Imágenes de Ca^{2 +} respuestas durante la infección de Shigella de células epiteliales

Aquí, presentamos protocolos para visualizar las respuestas de calcio (Ca^{2 +}) provocadas por las células HeLa infectadas por Shigella. Optimización de los parámetros de infección bacteriana y la proyección de imagen con sondas fluorescentes de Ca^{2 +} , se caracterizan atípicos globales y locales Ca^{2 +} señales inducidas por bacterias sobre una amplia gama de cinética de la infección.

CA^{2 +} es un ion omnipresente en todos los procesos celulares conocidos. Aunque global Ca^{2 +} respuestas pueden afectar el destino de la célula, variaciones locales en libre Ca^{2 +} citosólicas concentraciones, ligadas a la liberación de tiendas interiores o un flujo a través de canales de la membrana plasmática, regulan procesos celulares corticales. Patógenos se adhieren a o invadir el huésped células gatillo una reorganización del citoesqueleto de actina subyacente a la membrana plasmática de host, que probablemente afecta a nivel global y local de Ca^{2 +} señalización. Porque estos eventos pueden ocurrir en frecuencias bajas de manera pseudo-estocástica sobre cinética extendida, el análisis de Ca^{2 +} señales inducidas por patógenos plantea importantes desafíos técnicos que deben abordarse.

Aquí, Divulgamos los protocolos para la detección de Ca^{2 +} señales globales y locales en una Shigella infección de células epiteliales. En estos protocolos, artefactos vinculados a una exposición prolongada y fotoenvejecimiento asociado con la excitación de Ca^{2 +} fluorescentes puntas de prueba se removio controlando estrictamente los parámetros de adquisición durante períodos de tiempo definidos durante un Shigella invasión. Procedimientos se implementan para analizar rigurosamente la amplitud y la frecuencia de Ca^{2 +} señales citosólicas globales durante la cinética de la infección extendida usando la sonda química Fluo-4.

CA^{2 +} regula todos los procesos de células conocidas, incluyendo la reorganización del citoesqueleto, las respuestas inflamatorias y vías de muerte celular relacionadas con las interacciones huésped-patógeno^1,2,3. En condiciones fisiológicas, basal Ca^{2 +} las concentraciones citosólicas son bajas, en los cientos de rango nM, pero pueden ser sometidas a aumentos transitorios sobre el estímulo del agonista. Estas variaciones demuestran a menudo comportamiento oscilatorio a través de la acción de las bombas y canales en las membranas del retículo endoplásmico y plasma. El patrón de estas oscilaciones se caracteriza por el período de duración y amplitud de Ca^{2 +} aumenta y es desencriptado por las células que, a su vez, desencadenan respuestas específicas en lo que se conoce como el Ca^{2 +} código^4,5 . Un aumento sostenido en la citosólica Ca^{2 +} concentración en condiciones patológicas puede conducir a la muerte celular asociada a la permeabilización de las membranas mitocondriales y la liberación de pro-apoptóticos o necróticos factores^{6, 7}.

Shigella, el agente causal de la disentería bacilar, invade las células epiteliales mediante la inyección de efectores en las células del huésped utilizando un tipo III secreción sistema (T3SS)^8,9. Una invasión de Shigella de las células huésped se asocia a locales y globales Ca^{2 +} señales sacadas por el T3SS. En cuanto a la formación de poro las toxinas, el translocon T3SS que inserta en las membranas de la célula huésped y es necesario para la inyección de T3SS efectores es probable responsable de la activación de PLC y el trifosfato de inositol (1, 4, 5) (InsP3)-dependiente de Ca^{2 +} lanzamiento. La combinación de la estimulación localizada del PLC y la acumulación de actina polimerizada en los sitios de un resultado de la invasión de Shigella en una anormalmente larga duración InsP3 dependiente de Ca^{2 +} liberación¹⁰. Tipo III generador de efectos IpgD, una fosfatidil 4,5 bifosfato (PIP2) -4-fosfatasa, limita la cantidad local de PIP2, controlando así la cantidad de sustrato disponible para el PLC generar InsP3, que contribuye a la reclusión de local Ca^{2 +} respuestas en los sitios de invasión bacteriana^11,12. Estos Ca^{2 +} respuestas locales probablemente contribuyen a la polimerización de la actina en la invasión de Shigella sitios¹⁰. Ca^{2 +} respuestas globales que también son sacadas por Shigella, sin embargo, son prescindibles para el proceso de invasión bacteriana sino desencadenar la apertura de connexin hemichannels en la membrana plasmática y la liberación de ATP en el medio extracelular compartimiento. Lanzado ATP actúan de manera paracrina, a su vez, estimula la Ca^{2 +} oscilatorias respuestas en las células al lado de la célula infectada. También es responsable de formar global Ca^{2 +} respuestas erráticas respuestas aisladas con dinámica lenta IpgD. Finalmente, a una infección bacteriana prolongada, IpgD lleva a la inhibición de señales de InsP3 mediada por Ca^{2 +} . A través de su interferencia con la Ca^{2 +} señalización IpgD retrasa un Ca^{2 +}-activación de calpaínas dependiente hacia el desmontaje de estructuras de adhesión focal y la separación prematura de infectado las células¹³.

Mientras que el Ca^{2 +} señales están implicadas en aspectos críticos de la patogénesis, el uso de un microorganismo plantea una serie de desafíos técnicos que no se encuentran en estudios clásicos agonista. Los protocolos descritos aquí usan el utilizados fluorescente Ca^{2 +} químico indicador Fluo-4 que hemos diseñados para caracterizar señales de Ca^{2 +} locales durante una infección por Shigella . Pasos críticos para la detección de estas señales se discuten, así como procedimientos para su análisis cuantitativo que es necesaria para caracterizar el papel de efectores bacterianas en la señalización de Ca^{2 +} .

1. preparaciones

1. Preparación de bacterias
   1. Las bacterias de la placa: cepa de tipo salvaje deShigella expresando la adhesina de AfaE (M90T-AfaE) — en un tripticasa agar de soja (TCS) placa que contiene 0.01% Congo rojo (CR) e incubar de 18 h a 37 ° C.
      Nota: Para aumentar su reproducibilidad, las placas de Shigella obtenidas en el paso 1.1.1 se almacenan a 4 ° C y deben ser usadas dentro de una semana, porque todas las colonias en medio de CR se pondrá rojas eventualmente con el tiempo.
   2. Inocular el TCS caldo de cultivo previo escogiendo 3 colonias rojo de las placas de la raya.
      Nota: Se realiza una inoculación con 3 colonias para limitar la probabilidad de escoger una sola copia cuyo plásmido de virulencia ha sufrido una recombinación genética.
   3. Crecen cultivos bacterianos líquidos en un incubador de agitación por 16 h a 37 ° C a 200 rpm. Añadir ampicilina a una concentración final de 75 mg/mL. Las concentraciones de antibióticas no deben exceder 3 x la concentración inhibitoria mínima, como un exceso de antibiótico puede llevar a la pérdida del plásmido de virulencia grande.
      Nota: El mantenimiento del plásmido de virulencia de Shigella debe verificarse por los cultivos bacterianos sobre placas CR suplementados con concentraciones adecuadas del antibióticas de la galjanoplastia. La presencia de colonias blancas indica pérdida de plásmidos.
   4. Inocular el cultivo TCS con el cultivo bacteriano previo a la dilución 1: 100. Incubar a 37 ° C en un incubador de agitación durante 2 horas a 200 rpm. Asegúrese de que la densidad óptica a 600 nm (OD_{600 nm}) es de 0.2 - 0.4.
   5. Centrifugar el cultivo bacteriano por 2 min a 13.000 x g a 21 ° C y resuspender el precipitado en un volumen equivalente de EM medio (120 mM NaCl, 7 mM KCl, 1,8 mM CaCl₂, 0.8 mM MgCl₂, 5 mM de glucosa y 25 mM HEPES pH = 7.3).
   6. Diluir la suspensión bacteriana en un búfer de EM en un final de OD_{600 nm} de 0,1 y usarlo inmediatamente o guarde a 21 ° C y usar dentro de los próximos 60 minutos.
2. Preparación de la célula
   1. Las células HeLa cultura en DMEM con 1 g/L de glucosa suplementado con 10% de suero fetal de ternero (FCS) y crecen a 37 ° C con 10% CO₂. Crecer TC-7 cultivadas en DMEM con 4,5 g/L de glucosa, que contiene 10% de FCS y aminoácidos no esenciales en una incubadora de 37 ° C que contenga 10% CO₂.
   2. Para el mantenimiento celular, dividir las celdas con regularidad para evitar una inhibición de crecimiento contacto vinculada a Estados confluentes; Esto es crítico para una Ca^{2 +} sonda carga/transfección eficacia alta.
   3. Placa de células HeLa en cubreobjetos circulares estériles de 25 mm de diámetro en las placas de 6 pozos a una densidad de 3 x 10⁵ células/pozo el día antes del experimento de las células HeLa.
   4. Las células TC-7, trypsinize y contar las células. Semilla en 4 x 10⁵ células/pozo e incúbelos a 37 ° C en un 10% de CO₂de 5-7 días-incubadora antes los experimentos para permitir una polarización.
      1. Actualizar el medio de cultivo celular todos los días hasta el día del experimento.
         Nota: Cámaras desechables de 35 mm de diámetro de fondo de cristal pueden usarse como alternativa a los pocillos que contienen el cubreobjetos. Si esta última se utiliza, control de temperatura a través de una platina calefactada u objetivo no es suficiente, y una cámara de incubación termostato montado en la platina del microscopio es necesaria.
3. El día del experimento, quitarlo del medio y lavar las células 3 x medio de 1 mL EM a 21 ° C.
4. Carga las células con 3 mM Fluo-4-AM¹⁴ en un búfer de EM durante 30 min a 21 ° C.
   Nota: Mientras que la carga de células HeLa el confluentes no plantea grandes problemas, la carga de polarizado células TC-7 suele ser heterogénea y poco eficiente. Para estas células, se encontró que la adición del agente dispersante es aumentar la eficiencia de carga: pluronic ácido — a una concentración final de 0.1% y el transportador de aniones inhibidores bromosulfophtalein en una concentración final de 20 μm a las EM de fluo-4-AM-que contiene. El uso de químico radiométrica sondas o codificado-FRET genéticamente sondas que requieren adquisición de doble no es compatible con la velocidad de adquisición necesario para la proyección de imagen de locales Ca^{2 +} respuestas.
5. Lavar las muestras 3 x con EM tampón y además les Incube en 1 mL de tampón de EM a 21 ° C para permitir que la hidrólisis de la molécula de AM. Uso Fluo-4 cargado células inmediatamente o en el siguiente minuto 90 (mantenida a 21 ° C).

2. infección y adquisición de imagen de locales Ca^{2 +} respuestas

1. Coloque el cubreobjetos que contiene las células Fluo-4 cargado en una proyección de imagen de cámara o cámara de fondo de cristal. Lavar las muestras en la sala de proyección de imagen o desechables de fondo de cristal de cámara x 3 con tampón de EM para separar compuestos potencialmente resultante de la lisis celular. Añadir 1 mL de tampón de EM.
2. Coloque la cámara en un escenario de microscopio de fluorescencia invertido calentado a 33 º C.
   Nota: Esta temperatura es seleccionada como un compromiso entre la temperatura óptima compatible con el proceso de invasión de Shigella y la disminución de Ca^{2 +} las respuestas para visualizar respuestas locales. Utilizamos un 63 X objetivo de aceite de inmersión (NA = 1.25) equipado con anillos de contraste de fase.
3. Seleccione el campo de la microscopía y configurar los parámetros de adquisición, incluyendo el tiempo de exposición y binning si es necesario, para optimizar la señal fluorescente Fluo-4.
   Nota: Los principales desafíos de local Ca^{2 +} proyección de imagen son la amplitud baja y la pequeña duración de las respuestas, que requieren la adquisición de por lo menos cada 30 ms. EM-CCD o CMOS retroiluminado disponibles comercialmente varios de la cámaras presente la necesaria sensibilidad para detectar locales Ca^{2 +} respuestas utilizando Fluo-4. Sensibilidad de detección es también un tema importante para limitar el fotoenvejecimiento o artefactos como respuesta espontánea ligada a la excitación fluorescente de Fluo-4 en una frecuencia alta. Aquí, una iluminación basada en LED de 470 nm, con un filtro de excitación de 480 ± 40 nm band-pass, un filtro dicroico de 505 nm y un 527 ± 30 nm paso banda de emisiones en 5% de su máxima intensidad combinado con un filtro de densidad neutra 1,0 fueron utilizados para reducir al mínimo estos problemas bajo un chorro de adquisiciones de duración limitada. Habitualmente se realiza un análisis de Ca^{2 +} señales locales por lotes de los arroyos s 120. En estas condiciones de baja iluminación, photobleaching fluoróforo no se observó durante las adquisiciones flujo min 2. Adquisiciones sucesivas sobre la misma muestra se pueden realizar, siempre y cuando se utilizan diferentes campos. Como regla general, una primera secuencia de adquisición se realiza en un campo de control en ausencia de estimulación de bacterias para asegurar la ausencia de respuestas espontáneas. Si se observan las respuestas espontáneas, las muestras se lavan con buffer EM hasta que no hay respuestas se observan.
4. Para agregar las bacterias en la muestra, retire 500 μl de tampón de EM de la cámara y agregar 500 μl de la suspensión bacteriana preparada en el paso 1.1.6 para obtener un final OD_{600 nm} de 0.05, con el cuidado adecuado para evitar mover el campo seleccionado de la microscopia; los volúmenes de aseguran una mezcla adecuada de las bacterias y una distribución homogénea de las bacterias en las muestras de células.
5. Llevar a cabo una adquisición a la adición de bacteria. Como alternativa, realizar una adquisición 10 min después de la adición de bacteria, que se corresponde con el tiempo necesario para las bacterias al sedimento en las células bajo las condiciones. Al final de la secuencia de adquisición, adquirir una imagen de contraste de fase del campo seleccionado para visualizar la bacteria en contacto con las células y los volantes de membrana asociados a sitios de invasión bacteriana.
6. Repita el procedimiento de adquisición como en el paso 2.5, a intervalos que son susceptibles a la duración de la adquisición de imagen, ahorro de archivos y selección de un nuevo campo para cubrir todo el proceso.
   Nota: Para Shigella, encontramos que la adquisición de secuencias cada 5 min por 20 min, después de la sedimentación bacteriana de 10 minutos, permitida cubrir la mayoría de los acontecimientos de la invasión.
7. Al final del procedimiento de adquisición, añadir una concentración final de 2 μm de las Ca^{2 +} ionóforo ionomycin muestras para determinar la amplitud máxima de las señales de Ca^{2 +} . Adquirir imágenes cada 3-5 s hasta estabilización de la señal, generalmente de menos de 10 minutos.
8. Seguir añadiendo una concentración final de 10 mM para determinar la señal de fluorescencia en ausencia de Ca^{2 +}Ca^{2 +} quelante EGTA. Adquirir imágenes cada 3-5 s hasta estabilización de la señal, generalmente de menos de 10 minutos.
   Nota: Debido a la dinámica relativamente lenta de las global Ca^{2 +} variaciones, realizar estas adquisiciones cada 3-5 s (no en modo streaming), permitiendo para el Ca^{2 +} la proyección de imagen en el mismo campo microscópico durante los tratamientos sucesivos.

3. Análisis

1. Expresar variaciones de Ca^{2 +} citosólicas en el tiempo como el porcentaje de ΔF/F₀, donde ΔF representa la variación de la intensidad de fluorescencia media de la región de interés (ROI) y F₀ la fluorescencia basal en el mismo ROI, a la que un región no relevantes del campo desprovisto de células se resta.
   1. Eliminar los niveles de fluorescencia basal de cada célula en diferentes campos, correspondientes a los niveles de línea base; Estos niveles se pueden determinar sin ambigüedades debido a la baja frecuencia y relativamente corta duración de local Ca^{2 +} respuestas en la adquisición de una secuencia dada.
      Nota: Cuantificar características llamativas de las respuestas relacionadas con las preguntas y el modelo patógeno estudiados. Clásico, varios parámetros se tienen en cuenta para analizar el Ca^{2 +} señales, incluyendo la frecuencia de células que tengan locales o globales Ca^{2 +} las respuestas, así como la duración, amplitud y frecuencia de estas respuestas. En el caso de Shigella y respuestas locales, otro aspecto importante del análisis es la Asociación espacial de las respuestas con los sitios de invasión bacteriana.
2. Para cuantificar el porcentaje de células sensibles mostrando respuestas globales o locales, dibujar ROIs en células, en series de tiempo correspondiente a las variaciones de intensidad de Fluo-4.
   1. Establecer parámetros estrictos para identificar locales Ca^{2 +} respuestas, como una amplitud de tres variaciones de fondo arriba de la línea de base de celular de intensidad de fluorescencia media y una duración de al menos 200 ms, para evitar marcar un falso positivo.
      Nota: Como regla general, incluso los pequeños locales Ca^{2 +} respuestas pueden distinguirse de cualquier ruido de fondo por su perfil. El ROI debe ser lo bastante grande como para integrar suficientes señales de fluorescencia para la detección de variaciones locales. Dependiendo de la intensidad de la detección de Fluo-4, estos ROIs pueden corresponder a los círculos con diámetros desde 2-5 mM.
   2. Medir las variaciones de la intensidad media de fluorescencia de Fluo-4 en 2 regiones en una zona distinta de la misma célula, para determinar si las respuestas son locales o globales.
      Nota: El análisis de un gran número de células es facilitado por el uso de software que permite la visualización en pantalla en línea de las variaciones de la intensidad de fluorescencia media en el tiempo para las regiones seleccionadas de imágenes. Software de proyección de imagen disponible en el mercado tiene esa opción, pero esto también se puede realizar usando el freeware de Icy , usando el plugin de Evolución de intensidad de ROI .
   3. Determinar el porcentaje de células que muestran respuestas locales.
      Nota: Este porcentaje se calcula a partir del número total de células analizadas en el campo de la microscopía, que debe ser en número suficiente para apoyar una significación estadísticamente mediante una prueba no paramétrica.
   4. Determinar la duración de las respuestas locales.
      Nota: Local de Ca^{2 +} las respuestas pueden distinguirse más lejos según sus rangos de duración (es decir, menos de 500 ms, entre 5 y 10 s, o superiores a 10 s) y su asociación con los sitios de invasión de Shigella .
3. Cuantificar la amplitud de las respuestas. En primer lugar, calibrar las máxima Ca^{2 +} y la célula niveles de fondo determinados como en el paso 2.1.7. Puesto que la carga de Fluo-4 puede variar para cada celda, realizar estas determinaciones para las células individuales en el campo.
   1. Expresa la amplitud de las respuestas como un porcentaje relativo de la respuesta máxima.
   2. Realizar las pruebas estadísticas utilizando una prueba de normalidad, seguida por una prueba paramétrica para analizar posibles diferencias en la amplitud de las respuestas entre las muestras.
   3. Determinar la Asociación de estas respuestas en relación con los sitios de invasión bacteriana por su respectiva localización en las membrana bacteriana inducida por de volantes visualizados en las correspondientes imágenes de contraste de fase.

Invasión de Shigella se asocia con anormal duradero Ca^{2 +} respuestas locales:

Siguiendo el protocolo mencionado anteriormente, las células HeLa Fluo-4-cargado se desafiaron con WT Shigella y se realizaron adquisiciones de secuencia para analizar señales de Ca^{2 +} . En figura 1, se muestra un experimento representativo con serie de Time-lapse de imágenes de la intensidad de fluorescencia de la sonda de Fluo-4 promediada en una región de interés para una sola celda y la correspondiente imagen de contraste de fase (figura 1A, izquierda panel). El sitio de la invasión de Shigella se caracteriza por volantes de membrana detectados en la imagen de contraste de fase (figura 1A, flechas). Anormales locales aumenta en libre citosólico Ca^{2 +} se observan en el sitio de la invasión de Shigella con una amplitud variable y duraciones que van desde 2.5-5 s (figuras 1A y 1B, flechas), seguido por el aumento global de los infectados celular (figura 1B, puntas de flecha).

Tipo III generador de efectos IpgD regula la transición de local a global Ca^{2 +} respuestas inducidas por Shigella en células HeLa:

El análisis de Ca^{2 +} señales inducidas por tipo Shigella y una deficiente isogénicas cepa mutante para el tipo III unidad de efectos IpgD, una fosfatidil 4, 5 bifosfato fosfatasa, indicada que esta última tensión inducida más global y menos respuestas anormales locales de larga duración (RATPs) con 11,3 ± 4.4 (SEM) % y 40,3 ± 7.5 (SEM) % de las células sensibles con respuestas globales en el caso de un mutante WT y ipgD, respectivamente (figura 1)¹⁵. Este mutante ipgD obtiene respuestas locales en una frecuencia similar como la cepa WT.

Dependiente de la InsP3 global Ca^{2 +} aumenta en células HeLa durante la cinética de la infección prolongada inhiben la Shigella :

La proyección de imagen de Ca^{2 +} dar respuestas globales sobre la cinética de la infección extendida señalaron una disminución en la frecuencia de respuesta 30 minutos tras el reto con el salvaje-tipo Shigella (figura 2A). Una disminución similar en la frecuencia de respuestas de Ca2 + se observó en TC-7 células infectadas durante 30 min con el salvaje-tipo Shigella¹⁵. La cuantificación de las respuestas de la célula dependiente de la dosis a la histamina agonista de Ca^{2 +} ilustra la inhibición de un comunicado de InsP3 dependiente de Ca^{2 +} en etapas tardías de una infección por Shigella . WT Shigella conduce a anormal aislado Ca^{2 +} respuestas durante los primeros 30 min de la infección y después más incubación, una drástica disminución de la amplitud y la frecuencia de Ca^{2 +} las respuestas se observó (figura 2B).

Figura 1 . Locales y globales Ca^{2 +} respuestas durante invasión de Shigella . Las células HeLa fueron cargadas con Fluo-4-AM y desafiadas con WT Shigella. (A) el panel de la izquierda muestra imágenes de contraste de fase. El panel de la derecha muestra la serie de tiempo de intensidad media de fluorescencia de Fluo-4 con el código de color en la derecha. El tiempo desde el inicio de la adquisición se indica en segundos, 10 minutos después el reto bacteriano. La flecha indica que los focos de invasión. Los círculos representados corresponden a las regiones analizadas en (B) donde los rastros con el color correspondiente representan las variaciones en la intensidad de fluorescencia media Fluo-4 sobre la línea de base. Las flechas indican las respuestas locales. Las puntas de flecha indican respuestas globales. (C) este es un esquema que representa la determinación de la duración de las Ca^{2 +} las respuestas. La línea punteada horizontal indica los niveles básicos de Ca^{2 +} (F₀); las barras verticales indican variaciones de fondo. La línea punteada vertical indica la amplitud máxima de la respuesta; las barras horizontales indican la duración de la respuesta a la amplitud del máximo de la mitad. (D) es el porcentaje de células sensibles ± SEM mostrando las respuestas locales y global Ca^{2 +} respuestas inducidas por infección post 5min con el WT Shigella (barras grises oscuros) o el ipgD mutante (barras grises claros). RATPs son Ca2 + respuestas locales que duran para más de 5 s. N = 4; > 60 células por cada vez. Prueba de Wilcoxon, *P < 0.05; P < 0.01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 . Inhibición de global Ca^{2 +} respuestas durante extendido cinética de la infección del Shigella . (A) el azul superior flechas representa la escala de tiempo del reto bacteriano y la histamina en las concentraciones indicadas. Este panel muestra los rastros representativos de célula global Ca^{2 +} variaciones después de la infección por la WT Shigella (verde) y ipgD cepa mutante (naranja). (B) este panel muestra el porcentaje de la amplitud de Ca^{2 +} respuestas en relación a la respuesta máxima, con una estimulación a histamina μM 0,5 de las células infectadas con las cepas indicadas durante 90 minutos. La barra horizontal representa el porcentaje promedio de máximo. Prueba de Wilcoxon, **P < 0.01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Este manuscrito describe el protocolo que hemos diseñados para seguir Ca^{2 +} señales locales durante las cinéticas relativamente corto de una invasión de Shigella , así como Ca^{2 +} respuestas globales durante la cinética extendida de Shigella. A continuación, clave se encuentran cuestiones que deben abordarse para optimizar la detección de Ca^{2 +} señales y reducir al mínimo cualquier interferencia con los procesos biológicos.

Química y genéticamente había codificado Ca^{2 +} sondas:

Para locales Ca^{2 +} variaciones de la imagen, usamos la punta de prueba química de Fluo-4 debido a su rendimiento cuántico alto y su dinámica de respuesta rápida. La velocidad requerida para la adquisición también excluye el uso de sondas de proporcionales, ya que no se puede realizar una adquisición de doble longitud de onda. El uso de microorganismos patógenos, sin embargo, puede interferir con procedimientos estándar mediante sondas químicas de Ca^{2 +} . Por ejemplo, una infección de la célula prolongada más de 60 min por Shigella previene cualquier célula de carga con las puntas de prueba química, probablemente debido a alteraciones inducidas por el patógeno de las membranas del plasma de la célula huésped. Constantemente, se observa una disminución de la fluorescencia de Fluo-4 asociados de la célula durante la cinética de la infección larga, debido a la pérdida citoplasmática de este sondeo. Por lo tanto, implementar un control como la adición de ionomycin para determinar la fluorescencia en las máxima Ca^{2 +} las concentraciones al final de las adquisiciones es fundamental para identificar las células sensibles. También, polarizadas células epiteliales intestinales relevantes para una infección de patógenos parecen ser refractarias a una carga de la sonda de Ca^{2 +} y requieren procedimientos específicos de la carga. Mientras que el uso de un genéticamente codificados Ca^{2 +} reportero (GECR) puede ayudar a resolver algunos de estos temas, presenta también otros desafíos. La eficiencia de transfección en sistemas host de la célula puede representar una seria limitación, especialmente si superpone con un pobre rendimiento infeccioso. Además, las características de una respuesta al Ca^{2 +} variaciones de GECRs la mayoría no son compatibles con la cinética rápida necesaria para el análisis de Ca^{2 +} local. Por último, la expresión de la GECR puede interferir con procesos mediada por patógenos. No discutiremos el uso de GECR para el estudio de Ca^{2 +} señalización durante una interacción huésped-patógeno. La ingeniería reciente y en curso de varios "respuesta rápida" GECR probablemente merecerían los investigadores para revisar su uso en futuros estudios.

Adquisición de local Ca^{2 +} respuestas durante una infección bacteriana de la sincronización:

La proyección de imagen de locales Ca^{2 +} respuestas requiere una alta velocidad de adquisición de imágenes que comprometen a una excitación sostenida de la fluorescencia de la sonda de Fluo-4. Por el fotodaño vinculada a la adquisición de alta frecuencia, es fundamental que la intensidad de la luz de la excitación del fluoróforo se mantenga al mínimo requerido para obtener una suficiente proporción de señal a ruido con un tiempo de exposición no superior a 30 ms. tuvimos buenos resultados utilizando un sistema de LED en el 5% de su intensidad máxima, combinado con un filtro de densidad óptica 1,0 con la configuración de la adquisición como se describe en el paso 2.1.4. Incluso en estas condiciones, sin embargo, encontramos que no permitían la iluminación continua necesaria para la adquisición de modo de corriente durante un periodo de adquisición durante 2 minutos. Una iluminación más fuerte o período de adquisiciones superiores a este límite puede resultar en no específica global Ca^{2 +} respuestas o en la inhibición de los procesos de invasión bacteriana, presumiblemente ligados al fotoenvejecimiento. Mientras que la proyección de imagen de locales Ca^{2 +} respuestas sobre cinética más largo posible con medios de detección más sensibles, en el estado actual de que dichas imágenes sólo puede realizarse sobre una fracción de tiempo limitado de 15 min de proceso de invasión de Shigella . Para cubrir todo el proceso, realizamos sucesivas series de 2 min streaming adquisiciones. Este intervalo de tiempo es suficiente para seguir iniciales respuestas local y globales Ca^{2 +} en el inicio del proceso de infección y establecer diferencias significativas en la cepa de tipo salvaje de Shigella y sus ipgD isogénicas mutantes¹⁶. El desarrollo de una cámara muy sensible puede permitir que los investigadores para reducir la intensidad de la iluminación del fluoróforo y realizar local Ca^{2 +} imagen durante largos períodos, lo que mejora la resolución de tiempo de más Ca transitoria^{2 +} las señales.

Correlación espacial entre Ca^{2 +} respuestas locales y sitios de invasión bacteriana:

Por el aspecto local de eventos de señalización inducida por microorganismos, es importante para el estudio de Ca^{2 +} señales locales con respecto a su asociación con los sitios de las interacciones de la célula huésped patógeno. Esto provoca dos tipos de consideraciones. En primer lugar, todas las células no pueden ser infectadas, y todos los microorganismos pueden desencadenar señalización. Para Shigella, sólo una minoría de bacterias desencadenan una invasión, y todas las células no pueden ser infectadas. En nuestros experimentos, el Ministerio del interior fue ajustado por lo que una célula forma una 0.7 - 1 enfoque de la invasión bacteriana. Mayor número de focos de la célula puede conducir a una posible interferencia para el análisis de los acontecimientos de invasión individual y, por el contrario, números más bajos pueden representar el análisis demasiado complejo, en particular al estudiar células transfected transitorio. Encontramos que la eficiencia de transfección debe alcanzar al menos el 30% de las células para reducir el número de experimentos repetidos a números manejables. En segundo lugar, los sitios de invasión de Shigella pueden detectarse fácilmente por microscopía de contraste de fase. Para otros procesos, podrían utilizarse otros métodos de detección basados en fluorescencia. Sin embargo, un aspecto importante, es que en configuraciones más experimentales, la secuencia de adquisición requerida local Ca^{2 +} imagen excluye otros tipos de adquisición durante el período. Esto implica que el proceso analizado no debe presentar movimiento significativo durante esta secuencia para permitir su correlación espacial con Ca^{2 +} señales locales. Mientras que este es el caso de eventos de invasión de Shigella que localizar a la misma área de la célula durante varios minutos, procesos altamente móviles pueden no ser manejables o probablemente requeriría más cortas secuencias de adquisición.

Puntuación y análisis de Ca^{2 +} respuestas locales:

Mientras que global Ca^{2 +} respuestas se detectan fácilmente, la detección de local Ca^{2 +} respuestas de pequeña amplitud y duración requiere la optimización de la adquisición de señales fluorescentes descrito anteriormente. También es importante que se apliquen criterios para distinguir las señales por encima de las variaciones de fondo. Como regla general, nos cuenta como una señal de Ca^{2 +} un aumento de la intensidad media de fluorescencia de Fluo-4 que llega a por lo menos 3 x las variaciones de la línea de base en tres consecutivos 30 ms adquisiciones. Esta respuesta se considera como local si otra región de la célula con la misma intensidad de fluorescencia media no muestra dicho aumento. El marcador de local Ca^{2 +} respuestas en varias muestras no debería causar grandes problemas si estas reglas se aplican sistemáticamente. En nuestras manos, la baja frecuencia de Ca^{2 +} señales locales asociados a la invasión bacteriana y que van desde 5-20% de la célula analizada representó un gran obstáculo. Más allá de las variaciones biológicas detalladas en el párrafo anterior, el hecho de que sólo un flujo correspondiente a una fracción del proceso de invasión analizados también contribuye a esta baja frecuencia. Debido a esta baja frecuencia, estableciendo diferencias entre muestras puede implicar realizar una prueba de la energía en experimentos piloto para estimar el tamaño de la muestra para alcanzar una significación estadística.

Futuras aplicaciones:

Creemos que los protocolos elaboraron analizar local Ca^{2 +} señales durante una invasión de Shigella se útil imagen Ca^{2 +} respuestas locales para todos los procesos que quedan espacialmente limita durante el período de adquisición. Ca^{2 +} señalización es versátil, puede ser más relevante para los procesos que ocurren en el plasma o en las membranas intracelulares donde residen las fuentes de punto iniciales de las señales de Ca^{2 +} señalización local. Así, durante las interacciones de la célula microbiana huésped, Ca^{2 +} señales locales pueden ser relevante a los procesos adhesivos o invasivos en la membrana plasmática o que ocurren en las membranas intracelulares que contienen el patógeno las vacuolas. Por otra parte, los protocolos que hemos diseñado para analizar señales de Ca^{2 +} globales sobre cinética de la infección prolongada pueden ser relevantes para procesos que afectan a la fisiología de la célula general durante una infección, como la regulación de un programa transcripcional o vías de muerte celular por agentes patógenos.

Los autores no tienen nada que declarar.

Agradecemos a Jenny Lee Thomassin por su ayuda en editar el manuscrito. El trabajo fue financiado por la ANR otorga MITOPATHO y PATHIMMUN, subvenciones de la Labex Memolife y PSL IDEX Shigaforce. Chunhui sol es un recipiente de una beca de doctorado del Consejo de becas de China. Laurent Combettes y Guy Tran Van Nhieu reciben de un intercambio de WBI-Francia Tournesol programa N ° 31268YG (Wallonie-Bruxelles International, Fonds de la Recherche Scientifique, Ministère Français des Affaires étrangères et européennes, Ministerio de l ' enseignement supérieur et des de la Recherche dans le cadre dificultaría Hubert Curien).