימה שמקורה בסופרנטנט. בהתבסס על התוצאות, הגדר פרוטוקול משקעים אמוניום סולפט עבור החלבון המעניין, שישמש בניסויים עתידיים.
   הערה: אמוניום סולפט ידוע כמעוות את SDS-PAGE ואת הכתם המערבי. ככל שריכוז האמוניום סולפט עולה, איכות ניתוח הכתמים המערבי תיפגע. עם זאת, כמו בשלב 3 בעבר, ניתוח זה משמש לבדיקת המסיסות של החלבון המעניין בריכוזים נתונים של אמוניום סולפט. פרוטוקול זה נועד לזרז חלבונים אחרים, בעוד שהחלבון שיש לטהר חייב להישאר מסיס.

5. בדיקה: כרומטוגרפיית החלפה יונית עם FPLC

הערה: מולקולות עם קבוצות פונקציונליות טעונות קשורות לעמודת חלקיקי סיליקה עבור FPLC, מה שמאפשר התמיינות של חלבונים בהתאם למטען פני השטח שלהם. בצע שלב זה פעמיים, באמצעות עמודת ההחלפה הקטיונית ועמודת ההחלפה האניונית (ראה טבלת חומרים). שלבי הפרוטוקול זהים עבור כרומטוגרפיית החלפה קטיונית או אניונית, אך המאגרים שיש להשתמש בהם שונים (ראו טבלה 1); שניהם עם "מלח נמוך" 15 mM NaCl ו "מלח גבוה" 1 M NaCl תנאים. עבור העמודות שבהן נעשה שימוש, מומלץ קצב זרימה של 1 מ"ל/דקה.

1. הגדר את מערכת FPLC עם עמודת החליפין האניונית או הקטיונית. שטפו את העמודה עם 5 נפחי עמודים (CVs) של 20% EtOH (ב-H₂O), ואחריהם 5 קורות חיים של ddH₂O. לחלופין, שטפו את העמודה עם 1 CV של מאגר מלח נמוך, מאגר מלח גבוה, ושוב מאגר מלח נמוך בסדר עד שלא נצפו יותר פסגות בכרומטוגרמה, אלא שטפו לפחות פעם אחת.
2. לאחר קביעת הפרוטוקול האופטימלי למשקעי אמוניום סולפט בקנה מידה קטן (שלב 4), החל את פרוטוקול המשקעים על 10 מ"ל של רקמה מקורית הומוגנטית (שלב 2). לחלופין, יש להזין את הדגימה כנגד מאגר המלח הנמוך.
   1. החל את הדגימה על העמודה (למשל, בזריקה או באמצעות משאבת דגימה) ואסוף את הזרימה החוצה. שטפו את העמודה עם 1 קורות חיים של מאגר המלח הנמוך.
3. הגדר אלוטציה הדרגתית ליניארית מ-100% מאגר מלח נמוך/ 0% מאגר מלח גבוה ל-0% מאגר מלח נמוך/100% מאגר מלח גבוה בתוך 3 קורות חיים. לאחר סיום השיפוע, המשיכו לפעול עם מאגר המלח הגבוה עד שלא יזוהו עוד פסגות הקשורות לחלבון (ספיגת UV ב-280/255 ננומטר) בכרומטוגרמה בטווח של 1 CV.
4. יש למרוח 1 מ"ל של 25% SDS מומס ב-0.5 M NaOH (ב-ddH₂O) כדי לנקות את העמודה. ברצף, שטפו את העמודה עם 3 קורות חיים של ddH₂O ו-3 קורות חיים של 20% EtOH (ב-ddH₂O).
5. אסוף דגימות SDS-PAGE של כל שברי השיא והזרימה-דרך, ובדוק אותן באמצעות כתם מערבי לנוכחות החלבון המעניין (שלב 3). הקפיאו את השברים שנאספו בחנקן נוזלי ואחסנו אותם בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
6. לאחר השלמת ניתוח הכתמים המערביים, הפשירו ואגדו את השברים המכילים את החלבון בעל העניין והשליכו את האחרים. חזור על שלבים 5.1-5.5 עם העמודה החלופית (כלומר, עמודת החליפין הקטיונית או האניונית).
7. לאחר ששתי העמודות נבדקו, הגדר פרוטוקול FPLC לחלבון המעניין, שישמש בניסויים עתידיים. הפחיתו את נפח תמיסת החלבון באמצעות יחידות מסנן אולטרה-צנטריפוגה (10 kDa, ראו טבלת חומרים) עד ל-2 מ"ל.
   הערה: ישנן שתי תוצאות צפויות של סדרת ניסויים זו. או שהחלבון המעניין נקשר לאחד העמודים, ותמיסת החלבון כבר טהורה למדי לאחר האלוטציה, או שהחלבון נשאר בזרימה בשני המקרים. בתרחיש האחרון, למרות שהחלבון נמצא בזרימה- דרך, אפקט הניקוי של שלב זה עדיין עשוי להיות משמעותי. במקרה כזה, כמו עבור FAHD1 בכליות חזירים וכבד עכבר, שלב זה של חילופי יונית עדיין יבוצע. אם עמודת ההחלפה הקטיונית או האניונית אינה יכולה לספק אפקט ניקוי תקין, ניתן לנסות לשנות את ה- pH של ה- lysate וה- buffer, וכדי לבצע דיאליזציה של הדגימה כנגד מאגר הריצה לפני היישום ל- FPLC.

6. מיצוי חלבונים באמצעות תת-פרוטוקולים מוגדרים עבור אמוניום סולפט-משקעים ו-FPLC

הערה: חלקיקים נקבוביים בעמודת ג'ל סיליקה עבור FPLC (ראה טבלת חומרים) מאפשרים הבחנה של חלבונים בהתאם לרדיוס ההידרודינמי שלהם. השלבים המתוארים יבוצעו באמצעות מערכת FPLC, באמצעות כרומטוגרפיית אי הכללת גודל (SEC). עבור העמודה SEC שבה נעשה שימוש (ראה טבלת חומרים), מומלץ קצב זרימה של 0.3 מ"ל/דקה.

1. הכינו את כל החומרים הנדרשים (ראו שלב 1) והוציאו את סך החלבון מהרקמה (ראו שלב 2). בצע משקעי אמוניום סולפט עם כל הרקמה הומוגנטית שלא שימשה לבדיקה (ראה שלב 4). עבור נפחים גדולים יותר, רכזו את הליזאט באמצעות יחידות מסנן אולטרה-צנטריפוגה (10 kDa; ראו טבלת חומרים) עד לנפח קטן יותר של 50 מ"ל או פחות.
2. בצע שלב טיהור ראשון באמצעות כרומטוגרפיית החלפה יונית (ראה שלב 5).
   1. הכינו דוגמאות לכתם מערבי, כפי שתואר בשלבים הקודמים. בצע ניתוח כתמים מערביים ואגד את כל FAHD1 המכיל שברים מכרומטוגרפיית חילופי יונית.
   2. הפחיתו את נפח תמיסת החלבון עד ל-2 מ"ל באמצעות יחידות מסנן אולטרה-צנטריפוגה (10 kDa). סנן ברצף את התמיסה עם יחידות מסנן מזרקים של 0.45 מיקרומטר ו-0.22 מיקרומטר כדי להסיר כל מיקרו-משקעים.
3. אזן את עמודת ה- SEC עם 1 CV של מאגר הריצה של SEC (ראה טבלה 1), המכיל 1 mM DTT. טען את הדגימה על העמודה והפעל את הכרומטוגרפיה עד שכל החלבונים יתרוקנו (1-2 CV).
   1. אסוף שברים של 1 מ"ל של הזרימה-דרך המתאימה לשיאים משמעותיים בכרומטוגרמה (ספיגת UV ב-280/255 ננומטר) והכן דגימות של 50 μL של כל שבר שנאסף עבור SDS-PAGE וניתוח כתמים מערביים, כפי שתואר בשלבים הקודמים. הקפיאו את כל השברים באמצעות חנקן נוזלי, ואחסנו אותם בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
4. שטפו ברציפות את עמודת ה-SEC עם 1 קורות חיים של ddH₂O ו-1 CV של 20% EtOH (ב-ddH₂O). בצע ניתוח של כתם מערבי, ואגד את כל השברים המכילים FAHD1 המכילים. הפחיתו את נפח תמיסת החלבון ל-2 מ"ל באמצעות יחידות מסנן אולטרה-צנטריפוגה (10 kDa, ראו טבלת חומרים).
5. הערך את ריכוז החלבון באמצעות ערכת בדיקת BCA מסחרית (ראה טבלת חומרים).
   הערה: תכולת ה-pH והמלח של הפאזה הניידת עשויים להשפיע על פרופיל ההתרוממות של חלבונים כדוריים²⁰. תנאים חומציים או בסיסיים עשויים לגרום לשיאים להיות פחות מוגדרים ולהגביר את האינטראקציות בין חלבונים למטריצות שיובילו לשמירה חלקית של חלבון בעמודה²⁰. השפעה זו עשויה להיות מנוצלת להמשך טיהור חלבונים. חזרה על שלב 6 עם קצבי זרימה, pH וריכוזי מלח שונים עשויה לשפר את טוהר החלבון²⁰.

7. צביעת כסף

הערה: ניתוח צביעת כסף של ג'לים SDS-PAGE נדרש כדי לבדוק אם יש זיהומים חלבוניים שייתכן שלא ניתן לראות עם צביעת Coomassie. הפרוטוקול הבא הוא אחד מבין גרסאות רבות שניתן למצוא בספרות²¹. בצע את כל שלבי הדגירה על ידי רעד במגש זכוכית נקי. אספו את כל הנוזלים המכילים כסף ופורמלדהיד במיכל פסולת מיוחד והשליכו אותם כראוי.

1. דגירו את הג'לים של SDS-PAGE בתמיסת תיקון כתמי כסף (ראו טבלה 1) למשך הלילה בחדר הקר. דגירו את הג'לים בתמיסת דגירה מכתים כסופה (ראו טבלה 1) למשך 3 שעות בטמפרטורת החדר. לחלופין, הוסף גלוטארלדהיד (ראה טבלה 1) כדי לשפר את הזיהוי של רצועות קלושות. יש לשטוף את הג'לים ארבע פעמים ב-ddH₂O למשך 10 דקות כל אחד.
2. דגירו את הג'לים בתמיסת כסף מכתים כסופה (ראו טבלה 1) למשך שעה אחת.
   הערה: שימו לב שמעכשיו כל הנוזלים והג'ל עצמו מכילים כסף ופורמלדהיד שהם רעילים.
3. דגירו את הג'לים בתמיסת מפתחי כתמי כסף (ראו טבלה 1) תוך רעד נמרץ עד שהפסים נראים בבירור. כדי לעצור את התגובה, יש להשליך את תמיסת המפתחים ולדגום מיד את הג'לים בתמיסת עצירת צביעת כסף (ראו טבלה 1) למשך 10 דקות לפחות.
   הערה: רצועות מוכתמות בשלבים 7.2 ו- 7.3 יהפכו כל הזמן מפותחות יותר. הוספת יותר פורמלדהיד לפתרון ממה שצוין עשויה להיות נחוצה אם הכתם חלש.

חלבון FAHD1 הופק מתוך כבד הכליה והעכבר של חזירים באמצעות הפרוטוקול שהוצג. עבור רקמת עכבר, נדרשים מספר איברים כדי להשיג מספר מיקרוגרם לאחר שלב הטיהור הסופי. מסיבה זו, מאמר זה מתמקד במיצוי של FAHD1 מכליות חזירים, שהוא ניסוי הרבה יותר למופת. הפקת FAHD1 מכבד העכבר מבוצעת כדי להציג את הקשיים ואת המלכודות האפשריות של פרוטוקול זה. מומלץ בדרך כלל להשתמש באיברים המראים רמת ביטוי גבוהה של החלבון שרוצים לטהר. אטלס החלבון האנושי²² עשוי להועיל בהערכת הביטוי במערכת המודל, או לבצע ניסויים ראשוניים של כתם מערבי עם ליזטים שונים של רקמות גולמיות כדי להעריך רמות אלה. הבקרה החיובית ששימשה בכל ניתוחי הכתמים המערביים הייתה חלבון רקומביננטי מתויג, הפועל במשקל מולקולרי מעט גבוה יותר.

כניסוי ראשון, מוצגת מיצוי של FAHD1 מכליית החזירים. התהליך של הומוגניזציה של רקמות (שלב 1) ומיצוי החלבון הכולל (שלב 2) מוצג באיור משלים 1 (ראו את המקרא לתיאור השלבים הבודדים). עשירית מהליזאט הכולל שימשה לניסויים הבאים.

משקעי אמוניום סולפט נבדקו פעם אחת עבור הליזט הזה, על ידי הוספת אמוניום סולפט לליזאט בריכוזים שונים (שלב 4) (איור 2). לאחר צנטריפוגה, כדורים וסופרנאטורים נדגמו ונותחו עם כתם מערבי באמצעות נוגדן פוליקלונלי מוגדר² שהועלה נגד FAHD1 אנושי. 200 ng של רקומביננטי His/S מתויג FAHD1 אנושי שהושג מ - E. coli¹² נטען כבקרה חיובית. ניתן לראות את רצועת החלבון FAHD1 ב-25 kDa, בעוד שהבקרה החיובית המתויגת פועלת ב-34 kDa. בהתבסס על נתונים אלה, הוגדר פרוטוקול שבו הליזאט מטופל ב-25% אמוניום גופרתי, כלומר תנאים שבהם FAHD1 עדיין נמצא בסופרנאטנט, בעוד שרוב החלבונים האחרים מואצים. זהו צעד גדול באסטרטגיית הטיהור. משקעי אמוניום סולפט הם שלב ניקוי יעיל לפני שממשיכים בשיטות אחרות. יש לציין כי לא ייעשה שימוש בכמויות של אמוניום סולפט הגבוהות מ-30%, מכיוון שאמוניום גופרתי מעוות בהדרגה את איכות ה-SDS-PAGE ואת הכתם המערבי.

איור 2: משקעי אמוניום סולפט ובדיקת כתמים מערבית לחזירי FAHD1. (A) אמוניום סולפט נוסף לליזאט בריכוזים שונים (5% עד 25% מקסימום) כדי לזרז חלבונים מהתמיסה. (B) נוכחותם של החזירים FAHD1 (25 kDa) נקבעה בזוגות הבודדים של כדוריות וסופרנאטנטים המתאימים לריכוזי אמוניום גופרתיים משתנים באמצעות כתם מערבי באמצעות נוגדן פוליקלונלי שהועלה נגד FAHD1 אנושי. הסופרנאטנט המתאים ל-25% משקעי אמוניום סולפט עדיין מראה את נוכחותם של חזירי FAHD1 בסופרנאטנט, ובמקביל מזרז כמות טובה של חלבונים אחרים. 200 ננוגרם של חלבון רקומביננטי שתויג כ-His/S הועמסו כבקרה חיובית (34 kDa). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

לאחר בדיקת עמודות חילופי יוניות עם FPLC, הוגדרה אסטרטגיה שבה החזיר FAHD1 נשאר בזרימה-דרך של כרומטוגרפיית חילופי אניונים ב- pH 9 (שלב 5). החל מליזאט שהושג על ידי משקעי אמוניום סולפט בשיעור של 25% (כפי שהוגדר על ידי ניסויי בדיקה קודמים), כרומטוגרפיית חילופי אניונים שימשה לחיסול חלבונים נוספים מהתמיסה (איור 3A). חלבוני הקשירה הוסרו על ידי אלוטציה מהעמודה, בעוד שהזרימה-דרך טוהרה עוד יותר באמצעות SEC ב-pH 7.4 (איור 3B). לאחר שני השלבים, ניתוח הכתמים המערבי זיהה את כל השברים שהכילו את החזירים FAHD1, שרוכזו והתרכזו ל-2 מ"ל.

איור 3: טיהור של חזירים FAHD1 עם FPLC - חלק 1. חצים אדומים בכרומטוגרמה וכתמים מצביעים על נוכחות של FAHD1. בכרומטוגרמה, "UV" מציין את ספיגת ה- UV ב- 280 ננומטר, "Cond" מציין את המוליכות (הקשורה לריכוז המלח במאגר), ו- "Conc B" מציין את אחוז מאגר המלח הגבוה בשיפוע החיץ (0% מאגר מלח נמוך טהור; 100% מאגר מלח גבוה טהור). (A) טיהור של חזירי FAHD1 מליזאט המתקבל על ידי משקעי אמוניום סולפט בשיעור של 25% עם עמודת חילופי אניונית (FPLC). בעוד שחלבונים רבים נקשרים לעמודה, החזיר FAHD1 נמצא בזרימה החוצה. לכלוך ומזהמים שאינם חלבוניים מוסרים על ידי אלוטציה מהעמודה, בעוד שהזרימה-דרך מעובדת עוד יותר. (B) זרימה-דרך מהכרומטוגרפיה הקודמת של חילופי האניונים ב-(A) מטוהרת עוד יותר באמצעות כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל (FPLC) ב-pH 7.4. (א,ב) ניתוח כתמים מערביים (כתמים חתוכים בתחתית) זיהה שברים המכילים חזירים FAHD1, המאוגדים ומרוכזים. הכתמים המלאים מתארים את הממברנה המוכתמת בקומאסי לאחר ניתוח כתמים מערבי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

הדגימה המסוננת הוחלה שוב על SEC אך בתנאי מאגר ב-pH 9 (ראו טבלה 1) (איור 4). הרציונל מאחורי גישה זו הוא שתכולת ה-pH והמלח של הפאזה הניידת עשויים להשפיע על פרופיל האלוטיון של חלבונים כדוריים²⁰, ופרופיל אלוטיון משופר עבור FAHD1 נמצא בתנאי חיץ אלה. חלק אחד הכיל חלבון בעל רמות טוהר נאותות לפעילות בסיסית של אנזים¹² כדי לאשר סופית את זהות החלבון.

איור 4: טיהור החזירים FAHD1 עם FPLC - חלק 2. חצים אדומים בכרומטוגרמה וכתמים מצביעים על נוכחות של FAHD1. דגימות חלבונים שטוהרו בעבר באמצעות חילופי אניונים וכרומטוגרפיית הרחקת גודל מטוהרות עוד יותר באמצעות כרומטוגרפיית הרחקת גודל (FPLC) ב- pH 9 (הפאנל העליון). ניתוח כתמים מערבי המתואר בפינה הימנית התחתונה מזהה שברים המכילים FAHD1 חזירים, המאוגדים ומרוכזים (לוחות תחתונים). הכתם בפינה השמאלית התחתונה מראה את צביעת Coomassie של הממברנה לאחר הכתם המערבי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

אסטרטגיה חלופית (כלומר, SEC ואחריה כרומטוגרפיית חילופי יונית) נבחנה עם 2 מ"ל של הליזאט שהתקבל לאחר משקעי אמוניום סולפט (שלב 4) (איור משלים 2). הרציונל לניסוי זה הוא שעל ידי שימוש ראשוני ב-SEC, ניתן להפריד את השברים המכילים FAHD1 מרוב החלבונים האחרים, בעוד שכרומטוגרפיית חילופי יונית עוקבת עשויה לשמש לטיהור נוסף של החלבון. ראשית, הליזאט היה מפוצל באמצעות SEC ב-pH 7.4 (שלב 6). ניתוח כתמים מערביים זיהה את כל השברים שהכילו חזירים FAHD1. שנית, שברים אלה רוכזו וטוהרו עוד יותר באמצעות עמודת חילופי אניונים בעמ' 9 (שלב 5). הכרומטוגרמות וניתוח הכתמים המערביים (איור משלים 2) מראים שאסטרטגיה זו מעודדת מכיוון שכרומטוגרמה החליפין היוני מראה שיא צר מוגדר הקשור לרמות חלבון מועשרות בכתם המערבי. עם זאת, החיסרון של אסטרטגיה זו היא כי היא מוגבלת על ידי נפח ראשוני להיות מיושם על ה- SEC (2 mL), ולכן התפוקה של שיטה זו היא נמוכה מאוד. עיבוד כליה חזירית שלמה, למשל, אינו מעשי.

כשינוי נוסף בפרוטוקול זה, עמודת חילופי קטיונים נכללה לפני עמודת החליפין האניונית כאשר החזיר FAHD1 היה נוכח גם בזרימה-דרך. בכל שלב של הפרוטוקול, דגימות של החזיר FAHD1 המכיל שברים נדגמו ונבדקו באמצעות בדיקת ODx, כפי שתואר במקום אחר¹² (איור משלים 3). הפעילות האנזימטית הספציפית עולה יחד עם רמת הטוהר, כלומר, יחד עם הכמות היחסית ההולכת וגדלה של FAHD1 לכל סך החלבון.

כדוגמה שנייה, מוצגת מיצוי של FAHD1 מכבד עכברים, כלומר אוסף של רקמת כבד המתקבלת מ -20 עכברים. בהשוואה למיצוי של FAHD1 מכליית החזירים שהוצגה לעיל, מיצוי זה התגלה כמייגע יותר. בעיות נתקלו בכמה שלבים של הפרוטוקול, אשר יוצגו להלן. סך החלבון הופק כמתואר בשלב 2 (איור משלים 4). מכיוון שהומוגנט של כבד עכברים נוטה להיות ישות דביקה ורזה מאוד, נעשה שימוש בניירות פילטר (בדומה ליחידות מסנן קפה) כדי לסנן מראש את הליזאט, שדולל ביחס של 1:3 במאגר ליזה לאחר המיצוי, כדי להפוך את התמיסה לדומה יותר לנוזל. דילול זה שיפר את הליך הסינון; עם זאת, זה הפך את הזיהוי הבא של החלבון עם כתם מערבי למייגע יותר. לאחר הסינון, היה צורך לרכז את הליזאט המוכן לפני השימוש הנוסף. עשירית מהליזאט הכולל שימשה לניסויים הבאים.

שלב בדיקה ראשון של משקעי אמוניום סולפט (איור משלים 4I) הראה בעיה אפשרית שעשויה להיתקל בה. אמוניום סולפט בריכוזים גבוהים יותר משבש את הג'לים של SDS-PAGE וגורם לאפקט חיוך כאשר הוא מופעל ב-150 וולט (איור משלים 5A; תוצאה שלילית). אותה ריצת SDS-PAGE ב-80 וולט מציגה תוצאה חיובית (איור משלים 5B). במקרה האחרון, אפקט החיוך נוצר בתחילה אך בסופו של דבר נפתר בגלל המתח הנמוך המופעל. מכיוון שהיה צורך לדלל את התמיסה הראשונית בכבדות כדי להיות מסוגלת לתסיס את הליזאט, ניתוח הכתם המערבי הראשוני של דגימות אלה לא הצליח, כלומר, הבקרה החיובית זוהתה על ידי הנוגדן, אך לא על ידי החלבון בדגימות המיושמות. בעיה זו נפתרה באמצעות ריכוז גבוה יותר הן של הליסאט (המרוכז ביחידות סינון צנטריפוגליות) והן באמצעות הנוגדן, והן על ידי מריחת הנוגדן למשך הלילה בחדר הקר תוך כדי רעד. בסופו של דבר, ניתוח הכתמים המערבי סיפק הן את פיסות המידע על כך שהחלבון נמצא בליזאט, והן שהחלבון עדיין נמצא בסופרנט ב-15% אמוניום גופרתי (איור משלים 5C). יש לציין כי דגימות SDS שהכילו כמויות גבוהות יותר של אמוניום גופרתי (>15%) זירזו בזמן החימום והחלבון אבד. ניתן לראות זאת גם בכתם הקומאסי ובכתם המערבי (איור משלים 5C). השפעה זו לא נצפתה עבור הכליה החזירית, ולכן היא עשויה להיות ספציפית לרקמות.

לאחר משקעי אמוניום סולפט בשיעור של 15%, 10 מ"ל של ליזאט הוחלו על כרומטוגרפיית חילופים קטיוניים ב- pH 6.8. ניתוח כתמים מערביים הראה כי חלבון FAHD1 של העכבר נמצא בזרימה-דרך (איור 5A). נראה כי חלק החלבון הבוקע הוא מינורי; עם זאת, דוגמה זו מציגה השפעה משנית של כרומטוגרפיית חילופי יוני. בשלב זה של הפרוטוקול, ייתכן שהתמיסה עדיין תכיל תרכובות רבות שייתכן שאינן חלבוניות. כרומטוגרפיית חילופי יונית היא דרך מהירה וקלה להיפטר מזיהומים כאלה. בהתחשב בכך שביצוע כרומטוגרפיית החלפה יונית לוקח כמה שעות לביצוע (כולל כל שלבי הכביסה, הניסוי עצמו לוקח חצי שעה), הוא מספק שיטה פשוטה לניקוי הדגימה מזיהומים שאינם חלבונים.

איור 5: טיהור עכבר FAHD1 עם FPLC. חצים אדומים בכרומטוגרמה וכתמים מצביעים על נוכחות של FAHD1. (A) לאחר משקעי אמוניום סולפט בשיעור של 15%, הדגימה עברה צנטריפוגה, סוננה (0.22 מיקרומטר) והופעלה על עמודת החלפה קטיונית. ניתוח כתמים מערביים מראה כי החלבון נמצא בזרימה-דרך והכרומטוגרמה מראה כי לא הרבה מהחלבונים האחרים הוסרו בשלב זה. עם זאת, השוואת המראה והצמיגות של הקלט עם הזרימה-דרך מראה שהזרימה שנאספה היא הרבה יותר ברורה (לוח ימני המשווה קלט וזרימה-דרך). (B) הזרימה-דרך שנאספה מעמודת החליפין הקטיונית הופחתה ל-2 מ"ל באמצעות מסנני צנטריפוגה והוחלה על כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל בעמ' 7.4. (C) השברים המכילים FAHD1 רוכזו, רוכזו ויושמו על סבב שני של כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל בעמ' 9. (D) השברים המכילים FAHD1 רוכזו שוב והוחלו על SDS-PAGE עם צביעת כסף, כדי לראות את הזיהומים הנותרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

המדגם יושם גם על כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל ב-pH 7.4 (איור 5B). ניתוח כתמים מערביים הציג שברים המכילים את חלבון FAHD1 של העכבר, שרוכזו ורוכזו ל-2 מ"ל. תרכיז זה של 2 מ"ל הוקפא בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עם 10 μL של β-mercaptoethanol והופשר למחרת. נוצר משקע שסונן באמצעות יחידות מסנן מזרקים (0.22 מיקרומטר). דגימות עבור SDS-PAGE וניתוח כתמים מערביים נלקחו כדי להבטיח שחלבון FAHD1 של העכבר עדיין נמצא בתמיסה.

דגימות שהכילו את החלבון (מניתוח הכתמים המערבי) רוכזו, רוכזו באמצעות מסנני צנטריפוגה, והושמו על SDS-PAGE עם כתמי כסף כדי לראות את שארית הזיהומים (איור 5D). זה גילה כי תמיסת החלבון אינה טהורה במיוחד וכי גם כמויות החלבון שהתקבלו בשיטה זו מכבד העכברים לא היו גבוהות במיוחד (כמה מיקרוגרם בסך הכל כפי שנקבע באמצעות ערכת בדיקת BCA; ראו טבלת חומרים). תפוקת החלבון הייתה גבוהה בהרבה במקרה של FAHD1 חזירי (כ-1 מ"ג בשלב זה). רמת הטוהר של חלבון FAHD1 המופק מכליית החזירים היא כ-80% (נאמדת לאחר צביעת כסף; הנתונים לא מוצגים). טוהר זה עשוי להיות מוגבר עוד יותר באמצעות, למשל, כרומטוגרפיית זיקה באמצעות נוגדן מוגדר. מגבלות כאלה ואחרות של פרוטוקול זה יידונו בפירוט בהמשך.

טבלה 1.

איור משלים 1: מיצוי חלבון כולל מכליות חזירים. (A) רקמת הכליה נחתכה באמצעות אזמל על צלחת זכוכית מוכנה מנוקה כראוי שהונחה על קצף פוליסטירן כדי למנוע החלקה; (B) צינורות של 50 מ"ל המכילים 20 מ"ל של בופר ליזה קר כקרח עם מעכבי חלבון/פרוטאז מודגרים על קרח; (C) פיסות רקמת הכליה הוכנסו למאגר עד שהנפח הגיע לכ-30 מ"ל; (D) רקמת הכליה הומוגנית באמצעות אולטרסאונד (כלומר, סוניקציה); (E) הומוגנט גולמי היה צנטריפוגה בצנטריפוגה שולחנית במהירות בינונית במשך 30 דקות; (ו) מספר דגימות עובדו בו זמנית; (G) לאחר הצנטריפוגה הראשונה, הסופרנטנט הועבר לצינורות צנטריפוגה (בהשוואה ל-E), וצנטריפוגה במהירות גבוהה (10,000 x גרם) למשך 30 דקות; (H) שלב צנטריפוגה זה מניב כדור נוסף וסופרנטנט, המועבר לצינורות של 50 מ"ל; (I/J) הקדם-ליזאט מסונן ברצף על ידי יחידות מסנן של 0.45 מיקרומטר ו-0.2 מיקרומטר, מועבר לאצוות של 10 מ"ל, ומוקפא באופן קבוע עם חנקן נוזלי לאחסון לאחר מכן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. ניתוח כתמים מערביים משמש כדי לאמת את נוכחותו של החלבון בכל הדגימות (כדוריות, סופרנאטים, ליזאט מסונן). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 2: טיהור FAHD1 של חזירים עם FPLC; אסטרטגיה חלופית. חצים אדומים בכרומטוגרמה וכתמים מצביעים על נוכחות של FAHD1. (A) טיהור של FAHD1 חזירים מליזאט המתקבל על ידי משקעי אמוניום סולפט בשיעור של 25% עם כרומטוגרפיית הרחקת גודל (FPLC) בעמ' 7.4. ניתוח כתמים מערביים זיהה שברים המכילים חזירים FAHD1, שהיו מאוגדים ומרוכזים. (B) דגימות חלבון שטוהרו בעבר באמצעות כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל (לוח A) טוהרו עוד יותר באמצעות כרומטוגרפיית חילופי אניונים (FPLC). ניתוח כתמים מערביים מזהה שברים המכילים חזירים FAHD1, שהיו מאוגדים ומרוכזים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 3: פעילות אנזימים ספציפית של חזירי FAHD1. מדדו פעילות אנזימים ספציפית כפונקציה של העלאת רמת הטוהר. הטבלה משווה את פעילות האנזים היחסית (nmol/min) עם פעילות אנזים ספציפית (μmol/min/mg). הבדיקה מראה פעילות גוברת כל הזמן של החזירים FAHD1 לאחר כל שלב טיהור. בהשוואה לרקומביננטי שלו/S-human FAHD1 (ירוק) המתקבל מ-E. coli. ¹², חזיר FAHD1 הראה פעילות מעט גבוהה יותר (אדום) (n = 3). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 4: מיצוי חלבון כולל מכבד עכברים. (א,ב,ג) רקמת כבד קפואה מ-20 עכברים ובופר ליזיס הוכנו על קרח בצינורות של 50 מ"ל; (D,E,F) רקמת הכבד הומוגנית באמצעות אולטרסאונד (כלומר, סוניקציה); הומוגנט גולמי היה צנטריפוגה בצנטריפוגה שולחנית במהירות בינונית במשך 30 דקות; הסופרנאטנט הועבר לצינורות צנטריפוגה, וצנטריפוגה במהירות גבוהה (10,000 x גרם) למשך 30 דקות; (G,H,I) הקדם-ליזאט מסונן ברצף על ידי מסנני נייר, יחידות מסנן של 0.45 מיקרומטר ו-0.2 מיקרומטר, מוצמד לאצוות של 10 מ"ל, ומקפוא באופן קבוע עם חנקן נוזלי לאחסון לאחר מכן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס; (J) אמוניום סולפט נוסף לליזאט בריכוזים שונים (5% עד 30% מקסימום) כדי לזרז חלבון מהתמיסה; (K) כדורים שהתקבלו לאחר משקעי אמוניום גופרתי (פאנל J) הוחזרו ב-H₂O כדי לקחת דגימות עבור SDS-PAGE וניתוח כתמים מערביים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 5: משקעי אמוניום סולפט ובדיקת כתמים מערבית עבור עכבר FAHD1. חצים אדומים בכתמים מציינים את נוכחותו של FAHD1. (A) SDS-PAGE עם דגימות שהתקבלו לאחר הפעלת משקעי אמוניום סולפט ב-125 V. ג'ל זה הציג אפקט חיוך דרסטי, ולא ניתן להעריך ג'ל כזה. זוהי דוגמה לתוצאה שלילית. (B) SDS-PAGE עם אותן דוגמאות (לוח A) הופעל ב-80 וולט עד להשלמתו. אין אפקט חיוך בג'ל זה, וזו דוגמה לתוצאה חיובית. (C) SDS PAGE וניתוח כתם מערבי של הדגימות המתקבלות לאחר משקעי אמוניום סולפט. דגימות בריכוזים גבוהים יותר של אמוניום גופרתי עשויות לזרז בתוך מאגר הדגימה, כפי שצוין. הם הולכים לאיבוד ולא ניתן לזהותם יותר, בין אם באמצעות צביעת Coomassie (משמאל) או ניתוח כתמים מערביים (מימין). הריכוז הטוב ביותר של אמוניום סולפט, במקרה זה, נקבע להיות 15%. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

שלבים קריטיים בפרוטוקול
הקפדה על הנחיות נפוצות לטיפול בחלבונים היא חיונית, כגון עבודה על קרח ובתנאים מתונים של pH ומלח. השימוש במעכבי פרוטאזות מועיל לשיטה, בעוד שהשימוש במעכבי פרוטאזום מומלץ מאוד. הקפאה והפשרה של הדגימה עלולות תמיד לגרום למשקעי חלבון (לפחות באופן חלקי), ולכן כל אליקוט מופשר של חלבון ליזאט ראשוני (שלב 2) צריך להיות מעובד באופן רציף ללא הפסקה. צנטריפוגה וסינון לאחר הפשרה מומלץ בדרך כלל כדי להסיר microprecipitation.

החלבון הראשוני lysate המתקבל מרקמה עדיין מכיל חומרים רבים מלבד חלבונים. ניתן להשתמש בעמודות כרומטוגרפיות של חילופי יוני כדי לנקות את הליסאט. גם אם החלבון שרוצים לחלץ אינו נקשר לעמודת החילוף היונית, הזרימה-דרך עשויה להיות הרבה יותר ברורה מתמיסת הקלט, וקלה יותר לעיבוד בשלבים הבאים. זה מוצג עבור מיצוי של FAHD1 מכליות עכברים (ראו איור 5A).

מגבלות ושינויים של השיטה
פרוטוקול זה מתאר פרוטוקול להפקת FAHD1 מהרקמה. בהתבסס על אסטרטגיה זו, ניתן להפיק גישה כללית להפקת חלבוני FAHD (FAHD1, FAHD2) מרקמה אחרת, בעוד שייתכן שיידרשו התאמות ספציפיות למקרים בודדים. המגבלה המשתמעת של שיטה זו היא רמות הביטוי היחסיות של FAHD1 (או חלבוני FAHD) ברקמה נתונה והזמינות של רקמה זו בכמויות נאותות. התוכנית הכוללת המתוארת בפרוטוקול זה דורשת ביטוי גבוה של החלבון בכמות מתאימה של רקמה מלכתחילה. דוגמאות למיצוי של FAHD1 מכליות חזירים וכבד עכברים סופקו, שהם שני איברים המראים רמות ביטוי גבוהות של החלבון. בכל שלב המתואר בפרוטוקול זה, קיים אובדן מרומז של דגימה, כלומר, הכמות הראשונית הנמוכה של החלבון פוחתת עוד יותר. בסופו של דבר, רק כמויות נמוכות של חלבון ניתן להשיג באמצעות פרוטוקול זה. מכיוון שכליית החזירים היא איבר גדול, ניתן להפיק כגרם חלבון (כ-80% טוהר; ההערכה) על ידי גישה זו משתי כליות. החלת אותו פרוטוקול על מיצוי FAHD1 מכבד עכברים דרשה איסוף דגימות כבד מ -20 עכברים, כדי להשיג רק כמה מיקרוגרם של חלבון בסופו של דבר. השגת טוהר גבוה יותר של החלבון בשיטות המתוארות עשויה להיות מייגעת, וצביעת כסף מגלה כי לאחר הכרומטוגרפיה של אי-הכללת הגודל עדיין עשויים להיות חלבונים רבים אחרים בתמיסה. אפשר להגדיל את הפרוטוקול הזה באמצעות כרומטוגרפיית זיקה (עמודות מופעלות NHS), באמצעות נוגדן חד שבטי (למשל, CAB025530).

כל הפרוטוקולים המפורטים כאן מחייבים שהחלבון שרוצים להפיק הוא מסיס. יש לבדוק ולהגדיר תנאים אופטימליים של משקעי אמוניום סולפט והתאמות pH/מלח לכרומטוגרפיה. במקרה שכרומטוגרפיית החליפין היונית אינה מספקת תוצאות טיהור טובות, דיאליזה נגד מאגר כרומטוגרפיה לפני ביצוע FPLC עשויה להיות אפשרות לשיפור מסיסות החלבון ועוצמת הכרומטוגרפיה. עם זאת, לא מומלץ לבצע דיאליזה של הליזאט הגולמי, שכן הדבר עלול להוביל למשקעי חלבון מסיביים ובלתי מבוקרים בתוך צינור הדיאליזה. בעיות עלולות להתרחש אם החלבון נוטה להיות הידרופובי, וייתכן שהפרוטוקולים לא יהיו ישימים אם החלבון הוא הידרופובי מאוד (למשל, חלבוני ממברנה). אם חלבוני FAHD אינם מסיסים בחלקם כפי שנמצא עבור FAHD2 (נתונים לא מוצגים) בליזט רקמה נתון, ניתן לחקור גם סוגים אחרים של כרומטוגרפיה, לדוגמה, כרומטוגרפיה של אינטראקציה הידרופובית (HIC)¹².

שני שינויים בפרוטוקול הסטנדרטי הוצגו בסעיף התוצאות. לצורך טיהור FAHD1 מכליית חזירים, נעשה שימוש בכרומטוגרפיית אי-הכללת גודל לפני כרומטוגרפיית החליפין היונית (ראו איור משלים 2). בעיה בשיטה זו היא שכרומטוגרפיית אי-הכללת גודל כוללת מסלולי ריצה גדולים יותר, ונפח המדגם גדל מאוד במהלך הריצה. נפח המדגם לא יעלה על 2% מנפח המיטה כדי להשיג רזולוציה גבוהה²³, וגורם הדילול הסופי תלוי גם בנפח האלוטציה שנאסף. בדוגמה שסופקה באמצעות עמודה של 120 מ"ל, מומלץ נפח ראשוני של 2 מ"ל. ניתן לאסוף את הדגימה הראשונית מכמה מ"לים של הליזאט לאחר משקעי אמוניום סולפט, על ידי ריכוז באמצעות יחידות מסנן צנטריפוגליות, ללא צבירה או ממצאי משקעים. דוגמה לטיהור FAHD1 מכליית חזירים ניתנת כתוצאה מייצגת (ראו גם איור משלים 2). עם זאת, ההגבלה לנפחי מדגם קטנים בלבד עלולה להפוך את הגישה הזו לבלתי מעשית.

יישומים או כיוונים של השיטה
ביטוי וטיהור של חלבונים רקומביננטיים מחיידקים היא שיטה פשוטה ומבוססת היטב, להשגת כמויות אפשריות (בגרמים) של חלבון^24,25. זה הוצג עבור FAHD1¹². עם זאת, ישנם מספר חסרונות אפשריים בשימוש בשיטות אלה, כגון צמיחה לקויה אפשרית של הפונדקאי, היווצרות גוף הכללה, אובדן או שינוי פעילות החלבון, ולכן, האפשרות לא להשיג חלבון כלל, או לגרום לצורה מוטה של החלבון (קיפול שגוי, שינויים לא טובים לאחר התרגום וכו '). פיתוח שיטות שיכולות לחלץ חלבון מקופל היטב ושונה כראוי מרקמות ישירות הוא, אם כן, מושך. הבעיה העיקרית, עם זאת, היא שרוב החלבונים אינם באים לידי ביטוי ברמות משמעותיות, ובהשוואה לאינדוקציה המרומזת ולמיצוי החלבון מחיידקים לאחר מכן, כמות החלבון שיש להשיג היא בדרך כלל נמוכה בכמה סדרי גודל. יש פשרה בין מיצוי זול וקל של חלבון רקומביננטי מחיידקים לבין מיצוי יקר ומייגע יותר של חלבון מרקמות. ההתקדמות העיקרית עם האחרונה היא שניתן לחלץ את החלבון בצורתו הפיזיולוגית הקיימת ברקמה, כולל כל ההשפעות ההדדיות שעשויות להשפיע על פעילותו המתקפלת ו/או הקטליטית.

חלבון המופק ומטוהר על ידי פרוטוקול זה יסייע לזהות מעכבים מוסמכים של FAHD1¹³, שותפים אפשריים לאינטראקציה בין חלבונים⁹, ותפקידים אפשריים אך לא ידועים של החלבון⁹. המחקר של מעכבים אנזימטיים, פיתוח נוגדנים חד שבטיים, ואת המחקר של מבנה החלבון מלכתחילה נתמכים מאוד כאשר יש חלבון בטוהר גבוה מופק מרקמות ולא מופק מחיידקים.

למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

המחברים מודים מאוד על הסיוע הטכני של אייסה אוזטורק ואווה אלברטיני. עכברים ששימשו ליצירת רקמת כבד נשמרו תחת פיקוחה של אוניברסיטת דוז. ד"ר פידר יאנסן-דור (המכון לחקר ההזדקנות הביו-רפואית באוניברסיטת אינסברוק, Rennweg 10, 6020 אינסברוק, אוסטריה).