Cristallizzazione su chip e diffrazione seriale su larga scala a temperatura ambiente

Questo contributo descrive come impostare la cristallizzazione delle proteine su dispositivi cristallo su cristallo e come eseguire la raccolta automatica di dati seriali a temperatura ambiente utilizzando la piattaforma di cristallizzazione su chip.

Le reazioni biochimiche e i processi biologici possono essere meglio compresi dimostrando come le proteine passano tra i loro stati funzionali. Poiché le temperature criogeniche non sono fisiologiche e possono prevenire, scoraggiare o addirittura alterare la dinamica strutturale delle proteine, è altamente auspicabile un metodo robusto per esperimenti di diffrazione a raggi X di routine a temperatura ambiente. Il dispositivo cristallo su cristallo e l'hardware e il software di accompagnamento utilizzati in questo protocollo sono progettati per consentire la diffrazione a raggi X in situ a temperatura ambiente per cristalli proteici di diverse dimensioni senza alcuna manipolazione del campione. Qui presentiamo i protocolli per i passaggi chiave dall'assemblaggio del dispositivo, alla cristallizzazione su chip, alla scansione ottica, al riconoscimento dei cristalli, alla pianificazione dei colpi a raggi X e alla raccolta automatica dei dati. Poiché questa piattaforma non richiede la raccolta di cristalli né altre manipolazioni del campione, centinaia di migliaia di cristalli proteici cresciuti su chip possono essere introdotti in un fascio di raggi X in modo programmabile e ad alto rendimento.

A causa degli effetti ionizzanti delle radiazioni a raggi X, la cristallografia delle proteine, in larga misura, è stata limitata alle condizioni criogeniche negli ultimi tre decenni. Pertanto, l'attuale conoscenza dei movimenti delle proteine durante la sua funzione deriva in gran parte da confronti tra strutture statiche osservate in diversi stati in condizioni criogeniche. Tuttavia, le temperature criogeniche ostacolano inevitabilmente la progressione di una reazione biochimica o l'interconversione tra diversi stati conformazionali mentre le molecole proteiche sono al lavoro. Per osservare direttamente la dinamica strutturale delle proteine a risoluzione atomica mediante cristallografia, sono necessari metodi robusti e di routine per condurre esperimenti di diffrazione a temperatura ambiente, il che richiede innovazioni tecniche nella consegna del campione, nella raccolta dei dati e nell'analisi dei dati posteriori. A tal fine, i recenti progressi nella cristallografia seriale hanno offerto nuove strade per catturare le immagini molecolari di specie strutturali intermedie e di breve durata a temperatura ambiente ^1,2,3. In contrasto con la strategia "one-crystal-one-dataset" ampiamente utilizzata nella criocristallografia convenzionale, la cristallografia seriale adotta una strategia di raccolta dati simile a quella della crio-microscopia elettronica a singola particella. In particolare, i dati sperimentali in cristallografia seriale vengono raccolti in piccole frazioni da un gran numero di singoli campioni, seguiti da un'elaborazione intensiva dei dati in cui le frazioni di dati vengono valutate e combinate in un set di dati completo per la determinazione della struttura 3D⁴. Questa strategia "one-crystal-one-shot" allevia efficacemente il danno da radiazioni a raggi X ai cristalli proteici a temperatura ambiente attraverso una strategia di diffrazione prima della distruzione⁵.

Poiché la cristallografia seriale richiede un gran numero di cristalli proteici per completare un set di dati, pone importanti sfide tecniche per molti sistemi biologici in cui i campioni proteici sono limitati e / o è coinvolta una delicata manipolazione dei cristalli. Un'altra considerazione importante è come preservare al meglio l'integrità dei cristalli negli esperimenti di diffrazione seriale. I metodi di diffrazione in situ affrontano queste preoccupazioni consentendo ai cristalli proteici di diffrattarsi direttamente da dove crescono senza rompere il sigillo della camera di cristallizzazione 6,7,8,9. Questi metodi senza manipolazione sono naturalmente compatibili con la diffrazione seriale su larga scala. Abbiamo recentemente riportato la progettazione e l'implementazione di un dispositivo di cristallizzazione per la diffrazione in situ basato su un concetto di cristallo su cristallo - cristalli proteici cresciuti direttamente su quarzo monocristallino¹¹. Questo dispositivo "cristallo su cristallo" offre diversi vantaggi. In primo luogo, è dotato di una finestra trasparente a raggi X e luce fatta di un substrato di quarzo monocristallino, che produce poca dispersione dello sfondo, risultando quindi in eccellenti rapporti segnale-rumore nelle immagini di diffrazione da cristalli proteici. In secondo luogo, il quarzo monocristallino è un'eccellente barriera al vapore equivalente al vetro, fornendo così un ambiente stabile per la cristallizzazione delle proteine. Al contrario, altri dispositivi di cristallizzazione che utilizzano substrati a base di polimeri sono soggetti ad essiccazione a causa della permeabilità al vapore, a meno che il materiale polimerico non abbia uno spessore sostanziale, che di conseguenza contribuisce a un'elevata dispersione di fondo¹⁰. In terzo luogo, questo dispositivo consente la consegna di un gran numero di cristalli proteici al fascio di raggi X senza alcuna forma di manipolazione o raccolta dei cristalli, che è fondamentale per preservare l'integrità dei cristalli¹¹.

Per semplificare gli esperimenti seriali di diffrazione dei raggi X utilizzando i dispositivi cristallo su cristallo, abbiamo sviluppato un prototipo di diffrattometro per facilitare il passaggio tra la scansione ottica e le modalità di diffrazione dei raggi X¹². Questo diffrattometro ha un ingombro ridotto ed è stato utilizzato per la raccolta di dati seriali su due linee di luce dell'Advanced Photon Source (APS) presso l'Argonne National Laboratory. In particolare, abbiamo utilizzato BioCARS 14-ID-B per la diffrazione di Laue e LS-CAT 21-ID-D per l'oscillazione monocromatica. Questo hardware diffrattometrico non è necessario se una linea di fascio laser a raggi X o a raggi X a elettroni liberi è dotata di due funzionalità chiave: (1) posizionamento motorizzato del campione con un raggio di corsa di ±12 mm attorno al fascio di raggi X in tutte le direzioni; e (2) una fotocamera digitale in asse per la visualizzazione dei cristalli sotto l'illuminazione della luce che è sicura per i cristalli proteici in studio. Il dispositivo al quarzo monocristallino insieme a un diffrattometro portatile e al software di controllo per la scansione ottica, il riconoscimento dei cristalli e la raccolta automatica dei dati in situ costituiscono collettivamente la piattaforma inSituX per la cristallografia seriale. Sebbene questo sviluppo sia principalmente motivato dalle sue applicazioni di cristallografia dinamica che utilizzano una sorgente di raggi X policromatica, abbiamo dimostrato il potenziale di questa tecnologia per supportare i metodi di oscillazione monocromatica^10,12. Con l'automazione, questa piattaforma offre un metodo di raccolta dati seriale ad alta produttività a temperatura ambiente con un consumo di proteine accessibile.

In questo contributo, descriviamo in dettaglio come impostare la cristallizzazione su chip in un laboratorio umido e come eseguire la raccolta seriale di dati a raggi X su una linea di fascio di sincrotrone utilizzando la piattaforma inSituX.

Il metodo batch viene utilizzato per impostare la cristallizzazione su chip in una condizione simile a quella del metodo di diffusione del vapore ottenuto per lo stesso campione proteico (Tabella 1). Come punto di partenza, si consiglia di utilizzare il precipitante a una concentrazione di 1,2-1,5x di quello per il metodo di diffusione del vapore. Se necessario, la condizione di cristallizzazione del lotto può essere ulteriormente ottimizzata tramite uno screening a griglia fine. I wafer di quarzo non sono necessari per le prove di ottimizzazione; Al suo posto possono essere utilizzati vetrini di copertura (vedi sotto). Si consiglia di eseguire dispositivi di cristallizzazione parzialmente caricati per mantenere le prove di ottimizzazione su scala ridotta. Un certo numero di campioni di proteine sono stati cristallizzati con successo su tali dispositivi utilizzando il metodo batch¹⁰ (Tabella 1).

Il dispositivo stesso è costituito dalle seguenti parti: 1) un anello esterno; 2) due wafer di quarzo; 3) uno spessore simile a una rondella di plastica o acciaio inossidabile; 4) un anello di fissaggio; 5) olio ad immersione per microscopio come sigillante (Figura 1). Il volume totale della soluzione di cristallizzazione caricata su un chip dipende dallo scopo dell'esperimento. La capacità della camera di cristallizzazione può essere regolata scegliendo uno spessore di diverso spessore e/o diametro interno. Installiamo regolarmente dispositivi di cristallizzazione di capacità di 10-20 μL utilizzando spessori di 50-100 μm di spessore. Un dispositivo tipico può produrre da decine a migliaia di cristalli proteici adeguati per la raccolta seriale dei dati (Figura 2).

In caso di successo, la cristallizzazione su chip produrrà da decine a centinaia o addirittura migliaia di cristalli proteici su ciascun dispositivo al quarzo pronti per la diffrazione a raggi X. A una linea di fascio di sincrotrone, tale dispositivo è montato su uno stadio di traslazione a tre assi del diffrattometro utilizzando un meccanismo cinematico. La finestra di cristallizzazione di un dispositivo montato viene scansionata otticamente e ripresa in decine o centinaia di micrografie. Queste micrografie vengono poi cucite in un montaggio ad alta risoluzione. Per i cristalli fotosensibili, la scansione ottica può essere eseguita sotto luce infrarossa (IR) per evitare fotoattivazione involontaria. È stato sviluppato un software di visione artificiale per identificare e localizzare cristalli proteici distribuiti casualmente sul dispositivo. Questi cristalli vengono quindi classificati in base alle loro dimensioni, forma e posizione per informare o guidare la strategia di raccolta dei dati nella cristallografia seriale. Ad esempio, colpi singoli o multipli possono essere posizionati su ciascun cristallo mirato. Gli utenti potrebbero pianificare un singolo passaggio o più percorsi attraverso cristalli mirati. Abbiamo implementato un software per calcolare vari percorsi di viaggio. Ad esempio, il percorso più breve viene calcolato utilizzando algoritmi che risolvono il problema del commesso viaggiatore¹³. Per applicazioni cristallografiche dinamiche pompa-sonda, è possibile scegliere la tempistica e la durata delle riprese laser (pompa) e a raggi X (sonda). Una raccolta automatica di dati seriali è programmata per traslocare ogni cristallo mirato nel fascio di raggi X uno dopo l'altro.

I componenti chiave del diffrattometro insituX includono: 1) un supporto per dispositivo; 2) una fase di traslazione a tre assi; 3) una sorgente luminosa per la scansione ottica; 4) un arresto del fascio di raggi X; 5) pompare laser se vengono studiate proteine sensibili alla luce; 6) Microcomputer Raspberry Pi dotato di una fotocamera sensibile agli infrarossi; 7) software di controllo per sincronizzare motori, telecamera, sorgenti luminose, laser a pompa, e per interfacciarsi con i controlli beamline.

1. Pre-assemblaggio del dispositivo

1. Etichettare l'anello esterno (diametro 30 mm) per l'identificazione del campione. Se necessario, includere il nome del progetto, il numero del dispositivo, la condizione di cristallizzazione e la data (Figura 1A). Posizionare l'anello esterno capovolto su una superficie pulita (Figura 1B) e posizionare con attenzione un wafer di quarzo all'interno dell'anello (Figura 1C). Questo primo wafer di quarzo funge da finestra d'ingresso per i raggi X incidenti.
2. Versare una piccola quantità di olio da immersione al microscopio (viscosità di 150 cSt) in una capsula di Petri. Immergere uno spessore nell'olio e assicurarsi che entrambi i lati dello spessore siano adeguatamente oliati (Figura 1D). Rimuovere l'olio in eccesso tamponando lo spessore su una superficie pulita.
3. Posizionare lo spessore oliato sopra il primo wafer di quarzo (Figura 1E).
   NOTA: L'olio ad immersione è un eccellente sigillante che protegge la camera di cristallizzazione da potenziali perdite di vapore. I trucioli correttamente assemblati di solito durano per settimane senza asciugatura visibile. Questa fase di pre-assemblaggio viene eseguita sotto la luce della stanza. Per i campioni sensibili alla luce, tutte le fasi successive, compreso il caricamento del campione, la conservazione del dispositivo e l'osservazione, devono essere eseguite sotto luce di sicurezza.

2. Caricamento del campione e assemblaggio del dispositivo

1. Utilizzare una pipetta per miscelare accuratamente la soluzione proteica e il tampone di cristallizzazione sul primo wafer di quarzo. Il rapporto di volume tra il campione proteico e il tampone varia tipicamente da 2:1 a 1:2 (Figura 1F). Assicurarsi che il volume totale della soluzione di cristallizzazione non superi la capacità massima della camera di cristallizzazione determinata dalla dimensione e dallo spessore dello spessore. Evitare bolle d'aria durante la miscelazione.
   NOTA: la composizione di un buffer di cristallizzazione varia da un esperimento all'altro. Fare riferimento alla Tabella 1 per le condizioni di cristallizzazione.
2. Posizionare il secondo wafer di quarzo sulla soluzione miscelata quando la soluzione inizia a diffondersi (Figura 1G). Questo secondo wafer di quarzo funge da finestra di uscita dei raggi X diffratti.
3. Picchiettare leggermente il secondo wafer di quarzo sul bordo per aiutare a diffondere l'olio mentre si spinge fuori l'aria. Fissare il dispositivo avvitando un anello di fissaggio nell'anello esterno (Figura 1H). Se necessario, utilizzare uno strumento di serraggio (Figura 1I). Tieni presente che un serraggio eccessivo può causare la deformazione o addirittura la rottura di delicati wafer di quarzo.

3. Ottimizzazione della conservazione e della cristallizzazione del dispositivo

1. Conservare i dispositivi assemblati (Figura 1J) in una scatola a temperatura ambiente o all'interno di un'incubatrice con controllo della temperatura.
   NOTA: I cristalli proteici possono comparire in poche ore o giorni dopo l'assemblaggio di un dispositivo di cristallizzazione. I risultati tipici della cristallizzazione su chip sono mostrati per diversi campioni proteici rappresentativi (Figura 2).
2. Monitorare la crescita dei cristalli osservando il dispositivo di cristallizzazione al microscopio. Se necessario, ottimizzare le condizioni di cristallizzazione mediante iterazioni delle sezioni 1-3.

4. Calibrazione

NOTA: i programmi e i comandi menzionati nelle sezioni seguenti vengono eseguiti nel software inSituX.

1. Installare un sottile cristallo di granato di ittrio alluminio drogato sul supporto del chip (Figura 3). Installare l'arresto del raggio. Acquisire immagini a fluorescenza a raggi X del fascio diretto eseguendo il programma:
   burnmark.py .param
   dove è un nome selezionato dall'utente per il dispositivo di cristallizzazione. .param è un nome di file che contiene parametri di controllo specifici del dispositivo. I valori predefiniti verranno gradualmente sostituiti da valori specifici lungo il protocollo. Un file .param di esempio è riportato nel file supplementare 1.
2. Trova la posizione precisa del fascio radiogeno diretto eseguendo il programma di adattamento del profilo del fascio:
   beam.py -d
   dove è il nome file dell'immagine a fluorescenza a raggi X (Figura 4).
   NOTA: Questo programma calcola le posizioni precise del fascio diretto e la dimensione del fascio. La posizione del fascio segna la destinazione di traslocazione per tutti i cristalli dallo stesso dispositivo. La dimensione del fascio viene utilizzata anche per la pianificazione del target.

5. Scansione ottica

1. Posizionare un dispositivo di cristallizzazione nel supporto del chip e fissare il dispositivo utilizzando una vite a testa zigrinata (Figura 3A).
2. Montare il supporto del chip sullo stadio di traslazione del diffrattometro attraverso un meccanismo cinematico (Figura 3B).
3. Installare una fonte di luce adeguata per prendere micrografie dalla finestra ottica del dispositivo. La luce bianca, la luce IR o altra luce di scelta possono essere utilizzate a seconda della sensibilità alla luce del campione proteico e dello scopo dell'esperimento.
4. Eseguire il programma di scansione:
   scan.py .param
   Questo programma acquisisce una serie di micrografie che vengono automaticamente trasferite ai computer degli utenti specificati.
5. Eseguire il programma di affiancamento su un computer utente:
   tile.py -x -y
   dove < x > e sono i valori iniziali per gli spostamenti di colonne e righe delle micrografie, rispettivamente. Questo programma unisce tutte le micrografie in un montaggio con risoluzione di 1-3 μm/pixel (Figura 5).
   NOTA: i passaggi 5.4 e 5.5 richiedono in genere alcuni minuti. Il numero totale di micrografie varia da diverse decine a centinaia a seconda dell'area di scansione e dell'ingrandimento.
6. Eseguire il programma di ricerca dei cristalli:
   findX.py -c -w -x
   dove è l'immagine affiancata. Questo programma esegue il riconoscimento dei cristalli e la pianificazione dello scatto. e indicano la dimensione del cristallo da trovare. Se l'utente desidera evitare cristalli più piccoli, può essere utilizzato come limite impostando un numero maggiore delle dimensioni dei cristalli piccoli indesiderati. è un valore angolare che imposta la tolleranza per i cristalli di forma irregolare. fascio> si riferisce alla dimensione della trave diretta ottenuta dal raccordo del profilo di cui sopra (fase 4.2; Figura 4). Inoltre, un valore nominale può essere impostato dagli utenti per distanziare ulteriormente i colpi mirati. Questi parametri chiave consentono la selezione specifica dei cristalli e la pianificazione del target (Figura 6).

6. Diffrazione dei raggi X

1. Rimuovere la sorgente luminosa e installare l'arresto del fascio. Impostare una distanza del rilevatore appropriata. Seguire il protocollo di sicurezza della beamline per cercare la gabbia dei raggi X. Aprire l'otturatore a raggi X e l'otturatore laser, se applicabile.
2. Eseguire il programma di raccolta dati per la diffrazione seriale:
   collect.py .param -l
   Questo comando attiva la raccolta dei dati in cui tutti gli scatti pianificati vengono visitati uno dopo l'altro secondo una sequenza preprogrammata. Ogni cristallo mirato viene traslocato nella posizione del fascio (fase 4.2). Ad ogni fermata, l'esposizione ai raggi X viene effettuata con o senza illuminazione laser con un ritardo programmato. Il filmato 1 mostra una sequenza di raccolta dati automatizzata operata a una frequenza di 1 Hz. Di routine decine o centinaia di immagini di diffrazione vengono raccolte da un singolo dispositivo di cristallizzazione (Filmato 2).
   NOTA: la calibrazione della sezione 4 e la scansione ottica della sezione 5 sono autonome nella piattaforma inSituX, quindi completamente trasferibili su un'altra linea di luce. Sezione 6 La diffrazione dei raggi X deve comportare alcuni dettagli nel funzionamento della beamline.

Negli ultimi anni sono stati pubblicati diversi set di dati rappresentativi 10,12 insieme ai risultati cristallografici e ai risultati scientifici di una vasta gamma di campioni proteici, tra cui proteine ed enzimi fotorecettoriali, ad esempio, un fotorecettore UV-B UVR8, una fotoliasi di riparazione del DNA guidata dalla luce PhrB^10, una nuova proteina sensibile alla luce rossa da una istidina chinasi sensoriale multidominio ¹⁴ , domini a doppio sensore ligando/luce e il modulo centrale fotosensoriale di un batteriofitocromo¹². Come risultati rappresentativi, elenchiamo le condizioni di cristallizzazione su chip di queste proteine nella Tabella 1 e le confrontiamo direttamente con le condizioni utilizzate per il metodo di diffusione del vapore. Qui mostriamo quattro casi di studio aggiuntivi di cristallizzazione su chip (Figura 2) e una raccolta di modelli di diffrazione in situ in un filmato (Filmato 2). I set di dati rappresentativi in situ raccolti utilizzando questo protocollo sono riepilogati nella Tabella 2.

In un caso rappresentativo, la criocristallografia ha dato luogo a una scarsa diffrazione per una proteina fotorecettore sensibile alla luce rossa lontana, probabilmente a causa della sensibilità alla luce e dell'alto contenuto di solventi (~ 80%) di questi cristalli¹⁴. Le densità di elettroni ottenute dai dati della criocristallografia erano troppo imbrattate per risolvere la conformazione cromofora, che è al centro della nostra questione scientifica. Utilizzando il protocollo in situ, siamo stati in grado di evitare l'attivazione involontaria della luce prima della diffrazione e abbiamo ottenuto un set di dati scuro a temperatura ambiente da oltre 800 cristalli. Questo set di dati scuro dalla diffrazione seriale di Laue in situ ha portato a densità di elettroni meglio risolte, consentendo la costruzione di un modello sicuro di un cromoforo bilin che mostra una conformazione all-Z,syn finora sconosciuta (Figura 7A) ^12,14. I nostri esperimenti di cristallografia dinamica hanno ulteriormente rivelato cambiamenti indotti dalla luce in questa proteina fotorecettore rosso lontano confrontando i dati di 4.352 cristalli al buio e 8.287 cristalli dopo l'illuminazione della luce (Figura 7). Un'analisi preliminare delle mappe delle differenze indotte dalla luce ha rivelato movimenti concertati nel foglio centrale β, suggerendo l'importanza dell'impilamento π-π tra gli anelli pirrolici del cromoforo e diversi residui aromatici (Figura 7B,C). Un'analisi approfondita e risultati scientifici saranno presentati altrove.

Figura 1: Assemblaggio del dispositivo di cristallizzazione. Si stima che ogni assemblaggio abbia un costo di 30 dollari con due wafer di quarzo monocristallino o 10 dollari con due vetrini di vetro. I componenti hardware tranne lo spessore sono riutilizzabili. (A) Il lato piatto dell'anello esterno è etichettato a scopo di identificazione. (B) L'anello esterno è posto capovolto su una superficie pulita. (C) Un wafer di quarzo di 1 pollice di diametro è accuratamente posizionato all'interno. Un chip di vetro potrebbe anche essere usato durante le prove di cristallizzazione, ma non è compatibile con la diffrazione dei raggi X. (D) Entrambi i lati dello spessore sono oliati. (E) Lo spessore oliato è posto sul primo chip di quarzo. (F) Le soluzioni proteiche e di cristallizzazione vengono pipettate al centro del chip e miscelate. (G) Un secondo chip di quarzo o vetro copre la goccia in modo che si diffonda uniformemente sul chip. (H) Un anello di fissaggio è avvitato sopra il secondo wafer di quarzo. (I) Un utensile di serraggio viene utilizzato per stringere delicatamente l'anello di fissaggio. (J) Un dispositivo completamente assemblato. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Cristalli proteici rappresentativi cresciuti su dispositivi al quarzo. (A) Il modulo centrale fotosensoriale di un batteriofitocromo (Pa497 nella tabella 1). (B,C) Diversi costrutti del terzo dominio GAF da una istidina chinasi sensoriale multi-dominio (2551g3 e 2551g3Δα1 nella Tabella 1). (D) I domini sensoriali tandem da un'istidina chinasi a doppio sensore (RECGAF nella Tabella 1). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: diffrattometro inSituX . (A) Un dispositivo di cristallizzazione è montato nel supporto del chip. Sebbene il dispositivo sia montato verticalmente, i cristalli cresciuti su chip non cadranno, principalmente perché lo strato liquido in un dispositivo assemblato è molto sottile e i cristalli sono ancorati ai loro nuclei durante la crescita. (B) Per la scansione ottica è installata una sorgente luminosa IR. La fotocamera cattura la vista in linea dei cristalli proteici lungo il fascio di raggi X attraverso uno specchio prismatico (non visibile nella foto). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Raccordo del profilo a trave diretta. I canali rosso, verde e blu dell'immagine a fluorescenza a raggi X sono usati per adattarsi a una funzione gaussiana bidimensionale. La colonna di sinistra mostra l'immagine non elaborata dei canali rosso, verde e blu. La colonna centrale è il risultato del raccordo con la posizione e le dimensioni precise del fascio. La colonna di destra visualizza i residui del raccordo. Se l'ampiezza dei residui di raccordo si estende su una piccola frazione dell'immagine raw, l'adattamento del profilo del raggio diretto ha esito positivo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5: Affiancamento dell'immagine . (A) Una serie di micrografie a cristallo viene acquisita durante una scansione ottica. La scansione ottica e il trasferimento dei dati di solito richiedono 1-2 minuti. Le micrografie adiacenti condividono una striscia di area sovrapposta, orizzontalmente e verticalmente, contrassegnata da caselle gialle. (B) Le micrografie sono cucite insieme per realizzare un montaggio ad alta risoluzione basato sulla correlazione ottimale nelle aree sovrapposte. Questo processo richiede in genere un minuto su un computer portatile. Il riquadro giallo delinea l'area catturata da 2 x 2 micrografie mostrate in (A). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 6: Riconoscimento dei cristalli e pianificazione dello scatto. Ogni cerchio rosa segna lo scatto principale di un cristallo. I cerchi gialli segnano colpi aggiuntivi se un cristallo è abbastanza lungo da posizionare questi scatti. Le linee rosa segnano un percorso come soluzione al problema del commesso viaggiatore. I cristalli raggruppati e i cristalli più piccoli sono in gran parte evitati. L'aggressività della ricerca dei cristalli può essere regolata come opzione per findX.py (passo 5.6). Una strategia di "overkill" di forza bruta non lascerebbe alcun cristallo non sparato, ma potrebbe produrre molte immagini di diffrazione, ma non processabili¹². Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 7: Mappe di densità elettronica del dominio di rilevamento a luce rossa lontana di una istidina chinasi . (A) La mappa 2Fo-Fc sagomata a 2,5σ mostra le densità di elettroni associate al cromoforo bilin in una conformazione tutta Z,syn ¹⁴. Gli anelli pirrolici da A a D sono contrassegnati. (B e C) Le mappe di differenza chiaro-scuro sagomate a ±2,5σ in verde e rosso, rispettivamente, evidenziano il guadagno e la perdita di densità di elettroni. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella 1: Confronto delle condizioni di cristallizzazione tra la diffusione del vapore e il metodo del lotto su chip. La diffusione del vapore e i metodi batch di cristallizzazione sono altamente correlati 10,14,15,16,17,18,19. A partire da una condizione di diffusione del vapore, una condizione simile può essere ottimizzata per la cristallizzazione su chip. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Riepilogo dei set di dati in situ raccolti direttamente dai dispositivi al quarzo. Migliaia di modelli di diffrazione Laue possono essere raccolti da diversi dispositivi di cristallizzazione. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Filmato 1: Una finta raccolta di dati. I cristalli bersaglio vengono traslocati nel fascio di raggi X contrassegnati da un cerchio rosso. La sequenza dei cristalli presi di mira in questo film non segue una soluzione al problema del commesso viaggiatore. Le esposizioni laser e a raggi X vengono sparate ad ogni fermata con un ritardo programmato. Vengono raccolte immagini di diffrazione. Clicca qui per scaricare questo film.

Filmato 2: Immagini di diffrazione. Centinaia di immagini di diffrazione possono essere raccolte da un singolo dispositivo di cristallizzazione. Diversi dispositivi sono sufficienti per produrre un set di dati completo e altamente ridondante (Tabella 2). Clicca qui per scaricare questo film.

File supplementare 1: file .param di esempio. Un piccolo file di testo raccoglie alcuni parametri di controllo specifici per ciascun dispositivo di cristallizzazione. Questi parametri iniziano con i loro valori predefiniti e verranno modificati di conseguenza nelle sezioni 4, 5 e 6 man mano che il protocollo procede. Clicca qui per scaricare questo file.

La cristallografia delle proteine nei primi anni condotta a temperatura ambiente ha incontrato enormi difficoltà nel combattere i danni da radiazioni a raggi X. Pertanto, è stato sostituito dal metodo criocristallografico più robusto poiché le sorgenti di raggi X di sincrotrone sono diventate prontamente disponibili²⁰. Con l'avvento dei laser a elettroni liberi a raggi X, la cristallografia proteica a temperatura ambiente è stata rianimata negli ultimi anni, con molti nuovi sviluppi guidati dal desiderio di osservare la dinamica strutturale delle proteine ad una temperatura fisiologicamente rilevante ^2,21. Lo sviluppo della piattaforma inSituX basata sui dispositivi cristallo su cristallo è stato motivato dalla stessa ambizione, ovvero stabilire metodi di raccolta dati di routine e robusti per studi di cristallografia dinamica a temperatura ambiente. Questo metodo di diffrazione seriale automatica dei raggi X è applicabile anche alla determinazione della struttura statica per cristalli proteici non suscettibili di congelamento¹⁴. In questo protocollo, presentiamo considerazioni tecniche chiave insieme ai passaggi critici necessari per fornire la raccolta dei dati a temperatura ambiente utilizzando questa piattaforma. Questo metodo è particolarmente adatto per cristalli proteici fragili sensibili alla manipolazione meccanica, ai danni da radiazioni a raggi X o all'esposizione all'aria.

Il prototipo della piattaforma è stato ampiamente testato su due linee di cristallografia proteica presso l'Advanced Photon Source (APS) dell'Argonne National Laboratory. Mentre è piuttosto semplice impostare la cristallizzazione su chip secondo questo protocollo, la fase di raccolta dei dati coinvolge diversi componenti hardware e software personalizzati. Di conseguenza, l'applicazione e l'implementazione di strategie di raccolta dati specifiche del progetto possono richiedere una stretta collaborazione tra utenti e scienziati della beamline. In altre parole, questa tecnologia nella sua forma attuale è limitata a quegli utenti che hanno un accesso adeguato ai sincrotroni come APS. Tuttavia, il flusso di lavoro complessivo e i passaggi chiave descritti in questo protocollo servirebbero da riferimento o guida per qualsiasi gruppo di ricerca interessato alla cristallografia proteica a temperatura ambiente.

Il vantaggio più significativo di questa piattaforma è che non è necessaria alcuna manipolazione dei cristalli come il montaggio o il congelamento in modo tale che i delicati cristalli proteici siano diffratti in condizioni incontaminate. Un altro grande vantaggio è che l'uso del substrato di quarzo monocristallino dà luogo a pochissima dispersione di fondo alle immagini di diffrazione proteica, offrendo ambienti stabili per la cristallizzazione delle proteine per un lungo periodo (settimane o mesi). Tuttavia, questa piattaforma non è adatta per lo screening di cristalli a matrice sparsa in quanto è destinata alla produzione di cristalli su larga scala. Pertanto, è necessaria una conoscenza preliminare delle condizioni di cristallizzazione per impostare le prove iniziali di cristallizzazione su chip per un determinato campione proteico.

In pratica, troviamo che alcune fasi di assemblaggio del dispositivo, come come oliare uno spessore (passaggio 1.2) e come sigillare un dispositivo (passaggio 2.3), per quanto banali sembrino, spesso influenzano direttamente i risultati della cristallizzazione. Un dispositivo può asciugarsi rapidamente se l'oliatura non viene eseguita correttamente. Inoltre, un serraggio eccessivo del dispositivo nella fase finale dell'assemblaggio può deformare i wafer di quarzo, mentre il serraggio insufficiente porta a potenziali perdite e / o evaporazione incontrollata dal dispositivo. Un altro passo fondamentale è la pianificazione di colpi a raggi X. Si deve trattare attentamente con cristalli raggruppati o affollati per evitare modelli di diffrazione sovrapposti che sono spesso difficili da elaborare. Questo problema può essere alleviato dall'uso di un fascio di raggi X di micro-messa a fuoco. Potenzialmente, un set di dati completo potrebbe essere difficile da ottenere se la morfologia del cristallo è una grande lastra sottile in modo che la maggior parte delle lastre siano parallele alle finestre di quarzo. Inoltre, i trucioli di quarzo monocristallino possono essere riciclati e riutilizzati dopo una procedura di pulizia che coinvolge sapone e solventi organici che rimuovono i detriti di olio e proteine. Di solito, circa l'80-90% di questi delicati trucioli può essere pulito senza danni per i prossimi esperimenti. Nel caso di piccoli cristalli su una beamline micro-focalizzata, quando è necessario ottenere una migliore precisione nel posizionamento dei cristalli, diversi componenti hardware potrebbero essere aggiornati, come motori più fini, fotocamera e ottica migliori, maggiore ingrandimento, ecc. Tuttavia, nessuno di questi è vicino alle limitazioni dello stato dell'arte. Pertanto, è disponibile un ampio spazio per il miglioramento senza troppe difficoltà.

ZR è l'inventore dei chip cristallo su cristallo sul brevetto statunitense 9632042 concesso a Renz Research, Inc.

L'uso di Advanced Photon Source, una struttura dell'Office of Science User gestita per il Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti dall'Argonne National Laboratory, è stato supportato dal contratto DE-AC02-06CH11357. L'uso di BioCARS è stato sostenuto dal National Institute of General Medical Sciences del National Institutes of Health con il numero di sovvenzione R24GM111072. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health. L'uso del settore LS-CAT 21 è stato sostenuto dalla Michigan Economic Development Corporation e dalla sovvenzione Michigan Technology Tri-Corridor 085P1000817. Questo lavoro è supportato da sovvenzioni dell'Università dell'Illinois a Chicago, National Institutes of Health (R01EY024363) e National Science Foundation (MCB 2017274) a XY.