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Questo protocollo descrive un approccio fluido pressurizzato, fisiologicamente rilevante per induzione rapida e reversibile di varicosità in neuroni.
Varicosities axonal sono allargate strutture lungo i fasci di assoni con un elevato grado di eterogeneità. Sono presenti non solo nei cervelli con malattie neurodegenerative o lesioni, ma anche nel cervello normale. Qui, descriviamo un sistema di nuova costituzione micromeccanici per in modo rapido, affidabile ed reversibilmente indurre varicosities axonal, permettendoci di comprendere i meccanismi che regolano la formazione del varicosity e la proteina eterogenea composizione. Questo sistema rappresenta un mezzo romanzo per valutare gli effetti dello sforzo di compressione e taglio su diversi compartimenti cellulari dei neuroni, diversi da altri sistemi in vitro che si concentrano principalmente sull'effetto di stretching. Cosa importante, a causa delle caratteristiche uniche del nostro sistema, abbiamo recentemente effettuato una scoperta di nuovi risultati che l'applicazione del fluido pressurizzato può indurre rapidamente e reversibilmente varicosities axonal attraverso l'attivazione di un canale potenziale transitorio del ricevitore. Il nostro sistema biomeccanico può essere utilizzato comodamente in combinazione con aspersione di droga, live cell imaging, imaging del calcio e registrazione di patch clamp. Pertanto, questo metodo può essere adottato per lo studio di canali ionici meccanosensibili, regolamento di trasporto assonale, dinamica del citoscheletro assonale, segnalazione calcio e cambiamenti morfologici correlati a traumatico cranico.
Formazione del varicosity, o gonfiore/bordatura, lungo gli assoni, è una caratteristica prominente di neurodegenerazione osservata in molti disturbi o lesioni del sistema nervoso centrale, tra cui la sclerosi multipla, morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson e traumatica brain injury1,2. Nonostante gli impatti fisiologici significativi dei varicosities axonal sulla propagazione del potenziale d'azione e trasmissione sinaptica3, come vengono generati i varicosities rimane sconosciuto. Recentemente, usando un'analisi di nuova costituzione microbiomechanical su colture di neuroni ippocampali da roditori, abbiamo trovato che stimoli meccanici possono indurre varicosità in questi neuroni con altamente interessanti caratteristiche. In primo luogo, l'induzione del varicosity è rapida (< 10 s) e questo processo è reversibile in modo imprevisto. In secondo luogo, l'inizio del varicosity dipende dalla forza sbuffando pressione: maggiore è la pressione, più veloce all'avvio. In terzo luogo, l'inizio del varicosity dipende dall'età neuronale. Gli assoni dei neuroni più giovani appaiono più reattivi alle sollecitazioni meccaniche, rispetto a quelle dei neuroni più anziani. In quarto luogo, il modulo di varicosità lungo gli assoni dei neuroni ippocampali, mentre i segmenti di assone iniziale di questi neuroni e dendriti non visualizzare nessun cambiamento nella stessa circostanza puffing. Così, il nostro studio ha rivelato una caratteristica novella di polarità di un neurone. Questi risultati con il sistema in vitro sono fisiologicamente rilevanti. Utilizzando un modello in vivo per trauma cranico lieve (mTBI), abbiamo mostrato che varicosities axonal sviluppato in modo multi-focale nella corteccia somatosensoriale dei topi immediatamente dopo l'impatto di Chiudi-cranio, coerenza con il nostro in vitro Risultati4. È importante notare che la nostra colorazione e imaging dei topi mTBI forniscono solo un'istantanea di un neurone cambiamenti morfologici, da eseguire in vivo imaging time-lapse della morfologia neuronale durante un impatto meccanico è ancora non è fattibile.
Questo sistema fluido-sbuffando ci ha permesso non solo di catturare caratteristiche uniche associate alla formazione di varici indotta da stress meccanico, ma anche per determinare il meccanismo di fondo. Provando diverse soluzioni extracellulare, bloccanti e apribottiglie di diversi candidati di canali ionici mechanosensitive ed elettrofisiologia cellulare, abbiamo identificato che il catione potenziale transitorio del ricevitore canale membro subfamily V 4 (TRPV4) canale che è permeabile per Ca2 + e Na+ e attivato da sbuffando è principalmente responsabile per la rilevazione iniziale stress meccanico durante la formazione di varici axonal4. Questo è stato ulteriormente confermato con un approccio di knockout di siRNA. Presi insieme, questo nuovo sistema di dosaggio che abbiamo sviluppato con la cultura di Neurone ippocampale, è altamente utile per studiare le proprietà di micromeccanica dei neuroni centrali, specialmente in combinazione con altre tecniche.
Questo sistema di micromeccanica che abbiamo stabilito è unico e si differenzia dai sistemi già esistenti in diversi aspetti importanti. In primo luogo, in questo sistema, i neuroni esperienza fuori del piano sollecitazioni meccaniche nelle forme di compressione e taglio. Durante l'impatto meccanico, processi neuronali rimangono attaccati alla superficie del vetrino coprioggetto e non si muovono. Questo è diverso da altri sistemi che si occupa principalmente di flessione e stretching in piano sperimentale (o tensione), per esempio, la deflessione degli assoni in bundle come stringhe5,6 in movimento o stretching assoni coltivati su bioerodibili canali e membrane estensibile7,8. Inoltre, sebbene varicosities axonal possono anche essere indotti questi saggi come nel nostro sistema fluido-sbuffando, il processo in queste impostazioni richiede molto più tempo (da 10 minuti a parecchie ore6,7,8) e viene visualizzato irreversibile. Infine, il nostro sistema utilizzando sbuffando fluido locale consente l'esame delle caratteristiche spaziali della formazione del varicosity (ad es., dendriti, spine dendritiche, soma, axonal segmenti iniziali e terminali axonal), oltre alle sue caratteristiche temporali. Utilizzando questo sistema, abbiamo scoperto diverse caratteristiche inaspettate e unici di formazione del varicosity assonale, particolarmente rapida insorgenza, lenta reversibilità e polarità di assone-dendrite.
Il sistema che discutiamo in questa carta è compatibile con molte tecniche di molecolare e biologia cellulare. Per esempio, per studiare gli effetti dello stress meccanico sulla morfologia neuronale e funzione, può essere utilizzato insieme a coculture di mielina, time-lapse di imaging di fluorescenza di riflessione interna totale (TIRF) e di trasferimento di energia di risonanza fluorescente (FRET) formazione immagine del calcio e registrazione di patch clamp. In questa carta, ci concentriamo sui componenti di base del sistema. Cultura di neuroni ippocampali, il fluido-sbuffando installazione, imaging ad alta risoluzione time-lapse per trasporto assonale e calcio imaging sono illustrate passo passo qui di seguito.
Tutti i metodi descritti di seguito sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della Ohio State University.
1. preparazione vetrino coprioggetto
2. dissezione, la dissociazione e la cultura dei neuroni Hippocampal da Mouse/ratto incinto
3. configurazione dell'apparato di pipetta Puffing
Nota: Ci sono cinque componenti di base di questo set-up: la pipetta di vetro, la tubazione, la siringa, il micromanipolatore e il buffer (Hank). Qualsiasi buffer che è fisiologicamente rilevanti concentrazioni saline potrebbe essere utilizzato in questo set-up.
4. calibrare la pressione della pipetta che utilizzano un sistema a membrana stretch
5. sbuffando per indurre Varicosities
6. complimentarmi con metodi
Nota: Il dosaggio puffing possa essere combinato con una varietà di tecniche diverse che sono discussi nella sezione Introduzione. Qui, il focus è sulle tecniche di base che vengono utilizzate più di frequente con il dosaggio di puffing, compreso formazione immagine di fluorescenza ad alta risoluzione timelapse, calcio imaging e saggi di recupero. Questi sono discussi di seguito.
Prima sbuffando, assoni normalmente mostrano poca formazione di varici. Seguente sbuffando con la nostra pressione standard (190 mmH2O altezza), l'inizio di assoni di sviluppare molti tallone-come varicosità. La formazione di varicosità è parzialmente reversibile, come mostrato dalle regioni dell'assone tornando al loro stato pre-soffiato in seguito a un periodo di recupero di 10 min (Figura 2A-B). Dopo un periodo di recupero più lungo (> 20 min), alcuni assoni recupero completamente. Posizionamento non ottimale la pipetta puffing nonché accurato posizionamento della siringa a 190 mm sopra il palco non può rapidamente generare varicosità. Condizioni ottimali dovrebbero provocare la formazione di varici negli assoni dei neuroni giovane (circa 7 DIV) in circa 5 s4.
Figura 1 : Disegno schematico e fotografia di sbuffando apparato. (A) fotografie che mostrano di set-up generale di microscopio. (B) sbuffando apparecchio per mostrare la pipetta di vetro tenuto dal micromanipolatore e collegato alla tubazione di gomma. Contrasto di fase (C) immagini con messa a fuoco nel piano dei neuroni hippocampal primari risultati ombra della pipetta nella parte inferiore destra. (D) fuori della cella aereo focalizzata su sbuffando punta della pipetta. (E) schema delle distanze e delle pressioni calcolate per l'induzione di varicosità. Barra della scala = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Immagini rappresentative di formazione di varici segue sbuffando. (A) formazione immagine di 7DIV, neuroni ippocampali di mouse transfettate GFP mostrando un assone pre- e post-sbuffando oltre a seguire un periodo di recupero di 10 min. (B) Kymograph dell'imaging time-lapse del neurone in (A). Le frecce rosse indicano varicosità che si sono formate a seguito di 150 s di 190 mmH2O sbuffando (inizio alle 30 s). Barra della scala = 15 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Soluzione di rivestimento vetrino coprioggetti | |
Μ L 780 | Acid17 acetico mM calcio: 50 µ l di acido acetico in 50 mL di H2O |
200 Μ l | Poli-D-lisina (0,5 mg/mL di brodo) |
20 Μ l | Collagene di coda di ratto (3 mg/mL di brodo) |
Il volume totale viene determinato in base al numero di vetrini coprioggetto da rivestire. |
Tabella 1: soluzione di rivestimento vetrino coprioggetti. Fornisce la ricetta per preparare la soluzione di rivestimento vetrino coprioggetti usata per aderire le cellule coltivate a lamelle.
1 x fetta dissezione soluzione (SLD), filtrato, pH = 7,4, conservare a 4 ° C | |
1 L | ddH2O |
82 mM | Na2così4 |
30 mM | K2così4 |
10 mM | HEPES (acido libero) |
10 mM | D-glucosio |
5 mM | MgCl2 |
0.00% | Rosso fenolo (opzionale) |
Placcatura Media (PM, filtrare, conservare a 4 ° C) | |
439 mL | Sali di MEM Earle |
50 mL | FBS |
11,25 mL | 20% D-glucosio |
5 mL | Piruvato di sodio (100 mM), |
62,5 Μ l | L-Glutammina (200 mM) |
5 mL | Penicillina/streptomicina (P/S, x 100) |
Mezzi di manutenzione (MM, filtrare, conservare a 4 ° C) | |
484 mL | Neurobasal |
10 mL | Supplemento 50 x B27 |
1,25 mL | L-Glutammina (200 mM) |
5 mL | 100 x P/S |
Tutte le soluzioni sono sterilizzate con un filtro con pori di 0,2 mm. |
Tabella 2: Cell ricette di cultura media. Fornisce le ricette per preparare i supporti utilizzati alla coltura delle cellule primarie del neurone hippocampal.
Buffer di Hank (filtro, pH = 7,4, conservare a 4° C | |
150 mM | NaCl |
4 mM | KCl |
1.2 mM | MgCl2 |
1 mM | CaCl2 |
10 mg/mL | D-glucosio |
20 mM | HEPES |
Tabella 3: ricetta di buffer di Hank. Fornisce la ricetta per preparare il buffer utilizzato nel protocollo puffing e durante la formazione immagine di cellule vive.
Pipettare tirando i parametri | |||||
Calore | Tirare | Velocità | Ritardo | Pressione | Rampa |
501 | 0 | 15 | 1 | 500 | 530 |
Tabella 4: Pipettare tirando parametri. Fornisce i parametri da impostare sulla levetta della pipetta per ottenere un'apertura che è circa 45 µm di diametro.
La procedura di questo test di microbiomechanical è dritto in avanti. Esso produrrà risultati affidabili, se tutti i suoi passaggi sono eseguiti con attenzione. Ci sono diversi passaggi chiave che, se correttamente eseguita, ostacolerà la raccolta dei dati di successo. I passaggi critici cominciano a monte dell'effettiva applicazione dello stimolo puffing. La dissezione attenta, coltura e cura della cultura primaria del neurone sono di primaria importanza. Se i neuroni coltivati non sono sani, non reagiranno in modo coerente, poiché essi potrebbero già state innescate per lo stress. A valle della cultura, la configurazione iniziale e la taratura dell'apparato puffing per fornire una pressione costante, che indurrà varicosities ma non causerà il distacco delle cellule dalla superficie del vetrino coprioggetto, deve essere eseguita con pazienza. Una calibrazione accurata dell'assetto potrebbe richiedere 1 h a causa di problemi di valvola, tubi o pipetta intasamento. È fondamentale per assicurare che il fluido scorre fuori della pipetta con una resistenza minima prima di andare avanti con posizionando le cellule nel piatto e posizionare la punta della pipetta. Per quanto riguardano le modifiche all'assetto, uno può abbinare apparato puffing con aspersione, patch di bloccaggio e qualsiasi altro basati su microscopio strumento, per lo più dipenda sullo spazio fisico libero sui lati del microscopio.
Questo sistema ha due limitazioni intrinseche che richiedono attenzione. Il set-up può costantemente iniziano la formazione di varicosità reversibile in assoni dei neuroni hippocampal coltivati attraverso puffing fluido alle cellule. Tuttavia, è importante notare che i valori di pressione esatta sui neuroni all'interno dello stesso campo puffing non sono identici. La pressione del fluido che urta le cellule, calcolata in base alla misura del carico di pressione da un microfabbricati membrana in silicone4,10, rappresenta la pressione media al centro del campo puffing. Così, l'esatta pressione puffing è il più alto nel centro del campo del puffing e il più basso intorno al bordo del campo. Abbiamo dimostrato che le componenti di forza di pressione con l'insorgenza, la dimensione e il numero di varicosità indotto4. Pressione superiore ha provocato un inizio più veloce, più grande e più abbondante varicosities4. Nei nostri studi recenti, abbiamo usato una pressione minima (190 mmHg sulla punta della pipetta puffing) che possa indurre ancora attendibilmente varicosities nella maggior parte dei assoni4. In questa circostanza, insorgenza di varici per giovani neuroni è normalmente circa 5 s. È importante notare che con l'esatto stesso sbuffando sistema, il valore del tempo di insorgenza può variare, che non solo dipende dal tipo di un neurone, età e compartimento subcellulare, ma può anche essere influenzata dalla posizione del neurone nel campo puffing. Nonostante la variazione di pressione puffing ricevuto dai neuroni, questo sistema di dosaggio ancora fornisce un mezzo affidabile per lo studio di effetti meccanici su neuroni centrali e produce risultati sperimentali altamente coerenti e riproducibili.
La seconda limitazione del sistema è il suo problema di intasamento. Per ottenere la pressione fisiologicamente rilevanti, l'apertura delle pipette è piccolo, circa 45 μm. Tuttavia, la piccola apertura tende ad impastarsi con detriti dalla tubazione di plastica e i detriti nella punta della pipetta possono essere visto chiaramente al microscopio. Questo aumenta la quantità di tempo durante la preparazione il set-up, in caso di uno zoccolo di pipetta. Di conseguenza, tutte le soluzioni sono accuratamente filtrate prima di essere messo nella siringa, tubi e pipetta. Inoltre è importante lavare il sistema puffing con etanolo al 70% all'inizio e alla fine della giornata, seguita da lavaggio con buffer di Hank filtrata. Per risolvere il potenziale problema di intasamento, ti suggeriamo di provare a tirare più pipette. È essenziale per confermare che la soluzione è in realtà soffiata fuori la pipetta attraverso la visualizzazione prima di iniziare gli esperimenti. Una volta stabilito un buon sistema puffing, solitamente può durare per il resto della giornata.
Questa analisi biomeccanica, combinata con la cultura del neurone, presenta un'opportunità unica per lo studio del neurone centrale mechanosensation che imita le condizioni fisiologiche e/o patofisiologiche. Questo sistema permette di esaminare gli effetti di compressione e taglio sui neuroni. Al contrario, altri sistemi sono stati usati per esaminare in piano stretching5,6,7. La pressione media ricevuta dai neuroni nel centro delle zone puffing è 0.25 ± 0,06 nN/µm2 nel nostro sistema4. Questa pressione esercitata sulle cellule è paragonabile al modulo elastico dei neuroni ippocampali come misurato in precedenza utilizzando reologia microscopia e massa scansione di forza, per identificare otticamente indotto deformazione13,14, così come pressioni permette alterare la crescita di neuriti bordi iniziali in vitro, misurata mediante la scansione forza microscopia (0.27 ± 0,04 nN/µm2)16. Questa pressione non superi la pressione che possa essere generata naturalmente dalle cellule mesenchymal in un embrione E11, misurata utilizzando olio di dimensioni delle cellule fluorescenti meccanicamente specifico microgocce (1,6 ± 0,8 nN/µm)2,14.
Questo sistema è già stato utilizzato con successo in combinazione con calcio imaging, patch di bloccaggio, microscopio elettronico e analisi cellulare di un cranio chiuso mTBI mouse modello4. Il dosaggio anche utilizzabile in combinazione con esperimenti basati su microscopio, come recupero di fluorescenza dopo photobleaching (FRAP), per esaminare la proteina turn over all'interno di varicosità, come pure di FRET per studiare se sono alterate interazioni proteina-proteina durante la formazione di varici. In sostanza, qualsiasi metodo che può essere fatto utilizzando un microscopio e una cellula viva, set-up di imaging può essere accoppiato con questo dosaggio puffing. La versatilità di questo test è molto preziosa a studiare i meccanismi molecolari sottostanti vari effetti sulla morfologia neuronale e funzioni dallo sforzo di micromeccanica.
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con gli istituti nazionali di salute animale uso orientamenti. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalle concessioni dal National Institutes of Health (R01NS093073 e R21AA024873) a C. Gu.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
12 mm coverslips | Warner Instruments | 64-0702 | for 24-well plate |
25 mm coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | for 6-well plate |
Acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
Rat tail collagen | Roche | 11 179 179 001 | |
10X PBS | National Diagnostics | CL-253 | |
Na2SO4 | Fisher Scientific | S373-500 | |
K2SO4 | Fisher Scientific | P304-500 | |
HEPES | Fisher Scientific | BP410-500 | |
D-glucose | Fisher Scientific | D16-500 | |
MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
NaOH | Fisher Scientific | SS255-1 | |
Protease enzyme | Sigma | P4032 | |
FBS | Gibco | 26140 | |
Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
L-glutamine | Gibco | 25030081 | |
Penicillin/Streptomycin 100x (P/S) | Gibco | 15140122 | |
MEM Earle's Salts | Gibco | 11090 | |
B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
Arabinosylcytosine (Ara-C) | Sigma | 147-94-4 | |
Opti-MEM media | Gibco | 31985-070 | |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1854313 | transfection reagent |
Borosilicate rods | World Precision Instruments Inc. | PG52151-4 | for puffing pipette |
rubber tubing | Fisher Scientific | 14-169-1A | |
10cc plastic syringe and plunger | Becton Dickinson | ||
micromanipulator | Sutter Instruments | ||
NaCl | Fisher Scientific | S640-3 | |
KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
CaCl2 | Fisher Scientific | C70-500 | |
Cell culture dish (35 mm x 10 mm) | Corning | 3294 | |
Fluo-4 AM | Molecular Probes | F14201 | for calcium imaging |
Mito-YFP construct | Takara Bio Inc. | for cell transfection | |
YFP-N1 construct | Takara Bio Inc. | for cell transfection | |
Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette puller | Sutter Instruments | ||
Eclipse TE2000-U Mcroscope | Nikon | ||
Plan Fluor ELWD 20x lens | Nikon | 062933 | objective |
Apo TIRF 100x/1.49 oil lens | Nikon | MRD01991 | objective |
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