从猪肾和小鼠肝脏中提取和纯化FAHD1蛋白

该协议描述了如何从猪肾和小鼠肝脏中提取富马酰乙酰乙酸水解酶结构域蛋白1（FAHD1）。所列的方法可以适应于其他感兴趣的蛋白质并针对其他组织进行修饰。

富马酰乙酰乙酸水解酶结构域含蛋白1（FAHD1）是真核生物中FAH超家族的第一个成员，在线粒体中充当草酰乙酸脱羧酶。本文介绍了一系列从猪肾和小鼠肝脏中提取和纯化FAHD1的方法。涵盖的方法包括使用快速蛋白质液相色谱 （FPLC） 进行离子交换色谱，使用 FPLC 进行制备和分析凝胶过滤，以及蛋白质组学方法。全蛋白提取后，探讨硫酸铵沉淀和离子交换色谱， 采用 离子交换和尺寸排阻色谱法提取FAHD1。这种具有代表性的方法可以适应其他感兴趣的蛋白质（在显着水平上表达）并针对其他组织进行修饰。从组织中纯化的蛋白质可以支持高质量抗体和/或有效和特异性药理抑制剂的开发。

真核FAH结构域蛋白1（FAHD1）作为双功能草酰乙酸（OAA）脱羧酶（ODx）¹和酰基丙酮酸水解酶（ApH）²。它定位于线粒体2中，属于酶^1，2，³，^4，5，6的广泛FAH超家族。虽然其ApH活性仅具有次要相关性，但FAHD1的ODx活性参与TCA循环通量^1，7，^8，9的调节。OAA不仅是三羧酸循环中柠檬酸盐合酶反应所必需的，而且还作为琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂，作为电子传递系统的一部分和作为弹力代谢物。人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中FAHD1基因表达的下调导致细胞增殖速率¹⁰的显着降低，线粒体膜电位的显着抑制，与同时切换到糖酵解有关。工作模型是指线粒体功能障碍相关衰老（MiDAS）¹¹样表型⁸，其中线粒体OAA水平受到^{FAHD1活性1，8，9}的严格调节。

重组蛋白更容易 通过 细菌¹² 的表达和纯化而不是从组织中获得。然而，在细菌中表达的蛋白质可能由于缺乏翻译后修饰而偏倚，或者可能只是有问题（即，由于质粒丢失，细菌应激反应，扭曲/未形成的二硫键，无或分泌不良，蛋白质聚集，蛋白水解裂解等）。对于某些应用，蛋白质需要从细胞裂解物或组织中获得，以便包括这种修饰和/或排除可能的伪影。从组织中纯化的蛋白质支持高质量抗体的开发，和/或针对选定酶的有效和特异性药理抑制剂，例如FAHD1¹³。

本手稿介绍了从猪肾和小鼠肝脏中提取和纯化FAHD1的一系列方法。所描述的方法需要快速蛋白质液相色谱（FPLC），但使用常见的实验室设备。替代方法可以在其他地方找到^{14，15，16，17}。在全蛋白提取后，所提出的方案涉及一个测试阶段，其中讨论了硫酸铵沉淀和离子交换色谱的子方案（图1）。在定义了这些亚方案之后，通过使用离子交换和FPLC的尺寸排阻色谱法， 通过 顺序策略提取感兴趣的蛋白质。基于这些指南，最终方案可以单独适应其他感兴趣的蛋白质。

图 1:该协议的总体策略。从上到下:蛋白质是从组织中提取的。制备组织匀浆，离心和过滤。对于每对上清液和颗粒衍生样品，需要进行硫酸铵沉淀和离子交换色谱（FPLC）的测试以探针最佳条件。建立这些子方案后，可以通过硫酸铵沉淀，离子交换色谱和重复大小排阻色谱（FPLC）在不同pH和盐浓度下的顺序程序提取蛋白质。所有步骤都需要通过免疫印迹控制。请点击此处查看此图的大图。

所有实验均按照机构指南进行。猪肾是从当地超市新鲜获得的。从因斯布鲁克大学生物医学衰老研究所，Rennweg 10，6020奥地利因斯布鲁克大学生物医学衰老研究所保存的C57BL6野生型小鼠中收获肝脏组织，在Univ.-Doz的监督下。Pidder Jansen-Dürr 博士，2013 年获得项目负责人的道德许可（BMWF-66.008/0007-II/3b/2013）。该项目的小鼠的维护和使用由奥地利教育，科学和研究部（BMBWF）颁发的2020-0.242.978号道德许可No.2020-242.978涵盖。

1. 准备工作

注意:在方案开始之前，除了一般化学品和材料外，还需要准备几种东西，即蛋白质裂解缓冲液，粗组织样品和特定抗体。

1. 每100g组织净重制备250mL蛋白质裂解缓冲液:250mL 1x PBS与50mM NaF，1mM PMSF，2μg/ mL抑肽酶和1mM活化的原钒酸盐（见 表1）。使用0.22μm注射器过滤单元过滤溶液。
   注意:在使用前需要活化原钒酸盐，以将其转化为更有效的蛋白质酪氨酸磷酸酶¹⁸抑制剂。活化的原钒酸盐可以从商业供应商处获得，但也制备如下。
   1. 在_{ddH 2}O中制备200mM原钒酸钠（钠）储备溶液。为了制备10mL溶液，加入368mg Na₃VO₄ 至9mL水，搅拌溶解。溶解后，用ddH 2 O将体积增至₁₀mL。
      注意:原钒酸钠溶液的起始pH值可能因材料来源而异，并且需要按如下重复方法将pH值调节至10。
   2. 根据溶液的初始pH值，用NaOH或HCl将pH值调节至10。在pH值>10时，溶液将具有黄色。将溶液煮沸直至无色，将其冷却至室温，并检查pH值。如果pH值>10，则加入少量HCl以将pH调节至10。此时，溶液可能会再次变黄。
   3. 重复煮沸和冷却，直到溶液保持无色，pH稳定在10（约5-7倍）。此时，加入HCl会导致溶液中淡淡的黄色外观。将活化的原钒酸盐储存在-20°C的1mL等分试样中。
2. 每克组织用2 mL裂解缓冲液制备试管，并将其置于冰上。
   注意:该方案使用八个50 mL管，每个管子总共填充30 mL裂解缓冲液，用于一个猪肾（约100-150g），两个管子每个管填充40mL裂解缓冲液，总共20个小鼠肝脏（每个1-2g）。
3. 准备组织:在预先清洁的玻璃板上解剖组织，该玻璃板上放置在聚苯乙烯泡沫盒中的冰上。切割每个约100mg的组织片，以便于转移到各自的管中以进行随后的裂解。将组织片段转移到准备好的管中（步骤1.2）。
4. 制备饱和硫酸铵溶液:将500mL ddH₂O加热至70°C，搅拌的同时，逐渐加入硫酸铵粉末（见 材料表），直至不再溶解硫酸铵。将这种（过饱和）溶液冷却至室温，并将其储存在4°C过夜。

2. 总蛋白提取

注意:在冷蛋白质裂解缓冲液中制备样品后（参见步骤1.3）， 通过 超声探针超声处理或使用电动均质器尽可能最好地匀浆组织，如下所示。

1. 组织均质化
   1. 在猪肾的情况下，最好通过超声探头超声处理悬浮液，同时将样品保持在冰上（10个周期的15 s脉冲，脉冲之间的间隔为30 s，以在冰上冷却样品，中等幅度为50%占空比）。
   2. 在小鼠器官的情况下，使用电动均质机（从低力开始，缓慢加速到中等力）使悬浮液均质化，同时将样品保持在冰上。定期清洗PBS中的电均质机，以除去任何堵塞设备的有机物质。
   3. 从样品中取出20μL，并在显微镜下检查匀浆组织的细胞是否被适当破坏;否则，重复均质化。
2. 在4°C下以10，000× g 的台式离心机中离心管30分钟。
   注意:任选地，在4°C下以20，000× g 第二次离心上清液30分钟，以消除可能已转移的初始沉淀的一小部分。这将简化步骤2.3中的后续过滤。
3. 将上清液收集在新鲜的管中并将其放在冰上。使用0.45μm和0.22μm注射器过滤单元按顺序过滤上清液。将上清液等分到10mL批次中，并在-20°C下冷冻以进行短期储存或在-80°C下冷冻以进行长期储存。
   注意:在用0.22μm进行第二个过滤步骤去除更细小的颗粒之前，用0.45μm进行预过滤去除大部分颗粒。直接使用0.22 μm过滤器可能会导致过滤器堵塞的风险。
4. 通过将10μL的5x SDS样品缓冲液（见 表1）加入40μL上清液，然后在95°C下沸腾10分钟，制备50μL样品用于SDS-PAGE/蛋白质印迹分析。
   1. 任选地，将步骤2.2中获得的约100μL沉淀重悬于900μLddH₂O中，并如上所述制备用于SDS-PAGE/蛋白质印迹分析的样品。
      注意:除了阳性对照外，在蛋白质印迹分析中纳入颗粒衍生样品将表明蛋白质的表达是否低，或者抗体有问题。

3. SDS-PAGE和蛋白质印迹分析

注意:需要蛋白质印迹分析来检查蛋白质溶解度。下面描述了使用湿/罐印迹系统的电印迹方案（参见 材料表）。SDS-PAGE的替代协议可以在别处¹⁹找到。

1. 根据制造商的说明制备不连续的12.5%聚丙烯酰胺SDS-PAGE凝胶（即，在分辨凝胶之上的堆叠凝胶;见 表1）。运行先前在步骤 2 中准备的样本（类似于步骤 4、5 和 6;见下文）。
   1. 将蛋白质标记分子量标准品架加载到第一个孔中（参见 材料表）。加载5ng的hFAHD1重组蛋白（从细菌¹²中获得;见 表1）作为阳性对照进入第二孔。
   2. 随后，加载20μL待分析样品，并用20μL制备的SDS-PAGE 1x样品缓冲液（即用ddh₂O稀释的5x样品缓冲液）填充所有剩余的孔。使用SDS电泳缓冲液在125 V下电泳SDS-PAGE凝胶（见 表1）。
2. SDS-PAGE完成后，进行蛋白质印迹分析，并使用针对FAHD1的可用抗体探测膜（见 表1）。
   注意:由于样品是从粗组织匀浆中取出的，因此此时SDS-PAGE和蛋白质印迹分析的质量通常会受到影响;然而，重要的是要检查要提取的蛋白质是否可溶于上清液。以下方案针对猪肾和不同的小鼠器官（包括肝脏，心脏，大脑和肾脏）进行了测试。
   1. 准备10x蛋白质印迹转印缓冲液（见 表1）。准备1x蛋白质印迹转印缓冲液（见 表1）并将其冷却至4°C。
   2. 在甲醇中激活PVDF膜2分钟。将膜在ddH₂O中洗涤2分钟。在1x蛋白质印迹转印缓冲液中平衡膜15分钟。
   3. 用1x PBS洗涤SDS凝胶10分钟，同时摇动以除去SDS电泳缓冲液，然后将凝胶在1x蛋白质印迹转印缓冲液中孵育10分钟以进行平衡。根据制造商的说明组装电印迹盒（即，结合活化的PVDF膜和凝胶）。
   4. 在装满冰的聚苯乙烯泡沫盒中或在冷藏室（4°C）中 以 300 mA电印迹运行印迹1小时。将PVDF膜转移到50 mL管中，其暴露的一面朝向管的内侧。将膜在20mL蛋白质印迹封闭缓冲液（见 表1）中孵育4°C过夜，同时在管辊上滚动（参见 材料表）。
   5. 第二天，在滚动时用20mL蛋白质印迹洗涤缓冲液（PBS与0.1%（v / v）吐温20）在同一管中洗涤膜5分钟。将膜与一抗2（靶向^FAHD1 ;见 表1）在同一管中孵育，在室温下在免疫印迹封闭缓冲液中稀释1:500，同时滚动。
   6. 滚动时，用20mL蛋白质印迹洗涤缓冲液在同一管中洗涤膜三次，每次10分钟。将膜在室温下用HRP偶联二抗（参见 材料表）在5mL蛋白质印迹封闭缓冲液中稀释1:3000孵育30分钟。
   7. 在同一管中洗涤膜三次，每次10分钟，每次用20mL蛋白质印迹洗涤缓冲液，每次两次5分钟，每次1x PBS。用镊子小心地握住膜，并用膜的相对（下部）边缘触摸一块纤维素或一张Whatman纸，干燥膜。将膜（暴露的一面朝上）放在清洁的玻璃板上。
   8. 使用移液器用1 mL制备的ECL蛋白质印迹底物小心地覆盖整个膜，注意不要产生任何气泡。让ECL溶液孵育3分钟，然后立即使用X射线胶片或使用成像系统显影膜。
      注意:如果蛋白质没有在阳性对照中检测到，则可能表明蛋白质不溶，或者不存在足够的量来检测抗体。如果只加载了纳克的阳性对照，则第一种情况更有可能。如果根本没有检测到蛋白质，请检查抗体的质量，并可能改用多克隆抗体而不是单克隆抗体。在极少数情况下，即对于某些疏水性蛋白质，该蛋白质可以在离心后检测到，但在过滤后不能检测到。在这种情况下，建议对疏水性蛋白质使用特殊的过滤单元。
3. 任选地，在蛋白质印迹后对PVDF膜进行染色，以控制蛋白质从SDS-PAGE凝胶成功转移到PVDF膜。
   注意:建议使用考马斯染色进行故障排除、方法开发和记录，但请记住，在应用此方案后，膜会因进一步的蛋白质印迹分析而丢失。Ponceau S染色的染色较弱，但如果要重新探查膜，则可以使用。
   1. 准备装有染色（考马斯或庞索S）和脱色溶液的小托盘。
   2. 使用镊子将膜放入染色溶液中并轻轻摇动，直到膜染色良好（5-10分钟）。
   3. 将膜转移到脱色溶液中并摇动，直到溶液饱和（5-10分钟）。重复脱色步骤，直到可以在膜上观察到蛋白质条带;如果根本没有观察到条带，则以较长的孵育时间重复染色。使用镊子将其放在玻璃板上，使膜干燥。

4.测试:硫酸铵沉淀

注意:硫酸铵沉淀是一种通过改变蛋白质溶解度来纯化蛋白质的方法。在初步实验中，硫酸铵浓度依次增加到沉淀最大量蛋白质污染物的值，同时将FAHD1留在溶液中。 通过 蛋白质印迹分析再次探测蛋白质的溶解度。

1. 从步骤2.3开始:解冻样品的等分试样或在蛋白质提取后直接进行（即，不冻结样品）。使用0.22μm过滤单元过滤样品，以排除解冻后可能的沉淀物。在冰上制备六个1.5 mL管，并将250μL样品转移到每个管中。
2. 在上面制备的试管中制备5%，10%，15%，20%，25%和30%硫酸铵的稀释系列，并用蛋白质裂解缓冲液组成最终体积至1000μL。将样品在4°C下在管旋转器上孵育过夜（参见 材料表）。
3. 使用台式离心机，在4°C下以10，000× g 离心30分钟，并小心地将所有上清液转移到单独的管中。将得到的沉淀风干，并将其中的每一个重悬于1000μLddH₂O中。
4. 对于上一步中的每对重悬沉淀和上清液，将40μL与10μL5x SDS样品缓冲液混合，并在95°C下打开盖子沸腾，直到大部分液体蒸发。然后，将沉淀重悬于ddH₂O中50%DMSO的混合物中。
5. 执行SDS-PAGE（步骤3），但将凝胶在80 V下电泳3小时。对于每种浓度的硫酸铵，成对加载来自重悬沉淀和上清液的样品（步骤4.3）。执行蛋白质印迹分析（步骤 3）。
6. 检查最高浓度的硫酸铵，此时待纯化的蛋白质（即FAHD1）保留在来自上清液的样品中。根据结果，为感兴趣的蛋白质定义硫酸铵沉淀方案，以用于未来的实验。
   注意:众所周知，硫酸铵会扭曲SDS-PAGE和蛋白质印迹。随着硫酸铵浓度的增加，蛋白质印迹分析的质量将受到影响。然而，与前面的步骤3一样，该分析用于在给定浓度的硫酸铵下检查目标蛋白质的溶解度。该协议旨在沉淀其他蛋白质，而要纯化的蛋白质必须保持可溶性。

5. 测试:使用FPLC进行离子交换色谱

注意:具有带电官能团的分子与FPLC的二氧化硅颗粒柱结合，从而能够根据其表面电荷分化蛋白质。使用阳离子交换柱和阴离子交换柱执行此步骤两次（参见 材料表）。阳离子或阴离子交换色谱的方案步骤相同，但要使用的缓冲液不同（见 表1）;均具有"低盐"15 mM NaCl和"高盐"1 M NaCl条件。对于使用的色谱柱，建议流速为 1 mL/min。

1. 用阴离子或阳离子交换柱设置FPLC系统。用5个20%EtOH（_{在H 2}O中）的柱体积（CV）洗涤色谱柱，然后用5个ddH₂O的CVs洗涤柱。或者，用1 CV的低盐缓冲液，高盐缓冲液和再次低盐缓冲液洗涤柱，直到在色谱图中不再观察到峰，但至少洗涤一次。
2. 在小规模上确定硫酸铵沉淀的最佳方案（步骤4）后，将沉淀方案应用于10 mL原始组织匀浆（步骤2）。任选地，用低盐缓冲液透析样品。
   1. 将样品涂在色谱柱上（例如，通过进样或使用样品泵）并收集流出物。用1 CV的低盐缓冲液洗涤色谱柱。
3. 在3个CV内设置从100%低盐缓冲液/ 0%高盐缓冲液到0%低盐缓冲液/100%高盐缓冲液的线性梯度洗脱。连续收集1 mL级分。梯度完成后，继续使用高盐缓冲液运行，直到在色谱图中检测到1 CV范围内不再有蛋白质相关峰（280/255nm处的UV吸收）。
4. 应用1 mL溶解在0.5 M NaOH（ddH 2 O中）的₂₅%SDS以清洁色谱柱。连续用3个ddH 2 O的CVs和3个₂₀%EtOH的CV（在ddH₂O中）洗涤色谱柱。
5. 收集所有峰级分和流通的SDS-PAGE样品， 并通过 蛋白质印迹探测它们是否存在感兴趣的蛋白质（步骤3）。将收集的馏分在液氮中速冻，并将其储存在-80°C。
6. 蛋白质印迹分析完成后，解冻并池化含有目标蛋白质的馏分，并丢弃其他部分。用备用色谱柱（即阳离子或阴离子交换柱）重复步骤5.1-5.5。
7. 在探测到两个色谱柱后，为感兴趣的蛋白质定义FPLC方案，以便在未来的实验中使用。使用超离心过滤装置（10 kDa，见 材料表）将蛋白质溶液的体积减小到2 mL。
   注意:这一系列实验有两个预期结果。要么感兴趣的蛋白质已经附着在其中一个色谱柱上，并且蛋白质溶液在洗脱后已经非常纯净，要么在这两种情况下蛋白质都保持在流通中。在后一种情况下，尽管蛋白质处于流通状态，但此步骤的清洁效果可能仍然显着。在这种情况下，对于猪肾和小鼠肝脏中的FAHD1，仍将进行离子交换的这一步骤。如果阳离子或阴离子交换柱都不能提供适当的清洁效果，则可以尝试改变裂解液和缓冲液的pH值，并在施用于FPLC之前对样品进行电泳缓冲液透析。

6. 使用硫酸铵沉淀和FPLC的指定子协议进行蛋白质提取

注意:用于FPLC的硅胶柱中的多孔颗粒（参见 材料表）能够根据其流体动力学半径区分蛋白质。所描述的步骤将使用FPLC系统，使用尺寸排阻色谱（SEC）进行。对于使用的SEC色谱柱（参见 材料表），建议流速为0.3 mL/min。

1. 准备所有必需的材料（见步骤1），并从组织中提取总蛋白质（见步骤2）。对未用于测试的所有组织匀浆进行硫酸铵沉淀（参见步骤4）。对于较大体积的裂解物，使用超离心过滤装置（10 kDa;参见 材料表）浓缩裂解物，体积较小，为50 mL或更小。
2. 使用离子交换色谱法执行第一个纯化步骤（参见步骤5）。
   1. 准备用于蛋白质印迹的样品，如前面的步骤中所述。进行蛋白质印迹分析，并池化所有含有离子交换色谱的FAHD1级分。
   2. 使用超离心过滤装置 （10 kDa） 将蛋白质溶液的体积减小到 2 mL。用0.45μm和0.22μm注射器过滤单元按顺序过滤溶液，以除去任何微沉淀物。
3. 用1 CV的SEC电泳缓冲液平衡SEC色谱柱（见 表1），其中包含1 mM DTT。将样品上样到色谱柱上并运行色谱法，直到洗脱所有蛋白质（1-2 CV）。
   1. 收集对应于色谱图中显着峰（280/255nm处的紫外线吸收）的1mL流出部分，并制备每个收集的馏分的50μL样品用于SDS-PAGE和蛋白质印迹分析，如前面的步骤中所述。使用液氮快速冷冻所有馏分，并将其储存在-80°C。
4. 用1 CV的ddH 2 O和1 CV的₂₀%EtOH（在ddH₂O中）连续洗涤SEC色谱柱。进行蛋白质印迹分析，并池化所有含有FAHD1的馏分。使用超离心过滤装置将蛋白质溶液的体积减少到2 mL（10 kDa，参见 材料表）。
5. 使用商业BCA检测试剂盒评估蛋白质浓度（参见 材料表）。
   注意:流动相的pH和盐含量可能影响球状蛋白²⁰的洗脱曲线。酸性或碱性条件可导致峰被较少定义和增加蛋白质 - 基质相互作用导致蛋白质部分保留在色谱柱²⁰上。这种效应可用于进一步的蛋白质纯化。用不同的流速、pH和盐浓度重复步骤6可以提高蛋白质²⁰的纯度。

7. 银染

注意:需要对SDS-PAGE凝胶进行银染色分析，以检查考马斯染色可能看不到的蛋白质污染。以下协议是可以在文献中找到的众多版本之一²¹.通过在干净的玻璃托盘中摇动来执行所有孵育步骤。将所有含银和含甲醛的液体收集在特殊的废物容器中，并妥善丢弃。

1. 将SDS-PAGE凝胶在银染色固定溶液中孵育（见 表1）在冷室中过夜。将凝胶在室温下在银染色孵育溶液（见 表1）中孵育3小时。任选地，加入戊二醛（见 表1）以改善对微弱条带的检测。将凝胶在ddH₂O中洗涤四次，每次10分钟。
2. 将凝胶在银染银溶液中孵育1小时（见 表1）。
   注意:请注意，从现在开始，所有液体和凝胶本身都含有有毒的银和甲醛。
3. 将凝胶在银染色显影剂溶液（见 表1）中孵育，剧烈摇动，直到条带清晰可见。为了停止反应，丢弃显影剂溶液并立即将凝胶在银染色停止溶液中孵育（见 表1）至少10分钟。
   注意:在步骤7.2和7.3中染色的条带将不断变得更加发达。如果染色较弱，则可能需要向溶液中添加比所述更多的甲醛。

使用所提出的方案从猪肾和小鼠肝脏中提取FAHD1蛋白。对于小鼠组织，在最后的纯化步骤后需要多个器官才能获得几μg。出于这个原因，本文重点介绍从猪肾脏中提取FAHD1，这是一个更典型的实验。从小鼠肝脏中提取FAHD1是为了呈现该方案的困难和可能的陷阱。通常建议使用显示要纯化的蛋白质的高表达水平的器官。人蛋白图谱²² 可能有助于估计模型系统中的表达，或者可以使用不同的粗组织裂解物进行初步的蛋白质印迹实验以评估这些水平。所有蛋白质印迹分析中使用的阳性对照是标记的重组蛋白，以略高的分子量运行。

作为第一个实验，提出了从猪肾中提取FAHD1的方法。组织均质化（步骤1）和总蛋白提取（步骤2）的过程在 补充图1 中介绍（有关各个步骤的描述，请参阅图例）。总裂解物的等分十分之一用于以下实验。

通过向裂解物中加入不同浓度的硫酸铵来测试一次该裂解物的硫酸铵沉淀（步骤4）（图2）。离心后，对沉淀和上清液进行取样，并使用针对人FAHD1升高的定义的多克隆抗体²用蛋白质印迹进行分析。从大肠杆菌12获得的200ng重组His/S标记人^FAHD1作为阳性对照加载。FAHD1蛋白条带在25 kDa时可见，而标记的阳性对照在34 kDa下运行。基于这些数据，定义了一种方案，其中裂解物用25%硫酸铵处理，即FAHD1仍在上清液中，而大多数其他蛋白质沉淀的条件。这是纯化策略中的重要一步。硫酸铵沉淀是使用其他方法之前的有效清洁步骤。值得注意的是，高于30%的硫酸铵量不会被使用，因为硫酸铵逐渐扭曲了SDS-PAGE和蛋白质印迹的质量。

图2:硫酸铵沉淀和猪FAHD1的蛋白质印迹筛选（A）硫酸铵以不同浓度（最大5%至25%）加入裂解物中以沉淀来自溶液的蛋白质。（B）猪FAHD1（25 kDa）的存在是在单个颗粒和上清液对中测定的，对应于通过蛋白质印迹通过蛋白质印迹改变硫酸铵浓度，使用针对人FAHD1的多克隆抗体。对应于25%硫酸铵沉淀的上清液仍显示猪FAHD1在上清液中存在，同时沉淀了大量的其他蛋白质。200 ng His/S标记的重组蛋白作为阳性对照（34 kDa）上样。请点击此处查看此图的大图。

在用FPLC测试离子交换柱后，定义了一种策略，其中猪FAHD1在pH 9下保持在阴离子交换色谱的流通中（步骤5）。从硫酸铵沉淀在25%（如先前的测试实验所定义）获得的裂解物开始，使用阴离子交换色谱法从溶液中消除进一步的蛋白质（图3A）。通过从色谱柱中洗脱除结合蛋白，同时在pH 7.4下 通过 SEC进一步纯化流出（图3B）。在这两个步骤之后，蛋白质印迹分析确定了所有含有猪FAHD1的馏分，这些部分被合并并浓缩至2 mL。

图3:用FPLC纯化猪FAHD1 - 第1部分。 色谱图和印迹中的红色箭头表示FAHD1的存在。在色谱图中，"UV"表示280nm处的UV吸收，"Cond"表示电导率（与缓冲液中的盐浓度有关），"Conc B"表示缓冲液梯度中高盐缓冲液的百分比（0%纯低盐缓冲液;100%纯高盐缓冲液）。（A）用阴离子交换柱（FPLC）从硫酸铵沉淀25%获得的裂解物中纯化猪FAHD1。虽然许多蛋白质与色谱柱结合，但猪FAHD1在流通中被发现。污垢和非蛋白质污染物通过从色谱柱中洗脱除，同时进一步处理流出物。（B）从先前的阴离子交换色谱（A）中的流通 通过 pH 7.4的尺寸排阻色谱（FPLC）进一步纯化。（A，B）蛋白质印迹分析（底部的裁剪印迹）鉴定出含有猪FAHD1的馏分，这些部分被合并浓缩。完整的印迹描绘了蛋白质印迹分析后的考马斯染色膜。 请点击此处查看此图的大图。

将过滤后的样品再次施加到SEC上，但在pH 9的缓冲条件下（见 表1）（图4）。这种方法背后的基本原理是流动相的pH和盐含量可能会影响球状蛋白²⁰的洗脱曲线，并且在这些缓冲液条件下发现了FAHD1的增强洗脱谱。一部分含有足够纯度水平的蛋白质，用于碱性酶活性测定¹² ，以最终确认蛋白质的特性。

图4:用FPLC纯化猪FAHD1 - 第2部分。 色谱图和印迹中的红色箭头表示FAHD1的存在。先前用阴离子交换和尺寸排阻色谱法纯化的蛋白质样品在pH 9（顶板）下 通过 尺寸排阻色谱（FPLC）进一步纯化。右下角所示的蛋白质印迹分析可识别含有猪 FAHD1 的馏分，这些分数是合并和浓缩的（底部面板）。左下角的印迹显示蛋白质印迹后膜的考马斯染色。 请点击此处查看此图的大图。

用硫酸铵沉淀后获得的2mL裂解物测试另一种策略（即SEC，然后进行离子交换色谱法）（步骤4）（补充图2）。该实验的基本原理是，通过首先使用SEC，含有FAHD1的组分可以与大多数其他蛋白质分离，而随后的离子交换色谱法可用于进一步纯化蛋白质。首先，在pH 7.4下使用SEC分馏裂解物（步骤6）。蛋白质印迹分析确定了含有猪FAHD1的所有部分。其次，将这些级分浓缩并在pH 9下使用阴离子交换柱进一步纯化（步骤5）。色谱图和蛋白质印迹分析（补充图2）表明，这种策略令人鼓舞，因为离子交换色谱图显示了与蛋白质印迹中富集蛋白水平相关的定义窄峰。但是，此策略的缺点是它受要应用于 SEC （2 mL） 的初始体积的限制，因此此方法的通量非常低。例如，处理整个猪肾是不切实际的。

作为该方案的另一种修改，当猪FAHD1也存在于流通中时，在阴离子交换柱之前包括阳离子交换柱。在方案的每个步骤中，对含有组分的猪FAHD1的样品进行采样并用ODx测定进行测试，如其他地方^所述12 （补充图3）。特定的酶活性随着纯度水平的增加而增加，即随着每总蛋白质FAHD1的相对量的增加而增加。

作为第二个例子，从小鼠肝脏中提取FAHD1，即从20只小鼠获得的肝脏组织的集合被提出。与上面介绍的从猪肾中提取FAHD1相比，这种提取被证明更加繁琐。在协议的几个步骤中遇到了问题，这将在下面介绍。如步骤2所述提取总蛋白（补充图4）。由于小鼠肝脏匀浆往往是一个非常粘稠和粘稠的实体，因此使用滤纸（类似于咖啡过滤单元）来预过滤裂解物，其在提取后在裂解缓冲液中稀释1:3，以使溶液更像液体。这种稀释增强了过滤程序;然而，这使得随后用蛋白质印迹检测蛋白质变得更加乏味。过滤后，制备的裂解液必须在进一步使用前浓缩。总裂解物的等分十分之一用于以下实验。

硫酸铵沉淀的第一个测试步骤（补充图4I）显示了可能遇到的问题。较高浓度的硫酸铵会破坏SDS-PAGE凝胶，并在150 V下电泳时引起微笑效果（补充图5A;阴性结果）。在80 V下运行的相同SDS-PAGE显示阳性结果（补充图5B）。在后一种情况下，微笑效应最初形成，但由于施加的电压较低，最终得到解决。由于初始溶液必须大量稀释才能滤除裂解物，因此对这些样品的初始蛋白质印迹分析不成功，即抗体检测到阳性对照，但未检测到所应用样品中的蛋白质。使用较高浓度的裂解物（使用离心过滤单元浓缩）和抗体，并通过在摇动时在冷室中施用抗体过夜，解决了这个问题。最终，蛋白质印迹分析提供了蛋白质存在于裂解物中的信息，以及蛋白质仍存在于15%硫酸铵的上清液中的信息（补充图5C）。值得注意的是，含有较高量硫酸铵（>15%）的SDS样品在加热时沉淀，蛋白质丢失。这也可以在考马斯染色和蛋白质印迹中看到（补充图5C）。在猪肾上没有观察到这种效应，因此它可能是组织特异性的。

硫酸铵沉淀15%后，在pH 6.8下施用10 mL裂解物进行阳离子交换色谱。蛋白质印迹分析显示小鼠FAHD1蛋白在流通中（图5A）。洗脱的蛋白质部分似乎很小;然而，这个例子显示了离子交换色谱的二次效应。在方案的这一步，溶液可能仍然含有许多可能不是蛋白质的化合物。离子交换色谱是摆脱此类污染的快速简便方法。鉴于进行离子交换色谱需要几个小时才能完成（包括所有洗涤步骤，实验本身需要半小时），它提供了一种简单的方法来清除样品中的非蛋白质污染物。

图5:用FPLC纯化小鼠FAHD1。 色谱图和印迹中的红色箭头表示FAHD1的存在。（A）硫酸铵沉淀15%后，将样品离心，过滤（0.22μm），并施加到阳离子交换柱上。蛋白质印迹分析表明，蛋白质在流通中，色谱图显示此步骤没有去除太多其他蛋白质。但是，将输入的外观和粘度与流通进行比较，表明收集的流通更清晰（右图比较了输入和流通）。（B） 通过 离心过滤器将从阳离子交换柱收集的流通量减少到2 mL，并在pH 7.4下施加到尺寸排阻色谱中。（C）将含有FAHD1的馏分合并，浓缩，并在pH 9下进行第二轮尺寸排阻色谱。（D）再次将含有FAHD1的馏分合并并涂在SDS-PAGE上，并用银染色，以查看剩余的污染物。 请点击此处查看此图的大图。

将样品进一步应用于pH 7.4的尺寸排阻色谱（图5B）。蛋白质印迹分析显示含有小鼠FAHD1蛋白的组分，这些组分被合并浓缩至2 mL。将2mL浓缩物在-20°C下用10μL β巯基乙醇冷冻，并于第二天解冻。形成沉淀物， 通过 注射器过滤单元（0.22μm）过滤。采集用于SDS-PAGE和蛋白质印迹分析的样品，以确保小鼠FAHD1蛋白仍在溶液中。

将含有蛋白质的样品（来自蛋白质印迹分析）合并，通过离心过滤器浓缩，并用银染色施加到SDS-PAGE上以查看剩余的污染物（图5D）。这表明蛋白质溶液不是高纯度的，并且通过该方法从小鼠肝脏获得的蛋白质量也不是很高（使用BCA测定试剂盒确定总共几μg;见材料表）。在猪FAHD1的情况下，蛋白质产量要高得多（在此步骤中约为1mg）。从猪肾中提取的FAHD1蛋白的纯度水平约为80%（银染色后估计;数据未显示）。该纯度可以通过例如使用定义的抗体的亲和色谱法进一步增加。该协议的此类限制和其他限制将在下面进一步详细讨论。

表 1.

补充图1:从猪肾中提取总蛋白。 （A）用手术刀将肾组织切成适当清洁的玻璃板上放上聚苯乙烯泡沫，防止滑行;（B）将含有20 mL冰冷裂解缓冲液和蛋白质/蛋白酶抑制剂的50 mL试管在冰上孵育;（c）将肾组织片放入缓冲液中，直至体积达到约30mL;（四）使用超声波（即超声）对肾组织进行均质化;（五）粗均质物在台式离心机中以中速离心30min;（六）同时处理若干样品;（G）第一次离心后，将上清液转移到离心管中（与 E相比），并以高速（10，000× g）离心30分钟;（H）该离心步骤产生另一个沉淀和上清液，将其转移到50mL管中;（I / J）将预裂解物按顺序用0.45μm和0.2μm过滤单元过滤，等分装成10mL批次，并用液氮速冻，随后在-80°C下储存。 蛋白质印迹分析用于验证所有样品（沉淀，上清液，过滤裂解物）中蛋白质的存在。 请点击此处下载此文件。

补充图2:用FPLC纯化猪FAHD1;替代策略。 色谱图和印迹中的红色箭头表示FAHD1的存在。（A）从硫酸铵沉淀获得的裂解物中纯化猪FAHD1，其pH值为7.4，具有25%的尺寸排阻色谱（FPLC）。蛋白质印迹分析确定了含有猪FAHD1的组分，这些部分被合并和浓缩。（B）先前用尺寸排阻色谱 （图A）纯化的蛋白质样品 通过 阴离子交换色谱（FPLC）进一步纯化。蛋白质印迹分析可识别含有猪FAHD1的组分，这些部分被合并和浓缩。 请点击此处下载此文件。

补充图3:猪FAHD1的特异性酶活性。测量特异性酶活性作为纯度水平增加的函数。该表比较了相对酶活性（nmol/min）与特定酶活性（μmol/min/mg）。该测定显示猪FAHD1在每个纯化步骤后活性不断增加。与从大肠杆菌获得的重组His/S-human FAHD1（绿色）相比。¹²、猪FAHD1表现出略高的活性（红色）（n=3）。请点击此处下载此文件。

补充图4:从小鼠肝脏中提取总蛋白质。 （A，B，C）将20只小鼠的速冻肝组织和裂解缓冲液在50 mL管中冰冻在冰上制备;（D，E，F）使用超声波（即超声处理）使肝脏组织均质化;粗均质物在台式离心机中以中速离心30分钟;将上清液转移到离心管中，并以高速（10，000× g）离心30分钟;（G，H，I）将预裂解物按顺序用纸过滤器，0.45μm和0.2μm过滤单元过滤，等分装成10mL批次，并用液氮速冻，随后在-80°C下储存;（J）将硫酸铵以不同浓度（最大5%~30%）加入到裂解液中，使蛋白质从溶液中沉淀出来;（K）将硫酸铵沉淀（图 J）后得到的沉淀重悬于H₂O中，取样进行SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。 请点击此处下载此文件。

补充图5:硫酸铵沉淀和小鼠FAHD1的蛋白质印迹筛选。 印迹中的红色箭头表示存在FAHD1。（A） SDS-PAGE与硫酸铵沉淀后获得的样品在125 V下运行。这种凝胶表现出剧烈的微笑效果，这种凝胶无法评估。这是否定结果的一个示例。（B） 具有相同样品（面板A）的SDS-PAGE在80 V下运行直至完成。这种凝胶中没有微笑效果，这是积极结果的一个例子。（C）SDS PAGE和蛋白质印迹分析硫酸铵沉淀后得到的样品。如所示，较高浓度硫酸铵的样品可能会在样品缓冲液内沉淀。它们丢失了，无法再 通过 考马斯染色（左）或蛋白质印迹分析（右）检测到。在这种情况下，硫酸铵的最佳浓度被确定为15%。 请点击此处下载此文件。

协议中的关键步骤
遵循处理蛋白质的常见准则至关重要，例如在冰上以及在中等pH和盐条件下工作。使用蛋白酶抑制剂对该方法有益，而强烈建议使用蛋白酶体抑制剂。冷冻和解冻样品可能总是导致蛋白质沉淀（至少部分），因此任何解冻的初始蛋白质裂解物等分试样（步骤2）都应连续处理，不得中断。一般建议解冻后的离心和过滤，以除去微沉淀。

从组织获得的初始蛋白质裂解物除蛋白质外还含有许多物质。离子交换色谱柱可用于清除裂解物。即使想要提取的蛋白质不与离子交换柱结合，流通可能比输入溶液更清晰，并且更容易在后续步骤中处理。这用于从小鼠肾脏中提取FAHD1（见 图5A）。

方法的限制和修改
该协议描述了从组织中提取FAHD1的方案。基于该策略，可以衍生出从其他组织中提取FAHD蛋白（FAHD1，FAHD2）的一般方法，而对于个案可能需要特定的适应。该方法的隐含局限性是FAHD1（或FAHD蛋白）在给定组织中的相对表达水平以及该组织足够数量的可用性。该协议中描述的总体方案要求从蛋白质在适当量的组织中的高表达开始。已经提供了从猪肾和小鼠肝脏中提取FAHD1的例子，这是两个显示出高蛋白表达水平的器官。在该协议中描述的每个步骤中，都存在样品的隐性损失，即，蛋白质的低初始量甚至进一步减少。最终，使用该协议只能实现少量的蛋白质。因为猪肾是一个大器官，所以通过这种方法可以从两个肾脏中提取大约一克蛋白质（约80%纯度;估计）。应用相同的方案从小鼠肝脏中提取FAHD1需要从20只小鼠中收集肝脏样品，最终仅获得几μg蛋白质。使用概述的方法获得更高纯度的蛋白质可能是乏味的，并且银染色表明，在尺寸排阻色谱法之后，溶液中可能仍有许多其他蛋白质。人们 可以通过亲和 色谱（NHS活化柱）来增强该方案，使用单克隆抗体（例如，CAB025530）。

这里列出的所有方案都要求人们想要提取的蛋白质是可溶的。需要测试和定义硫酸铵沉淀的最佳条件和色谱法的pH/盐调整。如果离子交换色谱不能提供任何良好的纯化结果，则在进行FPLC之前对色谱缓冲液进行透析可能是提高蛋白质溶解度和色谱分辨率的一种选择。然而，不建议透析粗裂解物，因为这可能导致透析管内大量和不受控制的蛋白质沉淀。如果蛋白质倾向于疏水性，则可能会出现问题，如果蛋白质是高度疏水性的（例如，膜蛋白），则方案可能不适用。如果FAHD蛋白部分不溶于给定组织裂解物中的FAHD2（未显示数据），则可以探索其他类型的色谱，例如疏水相互作用色谱（HIC）^以及12。

结果部分显示了标准协议的两项修改。为了从猪肾中纯化FAHD1，在离子交换色谱法之前使用尺寸排阻色谱法（见 补充图2）。这种方法的一个问题是，尺寸排阻色谱具有较大的运行轨迹，并且在运行过程中样品量显着增加。样品体积不应超过床体积的2%，以达到高分辨率²³，最终的稀释因子也取决于收集的洗脱体积。在提供的示例中使用 120 mL 色谱柱时，建议初始体积为 2 mL。初始样品可以从硫酸铵沉淀后的几mL裂解物中收集，通过使用离心过滤单元进行浓缩，没有聚集或沉淀伪影。从猪肾中纯化FAHD1的示例作为代表性结果提供（另见 补充图2）。然而，仅对小样品体积的限制可能会使这种方法不切实际。

方法的应用或方向
从细菌中表达和纯化重组蛋白是一种简单而成熟的方法，以获得可行量（以克为单位）的蛋白质^24，25。这已经提交给FAHD1¹²。然而，使用这些方法有几个可能的缺点，例如宿主可能生长不良，包涵体形成，蛋白质活性丧失或改变，因此，根本无法获得任何蛋白质的可能性，或导致蛋白质的偏倚形式（错误折叠，不良的翻译后修饰等）。因此，开发能够直接从组织中提取折叠良好和适当修饰的蛋白质的方法具有吸引力。然而，主要问题是大多数蛋白质没有在显着水平上表达，并且与从细菌中隐式诱导和随后提取蛋白质相比，要获得的蛋白质量通常低几个数量级。在从细菌中提取重组蛋白的廉价和容易与从组织中提取蛋白质的更昂贵和繁琐之间存在权衡。后者的主要进展是，人们可以提取存在于组织中的生理形式的蛋白质，包括可能影响其折叠和/或催化活性的所有相互作用。

通过该方案提取和纯化的蛋白质将有助于鉴定FAHD1¹³的合格抑制剂，可能的蛋白质相互作用伙伴⁹，以及蛋白质⁹的可能但未被发现的作用。当从组织中提取蛋白质而不是从细菌中提取高纯度蛋白质时，酶抑制剂的研究，单克隆抗体的开发以及蛋白质结构的研究首先得到了极大的支持。

作者没有相互竞争的经济利益。

作者非常感谢Ayse Öztürk和Eva Albertini的技术援助。用于生成肝组织的小鼠在Univ.-Doz的监督下维持。Pidder Jansen-Dürr博士（因斯布鲁克大学生物医学老龄化研究所，Rennweg 10，6020因斯布鲁克，奥地利）。