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Descriviamo un metodo per la preparazione e l'imaging dal vivo di estratti citoplasmatici non diluiti da uova di Xenopus laevis .
Tradizionalmente utilizzati per saggi biochimici di massa, gli estratti di uova di Xenopus laevis sono emersi come un potente strumento basato sull'imaging per lo studio di fenomeni citoplasmatici, come la citochinesi, la formazione del fuso mitotico e l'assemblaggio del nucleo. Basandosi sui primi metodi che riprendevano estratti fissi campionati in punti temporali sparsi, i recenti approcci hanno ottenuto estratti live utilizzando la microscopia time-lapse, rivelando caratteristiche più dinamiche con una risoluzione temporale migliorata. Questi metodi di solito richiedono sofisticati trattamenti superficiali del vaso di imaging. Qui introduciamo un metodo alternativo per l'imaging dal vivo di estratti di uova che non richiedono alcun trattamento chimico superficiale. È semplice da implementare e utilizza materiali di consumo di laboratorio prodotti in serie per l'imaging. Descriviamo un sistema che può essere utilizzato sia per la microscopia a campo largo che per quella confocale. È progettato per l'imaging di estratti in un campo 2-dimensionale (2D), ma può essere facilmente esteso all'imaging in 3D. È adatto per studiare la formazione di modelli spaziali all'interno del citoplasma. Con dati rappresentativi, dimostriamo la tipica organizzazione dinamica di microtubuli, nuclei e mitocondri in estratti interfasici preparati con questo metodo. Questi dati di immagine possono fornire informazioni quantitative sulla dinamica citoplasmatica e sull'organizzazione spaziale.
Il citoplasma costituisce il volume principale di una cellula e ha un'organizzazione distinta. Gli ingredienti del citoplasma eucariotico possono auto-assemblarsi in una vasta gamma di strutture spaziali, come gli astri dei microtubuli e l'apparato di Golgi, che a loro volta sono disposti dinamicamente e girati a seconda dell'identità della cellula e dello stato fisiologico. Comprendere l'organizzazione spaziale del citoplasma e il suo legame con le funzioni cellulari è quindi importante per capire come funziona la cellula. Gli estratti di uova di Xenopus laevis sono stati tradizionalmente utilizzati per saggi biochimici di massa 1,2,3,4,5,6,7,8, ma recenti lavori li stabiliscono come un potente sistema di imaging dal vivo per studi meccanicistici delle strutture citoplasmatiche e delle loro funzioni cellulari 9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18. Questi estratti non diluiti preservano molte strutture e funzioni del citoplasma, consentendo manipolazioni dirette di contenuti citoplasmatici non ottenibili nei modelli cellulari convenzionali19,20. Ciò li rende ideali per caratterizzare i fenomeni citoplasmatici e sezionare le loro basi meccanicistiche.
I metodi esistenti per l'imaging degli estratti richiedono modifiche chimiche della superficie o la fabbricazione di dispositivi microfluidici. Un metodo basato su coprivetrini richiede la passivazione al glicole polietilenico (PEG) dei vetrini di vetro21. Un metodo basato su microemulsioni richiede la deposizione da vapore di tricloro(1H,1H,2H,2H-perfluoroottil)silano su superfici vetrate22,23. I sistemi basati sulla microfluidica consentono un controllo preciso del volume, della geometria e della composizione delle goccioline di estratto, ma richiedono strutture di microfabbricazione specializzate11,12,24.
Qui introduciamo un metodo alternativo per l'imaging degli estratti di uova che è facile da implementare e utilizza materiali prontamente disponibili e a basso costo. Ciò include la preparazione di una camera di imaging con un vetrino e un coprivetrino rivestito con nastro fluorurato di etilene propilene (FEP). La camera può essere utilizzata per l'imaging di estratti con una varietà di sistemi di microscopia, tra cui stereoscopi e microscopi verticali e invertiti. Questo metodo non richiede alcun trattamento chimico delle superfici, pur ottenendo una chiarezza ottica simile ottenuta con i metodi esistenti a base di vetro discussi sopra. È progettato per visualizzare uno strato di estratti con uno spessore uniforme su un campo 2D e può essere facilmente esteso per visualizzare un volume 3D di estratti. È adatto per l'imaging time-lapse del comportamento citoplasmatico collettivo su un ampio campo visivo.
Abbiamo utilizzato estratti di uova interfasici per dimostrare il nostro metodo di imaging. La preparazione dell'estratto segue il protocollo di Deming e Kornbluth19. In breve, le uova naturalmente arrestate in metafase della meiosi II vengono schiacciate da una rotazione a bassa velocità. Questo spin rilascia il citoplasma dall'arresto meiotico e consente all'estratto di procedere in interfase. Normalmente, la citocalasina B viene aggiunta prima dello spin di schiacciamento per inibire la formazione di F-actina. Tuttavia, può essere omesso se si desidera F-actina. La cicloeximide viene anche aggiunta prima dello spin di schiacciamento per impedire all'estratto interfase di entrare nella mitosi successiva. Gli estratti vengono successivamente collocati nelle suddette camere di imaging e posti su un microscopio. Infine, le immagini vengono registrate nel tempo a intervalli definiti da una fotocamera collegata al microscopio, producendo serie di immagini time-lapse che catturano il comportamento dinamico dell'estratto in un campo 2D.
Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Stanford University.
1. Preparazione di diapositive e copertine
2. Preparazione e imaging dal vivo di estratti di uova interfasiche
NOTA: Il seguente protocollo è adattato da Deming e Kornbluth19, Murray20 e Smythe e Newport25 con modifiche. Tutti i passaggi devono essere eseguiti a temperatura ambiente, se non diversamente specificato.
Gli estratti di uovo di Xenopus laevis possono essere utilizzati per studiare l'auto-organizzazione del citoplasma durante l'interfase. La Figura 2A mostra i risultati di un esperimento riuscito. Abbiamo integrato estratti interfasici con nuclei di spermatozoi demembranati di Xenopus laevis 19 ad una concentrazione di 27 nuclei / μL e 0,38 μM purificati GST-GFP-NLS 27,28,29,30 (proteina di fusione costituita da glutatione-S-transferasi, proteina fluorescente verde e una sequenza di localizzazione nucleare) per consentire la ricostituzione e la visualizzazione dei nuclei interfase. Abbiamo anche aggiunto 1 μM di tubulina marcata con fluorescenza per visualizzare i microtubuli e 500 nM MitoTracker Red CMXRos per visualizzare i mitocondri. Pochi istanti dopo che l'estratto è stato inserito nella camera di imaging, il citoplasma è apparso disorganizzato. Nel corso dei successivi 30 minuti a temperatura ambiente, il citoplasma ha iniziato ad auto-organizzarsi in compartimenti simili a cellule. Gli astri dei microtubuli sono cresciuti dai centrosomi introdotti con i nuclei degli spermatozoi e hanno formato zone di confine impoverite dai microtubuli quando si sono incontrati con i microtubuli degli astri vicini. Proteina GST-GFP-NLS traslocata nei nuclei interfase rotondi auto-assemblati dai nuclei di spermatozoi demembranati aggiunti. Le aree impoverite di componenti citoplasmatiche di diffusione della luce erano visibili sia nei canali del campo luminoso che nei mitocondri (Figura 2A, 20 min e 35 min). Anche i mitocondri si sono impoveriti dai bordi stabiliti dai microtubuli e si sono arricchiti in compartimenti isolati che si sono allineati con i compartimenti dei microtubuli. Entro 60 minuti a temperatura ambiente, un modello spaziale costituito da compartimenti simili a cellule dovrebbe essere ben stabilito, con microtubuli che formano una struttura vuota simile a una corona e mitocondri chiaramente suddivisi in ciascun compartimento (Figura 2A, 53 min).
La Figura 2B confronta le prestazioni degli estratti nelle camere di imaging con e senza nastri FEP su vetro. Abbiamo integrato estratti interfasici con nuclei spermatici demembranati di Xenopus laevis 19 ad una concentrazione di 27 nuclei / μL e 0,35 μM GST-mCherry-NLS27,28,29,30 (proteina di fusione costituita da glutatione-S-transferasi, proteina fluorescente mCherry e una sequenza di localizzazione nucleare) per consentire la ricostituzione e la visualizzazione dei nuclei interfase. Abbiamo anche aggiunto 1 μM di tubulina marcata con fluorescenza per visualizzare i microtubuli. Le differenze dinamiche sono diventate evidenti di circa 20 minuti a temperatura ambiente. Nella camera realizzata con vetro nastrato FEP, l'estratto si auto-organizza in normali modelli simili a cellule (Figura 2B, immagini nelle righe 1 e 3). Tuttavia, nella camera in cui le superfici di vetro non erano coperte dal nastro FEP (non passivato), l'estratto mostrava schemi anomali di campo luminoso e microtubuli che diventavano sempre più interrotti nel tempo (Figura 2B, immagini nelle righe 2 e 4). Non sono state osservate differenze significative nell'importazione nucleare della proteina GST-mCherry-NLS (Figura 2B, immagini nelle righe 5 e 6).
Figura 1: Schemi e foto relativi alla procedura sperimentale. (A) Schema per la preparazione di vetrini e vetrini rivestiti di nastro FEP. B) uova di Xenopus laevis depositate in uova ovaiole, con esempi di uova di scarsa qualità indicate da frecce. Frecce gialle, esempi di uova che sembrano palline bianche e gonfie. Frecce rosse, esempi di uova che appaiono in una stringa. C) Esempi di uova di Xenopus laevis dall'aspetto normale. D) Esempi di uova di scarsa qualità con pigmento irregolare o chiazzato. (E) Un uovo deteriorato con una regione bianca in crescita. (F) Un uovo che mostra un'area pigmentata scura e contratta, probabilmente a causa dell'attivazione partenogenetica. (G) Gli strati formati dalle uova di Xenopus laevis rotte dopo la centrifugazione di 12.000 x g nella fase 2.11. (H) Schemi per la preparazione della camera di imaging dell'estratto al punto 2.15. (I) Una foto di una camera di imaging preparata con un estratto di uova all'interno. (C) e (D) condividono la stessa barra della scala nella parte inferiore di (D). (E) e (F) condividono la stessa barra di scala nella parte inferiore di (F). Le barre della scala in (B) (C) (D) (E) (F) e (I) sono approssimative. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Gli estratti di uova arrestati interfase si auto-organizzano in compartimenti simili a cellule . (A) Montaggio time-lapse della formazione di pattern auto-organizzati in uno strato sottile (120 μm) di estratto di uovo di Xenopus laevis interfase-arrestato. L'estratto è stato integrato con 27 nuclei/μL di nuclei spermatici demembranati di Xenopus laevis per consentire la ricostituzione dei nuclei interfase. I microtubuli sono stati visualizzati dalla tubulina marcata con HiLyte 647 (mostrata in magenta), dai mitocondri da MitoTracker Red CMXRos (mostrata in rosso) e dai nuclei da GST-GFP-NLS (mostrata in verde). (B) Formazione di pattern auto-organizzati in estratti di uova di Xenopus laevis interphase-arrested collocati in camere con e senza superfici di vetro ricoperte di nastro FEP. Gli estratti sono stati integrati con 27 nuclei/μL di nuclei spermatici di Xenopus laevis demembranati per consentire la ricostituzione dei nuclei interfase. I microtubuli sono stati visualizzati dalla tubulina marcata con HiLyte 488 (mostrata in magenta) e i nuclei da GST-mCherry-NLS (mostrati in verde). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Guarnizione secondaria opzionale per la camera di imaging. Schemi per la preparazione di una guarnizione secondaria opzionale con olio minerale per evitare che l'estratto entri in contatto prolungato con l'aria. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Gli estratti di uova di Xenopus laevis sono emersi come un potente sistema modello per studi basati sull'imaging di varie strutture subcellulari 10,14,15,16,17,18,21,31,32,33,34,35,36 e organizzazione citoplasmatica nel suo complesso scala cellulare9. Qui abbiamo descritto un metodo di imaging dal vivo adatto per visualizzare l'organizzazione citoplasmatica dinamica in 2D. L'efficacia del metodo è dimostrata da risultati rappresentativi.
Diversi passaggi sono fondamentali per il successo del metodo. La qualità delle uova è importante per gli estratti, quindi i passaggi 2.3 e 2.7 sono fondamentali. Nella nostra esperienza, l'emisfero animale delle uova di alta qualità ha una pigmentazione uniforme, un punto bianco distinto al centro (indicativo della rottura della vescicola germinale, GVBD) e un bordo chiaro con l'emisfero vegetale (Figura 1C). Gli estratti ottenuti da uova di alta qualità hanno prestazioni migliori nelle nostre condizioni di imaging. Se più del 5% delle uova ha pigmento screziato (Figura 1D), ha un'area pigmentata scura e contratta (Figura 1F), assomiglia a palline bianche gonfie (Figura 1B), appare in una stringa (Figura 1B) o mostra segni di deterioramento dopo i lavaggi nei passaggi 2.6 e 2.7 (Figura 1E), allora l'intero lotto di uova deve essere scartato. Gli estratti mantengono una notevole attività biologica perché sono essenzialmente citoplasma non diluito. Pertanto, il passaggio che mira a ridurre al minimo la diluizione dell'estratto (passo 2.9) è importante per il successo dell'esperimento. Per l'imaging, gli estratti vengono gestiti in volumi molto piccoli ed evaporano rapidamente se a contatto prolungato con l'aria. Ciò influenzerà negativamente la loro attività. Pertanto, al punto 2.15, dopo che l'estratto è stato depositato, deve essere sigillato con il lato rivestito di nastro FEP del vetrino di copertura il più presto possibile. La sigillatura può essere confermata visivamente dal cambiamento di texture nel sito di contatto tra l'adesivo sul distanziatore e il coprivetrino. Il distanziatore dovrebbe essere in grado di creare una tenuta completa se applicato correttamente. Tuttavia, se si desidera una guarnizione aggiuntiva, l'olio minerale può essere erogato tra la sporgenza del vetrino e il vetrino. L'olio può formare un sigillo aggiuntivo attorno al distanziatore per azione capillare (Figura 3). La passivazione delle superfici vetrate può ridurre l'adsorbimento non specifico delle molecole, ed è importante per gli astri di microtubuli interfase negli estratti21,37. L'applicazione del nastro FEP su una superficie di vetro qui descritta sembra offrire vantaggi simili, come suggerito dall'assemblaggio di normali astri di microtubuli interfase (Figura 2, 6 min). Pertanto, anche il passaggio 1.1 è fondamentale.
Abbiamo dimostrato l'applicazione di un metodo di imaging utilizzando estratti di uova interfasiche arrestate seguendo il protocollo di Deming e Kornbluth19. Per impostazione predefinita, il protocollo integra gli estratti con l'inibitore della polimerizzazione dell'actina citocalasina B per prevenire la gelificazione-contrazione negli estratti dopo un'incubazione prolungata a temperatura ambiente26. Per consentire la polimerizzazione dell'actina e osservare la dinamica dell'actina, si può tralasciare la citocalasina B nel passo 2.10 del protocollo9. Una modifica che abbiamo apportato al protocollo di Deming e Kornbluth è che non integriamo gli estratti con un mix energetico per rigenerare l'ATP19. Questo perché nelle nostre mani, negli estratti integrati con questo mix rigenerante ATP19 e nuclei spermatici, i microtubuli occasionalmente formano un reticolo reticolato che interferisce con la formazione del pattern citoplasmatico. Pertanto, il protocollo non include il passaggio che aggiunge il mix energetico agli estratti19.
Il protocollo di estrazione interfase si basa sulla frantumazione delle uova in tampone privo di EGTA per liberarle dall'arresto meiotico (arresto CSF)37. Gli estratti successivamente progrediscono in interfase e sono mantenuti in interfase dal cicloeximide. Esistono altri metodi consolidati per preparare estratti interfase. Alcuni metodi preparano prima estratti che mantengono l'arresto meiotico schiacciando le uova nel tampone di lisi con EGTA38, e quindi rilasciano l'arresto aggiungendo calcio, guidando l'estratto nell'interfase 21,37,39. Gli estratti possono essere successivamente tenuti in interfase mediante aggiunta di inibitori della sintesi proteica come la cicloeximide37,39. Altri metodi partenogeneticamente attivano le uova con ionoforo di calcio (A23187) o scosse elettriche per liberarle dall'arresto meiotico, prima di schiacciare le uova in assenza di EGTA20,28 (recensito in Field et al.37). Questi estratti possono entrare in interfase ma in genere non rimarranno lì in quanto sono in grado di subire più cicli cellulari. Allo stesso modo, sono stati sviluppati metodi consolidati ottimizzati per la preparazione di estratti con citoscheletro di actina intatto 10,37,39. Il metodo di imaging può essere adatto per questi tipi di estratti, ma non lo abbiamo testato con loro.
Ai fini dell'imaging dell'organizzazione interna del citoplasma, il sistema di imaging qui presentato è relativamente facile da configurare, richiedendo solo l'applicazione di un nastro FEP alle superfici vetrate. Consente l'assemblaggio di strutture citoscheletriche in estratti9 riportati in sistemi di imaging più sofisticati in cui le superfici vetrate sono passivate con trattamento poli-L-lisina-g-polietilenglicole (PLL-g-PEG) o rivestite con doppi strati lipidici supportati10,21. Il metodo consente allo strato estratto di formarsi con uno spessore definito (determinato dalla profondità del distanziatore, che è di 120 μm per il sistema mostrato in Figura 1A, 1H, 1I e Figura 2). Possiamo regolare lo spessore impilando distanziali aggiuntivi. Abbiamo impilato fino a 6 distanziatori di questo tipo (720 μm di spessore) e i compartimenti si sono formati normalmente. Questa flessibilità consente applicazioni future come l'imaging degli estratti in 3D utilizzando la microscopia confocale o a foglio leggero.
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamo J. Kamenz, Y. Chen e W. Y. C. Huang per i commenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni del National Institutes of Health (R01 GM110564, P50 GM107615 e R35 GM131792) assegnate a James E. Ferrell, Jr.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
17 ml centrifuge tube | Beckman Coulter | 337986 | |
22x22 mm square #1 cover glass | Corning | 284522 | |
Aprotinin | MilliporeSigma | 10236624001 | Protease inhibitor |
Cycloheximide | MilliporeSigma | 01810 | Protein synthesis inhibitor |
Cytochalasin B | MilliporeSigma | C6762 | Actin polymerization inhibitor |
Female Xenopus laevis frogs | Nasco | LM00535MX | |
Fluorescent HiLyte 488 labeled tubulin protein | Cytoskeleton, Inc. | TL488M-A | For visualizing the microtubule cytoskeleton |
Fluorescent HiLyte 647 labeled tubulin protein | Cytoskeleton, Inc. | TL670M-A | For visualizing the microtubule cytoskeleton |
Fluorinated ethylene propylene (FEP) optically clear tape | CS Hyde company | 23-FEP-2-5 | |
Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
Human chorionic gonadotropin (hCG) | MilliporeSigma | CG10 | |
Imaging spacer | Electron Microscopy Sciences | 70327-8S | |
Leupeptin | MilliporeSigma | 11017101001 | Protease inhibitor |
Microscope slides | Fisher Scientific | 12-518-100B | |
Mineral oil | MilliporeSigma | 330760 | |
MitoTracker Red CMXRos | Thermo Fisher Scientific | M7512 | For visualizing mitochondria |
Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | BioVendor | RP1782725000 | |
Roller applicator | Amazon | B07HMBJSP8 | For applying the FEP tape to the glass slides and coverslips |
Single-edged razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | For removing excessive FEP tape |
Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-7M |
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