Method Article
Ce protocole décrit une approche fluide pressurisée physiologiquement pertinente pour l’induction rapide et réversible de varicosités dans les neurones.
Varicosités axonales sont des structures élargies sur les arbres des axones avec un haut degré d’hétérogénéité. Ils sont présents dans le cerveau avec des blessures ou de maladies neurodégénératives, mais aussi dans le cerveau normal. Nous décrivons ici un système nouvellement créé micromécaniques pour rapide, fiable et réversible induisent des varicosités axonales, ce qui nous permet de comprendre les mécanismes qui régissent la formation varicosité et composition en protéines hétérogènes. Ce système représente un moyen novateur d’évaluer les effets des contraintes de compression et de cisaillement sur les différents compartiments subcellulaires des neurones, différents des autres systèmes in vitro qui portent principalement sur l’effet de l’étirement. Ce qui est important, en raison des particularités de notre système, nous avons récemment fait une découverte montrant que l’application du fluide sous pression peut rapidement et de façon réversible induire axonales varicosités par l’activation d’un canal de potentiel récepteur transitoire. Notre système biomécanique peut être idéalement utilisé en combinaison avec la perfusion de médicaments, l’imagerie de cellules vivantes, imagerie calcique et enregistrement de patch clamp. Par conséquent, cette méthode peut adopter pour l’étude des canaux ioniques mécanosensibles, règlement transport axonal, dynamique du cytosquelette axonal, calcium de signalisation et les changements morphologiques liés à un traumatisme crânien.
Varicosité formation, ou gonflement/perler, le long des axones, est une caractéristique importante de la neurodégénérescence observée dans de nombreux troubles ou de lésions du système nerveux central, y compris la sclérose en plaques, maladie d’Alzheimer, de Parkinson et traumatique Brain injury1,2. Malgré les impacts physiologiques importantes de varicosités axonales sur la propagation du potentiel d’action et de la transmission synaptique3, comment naissent les varicosités reste inconnue. Récemment, à un dosage microbiomechanical nouvellement créé sur les neurones hippocampal cultivés contre les rongeurs, nous avons constaté que des stimuli mécaniques peuvent induire des varicosités dans ces neurones avec intriguant très caractéristiques. Tout d’abord, l’induction de la varicosité est rapide (< 10 s) et ce processus est réversible de façon inattendue. Deuxièmement, initiation varicosité dépend de la puissance soufflant la pression : plus la pression, plus vite l’initiation. En troisième lieu, initiation varicosité dépend de l’âge neuronale. Les axones des neurones plus jeunes semblent plus sensibles aux contraintes mécaniques, comparées à celles des neurones plus âgés. Quatrièmement, la forme de varicosités le long des axones des neurones de l’hippocampe, tandis que les dendrites et les segments de l’axone initiale de ces neurones n’afficher aucun changement dans les mêmes conditions de bouffées. Ainsi, notre étude a révélé une nouveauté de la polarité neuronale. Ces résultats avec le système in vitro sont physiologiquement pertinents. À l’aide d’un modèle in vivo pour léger traumatisme crânien léger (TCL), nous a montré que les varicosités axonales élaboré d’une manière multi-focale dans le cortex somatosensoriel des souris immédiatement après le choc de clôture-crâne, conforme à notre in vitro résultats4. Il est important de noter que notre coloration et d’imagerie des souris TCCL fournissent seulement un instantané des changements morphologiques neuronales, depuis l’exécution en vivo imagerie Time-lapse de la morphologie neuronale lors d’un impact mécanique n’est toujours pas réalisable.
Ce système fluide-bouffant nous a permis non seulement de capturer les particularités associées à la formation mécanique varicosité induite par le stress, mais aussi de déterminer le mécanisme sous-jacent. En testant différentes solutions extracellulaires, les bloqueurs et les ouvreurs de différents candidats des canaux ioniques mécanosensibles et de l’électrophysiologie cellulaire, nous avons identifié que le cation potentiel récepteur transitoire canal membre du subfamily V 4 (TRPV4) canal est perméable aux Ca2 + et Na+ et activables par bouffées est principalement responsable de la détection des contraintes mécaniques initiales au cours de la varicosité axonale formation4. Ceci a été confirmé plus loin avec une approche d’élimination directe de siARN. Pris ensemble, ce nouveau système de test, que nous avons mis au point avec la culture de neurones hippocampiques, est très précieux pour l’étude des propriétés de micromécanique des neurones centraux, en particulier en combinaison avec d’autres techniques.
Ce système de micromécanique, que nous avons mis en place est unique et diffère des systèmes déjà existants sous plusieurs aspects importants. Tout d’abord, dans ce système, les neurones expérience hors-plan des contraintes mécaniques dans les formes de compression et de cisaillement. Lors de l’impact mécanique, processus neuronaux restent attachées à la surface de la lamelle couvre-objet et ne bougent pas. Cela diffère des autres systèmes qui occupe principalement la flexion et l’extension dans le plan expérimental (ou tension), par exemple, la déviation des axones groupés comme se déplaçant chaînes5,6 ou l’étirement des axones cultivés sur micromotifs canaux et membranes extensible7,8. En outre, même si les varicosités axonales peuvent également être induites dans ces épreuves comme dans notre système fluide-bouffant, le processus dans ces milieux prend beaucoup plus de temps (à partir de 10 min à plusieurs heures6,7,8) et apparaît irréversibles. Enfin, notre système à l’aide locale fluide soufflant permet l’examen des caractéristiques spatiales de formation varicosité (e.g., dendrites, des épines dendritiques, soma, axonales segments initiaux bornes axonales), outre ses caractéristiques temporelles. Grâce à ce système, nous avons découvert plusieurs fonctionnalités inattendues et uniques de formation de varicosité axonale, surtout un début rapide, lente réversibilité et polarité axon-dendrite.
Le système que nous discutons dans cet article est compatible avec nombreuses techniques de moléculaire et biologie cellulaire. Par exemple, pour étudier les effets du stress mécanique sur la morphologie neuronale et la fonction, il peut être utilisé avec la co-culture de myelin, Time-lapse d’imagerie de fluorescence (FRBR), de la réflexion totale interne et de transfert d’énergie de fluorescence de résonance (FRET) imagerie calcique et enregistrement de patch clamp. Dans cet article, nous nous concentrons sur les composants principaux du système. Culture de neurones hippocampiques, le fluide-bouffées d’installation, une imagerie Time-lapse pour le transport axonal et imagerie calcique sont illustrées étape par étape ci-dessous.
Toutes les méthodes décrites ci-dessous ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université d’Etat de l’Ohio.
1. préparation de la lamelle couvre-objet
2. dissection, Dissociation et la Culture des neurones de l’hippocampe de souris/Rat enceinte
3. paramétrage de l’appareil de Pipette bouffées
Remarque : Il y a cinq éléments de base pour ce set-up : la pipette en verre, la tuyauterie, la seringue, le micromanipulateur et la mémoire tampon (Hank). N’importe quel tampon ayant des concentrations de sels physiologiquement pertinentes pourrait être utilisée dans cette configuration.
4. étalonnage de la pression de la Pipette, utilisant un système de membrane extensible
5. soufflant pour induire des varicosités
6. méthodes des compliments
Remarque : Le test de bouffées peut être combiné avec une variété de techniques différentes qui sont discutées dans la section Introduction. Ici, l’accent est sur les techniques de base qui sont plus fréquemment utilisés ainsi que le dosage de bouffées, y compris la fluorescence haute résolution timelapse imagerie, imagerie calcique et des tests de récupération. Elles sont examinées ci-dessous.
Avant de souffler, les axones présentent normalement peu formation varicosité. Suivant soufflant avec notre pression standard (hauteur de2O 190 mmH), le début des axones à développer de nombreuses perles comme varicosités. La formation de varicosités est partiellement réversible, comme illustré par les régions de l’axone, retournant à leur état préalablement gonflé après une période de récupération de 10 min (Figure 2A-B). Après une longue période de récupération (> 20 min), certains axones récupérer complètement. Positionnement suboptimal des bouffées de pipette et le positionnement précis de la seringue à 190 mm au-dessus de la scène ne peut pas générer des varicosités rapidement. Conditions optimales devraient aboutir à la formation de la varicosité dans les axones des neurones jeunes (environ 7 DIV) dans environ 5 s4.
Figure 1 : Schéma et photo de bouffées appareil. (A) photographies montrant la configuration globale de microscope. (B) appareil montrant la pipette en verre tenue par le micromanipulateur et connecté au tuyau en caoutchouc. (C) Phase de contraste des images en mettant l’accent en avion des neurones de l’hippocampe primaires montrant l’ombre de pipette en bas droite. (D) hors de la cellule plan axé sur les bouffées de pipette. (E) schéma des distances et des pressions calculées pour induire des varicosités. Echelle = 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Des images représentatives de formation varicosité suite soufflant. (A) imagerie de 7DIV, neurones hippocampal de GFP transfectée souris montrant un axone pré et post-souffler ainsi qu’après une période de récupération de 10 min. (B) kymographes d’imagerie Time-lapse du neurone en (A). Flèches rouges indiquent les varicosités qui se sont formées suite 150 s de 190 mmH2O bouffées (commençant à 30 s). Echelle = 15 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Lamelle couvre-objet solution d’enrobage | |
780 ΜL | Stock de mM acid17 acétique : 50 µL d’acide acétique dans 50 mL d’H2O |
200 ΜL | Poly-D-lysine (0,5 mg/mL de bouillon) |
20 ΜL | Collagène de queue de rat (3 mg/mL de bouillon) |
Le volume total est déterminé en fonction du nombre de lamelles à revêtir. |
Tableau 1 : solution de revêtement lamelle. Donne la recette pour la préparation de la solution de revêtement de lamelle couvre-objet utilisée pour faire adhérer les cellules cultivées à des lamelles couvre-objet.
1 solution x tranche dissection (SLD), filtrée, pH = 7,4, conserver à 4 ° C | |
1 L | ddH2O |
82 mM | Na2SO4 |
30 mM | K2SO4 |
10 mM | HEPES (acide libre) |
10 mM | D-glucose |
5 mM | MgCl2 |
0,00 % | Rouge de phénol (facultatif) |
Médias de placage (PM, filtrer, conserver à 4 ° C) | |
439 mL | Sels de MEM Earle |
50 mL | FBS |
11,25 mL | 20 % D-glucose |
5 mL | Pyruvate de sodium (100 mM), |
62,5 ΜL | L-glutamine (200 mM) |
5 mL | La pénicilline/streptomycine (P/S, 100 x) |
Médias de maintenance (MM, filtre, conserver à 4 ° C) | |
484 mL | Neurobasal |
10 mL | Supplément de 50 x B27 |
1,25 mL | L-glutamine (200 mM) |
5 mL | 100 x P/S |
Toutes les solutions sont stérilisées à l’aide d’un filtre avec la taille des pores 0,2 mm. |
Tableau 2 : recettes de milieux de culture de cellules. Fournit les recettes pour la préparation du support utilisé dans la mise en culture de cellules primaires de neurones hippocampiques.
Tampon de Hank (filtre, pH = 7,4, conserver à 4° C | |
150 mM | NaCl |
4 mM | KCl |
1. 2 mM | MgCl2 |
1 mM | CaCl2 |
10 mg/mL | D-glucose |
20 mM | HEPES |
Tableau 3 : recette de tampon de Hank. Donne la recette pour la préparation de la mémoire tampon utilisée dans le protocole haletant et en imagerie de cellules vivantes.
Pipetter tirant des paramètres | |||||
Chaleur | Tirez | Vitesse | Delay | Pression | Rampe |
501 | 0 | 15 | 1 | 500 | 530 |
Tableau 4 : Pipetter tirant paramètres. Fournit les paramètres à définir sur l’extracteur de pipette afin d’obtenir une ouverture qui est autour de 45 µm de diamètre.
La procédure de ce test de microbiomechanical est simple. Il va produire des résultats fiables, si toutes ses étapes sont réalisées avec soin. Il y a plusieurs étapes clés qui, si mal exécutée, vont entraver la collecte de données réussie. Les étapes critiques commencent en amont de la demande réelle du stimulus bouffée. Dissection minutieuse, culture et soins de la culture de neurones primaires sont primordiaux. Si les neurones en culture ne sont pas en bonne santé, ils ne réagiront pas systématiquement, car ils pourraient avoir déjà été amorcées pour le stress. En aval de la culture, l’installation initiale et l’étalonnage de l’appareil bouffées de fournir une pression constante, ce qui induira des varicosités mais ne causera pas de détachement des cellules de la surface de la lamelle couvre-objet, doit être exécutée avec patience. Un étalonnage précis de l’installation peut prendre 1 h en raison de colmatage de la pipette, une tubulure ou problèmes de vanne. Il est essentiel de veiller à ce que le liquide s’écoule la pipette avec une résistance minimale avant d’aller de l’avant avec la mise en place des cellules dans le plat et positionnement de l’embout de la pipette. Autant que les modifications apportées à la mise en place sont concernées, on peut appairer l’engin bouffées avec perfusion, serrage patch et tout autre axée sur le microscope instrument, pour la plupart dépendent de l’espace physique libre sur les côtés du microscope.
Ce système a deux limites intrinsèques qui ont besoin d’attention. La mise en place peut déclencher systématiquement la formation de varicosités réversibles dans les axones des neurones de l’hippocampe cultivés à travers bouffée fluide aux cellules. Cependant, il est important de noter que les valeurs de pression exacte sur les neurones dans le même champ bouffée ne sont pas identiques. La pression du fluide ayant un effet sur les cellules, calculé sur mesure la pression de la charge d’un microfabriques silicone membrane4,10représente la pression moyenne dans le centre du champ bouffée. Ainsi, la pression exacte bouffée est le plus élevé dans le centre du champ bouffée et le plus bas sur le pourtour du champ. Nous avons montré que les corrélats de la force de pression avec l’apparition, la taille et le nombre de varicosités induit4. Une pression plus élevée a entraîné une installation plus rapide, plus grande et plus abondante varicosités4. Dans nos études récentes, nous avons utilisé une pression minimale (190 mmHg à la pointe de pipette bouffée) qui peut induire encore fiable de varicosités dans la plupart des axones4. Dans ces conditions, apparition de varicosité pour jeunes neurones est normalement d’environ 5 s. Il est important de noter qu’avec exactement le même bouffées de système, la valeur de l’époque d’apparition peut varier, qui non seulement dépend du type de neurones, âge et compartiment subcellulaire, mais peut aussi être influencé par la position du neurone dans le domaine de bouffées. Malgré la variation de pression bouffée reçue par les neurones, ce système de dosage encore offre un moyen fiable pour l’étude des effets mécaniques sur les neurones centraux et donne des résultats expérimentaux très cohérentes et reproductibles.
La deuxième limitation du système est son problème de colmatage. Pour atteindre la pression physiologiquement pertinente, l’ouverture des pipettes est faible, autour de 45 μm. Toutefois, la petite ouverture a tendance à boucher avec des débris de la tubulure en plastique et les débris dans l’embout de la pipette est visible au microscope. Cela augmente la quantité de temps à préparer la mise en place, dans le cas d’une obstruction de la pipette. Par conséquent, toutes les solutions sont soigneusement filtrées avant d’être mis dans la seringue, tubulure et pipette. Il est également important de laver le système bouffée avec éthanol à 70 % au début et fin de la journée, suivie par un lavage avec un tampon de Hank filtrée. Pour résoudre le problème de colmatage éventuel, nous vous suggérons essayant de tirer les pipettes multiples. Il est essentiel de confirmer que la solution est effectivement soufflée hors de la pipette par visualisation avant de commencer les expériences. Dès qu’un bon système de bouffées est établi, il peut habituellement durer pour le reste de la journée.
Ce test biomécanique, combiné avec la culture de neurones, offre une occasion unique pour l’étude de neurone central mécanosensibilité imitant les conditions physiologiques ou physiopathologiques. Ce système nous permet d’examiner les effets de compression et de cisaillement sur les neurones. En revanche, autres systèmes ont été utilisés pour examiner dans le plan étirement5,6,7. La pression moyenne reçue par les neurones dans le Centre des zones bouffées est 0,25 ± 0,06 nN/µm2 dans notre système4. Cette pression exercée sur les cellules est comparable à l’élasticité des neurones de l’hippocampe, telle que mesurée précédemment utilisant balayage force microscopie et vrac rhéologie, afin d’identifier optiquement induite par déformation13,14, ainsi que les pressions utilisées pour modifier la croissance des neurites bords d’attaque in vitro, mesurée par analyse forcent microscopie (0,27 ± 0,04 nN/µm2)16. Cette pression ne dépasse pas la pression qui peut être générée naturellement par les cellules mésenchymateuses dans un embryon de E11, mesurée à l’aide d’huile de taille cellule fluorescente mécaniquement spécifiques gouttelettes (1,6 ± 0,8 nN/µm)2,14.
Ce système a déjà été utilisé avec succès en combinaison avec l’imagerie calcique, patch de serrage, microscope électronique et analyse cellulaire d’un crâne fermé TCCL souris modèle4. Le dosage aussi peut être utilisé en combinaison avec des expériences axées sur le microscope, telles que la récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP), pour examiner la protéine roulement au sein de varicosités, mais aussi de vous inquiétez pour étudier les cas de modification des interactions protéine-protéine au cours de la formation de la varicosité. Essentiellement, toute méthode qui peut être fait à l’aide d’un microscope et une mise en place de l’imagerie de cellules vivantes peut être couplé avec ce dosage bouffée. La polyvalence de ce test est extrêmement utile pour étudier les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les divers effets sur la morphologie neuronale et fonctions par le stress de la micromécanique.
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Toutes les expériences sur des animaux ont été menées selon le National Institutes of Health Animal usage Guidelines. Ce travail a été soutenu en partie par des subventions du National Institutes of Health (R01NS093073 et R21AA024873) de C. Gu.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
12 mm coverslips | Warner Instruments | 64-0702 | for 24-well plate |
25 mm coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | for 6-well plate |
Acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
Rat tail collagen | Roche | 11 179 179 001 | |
10X PBS | National Diagnostics | CL-253 | |
Na2SO4 | Fisher Scientific | S373-500 | |
K2SO4 | Fisher Scientific | P304-500 | |
HEPES | Fisher Scientific | BP410-500 | |
D-glucose | Fisher Scientific | D16-500 | |
MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
NaOH | Fisher Scientific | SS255-1 | |
Protease enzyme | Sigma | P4032 | |
FBS | Gibco | 26140 | |
Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
L-glutamine | Gibco | 25030081 | |
Penicillin/Streptomycin 100x (P/S) | Gibco | 15140122 | |
MEM Earle's Salts | Gibco | 11090 | |
B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
Arabinosylcytosine (Ara-C) | Sigma | 147-94-4 | |
Opti-MEM media | Gibco | 31985-070 | |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1854313 | transfection reagent |
Borosilicate rods | World Precision Instruments Inc. | PG52151-4 | for puffing pipette |
rubber tubing | Fisher Scientific | 14-169-1A | |
10cc plastic syringe and plunger | Becton Dickinson | ||
micromanipulator | Sutter Instruments | ||
NaCl | Fisher Scientific | S640-3 | |
KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
CaCl2 | Fisher Scientific | C70-500 | |
Cell culture dish (35 mm x 10 mm) | Corning | 3294 | |
Fluo-4 AM | Molecular Probes | F14201 | for calcium imaging |
Mito-YFP construct | Takara Bio Inc. | for cell transfection | |
YFP-N1 construct | Takara Bio Inc. | for cell transfection | |
Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette puller | Sutter Instruments | ||
Eclipse TE2000-U Mcroscope | Nikon | ||
Plan Fluor ELWD 20x lens | Nikon | 062933 | objective |
Apo TIRF 100x/1.49 oil lens | Nikon | MRD01991 | objective |
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