Extraktion und Reinigung von FAHD1-Protein aus Schweineniere und Mausleber

Dieses Protokoll beschreibt, wie das domänenhaltige Fumarylacetoacetat-Hydrolase-haltige Protein 1 (FAHD1) aus Schweineniere und Mausleber extrahiert werden kann. Die aufgeführten Methoden können an andere Proteine von Interesse angepasst und für andere Gewebe modifiziert werden.

Fumarylacetoacetathydrolase-Domänen-haltiges Protein 1 (FAHD1) ist das erste identifizierte Mitglied der FAH-Superfamilie in Eukaryoten und wirkt als Oxalacetat-Decarboxylase in Mitochondrien. Dieser Artikel stellt eine Reihe von Methoden zur Extraktion und Reinigung von FAHD1 aus Schweineniere und Mausleber vor. Abgedeckte Methoden sind die Ionenaustauschchromatographie mit schneller Proteinflüssigkeitschromatographie (FPLC), die präparative und analytische Gelfiltration mit FPLC und proteomische Ansätze. Nach der Gesamtproteinextraktion wurden die Ammoniumsulfatfällung und die Chromatographie des Ionenaustauschs untersucht, und FAHD1 wurde über eine sequentielle Strategie unter Verwendung der Ionenaustausch- und Größenausschlusschromatographie extrahiert. Dieser repräsentative Ansatz kann an andere Proteine von Interesse angepasst werden (in signifikanten Mengen exprimiert) und für andere Gewebe modifiziert werden. Gereinigtes Protein aus Gewebe kann die Entwicklung hochwertiger Antikörper und/oder potenter und spezifischer pharmakologischer Inhibitoren unterstützen.

Das eukaryotische FAH-domänenhaltige Protein 1 (FAHD1) wirkt als bifunktionelle Oxalacetat (OAA)-Decarboxylase (^ODx)1 und Acylpyruvathydrolase (ApH)². Es ist in Mitochondrien 2 lokalisiert und gehört zur breiten FAH-Superfamilie der Enzyme 1,2,3,4,5,6. Während seine ApH-Aktivität nur von geringer Relevanz ist, ist die ODx-Aktivität von FAHD1 an der Regulation des ^{TCA-Zyklusflusses} 1,7,8,9 beteiligt. OAA wird nicht nur für die zentrale Citratsynthase-Reaktion im Tricarbonsäurezyklus benötigt, sondern wirkt auch als kompetitiver Inhibitor der Succinat-Dehydrogenase als Teil des Elektronentransportsystems und als kataplerotischer Metabolit. Die Herunterregulierung der FAHD1-Genexpression in menschlichen Nabelvenendothelzellen (HUVEC) führte zu einer signifikanten Verringerung der Zellproliferation¹⁰ und einer signifikanten Hemmung des mitochondrialen Membranpotentials, verbunden mit einem gleichzeitigen Wechsel zur Glykolyse. Das Arbeitsmodell bezieht sich auf den mitochondrialen Dysfunktions-assoziierten Seneszenz (MiDAS)11-ähnlichen Phänotyp 8, bei dem die mitochondrialen OAA-Spiegel durch die ^{FAHD1-Aktivität 1,8,9} streng reguliert werden.

Rekombinantes Protein ist leichter durch Expression und Reinigung von Bakterien¹² als von Gewebe zu erhalten. Ein in Bakterien exprimiertes Protein kann jedoch durch mögliches Fehlen posttranslationaler Modifikationen verzerrt sein oder einfach problematisch sein (d. H. Aufgrund von Plasmidverlust, bakteriellen Stressreaktionen, verzerrten / ungeformten Disulfidbindungen, keiner oder schlechter Sekretion, Proteinaggregation, proteolytischer Spaltung usw.). Für bestimmte Anwendungen muss Protein aus Zelllysat oder Gewebe gewonnen werden, um solche Modifikationen einzuschließen und/oder mögliche Artefakte auszuschließen. Gereinigtes Protein aus Gewebe unterstützt die Entwicklung hochwertiger Antikörper und/oder potenter und spezifischer pharmakologischer Inhibitoren für ausgewählte Enzyme, wie z.B. für FAHD1¹³.

Dieses Manuskript stellt eine Reihe von Methoden zur Extraktion und Reinigung von FAHD1 aus Schweineniere und Mausleber vor. Die beschriebenen Methoden erfordern eine schnelle Proteinflüssigkeitschromatographie (FPLC), verwenden aber ansonsten gängige Laborgeräte. Alternative Methoden können an anderer Stelle^{gefunden werden 14,15,16,17}. Nach der Gesamtproteinextraktion umfasst das vorgeschlagene Protokoll eine Testphase, in der Teilprotokolle für die Ammoniumsulfatfällung und die Chromatographie des Ionenaustauschs diskutiert werden (Abbildung 1). Nach der Definition dieser Subprotokolle wird das interessierende Protein über eine sequentielle Strategie unter Verwendung von Ionenaustausch und Größenausschlusschromatographie mit FPLC extrahiert. Basierend auf diesen Richtlinien kann das endgültige Protokoll individuell für andere Proteine von Interesse angepasst werden.

Abbildung 1: Die Gesamtstrategie dieses Protokolls. Von oben nach unten: Protein wird aus Geweben extrahiert. Gewebehomogenat wird hergestellt, zentrifugiert und filtriert. Für jedes Paar von überstehenden und aus Pellets gewonnenen Proben müssen Tests zur Ammoniumsulfatfällung und zur Ionenaustauschchromatographie (FPLC) durchgeführt werden, um optimale Bedingungen zu untersuchen. Nach der Festlegung dieser Subprotokolle kann das Protein durch ein sequentielles Verfahren der Ammoniumsulfatfällung, der Ionenaustauschchromatographie und der repetitiven Größenausschlusschromatographie (FPLC) bei unterschiedlichen pH- und Salzkonzentrationen extrahiert werden. Alle Schritte müssen von Western Blot kontrolliert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien durchgeführt. Die Schweineniere wurde frisch aus dem örtlichen Supermarkt bezogen. Lebergewebe wurde von C57BL6-Wildtyp-Mäusen entnommen, die am Institut für Biomedizinische Alternsforschung der Universität Innsbruck, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Österreich, unter der Aufsicht von Univ.-Doz aufbewahrt wurden. Dr. Pidder Jansen-Dürr, 2013 als Projektleiter ethisch zugelassen (BMWF-66.008/0007-II/3b/2013). Die Wartung und Verwendung der Mäuse für das Projekt ist durch die ethische Genehmigung Nr. 2020-0.242.978 vom 5. Mai 2020 des österreichischen Bundesministeriums für Bildung, Wissenschaft und Forschung (BMBWF) abgedeckt.

1. Vorbereitungen

HINWEIS: Bevor das Protokoll beginnt, müssen mehrere Dinge vorbereitet werden, d.h. der Proteinlysepuffer, die Rohgewebeprobe und ein spezifischer Antikörper, neben allgemeinen Chemikalien und Materialien.

1. Bereiten Sie 250 ml Proteinlysepuffer pro 100 g Nettogewicht des Gewebes vor: 250 ml 1x PBS mit 50 mM NaF, 1 mM PMSF, 2 μg/ml Aprotinin und 1 mM aktiviertem Orthovanadat (siehe Tabelle 1). Filtern Sie die Lösung mit einer 0,22 μm Spritzenfiltereinheit.
   HINWEIS: Die Aktivierung von Orthovanadat ist vor der Anwendung erforderlich, um es in einen stärkeren Inhibitor von Proteintyrosinphosphatasen^{umzuwandeln 18}. Aktiviertes Orthovanadat kann von kommerziellen Anbietern bezogen, aber auch wie folgt hergestellt werden.
   1. Es wird eine 200 mM Stammlösung von (Natrium-) Orthovanadat in ddH₂O hergestellt. Zur Herstellung von 10 ml Lösung 368 mg_Na3VO₄ auf 9 ml Wasser zugeben und durch Rühren auflösen. Nach der Auflösung das Volumen auf 10 ml mit ddH₂O auffüllen.
      HINWEIS: Der Ausgangs-pH-Wert der Natriumorthovanadat-Lösung kann je nach Materialquelle variieren, und der pH-Wert muss in einem sich wiederholenden Ansatz wie folgt auf 10 eingestellt werden.
   2. Abhängig vom anfänglichen pH-Wert der Lösung stellen Sie den pH-Wert mit NaOH oder HCl auf 10 ein. Bei einem pH-Wert > 10 hat die Lösung eine gelbe Farbe. Kochen Sie die Lösung, bis sie farblos wird, kühlen Sie sie auf Raumtemperatur ab und überprüfen Sie den pH-Wert. Wenn der pH-Wert >10 beträgt, fügen Sie ein kleines Volumen HCl hinzu, um den pH-Wert auf 10 einzustellen. An diesem Punkt kann die Lösung wieder gelb werden.
   3. Wiederholen Sie das Kochen und Abkühlen, bis die Lösung farblos bleibt und sich der pH-Wert bei 10 (ca. 5-7 mal) stabilisiert. An diesem Punkt führt die Zugabe von HCl zu einem schwachen Erscheinungsbild der gelben Farbe in der Lösung. Lagern Sie aktiviertes Orthovanadat in 1 ml Aliquots bei -20 °C.
2. Bereiten Sie Röhrchen mit 2 ml Lysepuffer pro Gramm Gewebe vor und legen Sie sie auf Eis.
   HINWEIS: Dieses Protokoll verwendete acht 50-ml-Röhrchen, die jeweils mit insgesamt 30 ml Lysepuffer für eine Schweineniere (ca. 100-150 g) gefüllt waren, und zwei Röhrchen, die jeweils mit 40 ml Lysepuffer für insgesamt 20 Mauslebern (jeweils 1-2 g) gefüllt waren.
3. Bereiten Sie das Gewebe vor: Sezieren Sie das Gewebe auf einer vorgereinigten Glasplatte, die auf Eis in einer Styroporschaumbox platziert ist. Schneiden Sie Gewebestücke von jeweils etwa 100 mg, um sie für die anschließende Lyse leicht in die entsprechenden Röhrchen zu übertragen. Die Gewebestücke werden in die vorbereiteten Röhrchen überführt (Schritt 1.2).
4. Bereiten Sie eine gesättigte Ammoniumsulfatlösung vor: 500 ml ddH 2 O auf₇₀°C erhitzen und unter Rühren nach und nach Ammoniumsulfatpulver (siehe Materialtabelle) hinzufügen, bis kein Ammoniumsulfat mehr gelöst ist. Diese (über)gesättigte Lösung auf Raumtemperatur abkühlen und über Nacht bei 4 °C lagern.

2. Gesamte Proteinextraktion

HINWEIS Nach der Aufbereitung der Probe im kalten Proteinlysepuffer (siehe Schritt 1.3) wird das Gewebe durch Beschallung durch eine Ultraschallsonde oder mit einem elektrischen Homogenisator wie folgt so gut wie möglich homogenisiert.

1. Homogenisierung von Geweben
   1. Im Falle einer Schweineniere beschallen Sie die Suspension vorzugsweise durch eine Ultraschallsonde, während Sie die Probe auf Eis halten (10 Zyklen von 15 s Puls, mit Intervallen von 30 s zwischen den Pulsen, um die Probe auf Eis zu kühlen, bei mittlerer Amplitude mit 50% Tastverhältnis).
   2. Im Falle von Mausorganen homogenisieren Sie die Suspension mit einem elektrischen Homogenisator (beginnend mit einer geringen Kraft und langsam beschleunigend auf mittlere Kraft), während Sie die Probe auf Eis halten. Waschen Sie den elektrischen Homogenisator regelmäßig in PBS, um organisches Material zu entfernen, das das Gerät verstopft.
   3. Nehmen Sie 20 μL aus den Proben und überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die Zellen des homogenisierten Gewebes ordnungsgemäß zerstört werden; Andernfalls wiederholen Sie die Homogenisierung.
2. Zentrifugieren Sie die Röhrchen in einer Tischzentrifuge bei 10.000 x g für 30 min bei 4 °C.
   HINWEIS: Optional zentrifugieren Sie den Überstand ein zweites Mal bei 20.000 x g für 30 min bei 4 °C, um kleine Bruchteile des ursprünglichen Pellets zu eliminieren, die möglicherweise übertragen wurden. Dies vereinfacht die anschließende Filtration in Schritt 2.3.
3. Sammeln Sie den Überstand in einer frischen Tube und legen Sie ihn auf Eis. Filtern Sie den Überstand nacheinander mit 0,45 μm und 0,22 μm Spritzenfiltereinheiten. Aliquotieren Sie den Überstand in 10 ml-Chargen und frieren Sie sie bei -20 °C für eine kurzfristige Lagerung oder bei -80 °C für eine längere Lagerung ein.
   HINWEIS: Die Vorfilterung mit 0,45 μm entfernt den Großteil der Partikel, bevor ein zweiter Filterschritt mit 0,22 μm die feineren Partikel entfernt. Die direkte Verwendung des 0,22-μm-Filters kann das Risiko einer Verstopfung der Filter verursachen.
4. Bereiten Sie eine 50-μL-Probe für die SDS-PAGE/Western-Blot-Analyse vor, indem Sie 10 μL 5x SDS-Probenpuffer (siehe Tabelle 1) in 40 μL des Überstands geben und dann bei 95 °C für 10 min sieden.
   1. Optional werden etwa 100 μL Pellet, das in Schritt 2.2 in 900 μL_ddH2Oerhalten wurde, resuspendiert und eine Probe für die SDS-PAGE/Western-Blott-Analyse wie oben beschrieben vorbereitet.
      HINWEIS: Die Einbeziehung von aus Pellets gewonnenen Proben in die Western-Blot-Analyse zeigt zusätzlich zur Positivkontrolle an, ob die Expression des Proteins niedrig oder der Antikörper problematisch ist.

3. SDS-PAGE und Western Blot Analyse

HINWEIS: Eine Western-Blot-Analyse ist erforderlich, um die Proteinlöslichkeit zu überprüfen. Im Folgenden wird ein Protokoll für das Elektroblotting unter Verwendung eines Nass-/Tank-Blotting-Systems beschrieben (siehe Materialtabelle). Ein alternatives Protokoll für SDS-PAGE finden Sie an anderer Stelle¹⁹.

1. Bereiten Sie ein diskontinuierliches 12,5% Polyacrylamid-SDS-PAGE-Gel gemäß den Anweisungen des Herstellers vor (d. h. ein Stapelgel auf einem auflösenden Gel; siehe Tabelle 1). Führen Sie die zuvor in Schritt 2 vorbereiteten Beispiele aus (ähnlich den Schritten 4, 5 und 6; siehe unten).
   1. Laden Sie eine Proteinmarkerleiter in die erste Vertiefung (siehe Materialtabelle). 5 ng rekombinantes hFAHD1-Protein (gewonnen aus Bakterien¹²; siehe Tabelle 1) als Positivkontrolle in das zweite Well.
   2. Laden Sie anschließend 20 μL der zu analysierenden Probe und füllen Sie alle verbleibenden Vertiefungen mit 20 μL vorbereitetem SDS-PAGE 1x Probenpuffer (d.h. 5x Probenpuffer verdünnt mit ddH₂O). Lassen Sie die SDS-PAGE-Gele mit dem SDS-Laufpuffer bei 125 V laufen (siehe Tabelle 1).
2. Nachdem SDS-PAGE abgeschlossen ist, führen Sie eine Western-Blot-Analyse durch und untersuchen Sie die Membranen mit dem verfügbaren Antikörper, der gegen FAHD1 erhoben wird (siehe Tabelle 1).
   HINWEIS: Da die Proben aus rohem Gewebehomogenat entnommen werden, ist die Qualität der SDS-PAGE und der Western-Blot-Analyse an dieser Stelle in der Regel beeinträchtigt. Es ist jedoch wichtig zu überprüfen, ob das zu extrahierende Protein im Überstand löslich ist. Das folgende Protokoll wurde auf Schweineniere und verschiedene Mausorgane, einschließlich Leber, Herz, Gehirn und Niere, getestet.
   1. Bereiten Sie den 10-fachen Western Blot-Transferpuffer vor (siehe Tabelle 1). Bereiten Sie den 1x Western Blot Transferpuffer vor (siehe Tabelle 1) und kühlen Sie ihn auf 4 °C ab.
   2. Aktivieren Sie eine PVDF-Membran für 2 min in Methanol. Waschen Sie die Membran in ddH 2 O für₂min. Ausgleich der Membran für 15 min in 1x Western Blot Transfer Buffer.
   3. Waschen Sie das SDS-Gel mit 1x PBS für 10 min während des Schüttelns, um den SDS-laufenden Puffer zu entfernen, und inkubieren Sie dann das Gel in 1x Western Blot Transfer Buffer für 10 min zur Gleichgewichtung. Montieren Sie die Elektroblotting-Kassette (d. h. kombinieren Sie die aktivierte PVDF-Membran und die Gele) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   4. Führen Sie den Blot per Elektroblotting bei 300 mA für 1 h in einer mit Eis gefüllten Polystyrolschaumbox oder im Kühlraum (4 °C) aus. Übertragen Sie die PVDF-Membran in ein 50-ml-Rohr, dessen freiliegende Seite der Innenseite des Rohrs zugewandt ist. Inkubieren Sie die Membran in 20 ml Western Blot-Blocking-Puffer (siehe Tabelle 1) über Nacht bei 4 °C, während Sie auf einer Rohrwalze rollen (siehe Materialtabelle).
   5. Waschen Sie die Membran am nächsten Tag 5 Minuten lang mit 20 ml Western Blot-Waschpuffer (PBS mit 0,1% (v/v) Tween 20) im selben Rohr während des Rollens. Inkubieren Sie die Membran im selben Röhrchen mit dem primären Antikörper² (der auf FAHD1 abzielt; siehe Tabelle 1) verdünnt 1:500 im Western Blot-Blocking-Puffer für 1 h bei Raumtemperatur während des Rollens.
   6. Waschen Sie die Membran im selben Schlauch dreimal für jeweils 10 Minuten mit 20 ml Western Blot Waschpuffer während des Walzens. Inkubieren Sie die Membran für 30 min bei Raumtemperatur mit HRP-konjugiertem Sekundärantikörper (siehe Materialtabelle), verdünnt 1:3000 in 5 ml Western Blot Blocking Buffer.
   7. Waschen Sie die Membran im selben Schlauch dreimal für jeweils 10 min mit 20 ml Western Blot Waschpuffer und zweimal für jeweils 5 min mit 1x PBS. Trocknen Sie die Membran, indem Sie sie vorsichtig mit einer Pinzette an einer Kante halten und ein Stück Zellulose oder ein Stück Whatman-Papier mit dem gegenüberliegenden (unteren) Rand der Membran berühren. Legen Sie die Membran (freiliegende Seite nach oben) auf eine gereinigte Glasplatte.
   8. Bedecken Sie die gesamte Membran vorsichtig mit 1 ml vorbereitetem ECL-Western-Blot-Substrat mit einer Pipette und achten Sie darauf, keine Luftblasen zu erzeugen. Lassen Sie die ECL-Lösung 3 min inkubieren und entwickeln Sie die Membran sofort mit Röntgenfilm oder mit einem Bildgebungssystem.
      HINWEIS: Wenn das Protein in keiner der Proben, sondern nur in der Positivkontrolle nachgewiesen wurde, kann dies darauf hindeuten, dass das Protein unlöslich ist oder nicht in ausreichenden Mengen vorhanden ist, um vom Antikörper nachgewiesen zu werden. Wenn nur Nanogramm der Positivkontrolle geladen würden, ist das erste Szenario wahrscheinlicher. Wenn überhaupt kein Protein nachgewiesen wurde, überprüfen Sie die Qualität des Antikörpers und wechseln Sie möglicherweise zu einem polyklonalen Antikörper anstelle eines monoklonalen Antikörpers. In seltenen Fällen, z. B. bei einigen hydrophoben Proteinen, kann das Protein nach der Zentrifugation nachweisbar sein, jedoch nicht nach der Filtration. In einem solchen Fall empfiehlt es sich, spezielle Filtereinheiten für hydrophobe Proteine zu verwenden.
3. Optional färben Sie die PVDF-Membranen nach Western Bplot, um den erfolgreichen Transfer des Proteins vom SDS-PAGE-Gel auf die PVDF-Membran zu kontrollieren.
   HINWEIS: Die Coomassie-Färbung wird für die Fehlerbehebung, Methodenentwicklung und Dokumentation empfohlen, aber beachten Sie, dass nach der Anwendung dieses Protokolls Membranen für weitere westliche Fleckenanalysen verloren gehen. Die Ponceau S-Färbung führt zu einer schwächeren Färbung, kann jedoch verwendet werden, wenn die Membranen erneut untersucht werden sollen.
   1. Bereiten Sie kleine Schalen vor, die die Färbelösungen (Coomassie oder Ponceau S) und Entfärbungslösungen enthalten.
   2. Mit einer Pinzette die Membran in die Färbelösung geben und vorsichtig schütteln, bis die Membran gut gefärbt ist (5-10 min).
   3. Die Membran in die Färbelösung geben und schütteln, bis die Lösung gesättigt ist (5-10 min). Wiederholen Sie den Färbungsschritt, bis die Proteinbänder auf der Membran beobachtet werden können; Wenn überhaupt keine Bänder beobachtet werden, wiederholen Sie die Färbung mit einer längeren Inkubationszeit. Trocknen Sie die Membran, indem Sie sie mit einer Pinzette auf eine Glasplatte legen.

4. Prüfung: Ausfällung von Ammoniumsulfat

HINWEIS: Die Ausfällung von Ammoniumsulfat ist eine Methode der Proteinreinigung durch Veränderung der Löslichkeit des Proteins. In einem vorläufigen Experiment wird die Ammoniumsulfatkonzentration sequentiell auf einen Wert erhöht, der eine maximale Menge an Proteinverunreinigungen ausfällt, während FAHD1 in Lösung bleibt. Die Löslichkeit des Proteins wird erneut mittels Western-Blot-Analyse untersucht.

1. Fahren Sie mit Schritt 2.3 fort: Tauen Sie entweder ein Aliquot der Probe auf oder fahren Sie direkt nach der Proteinextraktion fort (d. h. ohne die Probe einzufrieren). Filtern Sie die Probe mit einer 0,22 μm Filtereinheit, um mögliche Ausfällungen nach dem Auftauen auszuschließen. Bereiten Sie sechs 1,5-ml-Röhrchen auf Eis vor und übertragen Sie 250 μL Probe in jedes Röhrchen.
2. Bereiten Sie eine Verdünnungsreihe von 5%, 10%, 15%, 20%, 25% und 30% Ammoniumsulfat in den oben hergestellten Röhrchen vor und machen Sie das Endvolumen auf 1000 μL mit Proteinlysepuffer aus. Inkubieren Sie die Proben bei 4 °C über Nacht auf einem Röhrchenrotator (siehe Materialtabelle).
3. Mit einer Tischzentrifuge bei 10.000 x g für 30 min bei 4 °C zentrifugieren und alle Überstände vorsichtig in separate Röhrchen überführen. Die resultierenden Pellets an der Luft trocknen und jedes von ihnen in 1000 μL von ddH₂O resuspendieren.
4. Für jedes Paar resuspendiertes Pellet und Überstand aus dem vorherigen Schritt 40 μL mit 10 μL 5x SDS-Probenpuffer mischen und bei 95 °C mit offenen Deckeln kochen, bis der größte Teil der Flüssigkeit verdampft ist. Dann suspendieren Sie das Pellet in einer Mischung von 50% DMSO in ddH₂O.
5. Führen Sie SDS-PAGE (Schritt 3) durch, aber lassen Sie die Gele bei 80 V für 3 h laufen. Für jede Konzentration von Ammoniumsulfat werden die aus dem resuspendierten Pellet und dem Überstand (Schritt 4.3) gewonnenen Proben paarweise geladen. Führen Sie eine Western-Blot-Analyse durch (Schritt 3).
6. Überprüfen Sie auf die höchste Konzentration von Ammoniumsulfat, bei der das zu reinigende Protein (dh FAHD1) in der aus dem Überstand gewonnenen Probe verbleibt. Basierend auf den Ergebnissen definieren Sie ein Ammoniumsulfat-Fällungsprotokoll für das interessierende Protein, das in zukünftigen Experimenten verwendet werden soll.
   HINWEIS: Es ist bekannt, dass Ammoniumsulfat SDS-PAGE und Western Blot verzerrt. Wenn die Konzentration von Ammoniumsulfat zunimmt, wird die Qualität der Western Blot-Analyse beeinträchtigt. Wie bei Schritt 3 zuvor wird diese Analyse jedoch verwendet, um die Löslichkeit des interessierenden Proteins bei bestimmten Konzentrationen von Ammoniumsulfat zu überprüfen. Dieses Protokoll zielt darauf ab, andere Proteine auszufällen, während das zu reinigende Protein löslich bleiben muss.

5. Testen: Ionenaustauschchromatographie mit FPLC

HINWEIS: Moleküle mit geladenen funktionellen Gruppen sind für die FPLC an eine Kieselsäurepartikelsäule gebunden, was die Differenzierung von Proteinen nach ihrer Oberflächenladung ermöglicht. Führen Sie diesen Schritt zweimal aus, indem Sie die kationische Austauschspalte und die anionische Austauschspalte verwenden (siehe Tabelle der Materialien). Die Protokollschritte sind für die kationische oder anionische Austauschchromatographie gleich, aber die zu verwendenden Puffer sind unterschiedlich (siehe Tabelle 1); sowohl mit "salzarmen" 15 mM NaCl als auch mit "salzreichen" 1 M NaCl-Bedingungen. Für die verwendeten Säulen wird ein Durchfluss von 1 ml/min empfohlen.

1. Richten Sie das FPLC-System mit der anionischen oder kationischen Austauschsäule ein. Waschen Sie die Säule mit 5 Säulenvolumina (CVs) von 20% EtOH (in H2 O), gefolgt von 5 CVs von ddH₂O. Alternativ waschen Sie die Säule mit 1 CV niedrigem Salzpuffer, hohem Salzpuffer und wieder niedrigem Salzpuffer in der Reihenfolge, bis keine Peaks mehr im Chromatogramm beobachtet werden, aber waschen Sie mindestens einmal.
2. Nach der Bestimmung des optimalen Protokolls für die Ammoniumsulfatfällung auf kleiner Skala (Schritt 4) wenden Sie das Fällungsprotokoll auf 10 ml ursprüngliches Gewebehomogenat an (Schritt 2). Optional dialysieren Sie die Probe gegen den niedrigen Salzpuffer.
   1. Tragen Sie die Probe auf die Säule auf (z. B. durch Injektion oder mit einer Probenpumpe) und sammeln Sie den Durchfluss. Waschen Sie die Säule mit 1 CV des salzarmen Puffers.
3. Richten Sie eine lineare Gradientenelution von 100% niedrigem Salzpuffer / 0% hohem Salzpuffer zu 0% niedrigem Salzpuffer / 100% hohem Salzpuffer innerhalb von 3 CVs ein. Sammeln Sie kontinuierlich 1 ml Fraktionen. Nachdem der Gradient beendet ist, laufen Sie mit dem hohen Salzpuffer weiter, bis keine proteinassoziierten Peaks (UV-Absorption bei 280/255 nm) mehr im Chromatogramm über den Bereich von 1 CV nachgewiesen werden.
4. Tragen Sie 1 ml 25% SDS auf, gelöst in 0,5 M NaOH (in ddH₂O), um die Säule zu reinigen. Waschen Sie die Säule nacheinander mit 3 CVs von ddH 2 O und3 CVs von 20% EtOH (in ddH₂O).
5. Sammeln Sie SDS-PAGE-Proben aller Peak-Fraktionen und des Durchflusses und untersuchen Sie sie über Western Blot auf das Vorhandensein des interessierenden Proteins (Schritt 3). Die gesammelten Fraktionen in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 °C lagern.
6. Nachdem die Western Blot-Analyse abgeschlossen ist, tauen und sammeln Sie die Fraktionen, die das interessierende Protein enthalten, und verwerfen Sie die anderen. Wiederholen Sie die Schritte 5.1-5.5 mit der alternativen Spalte (d. h. kationische oder anionische Austauschspalte).
7. Nachdem beide Säulen untersucht wurden, definieren Sie ein FPLC-Protokoll für das interessierende Protein, das in zukünftigen Experimenten verwendet werden soll. Reduzieren Sie das Volumen der Proteinlösung mit Ultrazentrifugationsfiltereinheiten (10 kDa, siehe Materialtabelle) auf 2 ml.
   HINWEIS: Es gibt zwei erwartete Ergebnisse dieser Versuchsreihe. Entweder hat sich das interessierende Protein an eine der Säulen gebunden, und die Proteinlösung ist nach der Elution bereits recht rein, oder das Protein verblieb in beiden Fällen im Durchfluss. Im letzteren Szenario könnte der Reinigungseffekt dieses Schritts, obwohl sich das Protein im Durchfluss befindet, immer noch signifikant sein. In einem solchen Fall, wie bei FAHD1 in Schweineniere und Mausleber, wird dieser Schritt des Ionenaustauschs noch durchgeführt. Wenn weder die kationische noch die anionische Austauschsäule einen angemessenen Reinigungseffekt erzielen kann, kann versucht werden, den pH-Wert des Lysats und des Puffers zu ändern und die Probe vor der Anwendung auf FPLC gegen den laufenden Puffer zu dialysieren.

6. Proteinextraktion unter Verwendung definierter Subprotokolle für Ammoniumsulfatfällung und FPLC

HINWEIS: Poröse Partikel in einer Kieselgelsäule für FPLC (siehe Materialtabelle) ermöglichen die Differenzierung von Proteinen nach ihrem hydrodynamischen Radius. Die beschriebenen Schritte sind mit einem FPLC-System unter Verwendung der Größenausschlusschromatographie (SEC) durchzuführen. Für die verwendete SEC-Spalte (siehe Materialtabelle) wird ein Durchfluss von 0,3 ml/min empfohlen.

1. Bereiten Sie alle erforderlichen Materialien vor (siehe Schritt 1) und extrahieren Sie das Gesamtprotein aus dem Gewebe (siehe Schritt 2). Führen Sie eine Ammoniumsulfatfällung mit dem gesamten Gewebehomogenat durch, das nicht zum Testen verwendet wurde (siehe Schritt 4). Bei größeren Volumina konzentrieren Sie das Lysat mit Ultrazentrifugationsfiltereinheiten (10 kDa; siehe Materialtabelle) auf ein kleineres Volumen von 50 ml oder weniger.
2. Führen Sie einen ersten Reinigungsschritt mittels Ionenaustauschchromatographie durch (siehe Schritt 5).
   1. Bereiten Sie Proben für Western Blot vor, wie in den vorherigen Schritten beschrieben. Führen Sie eine Western-Blot-Analyse durch und legen Sie alle FAHD1-haltigen Fraktionen aus der Ionenaustauschchromatographie zusammen.
   2. Reduzieren Sie das Volumen der Proteinlösung mit Ultrazentrifugationsfiltereinheiten (10 kDa) auf bis zu 2 ml. Filtern Sie die Lösung nacheinander mit 0,45 μm und 0,22 μm Spritzenfiltereinheiten, um Mikrofällungen zu entfernen.
3. Gleichen Sie die SEC-Spalte mit 1 CV des laufenden SEC-Puffers aus (siehe Tabelle 1), der 1 mM DTT enthält. Laden Sie die Probe auf die Säule und führen Sie die Chromatographie durch, bis alle Proteine eluiert sind (1-2 CV).
   1. Sammeln Sie Fraktionen von 1 ml des Durchflusses, der signifikanten Peaks im Chromatogramm entspricht (UV-Absorption bei 280/255 nm) und bereiten Sie 50 μL-Proben jeder gesammelten Fraktion für die SDS-PAGE- und Western-Blot-Analyse vor, wie in den vorherigen Schritten beschrieben. Alle Fraktionen mit flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 °C lagern.
4. Waschen Sie die SEC-Säule nacheinander mit 1 CV von ddH 2 O und1 CV von 20% EtOH (in ddH₂O). Führen Sie eine Western-Blot-Analyse durch und bündeln Sie alle FAHD1-haltigen Fraktionen. Reduzieren Sie das Volumen der Proteinlösung auf 2 ml mit Ultrazentrifugationsfiltereinheiten (10 kDa, siehe Materialtabelle).
5. Beurteilen Sie die Proteinkonzentration mit einem kommerziellen BCA-Assay-Kit (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Der pH- und Salzgehalt der mobilen Phase kann das Elutionsprofil von globulären Proteinen^{beeinflussen 20}. Saure oder basische Bedingungen können dazu führen, dass Peaks weniger definiert sind und Protein-Matrix-Wechselwirkungen zunehmen, was zu einer teilweisen Retention von Protein auf der Spalte²⁰ führt. Dieser Effekt kann für eine weitere Proteinreinigung ausgenutzt werden. Eine Wiederholung von Schritt 6 mit unterschiedlichen Flussraten, pH-Wert und Salzkonzentrationen kann die Reinheit des Proteins²⁰ verbessern.

7. Silberfärbung

HINWEIS: Die Silberfärbungsanalyse von SDS-PAGE-Gelen ist erforderlich, um nach Proteinkontaminationen zu suchen, die bei der Coomassie-Färbung möglicherweise nicht beobachtet werden. Das folgende Protokoll ist eine von vielen Versionen, die in der Literatur²¹ zu finden sind. Führen Sie alle Inkubationsschritte durch, indem Sie in einer sauberen Glasschale schütteln. Sammeln Sie alle silber- und formaldehydhaltigen Flüssigkeiten in einem speziellen Abfallbehälter und entsorgen Sie sie ordnungsgemäß.

1. Inkubieren Sie die SDS-PAGE-Gele in silberfarbener Färbefixierlösung (siehe Tabelle 1) über Nacht im Kühlraum. Die Gele werden in silberfärbender Inkubationslösung (siehe Tabelle 1) für 3 h bei Raumtemperatur inkubiert. Optional fügen Sie Glutaraldehyd hinzu (siehe Tabelle 1), um die Erkennung schwacher Banden zu verbessern. Waschen Sie die Gele viermal in ddH₂O für jeweils 10 min.
2. Die Gele werden in silberfärbender Silberlösung (siehe Tabelle 1) für 1 h inkubiert.
   HINWEIS: Beachten Sie, dass von nun an alle Flüssigkeiten und das Gel selbst Silber und Formaldehyd enthalten, die giftig sind.
3. Die Gele werden in einer Silberfärbungs-Entwicklerlösung (siehe Tabelle 1) mit starkem Schütteln inkubiert, bis die Bänder deutlich sichtbar sind. Um die Reaktion zu stoppen, verwerfen Sie die Entwicklerlösung und inkubieren Sie die Gele sofort in Silberflecken-Stopplösung (siehe Tabelle 1) für mindestens 10 min.
   HINWEIS: Bänder, die in den Schritten 7.2 und 7.3 gefärbt sind, werden ständig weiterentwickelt. Die Zugabe von mehr Formaldehyd zur Lösung als angegeben kann erforderlich sein, wenn die Färbung schwach ist.

Das FAHD1-Protein wurde mit dem vorgestellten Protokoll aus Schweineniere und Mausleber extrahiert. Für Mausgewebe sind mehrere Organe erforderlich, um nach dem letzten Reinigungsschritt mehrere μg zu erhalten. Aus diesem Grund konzentriert sich dieser Artikel auf die Extraktion von FAHD1 aus Schweinenieren, was ein viel exemplarischeres Experiment ist. Die Extraktion von FAHD1 aus der Mausleber wird durchgeführt, um die Schwierigkeiten und möglichen Fallstricke dieses Protokolls darzustellen. Es wird allgemein empfohlen, Organe zu verwenden, die ein hohes Expressionsniveau des Proteins aufweisen, das man reinigen möchte. Der Human Protein Atlas²² kann hilfreich sein, um die Expression im Modellsystem abzuschätzen, oder man kann vorläufige Western-Blot-Experimente mit verschiedenen Rohgewebelysaten durchführen, um diese Werte zu beurteilen. Die Positivkontrolle, die in allen westlichen Blot-Analysen verwendet wurde, war ein markiertes rekombinantes Protein, das mit einem etwas höheren Molekulargewicht lief.

Als erstes Experiment wird die Extraktion von FAHD1 aus der Schweineniere vorgestellt. Der Prozess der Gewebehomogenisierung (Schritt 1) und der Gesamtproteinextraktion (Schritt 2) ist in Ergänzender Abbildung 1 dargestellt (siehe Legende für eine Beschreibung der einzelnen Schritte). Ein alizitiertes Zehntel des Gesamtlysats wurde für die folgenden Experimente verwendet.

Die Ammoniumsulfatfällung wurde einmal für dieses Lysat getestet, indem dem Lysat Ammoniumsulfat in verschiedenen Konzentrationen zugesetzt wurde (Schritt 4) (Abbildung 2). Nach der Zentrifugation wurden Pellets und Überstände mit Western Blot unter Verwendung eines definierten polyklonalen Antikörpers 2, der gegen humanes FAHD1 erhoben wurde, beprobt und analysiert^. 200 ng rekombinantes His/S markiertes humanes FAHD1 aus E. coli¹² wurde als Positivkontrolle geladen. Das FAHD1-Proteinband kann bei 25 kDa gesehen werden, während die markierte Positivkontrolle bei 34 kDa verläuft. Basierend auf diesen Daten wurde ein Protokoll definiert, bei dem das Lysat mit 25% Ammoniumsulfat behandelt wird, d.h. Bedingungen, unter denen sich FAHD1 noch im Überstand befindet, während die Mehrheit anderer Proteine ausgefällt wird. Dies ist ein wichtiger Schritt in der Reinigungsstrategie. Die Ausfällung von Ammoniumsulfat ist ein effektiver Reinigungsschritt, bevor Sie mit anderen Methoden fortfahren. Bemerkenswert ist, dass Ammoniumsulfatmengen, die höher als 30% sind, nicht verwendet werden, da Ammoniumsulfat allmählich die Qualität von SDS-PAGE und Western Blot verzerrt.

Abbildung 2: Ammoniumsulfatfällung und Western Blot Screening auf Schweine FAHD1. (A) Ammoniumsulfat wurde dem Lysat in verschiedenen Konzentrationen (maximal 5 % bis 25 %) zugesetzt, um Proteine aus der Lösung auszufällen. (B) Das Vorhandensein von Schweine-FAHD1 (25 kDa) wurde in den einzelnen Paaren von Pellets und Überständen, die unterschiedlichen Ammoniumsulfatkonzentrationen entsprechen, über Western Blot unter Verwendung eines polyklonalen Antikörpers, der gegen humanes FAHD1 erhoben wird, bestimmt. Der Überstand, der einer Ausfällung von 25% Ammoniumsulfat entspricht, zeigt immer noch das Vorhandensein von Schweine-FAHD1 im Überstand, der gleichzeitig eine gute Menge anderer Proteine ausfällt. 200 ng His/S-markiertes rekombinantes Protein wurden als Positivkontrolle geladen (34 kDa). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Nach dem Testen von Ionenaustauschsäulen mit FPLC wurde eine Strategie definiert, bei der Schweine-FAHD1 im Durchfluss einer anionischen Austauschchromatographie bei pH 9 verbleibt (Schritt 5). Beginnend mit Lysat, das durch Ammoniumsulfatfällung bei 25% erhalten wurde (wie in früheren Testexperimenten definiert), wurde die anionische Austauschchromatographie verwendet, um weitere Proteine aus der Lösung zu eliminieren (Abbildung 3A). Bindungsproteine wurden durch Elution aus der Säule entfernt, während der Durchfluss über SEC bei pH 7,4 weiter gereinigt wurde (Abbildung 3B). Nach beiden Schritten identifizierte die Western-Blot-Analyse alle Fraktionen, die Schweine FAHD1 enthielten, die gepoolt und auf 2 ml konzentriert wurden.

Abbildung 3: Reinigung von Schweinen FAHD1 mit FPLC - Teil 1. Rote Pfeile im Chromatogramm und Flecken weisen auf das Vorhandensein von FAHD1 hin. Im Chromatogramm bezeichnet "UV" die UV-Absorption bei 280 nm, "Cond" bezeichnet die Leitfähigkeit (bezogen auf die Salzkonzentration im Puffer) und "Conc B" bezeichnet den Prozentsatz des hohen Salzpuffers im Puffergradienten (0% reiner niedriger Salzpuffer; 100% reiner Salzpuffer). (A) Reinigung von Schweinen FAHD1 aus Lysat, das durch Ammoniumsulfatfällung bei 25% mit einer anionischen Austauschsäule (FPLC) gewonnen wird. Während viele Proteine an die Säule binden, findet sich im Durchfluss Schweine FAHD1. Schmutz und Nicht-Protein-Verunreinigungen werden durch Elution aus der Kolonne entfernt, während der Durchfluss weiterverarbeitet wird. (B) Der Durchfluss aus der vorherigen anionischen Austauschchromatographie in (A) wird mittels Größenausschlusschromatographie (FPLC) bei pH 7,4 weiter gereinigt. (A,B) Western Blot-Analyse (abgeschnittene Blots am Boden) identifizierte Fraktionen, die Schweine FAHD1 enthalten, die gepoolt und konzentriert sind. Die vollständigen Blots zeigen die Coomassie-gefärbte Membran nach der westlichen Blot-Analyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die gefilterte Probe wurde erneut auf SEC aufgetragen, jedoch unter Pufferbedingungen bei pH 9 (siehe Tabelle 1) (Abbildung 4). Die Begründung für diesen Ansatz ist, dass der pH- und Salzgehalt der mobilen Phase das Elutionsprofil von globulären Proteinen²⁰ beeinflussen kann und ein verbessertes Elutionsprofil für FAHD1 unter diesen Pufferbedingungen gefunden wurde. Eine Fraktion enthielt Protein mit ausreichenden Reinheitsgraden für grundlegende Enzymaktivitätsassays^12, um schließlich die Identität des Proteins zu bestätigen.

Abbildung 4: Reinigung von Schweinen FAHD1 mit FPLC - Teil 2. Rote Pfeile im Chromatogramm und Flecken weisen auf das Vorhandensein von FAHD1 hin. Proteinproben, die zuvor mit anionischem Austausch und Größenausschlusschromatographie gereinigt wurden, werden mittels Größenausschlusschromatographie (FPLC) bei pH 9 (oberes Panel) weiter gereinigt. Die westliche Blott-Analyse, die unten rechts dargestellt ist, identifiziert Brüche, die Schweine FAHD1 enthalten, die gepoolt und konzentriert sind (untere Tafeln). Der Klecks unten links zeigt die Coomassie-Färbung der Membran nach dem westlichen Klecks. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Eine alternative Strategie (d.h. SEC, gefolgt von einer Ionenaustauschchromatographie) wurde mit 2 ml des nach der Ammoniumsulfatfällung erhaltenen Lysats getestet (Schritt 4) (Ergänzende Abbildung 2). Die Begründung für dieses Experiment ist, dass durch die erste Verwendung von SEC die FAHD1-haltigen Fraktionen von der Mehrheit der anderen Proteine getrennt werden können, während eine nachfolgende Ionenaustauschchromatographie verwendet werden kann, um das Protein weiter zu reinigen. Zunächst wurde das Lysat mit SEC bei pH 7,4 fraktioniert (Schritt 6). Die westliche Blott-Analyse identifizierte alle Fraktionen, die Schweine FAHD1 enthielten. Zweitens wurden diese Fraktionen mit einer anionischen Austauschsäule bei pH 9 konzentriert und weiter gereinigt (Schritt 5). Die Chromatogramme und die Western-Blot-Analyse (Ergänzende Abbildung 2) zeigen, dass diese Strategie ermutigend ist, da das Ionenaustauschchromatogramm einen definierten schmalen Peak zeigt, der mit angereicherten Proteinspiegeln im Western Blot assoziiert ist. Der Nachteil dieser Strategie besteht jedoch darin, dass sie durch das anfängliche Volumen begrenzt ist, das auf die SEC (2 ml) angewendet werden soll, so dass der Durchsatz dieser Methode sehr gering ist. Die Verarbeitung einer ganzen Schweineniere zum Beispiel ist nicht praktikabel.

Als weitere Modifikation dieses Protokolls wurde eine kationische Austauschsäule vor der anionischen Austauschsäule eingefügt, wenn das Schwein FAHD1 ebenfalls im Durchfluss vorhanden war. In jedem Schritt des Protokolls wurden Proben des Schweins FAHD1 mit Fraktionen beprobt und mit einem ODx-Assay getestet, wie an anderer Stelle¹² beschrieben (Ergänzende Abbildung 3). Die spezifische enzymatische Aktivität nimmt zusammen mit dem Reinheitsgrad zu, d.h. zusammen mit der zunehmenden relativen Menge an FAHD1 pro Gesamtprotein.

Als zweites Beispiel wird die Extraktion von FAHD1 aus der Mausleber vorgestellt, d.h. eine Sammlung von Lebergewebe, das von 20 Mäusen gewonnen wird. Im Vergleich zur oben vorgestellten Extraktion von FAHD1 aus der Schweineniere erwies sich diese Extraktion als mühsamer. In mehreren Schritten des Protokolls traten Probleme auf, die im Folgenden vorgestellt werden. Das Gesamtprotein wurde wie in Schritt 2 beschrieben extrahiert (Ergänzende Abbildung 4). Da Mausleberhomogenat dazu neigt, eine sehr klebrige und schleimige Einheit zu sein, wurden Filterpapiere (ähnlich wie Kaffeefiltereinheiten) verwendet, um das Lysat, das nach der Extraktion 1: 3 im Lysepuffer verdünnt wurde, vorzufiltern, um die Lösung mehr wie eine Flüssigkeit zu machen. Diese Verdünnung verbesserte das Filtrationsverfahren; Es machte jedoch den anschließenden Nachweis des Proteins mit Western Blot mühsamer. Nach der Filtration musste das vorbereitete Lysat vor der weiteren Verwendung konzentriert werden. Ein alizitiertes Zehntel des Gesamtlysats wurde für die folgenden Experimente verwendet.

Ein erster Testschritt für die Ammoniumsulfatfällung (Ergänzende Abbildung 4I) zeigte ein mögliches Problem, das auftreten kann. Ammoniumsulfat in höheren Konzentrationen stört SDS-PAGE-Gele und verursacht einen Smile-Effekt, wenn es mit 150 V betrieben wird (Ergänzende Abbildung 5A; negatives Ergebnis). Der gleiche SDS-PAGE-Lauf bei 80 V zeigt ein positives Ergebnis (Ergänzende Abbildung 5B). Im letzteren Fall bildet sich zunächst der Lächeln-Effekt, wird aber letztendlich aufgrund der niedrigeren angelegten Spannung aufgelöst. Da die Ausgangslösung stark verdünnt werden musste, um das Lysat filtrieren zu können, war die anfängliche Western-Blot-Analyse dieser Proben erfolglos, d.h. die Positivkontrolle wurde durch den Antikörper, aber nicht durch das Protein in den applizierten Proben nachgewiesen. Dieses Problem wurde durch eine höhere Konzentration sowohl des Lysats (konzentriert mit zentrifugalen Filtereinheiten) als auch des Antikörpers gelöst, und indem der Antikörper über Nacht im Kühlraum während des Schüttelns aufgetragen wurde. Letztendlich lieferte die Western-Blot-Analyse sowohl die Information, dass das Protein im Lysat vorhanden war, als auch dass das Protein bei 15% Ammoniumsulfat noch im Überstand vorhanden war (Ergänzende Abbildung 5C). Bemerkenswert ist, dass SDS-Proben, die höhere Mengen an Ammoniumsulfat (>15%) enthielten, beim Erhitzen ausfielen und das Protein verloren ging. Dies zeigt sich auch in der Coomassie-Färbung und dem Westernfleck (Ergänzende Abbildung 5C). Dieser Effekt wurde für die Schweineniere nicht beobachtet, so dass er gewebespezifisch sein kann.

Nach der Ausfällung von Ammoniumsulfat bei 15% wurden 10 ml Lysat auf die kationische Austauschchromatographie bei pH 6,8 aufgetragen. Die Western-Blot-Analyse zeigte, dass sich das FAHD1-Protein der Maus im Durchfluss befand (Abbildung 5A). Die eluierte Proteinfraktion scheint gering zu sein; Dieses Beispiel zeigt jedoch einen sekundären Effekt der Ionenaustauschchromatographie. In diesem Schritt des Protokolls kann die Lösung immer noch viele Verbindungen enthalten, die möglicherweise kein Protein sind. Die Ionenaustauschchromatographie ist eine schnelle und einfache Möglichkeit, solche Verunreinigungen loszuwerden. Da die Durchführung der Ionenaustauschchromatographie einige Stunden in Anspruch nimmt (einschließlich aller Waschschritte dauert das Experiment selbst eine halbe Stunde), bietet es eine einfache Methode, um die Probe von Nicht-Proteinkontaminationen zu befreien.

Abbildung 5: Reinigung der Maus FAHD1 mit FPLC. Rote Pfeile im Chromatogramm und Flecken weisen auf das Vorhandensein von FAHD1 hin. (A) Nach der Ausfällung von Ammoniumsulfat bei 15 % wurde die Probe zentrifugiert, filtriert (0,22 μm) und auf eine kationische Austauschsäule aufgebracht. Die Western-Blot-Analyse zeigt, dass sich das Protein im Durchfluss befindet und das Chromatogramm zeigt, dass durch diesen Schritt nicht viel von den anderen Proteinen entfernt wurde. Der Vergleich des Aussehens und der Viskosität des Inputs mit dem Flow-Through zeigt jedoch, dass der gesammelte Flow-Through viel klarer ist (rechtes Feld beim Vergleich von Input und Flow-Through). (B) Der von der kationischen Austauschsäule gesammelte Durchfluss wurde über Zentrifugationsfilter auf 2 ml reduziert und zur Größenausschlusschromatographie bei pH 7,4 angewendet. (C) Die Fraktionen, die FAHD1 enthielten, wurden gepoolt, konzentriert und auf eine zweite Runde der Größenausschlusschromatographie bei pH 9 aufgetragen. (D) Die FAHD1-haltigen Fraktionen wurden erneut gepoolt und mit Silberfärbung auf SDS-PAGE aufgetragen, um die verbleibenden Verunreinigungen zu sehen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die Probe wurde weiter zur Größenausschlusschromatographie bei pH 7,4 eingesetzt (Abbildung 5B). Die Western-Blot-Analyse zeigte Fraktionen, die das FAHD1-Protein der Maus enthielten, die gepoolt und auf 2 ml konzentriert wurden. Dieses 2 ml Konzentrat wurde bei -20 °C mit 10 μL β-Mercaptoethanol eingefroren und am nächsten Tag aufgetaut. Es bildete sich ein Niederschlag, der über Spritzenfiltereinheiten (0,22 μm) gefiltert wurde. Proben für die SDS-PAGE- und Western-Blot-Analyse wurden entnommen, um sicherzustellen, dass das FAHD1-Protein der Maus noch in Lösung war.

Proben, die das Protein enthielten (aus der Western-Blot-Analyse), wurden gepoolt, über Zentrifugationsfilter konzentriert und mit Silberfärbung auf SDS-PAGE aufgetragen, um die verbleibenden Kontaminationen zu sehen (Abbildung 5D). Dies zeigte, dass die Proteinlösung nicht hochrein ist und dass die mit dieser Methode aus der Mausleber gewonnenen Proteinmengen auch nicht sehr hoch waren (insgesamt einige μg, wie mit dem BCA-Assay-Kit bestimmt; siehe Materialtabelle). Der Proteinertrag war bei Schweinen FAHD1 deutlich höher (ca. 1 mg in diesem Schritt). Der Reinheitsgrad des FAHD1-Proteins, das aus der Schweineniere extrahiert wird, beträgt etwa 80% (geschätzt nach Silberfärbung; Daten nicht gezeigt). Diese Reinheit kann beispielsweise durch die Affinitätschromatographie mit einem definierten Antikörper weiter erhöht werden. Solche und andere Einschränkungen dieses Protokolls werden weiter unten im Detail diskutiert.

Tabelle 1.

Ergänzende Abbildung 1: Gesamtproteinextraktion aus der Schweinenieren. (A) Das Nierengewebe wurde mit einem Skalpell auf einer vorbereiteten, ordnungsgemäß gereinigten Glasplatte geschnitten, die auf Polystyrolschaum aufgesetzt war, um ein Verrutschen zu verhindern. (B) 50 ml Röhrchen, die 20 ml eiskalten Lysepuffer mit Protein-/Proteasehemmern enthalten, werden auf Eis inkubiert; (C) Nierengewebestücke wurden in den Puffer gegeben, bis das Volumen etwa 30 ml erreichte; (D) Nierengewebe wurde mittels Ultraschall (d. h. Ultraschall) homogenisiert; (E) Rohhomogenat wurde in einer Tischzentrifuge mit mittlerer Geschwindigkeit für 30 min zentrifugiert. F) mehrere Proben wurden gleichzeitig verarbeitet; (G) nach der ersten Zentrifugation wurde der Überstand in Zentrifugenröhrchen (im Vergleich zu E) überführt und mit hoher Geschwindigkeit (10.000 x g) für 30 min zentrifugiert; (H) dieser Zentrifugationsschritt ergibt ein weiteres Pellet und einen Überstand, der in 50-ml-Röhrchen überführt wird; (I/J) Das Vorlysat wird nacheinander durch 0,45 μm und 0,2 μm Filtereinheiten filtriert, in 10 ml-Chargen aliquotiert und mit flüssigem Stickstoff schockgefroren, um anschließend bei -80 °C gelagert zu werden. Die Western-Blot-Analyse wird verwendet, um das Vorhandensein des Proteins in allen Proben (Pellets, Überstände, gefiltertes Lysat) zu überprüfen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Reinigung von Schweinen FAHD1 mit FPLC; alternative Strategie. Rote Pfeile im Chromatogramm und Flecken weisen auf das Vorhandensein von FAHD1 hin. (A) Reinigung von Schweinen FAHD1 aus Lysat, das durch Ammoniumsulfatfällung bei 25% mit Größenausschlusschromatographie (FPLC) bei pH 7,4 erhalten wird. Die Western-Blot-Analyse identifizierte Fraktionen, die Schweine FAHD1 enthalten, die gepoolt und konzentriert wurden. (B) Proteinproben, die zuvor mit Größenausschlusschromatographie (Panel A) gereinigt wurden, wurden mittels anionischer Austauschchromatographie (FPLC) weiter gereinigt. Die Western-Blot-Analyse identifiziert Fraktionen, die Schweine FAHD1 enthalten, die gepoolt und konzentriert wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: Spezifische Enzymaktivität von Schweinen FAHD1. Spezifische Enzymaktivität als Funktion der zunehmenden Reinheit gemessen. Die Tabelle vergleicht die relative Enzymaktivität (nmol/min) mit der spezifischen Enzymaktivität (μmol/min/mg). Der Assay zeigt nach jedem Reinigungsschritt eine stetig steigende Aktivität von Schweine FAHD1. Im Vergleich zum rekombinanten His/S-human FAHD1 (grün) aus E. coli. ¹² zeigte Schweine FAHD1 eine etwas höhere Aktivität (rot) (n = 3). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 4: Gesamtproteinextraktion aus der Mausleber. (A,B,C) Schockgefrorenes Lebergewebe von 20 Mäusen und Lysepuffer wurden auf Eis in 50 ml Röhrchen hergestellt; (D,E,F) Lebergewebe wurde mittels Ultraschall (d.h. Beschallung) homogenisiert; Rohhomogenat wurde in einer Tischzentrifuge mit mittlerer Geschwindigkeit für 30 min zentrifugiert; der Überstand wurde in Zentrifugenröhrchen überführt und mit hoher Geschwindigkeit (10.000 x g) für 30 min zentrifugiert; (G,H,I) Das Vorlysat wird nacheinander durch Papierfilter, 0,45 μm und 0,2 μm Filtereinheiten filtriert, in 10 ml-Chargen aliquotiert und mit flüssigem Stickstoff schockgefroren, um anschließend bei -80 °C gelagert zu werden. (J) dem Lysat wurde Ammoniumsulfat in verschiedenen Konzentrationen (maximal 5 % bis 30 %) zugesetzt, um Protein aus der Lösung auszufällen; K) Pellets, die nach der Ausfällung von Ammoniumsulfat ( Panel J) gewonnen wurden, wurden in_H2Oresuspendiert, um Proben für SDS-PAGE und Western Blot Analyse zu entnehmen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 5: Ammoniumsulfatfällung und Western Blot Screening für Maus FAHD1. Rote Pfeile in den Flecken weisen auf das Vorhandensein von FAHD1 hin. (A) SDS-PAGE mit Proben, die nach der Ammoniumsulfatfällung bei 125 V gewonnen wurden. Dieses Gel zeigte einen drastischen Lächelneffekt, und ein solches Gel kann nicht bewertet werden. Dies ist ein Beispiel für ein negatives Ergebnis. (B) SDS-PAGE mit den gleichen Proben (Panel A) wurde bis zur Fertigstellung mit 80 V betrieben. Es gibt keinen Lächelneffekt in diesem Gel, und dies ist ein Beispiel für ein positives Ergebnis. (C) SDS PAGE und Western-Blot-Analyse der nach der Ausfällung von Ammoniumsulfat gewonnenen Proben. Proben mit höheren Konzentrationen von Ammoniumsulfat können wie angegeben im Probenpuffer ausfallen. Sie gehen verloren und können nicht mehr erkannt werden, weder durch Coomassie-Färbung (links) noch durch Western-Blot-Analyse (rechts). Die beste Konzentration von Ammoniumsulfat wurde in diesem Fall auf 15% festgelegt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Kritische Schritte im Protokoll
Die Einhaltung gemeinsamer Richtlinien für den Umgang mit Proteinen ist unerlässlich, wie z.B. die Arbeit auf Eis und bei moderaten pH- und Salzbedingungen. Die Verwendung von Proteasehemmern ist für die Methode von Vorteil, während die Verwendung von Proteasom-Inhibitoren dringend empfohlen wird. Das Einfrieren und Auftauen der Probe kann immer zu einer Proteinausfällung (zumindest teilweise) führen, daher sollte jedes aufgetaute Aliquot des anfänglichen Proteinlysats (Schritt 2) kontinuierlich ohne Unterbrechung verarbeitet werden. Die Zentrifugation und Filtration nach dem Auftauen wird im Allgemeinen empfohlen, um Mikrofällungen zu entfernen.

Das anfängliche Proteinlysat, das aus einem Gewebe gewonnen wird, enthält neben Proteinen noch viele Substanzen. Ionenaustauschchromatographiesäulen können verwendet werden, um das Lysat zu entfernen. Selbst wenn das Protein, das man extrahieren möchte, nicht an die Ionenaustauschsäule bindet, kann der Durchfluss viel klarer sein als die Eingangslösung und in nachfolgenden Schritten leichter verarbeitet werden. Dies ist für die Extraktion von FAHD1 aus den Nieren der Maus dargestellt (siehe Abbildung 5A).

Einschränkungen und Modifikationen der Methode
Dieses Protokoll beschreibt ein Protokoll zur Extraktion von FAHD1 aus dem Gewebe. Basierend auf dieser Strategie kann ein allgemeiner Ansatz zur Extraktion von FAHD-Proteinen (FAHD1, FAHD2) aus anderem Gewebe abgeleitet werden, während spezifische Anpassungen für Einzelfälle erforderlich sein können. Die implizite Einschränkung dieser Methode sind die relativen Expressionsniveaus von FAHD1 (oder FAHD-Proteinen) in einem gegebenen Gewebe und die Verfügbarkeit dieses Gewebes in ausreichenden Mengen. Das in diesem Protokoll beschriebene Gesamtschema erfordert zunächst eine hohe Expression des Proteins in einer geeigneten Menge an Gewebe. Es wurden Beispiele für die Extraktion von FAHD1 aus Schweineniere und Mausleber geliefert, bei denen es sich um zwei Organe handelt, die eine hohe Expression des Proteins aufweisen. Bei jedem in diesem Protokoll beschriebenen Schritt kommt es zu einem impliziten Probenverlust, d.h. die geringe Anfangsmenge an Protein wird noch weiter verringert. Letztendlich können mit diesem Protokoll nur geringe Mengen an Protein erreicht werden. Da es sich bei der Schweineniere um ein großes Organ handelt, konnte bei diesem Ansatz etwa ein Gramm Eiweiß (ca. 80% Reinheit; geschätzt) aus zwei Nieren extrahiert werden. Die Anwendung des gleichen Protokolls für die Extraktion von FAHD1 aus der Mausleber erforderte das Sammeln von Leberproben von 20 Mäusen, um am Ende nur wenige μg Protein zu erhalten. Die Erzielung einer höheren Reinheit des Proteins mit den beschriebenen Methoden kann mühsam sein, und die Silberfärbung zeigt, dass nach der Größenausschlusschromatographie noch viele andere Proteine in Lösung sein könnten. Man könnte dieses Protokoll durch Affinitätschromatographie (NHS-aktivierte Säulen) unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers (z. B. CAB025530) erweitern.

Alle hier aufgeführten Protokolle erfordern, dass das Protein, das man extrahieren möchte, löslich ist. Optimale Bedingungen der Ammoniumsulfatfällung und pH/Salz-Anpassungen für die Chromatographie müssen getestet und definiert werden. Falls die Ionenaustauschchromatographie keine guten Aufreinigungsergebnisse liefert, kann die Dialyse gegen einen Chromatographiepuffer vor der Durchführung der FPLC eine Option zur Verbesserung der Löslichkeit des Proteins und der Auflösung der Chromatographie sein. Es wird jedoch nicht empfohlen, das Rohlysat zu dialysieren, da dies zu einer massiven und unkontrollierten Proteinausfällung im Dialyseschlauch führen kann. Probleme können auftreten, wenn das Protein dazu neigt, hydrophob zu sein, und die Protokolle sind möglicherweise nicht anwendbar, wenn das Protein stark hydrophob ist (z. B. Membranproteine). Wenn FAHD-Proteine teilweise unlöslich sind, wie sie für FAHD2 (Daten nicht gezeigt) in einem gegebenen Gewebelysat gefunden wurden, können auch andere Arten der Chromatographie, zum Beispiel die hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC), erforscht^{werden 12}.

Zwei Modifikationen des Standardprotokolls wurden im Abschnitt "Ergebnisse" gezeigt. Für die Reinigung von FAHD1 aus einer Schweineniere wurde vor der Ionenaustauschchromatographie die Größenausschlusschromatographie verwendet (siehe Ergänzende Abbildung 2). Ein Problem bei dieser Methode ist, dass die Größenausschlusschromatographie größere Laufspuren aufweist und das Probenvolumen während des Laufs stark zunimmt. Das Probenvolumen sollte 2% des Bettvolumens nicht überschreiten, um eine hohe Auflösung²³ zu erreichen, und der endgültige Verdünnungsfaktor hängt auch vom gesammelten Elutionsvolumen ab. Im bereitgestellten Beispiel mit einer 120-ml-Spalte wird ein Anfangsvolumen von 2 ml empfohlen. Die Ausgangsprobe kann aus mehreren ml des Lysats nach der Ausfällung von Ammoniumsulfat durch Konzentration unter Verwendung von Zentrifugalfiltereinheiten ohne Aggregations- oder Fällungsartefakte entnommen werden. Ein Beispiel für die Reinigung von FAHD1 aus einer Schweineniere wird als repräsentatives Ergebnis bereitgestellt (siehe auch Ergänzende Abbildung 2). Die Beschränkung auf nur kleine Stichprobenvolumina kann diesen Ansatz jedoch unpraktikabel machen.

Anwendungen oder Richtungen des Verfahrens
Die Expression und Reinigung von rekombinanten Proteinen aus Bakterien ist eine einfache und gut etablierte Methode, um machbare Mengen (in Gramm) von Protein^24,25 zu erhalten. Dieser wurde für FAHD1¹² vorgestellt. Es gibt jedoch mehrere mögliche Nachteile bei der Verwendung dieser Methoden, wie z.B. mögliches schlechtes Wachstum des Wirts, Einschlusskörperbildung, Verlust oder veränderte Proteinaktivität und daher die Möglichkeit, überhaupt kein Protein zu erhalten oder zu einer verzerrten Form des Proteins zu führen (Fehlfaltung, schlechte posttranslationale Modifikationen usw.). Die Entwicklung von Methoden, die gut gefaltetes und richtig modifiziertes Protein direkt aus dem Gewebe extrahieren können, ist daher ansprechend. Das Hauptproblem ist jedoch, dass die meisten Proteine nicht in signifikanten Mengen exprimiert werden, und verglichen mit der impliziten Induktion und anschließenden Extraktion von Protein aus Bakterien ist die Menge des zu erhaltenden Proteins typischerweise um mehrere Größenordnungen niedriger. Es gibt einen Kompromiss zwischen der kostengünstigen und einfachen Extraktion von rekombinantem Protein aus Bakterien und der teureren und mühsameren Extraktion von Protein aus Gewebe. Der größte Fortschritt bei letzterem ist, dass man das Protein in seiner physiologischen Form, die im Gewebe vorhanden ist, extrahieren kann, einschließlich aller gegenseitigen Wirkungen, die seine faltende und / oder katalytische Aktivität beeinflussen können.

Protein, das durch dieses Protokoll extrahiert und gereinigt wird, wird dazu beitragen, kompetente Inhibitoren von FAHD1¹³, mögliche Proteininteraktionspartner 9 und mögliche, aber unentdeckte Rollen des Proteins⁹ zu identifizieren. Das Studium enzymatischer Inhibitoren, die Entwicklung monoklonaler Antikörper und das Studium der Proteinstruktur werden in erster Linie stark unterstützt, wenn Protein in hoher Reinheit aus Gewebe extrahiert und nicht aus Bakterien extrahiert wird.

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Die Autoren sind sehr dankbar für die technische Unterstützung durch Ayse Öztürk und Eva Albertini. Mäuse, die zur Erzeugung von Lebergewebe verwendet wurden, wurden unter der Aufsicht von Univ.-Doz gepflegt. Dr. Pidder Jansen-Dürr (Institut für Biomedizinische Alternsforschung an der Universität Innsbruck, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Österreich).