Adattamento del semiautomatico circolanti (CTC) Saggi Tumor Cell per applicazioni cliniche e di ricerca preclinica

Cellule tumorali circolanti (CTC) sono prognostico in diversi tumori metastatici. Questo manoscritto descrive il sistema Gold Standard CellSearch (CSS) CTC piattaforma di censimento e mette in evidenza errori di classificazione comuni. Inoltre, due protocolli adattati sono descritti per l'utente definito caratterizzazione marcatore delle CTC e CTC censimento in modelli murini preclinici di metastasi che utilizzano questa tecnologia.

La maggioranza dei decessi per cancro si verifica in seguito allo sviluppo della malattia metastatica. Questa fase malattia altamente letale è associata con la presenza di cellule tumorali circolanti (CTC). Queste cellule rare hanno dimostrato di essere clinicamente significativa in seno metastatico, della prostata e del colon-retto. Il gold standard attuale in clinica rilevazione CTC ed enumerazione è il sistema CellSearch approvato dalla FDA (CSS). Questo manoscritto descrive il protocollo standard utilizzato da questa piattaforma nonché due protocolli adattati aggiuntive che descrivono il processo dettagliato di ottimizzazione marcatore definito dall'utente per la caratterizzazione di proteine ​​CTC paziente e un protocollo paragonabile per la cattura CTC molto bassi volumi di sangue, utilizzando lo standard reagenti CSS, per lo studio in vivo modelli preclinici murini di metastasi. Inoltre, differenze di qualità tra CTC sangue donatore sano addizionati con cellule di coltura tissutale rispetto paziente samp sangueles sono evidenziati. Infine, diversi oggetti comunemente discrepanti che possono portare ad errori di classificazione CTC sono delineati. Presi insieme, questi protocolli forniranno una risorsa utile per gli utenti di questa piattaforma interessati alla ricerca preclinica e clinica di pertinenza di metastasi e CTC.

Nel 2013 si stima che 580.350 persone muoiono di cancro e che i 1.660.290 nuovi casi di questa malattia viene diagnosticata in solo ¹ negli Stati Uniti. La maggior parte di questi decessi si verifica in seguito allo sviluppo della malattia metastatica ^2. L'attuale mancanza di terapie efficaci nel trattamento di metastasi e di una comprensione limitata della cascata metastatica rende questo stadio della malattia altamente letale. La presenza di cellule tumorali circolanti (CTC) nel sangue sono stati dimostrati correlati con malattia metastatica ^3. Queste cellule sono estremamente rari e la loro individuazione è indicativa di sopravvivenza globale in seno metastatico ^{4, 5} prostata e del colon-retto ⁶ cancro. In questi pazienti, la presenza di ≥ 5 (seno e prostata) o ≥ 3 (colon-retto) CTC in 7,5 ml di sangue è indice di prognosi peggiore rispetto ai pazienti con meno o nessun CTC rilevabili nelle samil volume e il sangue. Inoltre, la variazione del numero CTC durante o dopo l'intervento terapeutico è stato dimostrato per essere utile come predittore di risposta al trattamento, spesso prima di tecniche attualmente utilizzate ^7-10.

È stato stimato che, in pazienti tumorali metastatiche, CTC verificano ad una frequenza di circa 1 a 10 CTC ⁵ -10 ⁷ cellule mononucleate del sangue e in pazienti con malattia localizzata, questa frequenza può essere anche inferiore (~ 1 in 10 ^8). La natura rara di queste cellule può rendere difficile accurato e affidabile rilevare e analizzare CTC ^11. Diversi metodi (recensito in precedenza ^12-14) sono state utilizzate per arricchire e rilevare queste cellule sfruttando le proprietà che li differenziano dai circostante componenti del sangue. In generale, CTC enumerazione è un processo a due fasi che richiede sia una fase di arricchimento e una fase di rivelazione. Tradizionalmente, passaggi di arricchimento si basano su differenze di educazione fisicaProprietà iCal di CTC (dimensioni delle cellule, la densità, deformabilità) o sull'espressione proteina marker (cioè di adesione delle cellule epiteliali molecola [EpCAM], citocheratina [CK]). Seguendo arricchimento, rilevazione CTC può essere eseguita in vari modi diversi, il più comune dei quali sono saggi a base di acido nucleico e / o approcci citometria. Ognuna di queste strategie sono uniche, avendo vantaggi e svantaggi, ma tutti mancano normalizzazione; una necessità per l'ingresso in ambito clinico. Il sistema CellSearch (CSS) è stato quindi sviluppato per fornire un metodo standardizzato per il rilevamento e l'enumerazione di rari CTC nel sangue umano usando la microscopia a fluorescenza e le tecniche di base di anticorpi ^4-6. Questa piattaforma è attualmente considerato il gold standard nella CTC enumerazione ed è l'unica tecnica approvato dalla US Food and Drug Administration (FDA) per l'uso in clinica ^15.

Il CSS è una piattaforma a due COMPOSTE componentig, (1) il sistema CellTracks AutoPrep (di seguito denominato come strumento di preparazione), che automatizza la preparazione dei campioni di sangue umano, e (2) la CellTracks Analyzer II (di seguito indicato come strumento di analisi), che analizza questi campioni dopo la preparazione. Per distinguere CTC di contaminare leucociti strumento di preparazione impiega un anticorpo mediata, approccio separazione magnetica a base di ferrofluido-differenziale e la colorazione in fluorescenza. Inizialmente, il sistema etichette CTC utilizzando anticorpi anti-EpCAM coniugati a nanoparticelle di ferro. Il campione viene quindi incubato in un campo magnetico, e tutte le cellule non marcate vengono aspirati. Cellule tumorali selezionate vengono risospese e incubate in una macchia fluorescenza differenziale, costituito anticorpi di fluorescenza marcata e un reagente colorazione nucleare. Infine, il campione viene trasferito in una cartuccia magnetica, chiamato MagNest (di seguito denominato il dispositivo magnetico), e scanned usando lo strumento di analisi.

Lo strumento di analisi è utilizzato per la scansione di campioni preparati usando diversi filtri di fluorescenza, ciascuno ottimizzato alla particella fluorescente appropriato, utilizzando una lente obiettivo 10X. CTC sono identificati come cellule che sono vincolati da anti-EpCAM, anti-pan-CK-ficoeritrina (PE) (CK8, 18, e 19), e la macchia nucleare 4 ',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI). Al contrario, leucociti contaminanti vengono identificati come cellule che sono vincolati da anti-CD45-allophycocyanin (APC) e DAPI. Seguendo la scansione, potenziali cellule tumorali informatici definiti vengono presentati all'utente. Da queste immagini, l'utente deve impiegare analisi qualitativa utilizzando i parametri definiti e colorazione differenziale discussi sopra per determinare quali eventi sono CTC.

Oltre a fornire un metodo standardizzato per CTC enumerazione, il CSS permette per la caratterizzazione molecolare delle CTC sulla base di marcatori proteici di interesse. Questo interrogatorio cun essere effettuata a livello di singola cellula, utilizzando un isotiocianato di fluoresceina (FITC) canale di fluorescenza non richiesto per l'identificazione CTC ^16. Sebbene questa piattaforma fornisce la capacità di caratterizzazione molecolare, il processo dettagliato di protocollo di sviluppo e ottimizzazione non è ben definito. Tre marcatori disponibili in commercio sono stati sviluppati dal costruttore per l'utilizzo con il CSS, compreso il fattore di crescita epidermico (EGFR), fattore di crescita epidermico umano del recettore 2 (HER2), e insulin-like growth factor 1 recettore (IGF-1R). Analisi HER2, in combinazione con il CSS, è stato utilizzato da diversi gruppi per illustrare il potenziale per la caratterizzazione CTC informare decisionale clinico e cambiare potenzialmente linee guida di trattamento esistenti. Ad esempio, Fehm et al. ¹⁷ dimostrato che circa un terzo dei pazienti con carcinoma mammario con tumori HER2-primario aveva HER2 ⁺ CTC. Inoltre, Liu et al.18 recentemente riportato che fino al 50% dei pazienti con HER ⁺ carcinoma mammario metastatico non ha avuto HER2 ⁺ CTC. Herceptin, un recettore HER2 interferire anticorpo monoclonale dimostrato di trarre enormi benefici pazienti i cui tumori esprimono sufficienti livelli di HER2, è un trattamento comunemente utilizzati per i pazienti con HER2 ⁺ tumori primari ^19-21. Tuttavia, questi studi suggeriscono che Herceptin può essere essendo sub-ottimale utilizzati e che la caratterizzazione CTC può essere di aiuto nel predire la risposta al trattamento. In ultima analisi, caratterizzazione CTC può avere il potenziale per migliorare la cura personalizzata.

La ricerca CTC è unico in quanto ha in gran parte utilizzato un approccio capezzale a banco. Questo metodo, a differenza di banco-to-capezzale di ricerca, che spesso può richiedere anni per urtare la cura del paziente, ha permesso CTC rapida entrata in ambito clinico. Tuttavia, i medici sono riluttanti a utilizzare i risultati dell'analisi CTC nel trattamento dei pazienti dei processi decisionalizione a causa di una mancanza di comprensione della loro biologia sottostante. Pertanto appropriati modelli preclinici murini di tecniche di metastasi e complementari analisi CTC devono essere utilizzati al fine di indagare su queste questioni in sospeso. In generale, esistono due tipi di modelli preclinici utilizzati per studiare la cascata metastatica, (1) modelli metastasi spontanea, che permettono lo studio di tutti i passaggi della cascata metastatica, e (2) modelli metastasi sperimentali, che consentono soltanto lo studio delle successive fasi del processo metastatico come stravaso e formazione del tumore secondario ^22. Modelli metastasi spontanee, coinvolgono iniezioni di cellule tumorali in opportune sedi ortotopico (ad esempio iniezione di cellule tumorali della prostata nella prostata per lo studio del cancro alla prostata). Le cellule sono poi dato tempo per formare tumori primari e spontaneamente metastatizzare siti secondari come l'osso, polmone e linfonodi. Incontrasto, modelli metastasi sperimentali implicano l'iniezione diretta di cellule tumorali nel sangue (ad esempio via vena caudale o iniezione intracardiaca per indirizzare le cellule a posizioni specifiche) e quindi saltare le fasi iniziali di intravasation e diffusione di organi secondari ^22. Finora la maggior parte delle analisi CTC in in vivo sistemi modello è stato eseguito utilizzando sia basato ^{citometria-23} o adattate tecniche CTC basato umane (ad es AdnaTest) ^24. Anche se utile, nessuna di queste tecniche riflette adeguatamente CTC censimento utilizzando il CSS gold standard. Sulla base del riconoscimento clinico, natura standardizzata, e l'utilizzo diffuso di CSS, lo sviluppo di una cattura e rilevazione tecnica CTC in vivo modellazione che utilizza preparazione del campione equivalente, elaborazione e criteri di identificazione sarebbe vantaggiosa risultati sarebbero paragonabili a quelli ottenuti da campioni di pazienti. Tuttavia, a causa del volume di requirements dello strumento preparazione non è possibile realizzare piccoli volumi di sangue usando questa piattaforma automatizzata. . Inoltre, il lavoro precedente di Eliane et al ²⁵ ha dimostrato che la contaminazione dei campioni con le cellule epiteliali del mouse (che soddisfano anche la definizione standard CTC [EpCAM ⁺ CK ⁺ DAPI ⁺ CD45 ^-]) può portare ad errori di classificazione delle cellule epiteliali squamose del mouse come CTC. Per affrontare questi problemi una tecnica adattata che permette l'utilizzo del kit reagenti CSS CTC unita ad una procedura di isolamento manuale è stato sviluppato. L'aggiunta di un FITC marcato antigene leucocitario umano (HLA) anticorpo per il saggio permette alle cellule tumorali umane di distinguerli da cellule epiteliali squamose mouse.

Questo manoscritto descrive lo standard, sviluppata commercialmente e il protocollo CSS ottimizzato per la lavorazione di campioni di sangue e le insidie ​​più comuni che si possono riscontrare, tra cui discrepanzeelementi t che possono portare ad errori di classificazione CTC. Inoltre, la personalizzazione del dosaggio CSS esaminare caratteristiche proteiche definite dall'utente CTC catturate e una tecnica analoga CSS adattato che permette l'arricchimento e rilevamento delle CTC da piccoli volumi di sangue in modelli preclinici murini di metastasi sono descritti.

Tutti gli studi umani descritti in questo manoscritto sono state effettuate secondo protocolli approvati da Research umano Comitato Etico della Western University. Tutti sono stati condotti studi su animali in conformità con le raccomandazioni del Consiglio canadese per la cura degli animali, secondo protocolli approvati dalla Western University uso di animali sottocommissione.

1. Standard CTC Enumeration da paziente campioni di sangue Utilizzo del CSS

1. Sangue umano Raccolta dei campioni e preparazione per la trasformazione in strumento di preparazione

1. Utilizzando tecniche salasso standard di asepsi, disegnare un minimo di 8,0 ml di sangue umano in una provetta CellSave 10 ml (di seguito denominato il tubo conservanti CTC), che contiene etilene acido diaminetetraacetic (EDTA) e un conservante cellulare proprietaria. Invertire le 5x tubo per impedire la coagulazione del sangue. I campioni possono essere trattati immediatamente o conservate a temperatura ambiente per un massimo di 96 ore.
2. Removreagenti e CSS dal frigo e lasciare che raggiungano la temperatura ambiente prima dell'uso.
3. Usando una pipetta monouso 10 ml e pipetta automatizzata, raccogliere 7,5 ml di sangue dal tubo conservante CTC e lentamente dispensare il sangue in un tubo preparazione trasformazione strumento adeguatamente etichettati.
4. Aggiungere 6,5 ml di tampone di diluizione per ogni campione. Miscelare capovolgendo campione 5x. Campione centrifugare a 800 xg per 10 min con il freno in posizione "off". Seguire le istruzioni sullo schermo sullo strumento di preparazione per caricare tutti i campioni dei pazienti nel sistema per l'elaborazione. I campioni devono essere trattati entro 1 ora di preparazione.

2. Preparazione di controllo per la trasformazione in strumento di preparazione

1. Vortice delicatamente il flacone di controllo e capovolgere 5x per mescolare.
2. Rimuovere con cautela il tappo dal flacone di controllo e inserire una preparazione tubo di elaborazione dello strumento capovolta sulla parte superiore del flaconcino scoperchiato. In un movimento rapido, invertire lacontrollare la fiala e versare il contenuto nel tubo di elaborazione. Mentre rovesciata, sfiora delicatamente i lati del flacone di controllo per rilasciare eventuali contenuti residui.
3. Rimuovere con attenzione il flacone di controllo invertita dal tubo di elaborazione, assicurando che nessun liquido si perde e mettere da parte. Usando una pipetta di 1.000 ml, raccogliere tutti i restanti contenuti della fiala e coperchio e pipettare delicatamente nel tubo di elaborazione.
4. Seguire le istruzioni sullo schermo sullo strumento di preparazione per caricare il controllo sul sistema per l'elaborazione.

3. Scansione del campione sullo strumento di analisi

1. Seguire le istruzioni sullo schermo sullo strumento di preparazione per scaricare tutti i campioni dal sistema. Cap Liberamente ogni cartuccia dispositivo magnetico e toccare il dispositivo magnetico con le mani o banco di laboratorio per liberare eventuali bolle che sono bloccati ai bordi della cartuccia. Una volta che tutte le bolle sono state rimosse, tappare bene la cartuccia, stesi il dispositivo magnetico piatto, e honcubate al buio per almeno 20 minuti a temperatura ambiente. I campioni devono essere analizzati entro 24 ore di preparazione.
2. Accendere l'analizzatore e inizializzare la lampada. Una volta riscaldato (~ 15 min), caricare la cartuccia verifica del sistema sullo strumento di analisi e selezionare la scheda di test QC. Seguire le istruzioni sullo schermo per eseguire le necessarie misure di controllo di qualità.
3. Caricare un campione sullo strumento di analisi e selezionare la scheda test del paziente. Verrà visualizzato tutte le informazioni salvate dallo strumento di preparazione. Fare clic su Start per inizializzare la scansione del campione. Il sistema esegue un fuoco grossolana e rilevamento dei bordi sulla cartuccia dispositivo magnetico.
4. Regolare tutti i bordi se necessario utilizzando i tasti direzionali. Selezionare Accetta. Il sistema effettuerà un bel fuoco e avviare la scansione del campione.
5. Dopo il controllo la scansione dei risultati deve essere convalidato utilizzando i criteri definiti per le celle a spillo ad alta (CK ⁺ DAPI ⁺ CD45 ^- APC ⁺⁾ e bassa (CK ⁺ DAPI ⁺ CD45 ^- FITC ⁺⁾ concentrazioni. A seguito di campione del paziente scansione dei risultati dovrebbe essere riesaminata per CTC catturati utilizzando i criteri definiti CTC (CK ⁺ DAPI ⁺ CD45 ^-).

2. CTC Caratterizzazione di marcatori definiti dall'utente utilizzando il CSS

1. Preparazione di marcatori definiti dall'utente e strumento inizializzazione

1. Diluire l'anticorpo di interesse utilizzando legame primario diluente alla concentrazione desiderata in una tazza reagente marcatore utilizzando la seguente formula, in cui la concentrazione di lavoro è la concentrazione dell'anticorpo dopo l'aggiunta al campione e la concentrazione di calcio è la concentrazione di anticorpo nel Coppa del reagente. Per i più campioni, regolare i volumi di anticorpi, come descritto nella tabella 1. Posizionare la tazza reagente marcatore nella posizione 1 nella cartuccia reagenti e load la cartuccia su CSS.
   Archivio Concentrazione = (concentrazione di lavoro x 850 microlitri) / 150 ml
   
2. Raccogliere il sangue, preparare i campioni, e caricare lo strumento di preparazione come descritto nel precedente standard CTC Enumeration da paziente campioni di sangue usando il protocollo CSS. Per attivare marcatore Inoltre personalizzato, selezionare Definito dall'utente Assay quando richiesto dallo strumento di preparazione. Immettere il nome del marcatore e selezionare Salva. Come i campioni vengono caricati sullo strumento, l'operatore verrà richiesto di indicare quale dovrebbe ricevere marcatore personalizzato selezionando Sì o No, se necessario.

2. Esempio di scansione di marcatori definiti dall'utente sullo strumento di analisi

1. Accendere lo strumento di analisi, inizializzare la lampada, ed eseguire il controllo di qualità e verifica del sistema, come descritto nella Sezione 3.2 del CTC Enumeration standard da paziente campioni di sangue usando il CSS protocollo.
2. Caricare un campione sullo strumento di analisi e selezionare la scheda Impostazione. Per inizializzare il canale FITC, selezionare CellSearch CTC come ID Kit nella sezione Test di protocolli. Da questo menu, selezionare CTC ricerca, fare clic sul pulsante Modifica e impostare il tempo di esposizione, se lo desideri. Si raccomanda un tempo di esposizione di 1.0 sec non superare quando si utilizza il kit CSS CTC come questo può aumentare sanguinare-through in altri canali fluorescenti utilizzati per l'identificazione CTC.

3. Adattamento del CSSProtocol standard per l'uso in modelli preclinici mouse

** Adattato da Veridex Mouse / Rat CellCapture Kit (non più disponibile in commercio)

1. Raccolta di sangue Mouse e bagagli

1. Prima della raccolta del sangue, corrono ~ 30 ml di 0,5 M EDTA avanti e indietro attraverso un ago G 22, lasciando una piccola quantità di EDTA nel mozzo.
2. Raccogliere un minimo di 50 ml di sangue del mouse da topi precedentemente iniettate cellule tumorali umane attraverso vie ortotopici, coda vena, o intracardiaci. Raccogliere il sangue dalla vena safena (per l'analisi seriale CTC) o mediante puntura cardiaca (per terminale analisi CTC). Rimuovere l'ago e distribuire il sangue in una provetta con EDTA Microtainer raccolta del sangue 1 ml. Miscelare per inversione o il tubo dolcemente flick per prevenire la coagulazione del sangue. Il sangue può essere elaborato immediatamente o conservato a temperatura ambiente fino a 48 ore dopo l'aggiunta di un volume uguale di CytoChex conservante cellulare.

2. CTC arricchimento

1. Rimuovere i reagenti CSS dal frigorifero e lasciare che raggiungano la temperatura ambiente prima dell'uso.
2. Trasferire l'equivalente di 50 ml di sangue intero per un flusso x 75 mm 12 millimetri citometria tubo. Aggiungere 500 microlitri di tampone di diluizione per ogni campione, lavando giù qualsiasi sangue che rimane sui lati del tubo. Se necessario, una breve centrifuga centrifugapuò essere utilizzato per raccogliere il sangue residuo.
3. Vortice delicatamente il ferrofluido anti-EpCAM e aggiungere 25 microlitri di ciascun campione posizionando la punta della pipetta direttamente nel campione. Aggiungere 25 ml di reagente Valorizzazione Capture e vortice delicatamente per mescolare. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 15 min.
4. Mettere provette nel magnete e incubare per 10 min. Mentre provette sono ancora nel magnete, utilizzare una pipetta di vetro per aspirare accuratamente il liquido residuo senza toccare la parete del tubo vicino al magnete e scartare.

3. CTC colorazione

1. Rimuovere le provette dal magnete e risospendere in 50 ml di acidi nucleici Dye, 50 ml di colorazione reagente, 1,5 ml di anti-topo CD45-APC, 5.0 ml di anti-umano HLA-Alexa Fluor 488, e 100 ml di Permeabilization reagente. Per campioni multipli, questi reagenti possono essere premiscelati e 206,5 ml di miscela possono essere aggiunti in ogni provetta. Vortex delicatamente per miscelaree incubare per 20 minuti a temperatura ambiente al buio.
2. Aggiungere 500 ml di tampone di diluizione, vortice delicatamente, provette posto nel magnete, e incubare per 10 min. Mentre provette sono ancora nel magnete, utilizzare una pipetta di vetro per aspirare accuratamente il liquido residuo senza toccare la parete del tubo vicino al magnete e scartare. Rimuovere le provette dal magnete e risospendere in 350 ml di tampone di diluizione. Vortex delicatamente per mescolare.

4. Magnetic Carica

1. Utilizzando una punta di caricamento del gel, trasferire accuratamente l'intero volume dal tubo campione in una cartuccia nel dispositivo magnetico. Inizia nella parte inferiore della cartuccia e ritirare lentamente la punta come il campione viene erogato.
2. Una volta che l'intero campione è stato trasferito, tappare bloccare la cartuccia dispositivo magnetico e toccare il dispositivo magnetico con le mani o banco di laboratorio per liberare eventuali bolle che sono bloccati ai bordi della cartuccia come descritto nella Section 3.1 del CTC Enumeration standard da paziente campioni di sangue usando il CSS.
3. Pop eventuali bolle utilizzando una sterile 22 ago G intrappolando tra lo smusso e il bordo della cartuccia. Una volta che tutte le bolle sono stati rimossi, ricoprire con fermezza la cartuccia, porre il dispositivo magnetico piatto, e incubare al buio per almeno 10 min. I campioni devono essere analizzati entro 24 ore di preparazione.

5. Scansione dei campioni separati manualmente sullo strumento di analisi

1. Accendere lo strumento di analisi, inizializzare la lampada, ed eseguire il controllo di qualità e verifica del sistema, come descritto nella Sezione 3.2 del CTC Enumeration standard da paziente campioni di sangue utilizzando il protocollo CSS.
2. Caricare il campione attraverso lo strumento di analisi e selezionare la scheda Impostazione. Cancellare tutti i dati esistenti sul tasto dati del dispositivo magnetico facendo clic sul pulsante Formato Sample. Attivare il canale di FITCnd impostare il tempo di esposizione di 1.0 sec come descritto nella Sezione 2.2 della CTC Caratterizzazione di marcatori definiti dall'utente utilizzando il CSS.
3. Fare clic sulla scheda Test Paziente e selezionare Modifica per inserire le informazioni sul campione. Selezionare CellSearch CTC come ID Kit e CTC ricerca come protocollo di test. Inserire il restante informazioni necessarie come indicato come l'asterisco. Salvare le informazioni campione e fare clic su Avvia.

Standard CTC Enumerazione Assay

La sensibilità e la specificità del CSS è stata ben documentata in letteratura. Tuttavia, per validare il recupero CTC equivalente a spillo (cellule tumorali della prostata umana 1.000 LNCaP) e campioni di sangue umano unspiked da donatori volontari sani sono stati elaborati sulla CSS utilizzando il protocollo CSSCTC standard. Come previsto, i campioni unspiked erano liberi di CTC, 0.00 ± 0.00%, e il recupero CTC è stata dimostrata essere 86,9 ± 4,71% per i campioni arricchiti (Figura 1A). Galleria immagini CSS ottenute da campioni drogati erano di ottima qualità e CTC sono facili da distinguere dai non-CTC. Tuttavia, quando si trattano i campioni ottenuti da pazienti affetti da cancro, l'identificazione delle CTC è leggermente più impegnativo, con molte cellule appaiono di dimensioni più piccole e di essere meno facilmente distinguibile dalla non-CTC (Figura 1B). Inoltre, al momento di rivedere i campioni dei pazienti 6 categorie di eventi sono stati identified che erano oggetti comunemente discrepanti fra utenti (Figura 1C). Questi 6 categorie incluse, (1) piccoli eventi che non soddisfano il requisito 4 dimensioni micron per la classificazione CTC; (2) oggetti con CK fioca e / o colorazione DAPI, (3) giustificata (dovrebbero essere conteggiati come CTC) rispetto ingiustificata (non dovrebbe essere considerato come un CTC) sanguinare attraverso nel canale CD45-APC causata dalla brillante colorazione CK-PE; (4) FITC + eventi; (5) le immagini pixelati del CK e / o canali DAPI e (6) Eventi con colorazione DAPI che è più grande rispetto alle immagini CK o quelli con colorazione DAPI che non si sovrappongano> 50% l'immagine con CK. Per le categorie (2) e (5) Esistono criteri specifici per la classificazione CTC. Per la categoria (2), oggetti con dim CK / DAPI possono essere classificati come CTC purché una membrana intatta può essere osservato nel canale CK e unimmagine di dimensioni adeguate DAPI è notato. Per la categoria (5), oggetti con CK pixel / DAPI non possono essere classificati come CTC se pixelation si osserva nel canale CK. Tuttavia, pixelation è accettabile nel canale DAPI a condizione che non sia troppo grave (cioè l'immagine è interamente bianca su uno sfondo, senza zone grigie - descritte da Janssen Diagnostics (ex Veridex) come vernice bianca su sfondo nero) o diffusi (deve ancora apparire di forma ovale e rientrare CK).

User-Defined Marker Assay Development

Adattamento del CSS per caratterizzare CTC per gli indicatori definiti dall'utente richiede un notevole lavoro-up con rigorosi controlli ed è stato descritto in precedenza ^16. Come regola generale, l'ottimizzazione appropriato di qualsiasi marcatore definito dall'utente che richiede controlli negativi essere impiegati per garantire che i risultati sono specifici. I migliori risultati si ottengono quando i campioni addizionati sono trattati sia conun controllo non specifico IgG nel posto dell'anticorpo bersaglio e con il diluente anticorpo da solo come descritto in precedenza. Diverse concentrazioni di anticorpi bersaglio e tempi di esposizione dovrebbero essere valutati e convalidati utilizzando linee cellulari con (negativi) alta densità, bassa, e di assenza di antigene. Condizioni di protocollo ottimali si ottengono quando il saggio dimostra sia elevata sensibilità per l'antigene bersaglio e basso rumore di fondo dal legame non specifico ^16.

Un esempio di questo work-up utilizzando un marcatore di cellule staminali del cancro, CD44, è presentato qui. I test iniziali con questo indicatore ha iniziato a utilizzare il kit CSS CTC standard (di seguito denominato il kit tradizionale CTC), che utilizza il canale FITC per lo sviluppo marcatore definito dall'utente. Utilizzando il kit tradizionale CTC, è stato dimostrato che, dopo l'ottimizzazione significativa, il numero massimo di CTC che potrebbero essere classificati come CD44 ⁺ era 69,3 ± 2,67% utilizzando campioni a spillo con 1.000 MDA-MB-468 human seno cellule tumorali, noti per dimostrare l'alta espressione CD44 con la maggioranza delle cellule (98,4 ± 0,90%; determinata mediante citometria a flusso) che esprimono questa proteina (Figura 2A). Sulla base di questi risultati è stato ipotizzato che il kit CSS CXC disponibile in commercio può produrre risultati migliori. Questo kit consente una migliore visualizzazione dei marcatori con una densità di antigeni inferiore (~ 50.000 antigeni / cella) rispetto al kit tradizionale CTC (ottimizzato per marcatori con una densità di circa 100.000 antigeni / cella) invertendo il canale di fluorescenza in cui il CK8 / 18/19 (tradizionalmente rappresentata nel canale PE) e il marcatore di interesse dell'utente (tradizionalmente rappresentata nel canale FITC) sono rappresentati (quindi seguito il kit CXC sarà denominato kit CTC bassa densità antigene) ^26. Dopo l'ottimizzazione significativa, è stato dimostrato che questo cambiamento ha permesso di migliorare la colorazione CD44, con 98,8 ± 0,51% delle CTC classificati come CD44 ^{+ <}/ Sup> con CD44-PE ad una concentrazione di 1,0 mg / ml e un tempo di esposizione di 0,6 sec (Figura 2A). Appropriata ottimizzazione di qualsiasi marcatore definito dall'utente richiede anche la validazione utilizzando alta densità antigene (MDA-MB-468), bassa densità antigene (21 NT), e (LNCaPs) linee cellulari negative per il marcatore di interesse (Figura 2B).

Analisi CTC in modelli preclinici mouse

Per determinare la sensibilità e la specificità del protocollo CSS topo adattato, spillo (1.000 LNCaP cellule di cancro della prostata umana) e campioni di sangue sono stati unspiked topi trattati manualmente e scansionate sullo strumento di analisi e confrontati con quelli ottenuti utilizzando la stessa linea cellulare elaborati usando lo standard protocollo CSS automatizzato sul (Figura 3A) strumento preparazione. Come previsto, i campioni unspiked erano liberi di CTC utilizzando entrambi i saggi, 0,00 ± 0,00% e il recupero CTC utilizzando il kit del mouse adattato (90,8 ± 5,18%) non è stato significantly diverso dai risultati ottenuti con il sistema automatizzato standard (86,9 ± 4,71%; p> 0.05). Immagini ottenute con il mouse protocollo adattato manuale non differiscono da quelli osservati con la tecnica automatizzata standard, con l'eccezione dell'aggiunta del marcatore HLA-FITC. Inoltre, le cellule epiteliali squamose del mouse non si colorano positivamente per HLA-FITC (Figura 3B). Per confermare che questa tecnica era sensibile come il protocollo CSS standard per l'isolamento di basso numero di CTC, diluizioni seriali sono stati eseguiti con campioni di sangue a spillo e la correlazione di numero atteso di cellule rispetto recuperato numero di cellule è stata valutata (Figura 3C). I risultati dimostrano che CTC potrebbe efficacemente essere recuperato fino ad una sensibilità di 5 cells/50 ml di sangue intero da questo test. Questi valori correlati con i risultati attesi con una R ² = 0,99.

Figura 1. CTC enumerazione e l'interpretazione utilizzando il protocollo CSS standard. (A) recupero CTC misurata come percentuale del numero di cellule spillo. Le cellule sono state contate da emocitometro e ~ 1.000 LNCaP cellule tumorali della prostata umana sono stati aggiunti in 7,5 ml di sangue umano. Unspiked campioni di sangue umano sono stati usati come controllo negativo (n = 3). I dati sono presentati come media ± SEM. (B) Rappresentante galleria immagini CSS delle differenze di CTC qualità osservata in campioni di sangue a spillo (cioè sangue donatore sano spillo con le cellule tumorali della cultura) contro i campioni raccolti da pazienti affetti da cancro. (C) Rappresentante galleria CSS immagini di oggetti comunemente discordanti che vengono spesso erroneamente classificati. Piazze arancioni indicano CTC accettabili, identificati come CK ⁺ / DAPI ⁺ / CD45^-. Le immagini acquisite a 10X di ingrandimento obiettivo. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 2. Caratterizzazione delle CTC per i marcatori definite dall'utente utilizzando il CSS. (A) Percentuale di cellule classificate come CD44 ⁺ utilizzando i kit CTC e CXC sul CSS (n = 3). I dati sono presentati come media ± SEM. *** = Significativamente differenti (p <0,0005). (B) rappresentativi immagini della galleria CSS di sangue da un donatore volontario sano (7,5 ml), addizionati con ~ 1.000 cellule dalla linea cellulare identificato, incubate con 1,5 ug / ml di anticorpi anti -CD44-PE, e scansionata ad un tempo di esposizione di 0.2 sec. Arancione quadrati indicano CD44 ^{+ <}/ Sup> CTC, identificato come CK ⁺ / DAPI ⁺ / CD45 ^- / CD44 ^-. PE ⁺ Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 3. Adeguamento della procedura CSS per l'uso in modelli preclinici murini di metastasi. (A) recupero CTC utilizzando il protocollo CSS topo adattato misurata come percentuale del numero di cellule spillo e rispetto ai risultati ottenuti con il protocollo CSS umano standard. Le cellule sono state contate da emocitometro e ~ 1.000 LNCaP cellule tumorali della prostata umana sono stati aggiunti in 7,5 ml di sangue umano. Unspiked campioni di sangue umano sono stati usati come controllo negativo (n = 3). I dati sono presentati come media ± SEM. ns = non significativo. (B) rappresentativi immagini della galleria CSS del CTC catturato il protocollo CSS del mouse adattato dimostrando che HLA-AF488 è in grado di distinguere umano da cellule di topo. (C) Analisi di correlazione e regressione lineare del previsto rispetto al numero recupero di cellule tumorali a spillo a varie concentrazioni . Cellule di cancro alla prostata umano sono stati inizialmente contati da emocitometro e successivamente addizionati in sangue topo ad una concentrazione di circa 1.000 tumore cells/50 microlitri di sangue. Sangue Spiked mouse è stato poi diluiti serialmente ad una concentrazione di 5 tumore microlitri cells/50 ed elaborati utilizzando il protocollo del mouse adattato CSS (n = 3). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Tabella 1. . Requisiti di volume totale per il CSS durante l'elaborazione di vari numeri di campioni con un pennarello definita dall'utente ** Tratto da White Paper Veridex (disponibile all'indirizzo: http://www.veridex.com/pdf/CXC_Application_Guideline.PDF ).

Nonostante lo sviluppo di molte nuove tecnologie CTC dopo l'introduzione del CSS nel 2004, questa tecnica è ancora l'unica tecnologia clinicamente approvato oggi sul mercato e, pertanto, è considerato il gold standard attuale per la rilevazione CTC e l'enumerazione. Questo manoscritto ha dimostrato che, sebbene il CSS ha standard rigoroso controllo di qualità può essere soggetto a bias di interpretazione e che l'identificazione CTC nei campioni dei pazienti è molto diverso da identificazione in campioni a spillo. Sei categorie di oggetti comunemente discordanti sono stati identificati che può causare errori di classificazione CTC a verificarsi. Questi elementi discrepanti evidenziano la necessità di molteplici utenti su ciascun campione clinico elaborati su questo strumento. Inoltre, le differenze osservate nei spillo contro paziente ottenuti CTC dimostra che vi è una necessità per tutte le nuove tecnologie CTC essere convalidati in entrambi i campioni a spillo e pazienti. Inoltre, queste nuove tecnologie devono be rispetto al gold standard CSS tramite test a campione separato di entrambi i campioni arricchiti e pazienti, il più efficiente cattura CTC da campioni drogati solo non riflette necessariamente CTC efficienza di cattura nei campioni dei pazienti.

Anche se il CSS ha la capacità di eseguire la caratterizzazione delle CTC catturati, è abbastanza limitato per quanto riguarda l'ottimizzazione altamente personalizzabile. In generale, gli unici parametri che possono essere modificati in questo strumento per l'ottimizzazione di marcatori definiti dall'utente sono la concentrazione dell'anticorpo e la lunghezza del tempo che il fluoroforo è esposta alla lampada di mercurio. Questa limitata capacità di ottimizzazione può presentare problemi quando marcatori definiti dall'utente lavorando-up sul CSS. Una soluzione proposta in questo manoscritto (descritto in dettaglio in precedenza ¹⁶⁾ è l'uso del kit CTC bassa densità di antigeni che commuta il FITC e canali fluorescenti PE da permettere una migliore visualizzazione dei marcatori con una bassa densità di antigeni. Senza riguardodi cui kit viene utilizzato (densità tradizionale o bassa antigene kit CTC), ci sono diversi passaggi necessari che devono essere intraprese per garantire un'adeguata sensibilità di servirlo, la specificità e l'ottimizzazione. In primo luogo, la sensibilità del test deve essere valutata in confronto a un metodo ben convalidato, come la citometria a flusso, che consente di determinare il livello di rilevamento atteso (cioè la percentuale di cellule nella popolazione di cellule che esprimono il marcatore di interesse) dell'utente- indicatore definito. In secondo luogo, il dosaggio deve essere valutato per la sua capacità di rilevare il marker di interesse in linee cellulari con diversi livelli di espressione (cioè densità di antigene alta e bassa) e la sua specificità deve essere convalidato in una linea cellulare che è negativo per il marcatore di interesse . In ogni caso, tutte le linee cellulari devono essere testati utilizzando un solo controllo cellule (senza anticorpo aggiunto), il controllo IgG appropriato, e l'anticorpo di interesse a varie concentrazioni e tempi di esposizione per determinare il most impostazioni appropriate che garantiscano l'ottimizzazione del marcatore definito dall'utente. Tuttavia, va notato che, anche se è possibile la caratterizzazione delle CTC sul CSS, attualmente solo un marcatore definito dall'utente di interesse può essere esplorato in ciascun campione, e che il sistema è molto limitata per quanto riguarda le applicazioni a valle a causa della trasformazione dura dei campioni.

L'approccio unico comodino da banco utilizzati nella ricerca CTC ha consentito l'immissione rapida di questo test utile in ambito clinico. Tuttavia, ha comportato una inadeguata comprensione della biologia di base di queste cellule rare. Pertanto, lo sviluppo e l'ottimizzazione di saggi che permettono di valutazione del CTC in preclinici in modelli murini vivo di cancro sono necessari. Questo manoscritto descrive un protocollo CSS adattata che permette di CTC da valutare in 50 volumi microlitri di sangue del mouse, ideali per la raccolta CTC seriale modelli sperimentali. Questo manoscritto demonstrates che CTC enumerazione usando questo protocollo è paragonabile ai risultati ottenuti con il CSS in combinazione con il kit tradizionale CTC, con differenze significative nella CTC efficienza di cattura tra le tecniche di separazione automatiche e manuali. Inoltre, durante lo sviluppo di questo saggio è stato riconosciuto, come già descritto in letteratura ^25, che la contaminazione delle cellule epiteliali squamose mouse può effettuare un'accurata identificazione delle CTC più difficile e talvolta impossibile. Quindi per combattere questo problema un utente definito HLA-Alexa Fluor 488 è stato aggiunto a questo protocollo per garantire che solo le cellule umane (CK ⁺ DAPI ⁺ CD45 ^- HLA ^- Alexa Fluor 488 ⁺⁾ sono stati opportunamente assegnati come CTC. È importante notare che la linea cellulare LNCaP utilizzato in questo manoscritto è HLAlow e quindi HLA-Alexa Fluor 488 può essere necessario titolato per linee cellulari con vari espressione HLA. Anche se abbiamo aggiunto un HLA-Alexa Fluor 488 per il nostro protocollo per garantire l'identificazione accurata di CTC, è da notare che la stragrande maggioranza delle cellule epiteliali squamose topo erano facilmente identificabili dalla morfologia e sono stati limitati nel numero di cellule (0.33 ± 0.24 events/50 microlitri, n = 9). Il numero di cellule più elevate (fino a 11 events/50 microlitri) sono stati osservati solo quando la raccolta del sangue (tramite puntura cardiaca) si è rivelata difficile e ripetuti tentativi erano necessari. Pertanto proponiamo che se lo si desidera, la caratterizzazione on-sistema delle CTC potrebbe essere realizzato omettendo questo marcatore. Inoltre, anche se qui non descritto, ci aspettiamo che la raccolta delle CTC e l'ulteriore caratterizzazione valle delle CTC utilizzando altri metodi potrebbe essere facilmente raggiunto, come dimostrato in precedenza utilizzando il CSS ^27,28.

Anche se il CSS è stato utilizzato clinicamente per individuare efficacemente CTC nel sangue della mammella metastatico, prostata e pazienti affetti da cancro del colon-retto ^4,10,29, non ha vari limitations. In fino al 35% dei pazienti con vari tumori metastatici, CTC sono rilevabili nonostante la presenza di una diffusa malattia sistemica ^30. Questa mancanza di rilevamento è stato proposto di essere il risultato della transizione epiteliale-mesenchimale, un processo ben documentato noto che permettono di migliorare invasione cancro, metastasi, e aggressività generale ^31. Questa transizione è stata associata con una riduzione significativa marcatori epiteliali, come EpCAM, e un corrispondente aumento mesenchimali marcatori ^32. Diversi studi hanno recentemente dimostrato che la presenza di questi marcatori mesenchimali in CTC sono indicativi di prognosi peggiore e che molte di queste cellule mancano di espressione di marcatori epiteliali che sarebbero necessari per la loro rivelazione usando il CSS ^24,33-38. Questo suggerisce che la definizione CSS standard può mancare alcune delle CTC più aggressivi.

Nonostante i limiti descritti, è prevista ªe protocolli descritti in questo manoscritto saranno strumenti importanti per una migliore analisi CTC utilizzando il CSS, lo sviluppo di tecnologie innovative CTC, l'ottimizzazione di marcatori definiti dall'utente, e una migliore comprensione della biologia CTC utilizzando modelli in vivo preclinici mouse. Presi insieme, questi protocolli forniranno una risorsa utile per gli utenti di questa piattaforma interessati alla ricerca preclinica e clinica di pertinenza di metastasi e CTC.

L'autore (ALA) ha ricevuto un finanziamento che è stato fornito da Janssen Oncologia, la cui casa madre Johnson & Johnson detiene inoltre Janssen Diagnostics LLC, che produce reagenti e strumenti utilizzati in questo articolo.

Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti dell'Istituto Ontario di Ricerca sul Cancro (# 08NOV230), la Fondazione canadese per l'innovazione (# 13199), Cancro alla prostata Canada, Janssen Oncologia, il Cancer Program Regionale di Londra, e il sostegno dei donatori da Giovanni e Donna Bristol attraverso il London Health Sciences Foundation (a ALA). LEL è supportato da un Frederick Banting e Charles Best Canada Graduate Scholarship Award di dottorato. ALA è supportato da un CIHR New Investigator Award e un ricercatore Award anticipata dal Ministero della Ricerca e Innovazione Ontario.