Ca^{2 +} risposte di imaging durante l'infezione delle cellule epiteliali Shigella

Qui, presentiamo protocolli per visualizzare le risposte di calcio (Ca^{2 +}) indotte dalle cellule HeLa infettate da Shigella. Ottimizzando i parametri di infezione batterica e di imaging con sonde Ca^{2 +} fluorescenti, atipico globali e locali Ca^{2 +} segnali indotti da batteri sopra una vasta gamma di cinetica di infezione sono caratterizzati.

CA^{2 +} è un ione onnipresente coinvolti in tutti i processi cellulari conosciuti. Mentre global Ca^{2 +} le risposte possono influenzare il destino delle cellule, variazioni locali in Ca^{2 +} citosolico le concentrazioni libere, legate per rilasciare da negozi interni o un afflusso attraverso i canali della membrana plasmatica, regolano i processi delle cellule corticali. Gli agenti patogeni che aderiscono a o invadere host cellule grilletto una riorganizzazione del citoscheletro di actina sottostante la membrana plasmatica di host, che probabilmente colpisce sia globale che locale di Ca^{2 +} segnalazione. Perché questi eventi possono verificarsi alle basse frequenze in modo pseudo-stocastico sopra estesa cinetica, l'analisi del Ca^{2 +} segnali indotti da agenti patogeni solleva grandi sfide tecniche che devono essere affrontate.

Qui, segnaliamo i protocolli per la rilevazione di globale e locale Ca^{2 +} segnali su un'infezione di Shigella delle cellule epiteliali. In questi protocolli, manufatti legati ad un'esposizione prolungata e photodamage connesso con l'eccitazione di sonde Ca^{2 +} fluorescenti sono Troubleshooting controllando rigorosamente i parametri di acquisizione su periodi di tempo definiti durante un Shigella invasione. Le procedure vengono implementate per analizzare rigorosamente l'ampiezza e la frequenza di Ca^{2 +} segnali citosolici globali durante la cinetica di infezione estesa utilizzando la sonda chimica Fluo-4.

CA^{2 +} regola tutti i processi conosciuti delle cellule, tra cui la riorganizzazione del citoscheletro, le risposte infiammatorie e vie di morte cellulare relazionate al ospite-patogeno interazioni^1,2,3. In condizioni fisiologiche, basale concentrazioni Ca^{2 +} citosoliche sono basse, in alcune centinaia di nM, ma possono essere soggetti ad aumenti transitori dopo stimolazione agonista. Queste variazioni mostrano spesso comportamento oscillatorio attraverso l'azione delle pompe e canali alle membrane del reticolo endoplasmatico e del plasma. Il modello di queste oscillazioni si caratterizza per il periodo, la durata e l'ampiezza del Ca^{2 +} aumenta e viene decrittografato dalle cellule che, a loro volta, innescano risposte specifiche in quello che è noto come il Ca^{2 +} codice^4,5 . Un aumento marcato la concentrazione Ca^{2 +} citosolico in condizioni patologiche può portare alla morte cellulare connessa con la permeabilizzazione delle membrane mitocondriali e il rilascio di pro-apoptotici o necrotico fattori^{6, 7}.

Shigella, l'agente eziologico della dissenteria bacillare, invade le cellule epiteliali iniettando effettori nelle cellule ospiti utilizzando un tipo di secrezione di III (T3SS) sistema^8,9. Un'invasione di Shigella delle cellule dell'ospite è associata con Ca^{2 +} segnali locali e globali suscitati dalla T3SS. Per quanto riguarda poro-formare tossine, il Traslocone T3SS inserisce in membrane cellulari host e è necessario per l'iniezione di T3SS effettori è probabile responsabile dell'attivazione di PLC e la (1, 4, 5) l'inositolo trifosfato (InsP3)-dipendente Ca^{2 +} rilascio. La combinazione di stimolazione localizzata PLC e l'accumulo di actina polimerizzata in siti di un risultato di invasione di Shigella in un insolitamente lunga durata InsP3-dipendente Ca^{2 +} rilascio¹⁰. L'effettore III tipo IpgD, un fosfatidil 4,5 bifosfato (PIP2) -4-fosfatasi, limita la quantità di locale di PIP2, controllando così la quantità di substrato disponibile per PLC generare InsP3, che contribuisce al confino di locale Ca^{2 +} risposte all'invasione batterica siti^11,12. Questi Ca^{2 +} risposte locali probabile contribuiscono per la polimerizzazione dell'actina Shigella invasione siti¹⁰. Ca^{2 +} risposte globale che sono anche suscitate da Shigella, tuttavia, sono indispensabili per il processo di invasione batterica ma innescare l'apertura del connexin adenosina alla membrana del plasma e il rilascio di ATP in extracellulare vano. ATP rilasciato agisca in modo paracrino, a sua volta, stimola Ca^{2 +} oscillatorio responses in cellule accanto alla cellula infettata. IpgD è anche responsabile per la modellatura del global Ca^{2 +} le risposte nelle risposte erratiche isolate con dinamica lenta. Finalmente, dopo un'infezione batterica prolungata, IpgD conduce all'inibizione di InsP3-mediata di Ca^{2 +} segnali. Attraverso la sua interferenza con segnalazione di Ca^{2 +} , IpgD ritarda a Ca^{2 +}-dipendente calpaina attivazione che conduce lo smontaggio delle strutture di adesione focale e il distacco prematuro della infettato cellule¹³.

Mentre Ca^{2 +} segnali sono coinvolti in aspetti critici della patogenesi, l'uso di un microorganismo solleva una serie di sfide tecniche che non vengono rilevati negli studi classici agonista. I protocolli descritti qui utilizzano il comunemente usato fluorescente Ca^{2 +} indicatore chimico Fluo-4 che abbiamo progettato per caratterizzare il Ca^{2 +} segnali locali durante un'infezione Shigella . Passaggi critici per la rilevazione di questi segnali sono discusse, così come le procedure attuate per la loro analisi quantitativa necessarie per caratterizzare il ruolo di effettori batterici nella segnalazione di Ca^{2 +} .

1. preparati

1. Preparazione di batteri
   1. I batteri del piatto — ceppo selvaggio-tipoShigella esprimendo l'adesina AfaE (M90T-AfaE) — su un trypticase agar soia (TCS) piastra contenente 0,01% Congo rosso (CR) e li Incubare per 18 h a 37 ° C.
      Nota: Per aumentare la loro riproducibilità, le piastre di Shigella ottenute al passaggio 1.1.1 sono conservate a 4 ° C e devono essere utilizzate entro una settimana, perché tutte le colonie su supporto CR alla fine diventerà rosse nel corso del tempo.
   2. Inoculare TCS brodo di pre-coltura selezionando 3 colonie rosse dalle piastre striatura.
      Nota: Un'inoculazione con 3 colonie viene eseguita per limitare la probabilità di scegliere un singolo clone cui plasmide di virulenza ha subito una ricombinazione genetica.
   3. Crescere le colture batteriche liquide in un incubatore d'agitazione per 16 h a 37 ° C a 200 giri/min. Aggiungere ampicillina ad una concentrazione finale di 75 mg/mL. Le concentrazioni di antibiotiche non devono superare 3 x la concentrazione inibitoria minima, come un eccesso di antibiotico può portare alla perdita del plasmide di virulenza grande.
      Nota: La manutenzione del plasmide di virulenza di Shigella deve essere verificata da colture batteriche su piastre CR completati con concentrazioni di antibiotiche appropriate di placcatura. La presenza di colonie bianchi indica una perdita di plasmide.
   4. Inoculare la cultura TCS con la pre-coltura batterica ad una diluizione di 1: 100. Incubare a 37 ° C in un incubatore d'agitazione per 2 h a 200 giri/min. Garantire che la densità ottica a 600 nm (OD_600nm) è di 0,2 - 0,4.
   5. Centrifugare la coltura batterica per 2 min a 13.000 x g a 21 ° C e risospendere il pellet in un volume equivalente di mezzo EM (120 mM NaCl, 7 mM KCl, 1,8 mM CaCl₂, 0,8 mM MgCl₂, glucosio di 5 mM e 25 mM HEPES pH = 7.3).
   6. Diluire la sospensione batterica in un buffer di EM un finale OD_600nm di 0.1 e utilizzarlo da subito o conservarlo a 21 ° C e utilizzarlo entro i prossimi 60 min.
2. Preparazione delle cellule
   1. Cellule HeLa di cultura in DMEM con 1 g/L di glucosio completati con 10% siero fetale di vitello (FCS) e farle crescono a 37 ° C con 10% CO₂. Crescere TC-7 coltivate in DMEM con 4,5 g/L di glucosio, contenente 10% FCS e gli aminoacidi non essenziali in un incubatore a 37 ° C contenente 10% CO₂.
   2. Per la manutenzione delle cellule, dividere le celle regolarmente, per evitare un'inibizione di crescita-contatto collegata agli Stati confluenti; Questo è fondamentale per un'elevato Ca^{2 +} sonda caricamento/efficienza transfezione.
   3. Piastra di cellule HeLa sulla sterile 25 mm diametro circolare coprioggetti in piastre da 6 pozzetti ad una densità di 3 x 10⁵ cellule/pozzetto il giorno prima dell'esperimento per le cellule HeLa.
   4. Per cellule TC-7, tripsinizzano e contare le celle. Semi a 4 x 10⁵ cellule/pozzetto e incubare li 5-7 giorni a 37 ° C in un 10% CO₂-incubatore prima degli esperimenti per consentire una polarizzazione.
      1. Aggiornare il mezzo di coltura cellulare ogni giorno fino al giorno dell'esperimento.
         Nota: Chambers USA e getta di diametro 35 mm con fondo di vetro può anche essere utilizzato come alternativa ai pozzetti contenenti coprioggetti. Se questi ultimi sono utilizzati, controllo della temperatura attraverso un piatto riscaldato o obiettivo non è sufficiente, e una camera di incubazione termostato montato sul tavolino del microscopio è necessario.
3. Il giorno dell'esperimento, rimuovere il supporto e lavare le cellule 3 x con il mezzo di 1ml EM a 21 ° C.
4. Caricare le celle con 3mm Fluo-4am¹⁴ in un buffer di EM per 30 min a 21 ° C.
   Nota: Mentre il caricamento delle cellule HeLa Sub-confluenti non genera problemi principali, il caricamento di cellule polarizzate TC-7 è spesso eterogeneo e scarsamente efficiente. Per queste cellule, abbiamo trovato che l'efficienza di caricamento è migliorata con l'aggiunta dell'agente disperdente — pluronic acido — ad una concentrazione finale di 0,1% e l'anione-trasportatore inibitore bromosulfophtalein ad una concentrazione finale di 20 µM per il Fluo-4-AM-contenente EM. L'uso di raziometrici chimico sonde o geneticamente codificato-FRET sonde che richiedono dual-acquisizione non è compatibile con la velocità di acquisizione necessaria per l'imaging del locale Ca^{2 +} le risposte.
5. Lavare i campioni 3 x con EM buffer e ulteriormente li Incubare in 1 mL di tampone di EM a 21 ° C per consentire l'idrolisi della parte dell'AM. Uso Fluo-4 caricato cellule immediatamente o entro i prossimi 90 min (mantenuta a 21 ° C).

2. infezione e acquisizione di immagini di locale Ca^{2 +} risposte

1. Posizionare il vetrino coprioggetto contenente le celle di Fluo-4 caricato in una camera di imaging o con fondo di vetro camera. Lavare i campioni nella camera di imaging o USA e getta con fondo di vetro camera 3x con buffer di EM per rimuovere i composti potenzialmente derivanti da lisi cellulare. Aggiungere 1 mL di tampone di EM.
2. Posizionare la camera su un palcoscenico di microscopio di fluorescenza invertito riscaldato a 33 ° C.
   Nota: Questa temperatura è selezionata come un compromesso tra le temperature ottimali compatibili con il processo di invasione di Shigella e il rallentamento del Ca^{2 +} le risposte di visualizzare risposte locali. Usiamo un 63 X obiettivo a immersione in olio (NA = 1.25) dotati di anelli di contrasto di fase.
3. Selezionare un campo di microscopia e impostare i parametri di acquisizione, incluso il tempo di esposizione e binning se necessario, per ottimizzare il segnale fluorescente Fluo-4.
   Nota: Le principali sfide del locale Ca^{2 +} formazione immagine sono la bassa ampiezza e la piccola durata delle risposte, che richiedono acquisizione almeno ogni 30 ms più commercialmente disponibili retro-illuminato EM-CCD o C-MOS telecamere presentano la necessaria sensibilità per rilevare locale Ca^{2 +} risposte utilizzando Fluo-4. Sensibilità di rilevazione è anche una questione importante per limitare photodamage o manufatti quali risposte spontanee collegate all'eccitazione fluorescente di Fluo-4 ad alta frequenza. Qui, un'illuminazione basati su LED di 470 nm, con un filtro di eccitazione di 480 ± 40 nm passa-banda, un filtro dicroico 505 nm e un 527 emissione del passa-banda ± 30 nm usato al 5% della sua massima intensità combinata con un filtro a densità neutra 1,0 sono stati utilizzati per ridurre al minimo questi problemi sotto un flusso di acquisizioni di durata limitata. Un'analisi del Ca^{2 +} segnali locali di lotti di 120 flussi di s è stata effettuata ordinariamente. In queste condizioni di bassa illuminazione, fluoroforo photobleaching non è stata osservata durante le acquisizioni di min-flusso 2. Acquisizioni successive sullo stesso campione possono essere eseguite, condizione diversi campi sono utilizzati. Come regola generale, un primo flusso di acquisizione viene eseguito su un campo di controllo in assenza di stimolazione di batteri per garantire l'assenza di risposte spontanee. Se si osservano le risposte spontanee, i campioni sono lavati con un tampone di EM fino a quando non risposte sono osservate.
4. Per aggiungere i batteri al campione, rimuovere 500 µ l di tampone di EM dalla camera e aggiungere 500 µ l della sospensione batterica preparata al punto 1.1.6 per ottenere un finale OD_600nm di 0.05, con la cura adeguata per evitare di spostare il campo selezionato microscopia; i volumi di garantiscono una corretta miscelazione dei batteri e una distribuzione omogenea dei batteri su campioni di cellule.
5. Eseguire un'acquisizione su aggiunta batterica. In alternativa, eseguire un'acquisizione 10 min dopo l'aggiunta di batterico, che corrisponde al tempo necessario per i batteri di sedimento sulle cellule nelle circostanze usate. Alla fine del flusso acquisizione, acquisire un'immagine di contrasto di fase del campo selezionato per visualizzare i batteri a contatto con le cellule e il volant di membrana associato ai siti di invasione batterica.
6. Ripetere la procedura di acquisizione come descritto al punto 2.5, a intervalli che sono favorevoli alla durata delle acquisizioni di immagine, file risparmio e selezione di un nuovo campo per coprire l'intero processo.
   Nota: Per Shigella, abbiamo trovato che acquisizione flussi ogni 5 min per 20 min, seguendo la sedimentazione batterica di 10 min, ha permesso di coprire la maggior parte degli eventi invasione.
7. Al termine della procedura di acquisizione, è necessario aggiungere una concentrazione finale di 2 µM di Ca^{2 +} ionoforo ionomicina campioni per determinare la massima ampiezza di Ca^{2 +} segnali. Acquisire immagini ogni 3-5 s fino al segnale di stabilizzazione, di solito per meno di 10 min.
8. Seguire con l'aggiunta di Ca^{2 +} chelante EGTA ad una concentrazione finale di 10 mM per determinare il segnale di fluorescenza in assenza di Ca^{2 +}. Acquisire immagini ogni 3-5 s fino al segnale di stabilizzazione, di solito per meno di 10 min.
   Nota: A causa della relativamente lenta dinamica delle variazioni^{2 +} Ca globale, eseguire queste acquisizioni ogni 3-5 s (non in modalità streaming), permettendo per Ca^{2 +} imaging nello stesso campo microscopico durante i trattamenti successivi.

3. analisi

1. Rapidi^{2 +} variazioni di Ca citosolici nel tempo come la percentuale di ΔF/F₀, dove ΔF rappresenta la variazione dell'intensità di fluorescenza media della regione di interesse (ROI) e F₀ la fluorescenza di base nello stesso ROI, a cui un regione non rilevanti del campo privo di cellule viene sottratto.
   1. Rimuovere i livelli basali di fluorescenza per ogni cella in diversi campi, corrispondenti ai livelli basali; questi livelli possono essere determinati in modo non ambiguo a causa della bassa frequenza e relativamente di breve durata di Ca^{2 +} risposte locali in un'acquisizione di flusso specificato.
      Nota: Quantificare caratteristiche sorprendenti delle risposte relazionate alle domande poste e il modello patogeno studiato. Classicamente, vari parametri sono presi in considerazione per analizzare il Ca^{2 +} segnali, tra cui la frequenza delle cellule risultati locali o globali Ca^{2 +} risposte, così come la durata, ampiezza e frequenza di queste risposte. Nel caso di Shigella e risposte locali, un altro aspetto importante dell'analisi è l'associazione spaziale delle risposte con i siti di invasione batterica.
2. Per quantificare la percentuale di cellule rispondenti le risposte globali o locali, disegnare ROIs in cellule, nelle serie temporali corrispondenti alle variazioni di intensità di Fluo-4.
   1. Impostare parametri precisi per identificare locale Ca^{2 +} risposte, ad esempio un'ampiezza di variazioni dello sfondo sopra triplice della linea di base delle cellule di fluorescenza media intensità o una durata di almeno 200 ms, per evitare segnando un falso positivo.
      Nota: Come regola generale, anche i piccoli Ca^{2 +} risposte locali possono essere distinto da qualsiasi rumore di fondo dal loro profilo. Il ROIs dovrebbe essere sufficiente per integrare abbastanza segnali di fluorescenza per consentire la rilevazione delle variazioni locali. A seconda dell'intensità della rilevazione Fluo-4, questi ROIs può corrispondere a cerchi con diametri che vanno da 2-5 mM.
   2. Misurare le variazioni dell'intensità di fluorescenza di Fluo-4 media in 2 regioni in una zona distinta della cella stessa, per determinare se le risposte sono locali o globali.
      Nota: L'analisi di un gran numero di cellule è facilitato dall'uso di software che permette la visualizzazione on-line delle variazioni dell'intensità di fluorescenza media nel tempo per le regioni selezionate di imaging. Software di imaging disponibili in commercio ha una tale opzione, ma questo può essere eseguito anche utilizzando il freeware di Icy , utilizzando il plugin di ROI intensità Evolution .
   3. Determinare la percentuale di cellule che mostrano risposte locali.
      Nota: Questa percentuale è calcolata dal numero totale delle cellule analizzate nel campo della microscopia, che dovrebbe essere in numero sufficiente per supportare un statisticamente significato utilizzando un test non parametrico.
   4. Determinare la durata delle risposte locali.
      Nota: Locale Ca^{2 +} le risposte possono essere ulteriormente distinti secondo le loro gamme di durata (cioè, meno di 500 ms, tra 5 e 10 s, o superiore a 10 s) e la loro associazione con siti di invasione di Shigella .
3. Quantificare l'ampiezza delle risposte. In primo luogo, calibrare i Ca^{2 +} e delle cellule sfondo i livelli massimi determinati come descritto al punto 2.1.7. Poiché il carico di Fluo-4 può variare per ogni cella, è possibile eseguire queste determinazioni per le singole celle nel campo.
   1. L'ampiezza delle risposte si esprime come percentuale relativa della risposta massima.
   2. Eseguire il test statistico utilizzando un test di normalità, seguito da un test parametrico per analizzare le differenze di potenziale nell'ampiezza delle risposte tra i campioni.
   3. Determinare l'associazione di queste risposte riguardante i siti di invasione batterica dalla loro rispettiva localizzazione per il volant di membrana batterica-indotta visualizzati nelle immagini di contrasto di fase corrispondente.

Invasione di Shigella è associato con atipico lunga durata Ca^{2 +} risposte locali:

A seguito del protocollo di cui sopra, le cellule HeLa Fluo-4-caricati sono state sfidate con WT Shigella e acquisizioni di flusso sono stati effettuati per analizzare segnali di Ca^{2 +} . Un esperimento rappresentativo è mostrato in Figura 1, con serie di time-lapse immagini dell'intensità di fluorescenza della sonda Fluo-4 in media in una regione di interesse per una singola cella e la corrispondente immagine di contrasto di fase (Figura 1A, sinistra pannello). Il sito di invasione di Shigella è caratterizzato da ruches membrana rilevato nell'immagine di contrasto di fase (Figura 1A, freccia). Locale atipico aumenta in Ca citosolico libero^{2 +} sono osservate presso il sito di invasione di Shigella con un'ampiezza variabile e con durate da 2.5-5 s (figure 1A e 1B, frecce), seguita da un aumento globale gli infetti cella (Figura 1B, punte di freccia).

L'effettore III tipo IpgD regola la transizione da locale a globale Ca^{2 +} risposte indotte da Shigella in cellule HeLa:

L'analisi del Ca^{2 +} segnali indotti da selvaggio-tipo Shigella e un carente isogeniche ceppo mutante per il tipo effettrici III IpgD, una fosfatidil 4, 5 bisfosfato fosfatasi, ha indicato che questo ceppo di quest'ultimo indotto più globale e meno risposte atipiche locali di lunga durata (RATPs) con 11,3 ± 4.4 (SEM) % e 40.3 ± 7,5 (SEM) % di cellule reattive con risposte globali nel caso di un mutante WT e ipgD, rispettivamente (Figura 1)¹⁵. Questo mutante ipgD ottiene risposte locali ad una frequenza simile come il ceppo WT.

Shigella inibire InsP3-dipendente global Ca^{2 +} aumenta in cellule HeLa durante la cinetica di infezione prolungata:

L'imaging del global Ca^{2 +} risposte sulla cinetica di infezione estesa ha indicato una diminuzione nella frequenza delle risposte 30 min dopo la sfida con selvaggio-tipo Shigella (Figura 2A). Una simile diminuzione nella frequenza delle risposte Ca2 + è stata osservata in cellule di TC-7 infettate per 30 min con selvaggio-tipo Shigella¹⁵. La quantificazione delle risposte di dose-dipendente delle cellule per il Ca^{2 +} agonista dell'istamina illustra l'inibizione di un InsP3-dipendente Ca^{2 +} rilascio alle fasi ritardate di un'infezione di Shigella . WT Shigella conduce a atipica isolato Ca^{2 +} risposte durante il primo min 30 dell'infezione e dopo ulteriore incubazione, una drastica diminuzione nell'ampiezza e nella frequenza di Ca^{2 +} le risposte è stato osservato (Figura 2B).

Figura 1 . Locale e globale Ca^{2 +} risposte durante l'invasione di Shigella . Cellule HeLa sono state caricate con Fluo-4-AM e sfidate con WT Shigella. Immagini di contrasto di fase spettacoli (A), il pannello di sinistra. Il pannello di destra Mostra serie temporali di intensità media di fluorescenza di Fluo-4 con il codice colore raffigurato sulla destra. Il tempo dall'inizio dell'acquisizione è indicato in secondi, 10 min dopo la sfida batterica. La freccia indica i fuochi di invasione. I cerchi raffigurati corrispondano alle regioni analizzate in (B) dove le tracce con il colore corrispondente rappresentano le variazioni nell'intensità di fluorescenza media Fluo-4 sopra la linea di base. Le frecce indicano le risposte locali. Le frecce indicano risposte globali. (C) questo è uno schema che raffigura la determinazione della durata delle risposte Ca^{2 +} . La linea tratteggiata orizzontale indica i Ca^{2 +} i livelli basali (F₀); le barre verticali indicano variazioni dello sfondo. La linea verticale tratteggiata indica la massima ampiezza della risposta; le barre orizzontali indicano la durata della risposta determinata alla mezzo massima ampiezza. (D) Questa è la percentuale di cellule rispondenti ± SEM risultati risposte locali e globali Ca^{2 +} risposte indotte 5 min dopo l'infezione con il WT Shigella (barre di colore grigio scure) o il mutante di ipgD (barre di colore grigio chiaro). RATPs sono le risposte locali Ca2 + che durano per più di 5 s. N = 4; > 60 celle per ogni volta. Test di Wilcoxon, *P < 0,05; P < 0.01. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 . Inibizione di Ca^{2 +} risposte globali durante estesa cinetica dell'infezione dello Shigella . (A), il blu superiore frecce rappresenta la scala di tempo della sfida batterica e istamina alle concentrazioni indicate. Questo pannello mostra le tracce rappresentative della singola cella globale Ca^{2 +} variazioni dopo l'infezione dal WT Shigella (verde) e ipgD ceppo mutante (arancione). (B) questo pannello mostra la percentuale dell'ampiezza di Ca^{2 +} risposte rispetto la risposta massima, al momento di una stimolazione a istamina di 0,5 μM delle cellule infettate con i ceppi indicati per 90 min. La solida barra orizzontale rappresenta la percentuale massima media. Test di Wilcoxon, * *P < 0.01. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Questo manoscritto descrive il protocollo che abbiamo progettato per seguire Ca^{2 +} segnali locali durante la cinetica relativamente breve di un'invasione di Shigella , nonché global Ca^{2 +} le risposte durante la cinetica estesa di Shigella. Di seguito, chiave possono essere rilevati problemi che devono essere affrontate per ottimizzare l'individuazione di Ca^{2 +} segnali, riducendo al minimo qualsiasi interferenza con i processi biologici.

Chimica vs geneticamente codificato Ca^{2 +} sonde:

Per realizzare l'immagine^{locale Ca 2 + +} variazioni, abbiamo usato la sonda chimica Fluo-4 a causa del suo rendimento quantico alta e le sue dinamiche di risposta veloce. La velocità necessaria per l'acquisizione anche preclude l'uso di sonde raziometriche, poiché non è possibile eseguire un'acquisizione di doppia lunghezza d'onda. L'utilizzo di microrganismi patogeni, tuttavia, può interferire con le procedure standard utilizzando sonde Ca^{2 +} chimiche. Ad esempio, un'infezione prolungata delle cellule oltre 60 min da Shigella impedisce qualsiasi cella di carico con sonde chimiche, presumibilmente a causa di alterazioni indotte da agente patogeno della membrana plasmatica delle cellule ospite. Coerentemente, si osserva una diminuzione della fluorescenza di Fluo-4 associato durante la cinetica di infezione lungo, a causa della perdita citoplasmica di questa sonda. Implementazione di un controllo come l'aggiunta di ionomicina per determinare la fluorescenza alle massime concentrazioni^{2 +} Ca alla fine delle acquisizioni è quindi fondamentale per identificare le cellule reattive. Inoltre, cellule epiteliali intestinali polarizzate pertinenti per l'infezione di un agente patogeno sembrano essere refrattari a un caricamento della sonda Ca^{2 +} e richiedono procedure di caricamento specifiche. Mentre l'uso di un codificato geneticamente Ca^{2 +} reporter (GECR) può contribuire a risolvere alcuni di questi problemi, inoltre, introduce altre sfide. L'efficienza di trasfezione in sistemi cellulari host può rappresentare una seria limitazione, in particolare se si sovrappone con una scarsa resa infettiva. Inoltre, le caratteristiche di una risposta al Ca^{2 +} variazioni di GECRs la maggior parte non sono compatibili con la cinetica veloce per Ca^{2 +} analisi locale. Infine, l'espressione del GECR può interferire con i processi patogeni-mediata. Non discutiamo l'uso di GECR per lo studio di Ca^{2 +} segnalazione durante un'interazione ospite-patogeno. L'ingegneria recente e in corso di vari "fast-risponde" GECR sarebbe probabilmente meritano i ricercatori per rivisitare il loro uso negli studi futuri.

Tempi di acquisizione delle risposte^{2 +} Ca locali durante l'infezione batterica:

L'imaging delle risposte^{2 +} Ca locali richiede un'alta velocità di acquisizione di immagini che implicano un'eccitazione di fluorescenza sostenuta della sonda Fluo-4. A causa del photodamage legati all'acquisizione ad alta frequenza, è fondamentale che l'intensità dell'eccitazione fluoroforo luce viene mantenuto al minimo richiesto per ottenere un rapporto segnale-rumore sufficiente con un tempo di esposizione non superiore a 30 ms. avevamo buoni risultati utilizzando un sistema di LED al 5% della sua massima intensità, combinato con un filtro di densità ottica 1,0 con il set-up di acquisizione come descritto al punto 2.1.4. Anche in queste condizioni, tuttavia, abbiamo trovato che l'illuminazione continua necessaria per l'acquisizione di modalità di flusso non ha permesso per un periodo di acquisizione in 2 minuti. Una più forte illuminazione o un periodo di acquisizioni che superano questo limite potrebbero non specifico Ca^{2 +} risposte globali e/o l'inibizione dei processi di invasione batterica, presumibilmente legati al photodamage. Mentre l'imaging del locale Ca^{2 +} risposte sopra cinetica più a lungo possibile con mezzi di rilevazione più sensibili, allo stato attuale che tale imaging può essere eseguita solo su una frazione di tempo limitato i 15 min processo di invasione di Shigella . Per coprire l'intero processo, abbiamo effettuato la serie successiva di acquisizioni streaming 2 min. Questo intervallo di tempo è sufficiente per seguire locali e globali Ca^{2 +} risposte iniziali all'inizio del processo di infezione e di stabilire le differenze significative nel ceppo di selvaggio-tipo di Shigella e suoi mutanti isogeniche ipgD¹⁶. Lo sviluppo di una telecamera altamente sensibile può permettere ai ricercatori di ulteriormente ridurre l'intensità dell'illuminazione fluoroforo ed eseguire locale Ca^{2 +} imaging per lunghi periodi, migliorando così la risoluzione di tempo di più transitoria Ca^{2 +} segnali.

Correlazione spaziale tra Ca^{2 +} risposte locali e siti di invasione batterica:

A causa dell'aspetto locale di segnalazione eventi indotti da microrganismi, è importante studiare il Ca^{2 +} segnali locali rispetto alla loro associazione con i siti delle interazioni di cellulare dell'agente patogeno-ospite. Ciò ha sollevato due tipi di considerazioni. In primo luogo, tutte le celle non possono essere infettate, e tutti i microrganismi non possono attivare la segnalazione. Per Shigella, solo una minoranza dei batteri innescare un'invasione, e tutte le celle non possono essere infettate. Nei nostri esperimenti, il MOI era regolato in modo che una cella costituisce un 0,7 - 1 fuoco dell'invasione batterica. Numeri più alti di fuochi/cella possono causare un'interferenza possibile per l'analisi degli eventi individuali invasione e, al contrario, i numeri più bassi possono rendere l'analisi troppo complessa, in particolare quando si studia transitoriamente transfected le cellule. Abbiamo trovato che l'efficienza di trasfezione deve raggiungere almeno il 30% delle cellule di portare giù il numero di esperimenti di replicare ai numeri gestibili. In secondo luogo, i siti di invasione di Shigella possono essere facilmente individuate da microscopia di contrasto di fase. Per altri processi, altri metodi di rilevamento basati sulla fluorescenza potrebbero essere utilizzati. Un aspetto importante, tuttavia, è che in configurazioni più sperimentale, il flusso di acquisizione necessario per locale Ca^{2 +} formazione immagine escluda altri tipi di acquisizione durante il periodo. Ciò implica che il processo analizzato non dovrebbe mostrare il movimento significativo durante questo flusso per consentire loro correlazione spaziale con Ca^{2 +} segnali locali. Mentre questo è il caso per gli eventi di invasione di Shigella che localizzare nella stessa area di cella per diversi minuti, processi altamente mobili potrebbero non essere gestibili o richiederebbero probabilmente più brevi flussi di acquisizione.

Scoring e analisi di Ca^{2 +} risposte locali:

Mentre global Ca^{2 +} le risposte possono essere facilmente individuate, la rilevazione delle locali Ca^{2 +} risposte di piccola ampiezza e durata richiede l'ottimizzazione dell'acquisizione dei segnali fluorescenti descritto sopra. È anche importante che siano applicati criteri rigorosi per differenziare i segnali sopra le variazioni dello sfondo. Come regola, segnamo come un segnale di Ca^{2 +} un aumento dell'intensità di fluorescenza Fluo-4 media che raggiunge almeno 3 x le variazioni della linea di base in tre consecutivi 30 ms acquisizioni. Questa risposta è considerata come locale se un'altra regione della cella mostrando la stessa intensità di fluorescenza media non mostra tale aumento. Le marcature di Ca^{2 +} risposte locali in vari campioni non dovrebbe causare gravi difficoltà se queste regole vengono applicate sistematicamente. Nelle nostre mani, la bassa frequenza di Ca^{2 +} segnali locali associati con l'invasione batterica e che vanno da 5-20% della cella analizzato rappresentato un grande ostacolo. Di là di variazioni biologiche dettagliate nel paragrafo precedente, il fatto che solo un flusso corrispondente a una frazione del processo analizzato invasione inoltre contribuisce a questa bassa frequenza. A causa di questa bassa frequenza, che istituisce le differenze fra i campioni possono implicare l'esecuzione di un test di potenza su esperimenti pilota per stimare la dimensione del campione per raggiungere una significatività statistica.

Future applicazioni:

Noi crediamo che i protocolli per l'analisi locale Ca^{2 +} segnali durante un'invasione di Shigella sarà utile immagine Ca^{2 +} risposte locali per tutti i processi che rimangono nello spazio limitato durante il periodo di acquisizione ha funzionato. Mentre la segnalazione di Ca^{2 +} è versatile, Ca^{2 +} segnalazione locale può essere più rilevanti per i processi che si verificano presso il plasma o le membrane intracellulari, dove si trovano le fonti di punto iniziale dei segnali. Quindi, durante le interazioni cellula microbica-ospite, Ca^{2 +} segnali locali possono essere pertinenti ai processi di adesivo o invasivi sulla membrana plasmatica o che si verificano alle membrane intracellulari di agente patogeno-contenere vacuoli. D'altra parte, i protocolli che abbiamo progettato per l'analisi globale di Ca^{2 +} segnali sulla cinetica di infezione estesa possono essere rilevanti per i processi che riguardano la fisiologia cellulare generale durante un'infezione, come il regolamento di un programma trascrizionale o vie di morte delle cellule dagli agenti patogeni.

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Ringraziamo Thomassin Jenny-Lee per il suo aiuto nella redazione del manoscritto. Il lavoro è stato supportato da ANR concede MITOPATHO e PATHIMMUN, concede dal Labex Memolife e PSL IDEX Shigaforce. Chunhui Sun è un beneficiario di una sovvenzione di pH.d. dal Consiglio di borsa di studio di Cina. Laurent Combettes e Guy Tran Van Nhieu sono destinatari di un cambio di WBI-Francia Tournesol programma N ° 31268YG (Wallonie-Bruxelles International, Fonds de la Recherche Scientifique, Ministère Français des Affaires étrangères et européennes, Ministère de l'enseignement supérieur et de la Recherche dans le cadre des Partenariats Hubert Curien).