Klinik ve Klinik Öncesi Araştırma Uygulamaları Tümör Hücre (CTC) Tahliller Sirkülasyon semiautomated adaptasyon

Sirkülasyon tümör hücrelerinin (kapalı zaman eğrilerinin) birçok metastatik kanser prognostik bulunmaktadır. Bu el yazması altın standart CellSearch sistemi (CSS) CTC sayım platformu ve golleri ortak yanlış sınıflandırma hatalar açıklanır. Buna ek olarak, iki uyarlanmış protokolleri bu teknolojiyi kullanarak metastaz klinik öncesi fare modellerinde kapalı zaman eğrilerinin ve CTC numaralandırma kullanıcı tanımlı işaretleyici karakterizasyonu için tarif edilmiştir.

Kansere bağlı ölümlerin çoğunluğu metastatik hastalık gelişimine daha sonra meydana gelir. Bu son derece öldürücü hastalık aşama tümör hücrelerinin (kapalı zaman eğrilerinin) dolaşan varlığı ile ilişkilidir. Bu nadir hücreler metastatik göğüs, prostat, kolorektal kanser ve klinik öneme sahip olduğu gösterilmiştir. Klinik CTC algılama ve numaralandırma güncel altın standardı FDA onaylı CellSearch sistemi (CSS) 'dir. Bu el yazması standart bu platformu tarafından kullanılan protokolü yanı sıra özetliyor standardını kullanarak, hasta kapalı zaman eğrileri protein karakterizasyonu için kullanıcı-tanımlı işaretleyici optimizasyonu ve kanın çok düşük hacimlerde CTC yakalamak için benzer bir protokol ayrıntılı sürecini açıklayan iki ek protokol uyarlanmıştır CSS reaktifler, metastaz vivo preklinik fare modellerinde okuyan için. Buna ek olarak, sağlıklı kan verici arasında CTC kalitesinde farklılıklar hastanın kan samp karşılık doku kültürü hücreleri ile tutturuldules vurgulanır. Son olarak, CTC yanlış sınıflandırma hatalara yol açabilir birçok yaygın discrepant öğeler özetlenmiştir. Birlikte ele alındığında, bu protokoller metastaz ve kapalı zaman eğrileri ilişkin klinik öncesi ve klinik araştırma ile ilgilenen bu platform kullanıcıları için yararlı bir kaynak sağlayacaktır.

2013 yılında 580.350 kişi kanserden öleceği tahmin edilmektedir ve bu hastalığın o 1.660.290 yeni vaka başına ¹ ABD'de tanısı olacaktır. Bu ölümlerin çoğunluğu metastatik hastalık ² gelişiminde sonra ortaya. Metastaz ve metastatik kaskad sınırlı bir anlayış tedavisinde etkili tedavilerin mevcut olmaması hastalığın bu aşamada son derece ölümcül yapar. Kan içinde, tümör hücrelerinin (kapalı zaman eğrilerinin) sirküle varlığı metastatik hastalık ³ ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. Bu hücreler son derece nadirdir ve algılama metastatik meme ^4, prostat ⁵ genel sağkalım göstergesidir ve kolorektal kanser ^6. Daha az olan hastalar ya da Sam tespit edilebilir bir kapalı zaman eğrileri ile karşılaştırıldığında, bu hastalarda, varlığı ≥ 5 (göğüs ve prostat) veya kan 7.5 ml ≥ 3 (kolorektal) kapalı zaman eğrilerinin daha kötü prognoz göstergesidire kan hacmi. Buna ek olarak, terapötik müdahale sırasında ya da sonrasında CTC sayısındaki değişim çoğu zaman daha önce şu anda kullanılan tekniklere göre ^7-10, tedaviye yanıt bir göstergesi olarak yararlı olduğu gösterilmiştir.

Bu metastatik kanser hastalarında, kapalı zaman eğrilerinin 10 ⁵ -10 ⁷ kan tek-çekirdekli hücreleri için yaklaşık 1 CTC bir frekansta ortaya çıkar ve lokalize hastalığı olan hastalarda, bu frekans (1 ^{ila 8} 10 ~) daha düşük olabilir, bu tahmin edilmiştir. Bu hücrelerin nadir doğası zor doğru ve güvenilir CTCS ¹¹ algılamak ve analiz yapabilirsiniz. Çeşitli yöntemler (önceden ^12-14 gözden), kan bileşenleri çevreleyen onları ayırt özelliklerini istismar ederek bu hücreleri zenginleştirmek ve algılamak için kullanılmıştır. Genel olarak, CTC numaralandırma bir zenginleştirme aşaması ve bir adım algılama gerektiren hem iki bölümlü bir işlemdir. Geleneksel olarak, zenginleştirme adımlar fizik farklılıkları güveniyorkapalı zaman eğrileri (hücre boyutu, yoğunluk, deformabilite) veya protein işaretleyici ifade (yani epitel hücre adezyon molekülü [EpCAM], sitokeratin [CK]) iCal'ın özellikleri. Zenginleştirme sonra, CTC tespiti, nükleik asit bazlı deneyler ve / veya sitometrik yaklaşımlar en yaygın olarak farklı şekillerde, bir dizi gerçekleştirilebilir. Bu stratejilerin her biri farklı avantaj ve dezavantajları olan, ancak hepsi standardizasyon eksikliği, benzersiz, klinik ortamda içine giriş için bir zorunluluk. CellSearch sistemi (CSS) dolayısıyla floresan mikroskobu ve antikor bazlı teknikler ^4-6 kullanılarak insan kanında nadir kapalı zaman eğrileri tespiti ve sayımı için standart bir yöntem temin etmek üzere geliştirilmiştir. Bu platform şu anda CTC numaralandırma altın standart kabul edilir ve klinikte ¹⁵ kullanılmak üzere ABD Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) tarafından onaylanmış tek teknik olduğunu.

CSS iki bileşenli bir platformdur consistin olduğunug, insan kan numunelerinin hazırlanması ve bu tarar (bundan sonra analiz aracı olarak da adlandırılır) (2) CellTracks Analiz II, otomatik (bundan sonra hazırlama aracı olarak da adlandırılır) (1) CellTracks otoprep sistemi, Aşağıdaki örnekler, hazırlama. Lökositler hazırlık aleti karışmasını CTCS ayırt aracılı bir antikor, ferrofluid tabanlı manyetik ayırma yaklaşımı ve diferansiyel floresan boyama kullanır. İlk olarak, sistem demir nanopartiküllerinin konjuge anti-EpCAM antikor kullanılarak CTCS etiketler. Numune daha sonra, bir manyetik alan içinde inkübe edilir ve tüm etiketlenmemiş hücreler aspire edilir. Seçilen tümör hücrelerinin floresan-etiketli antikorlar ve nükleer boyama reaktif oluşan, farklı flüoresans leke içinde yeniden süspansiyona alınmış, ve inkübe edilir. Son olarak, numune, bir manyetik kartuş için (bundan böyle manyetik cihazı olarak anılacaktır) bir MagNest denir ve sc ediliranaliz aleti kullanılarak anned.

Bu analiz aleti, bir 10X objektif lens kullanarak, farklı floresan filtreler, uygun floresan parçacık için optimize her kullanılarak hazırlanan örnekleri taramak için kullanılır. Kapalı zaman eğrilerinin anti-EpCAM, anti-pan-CK-fikoeritrin (PE) ile bağlıdırlar hücreleri (CK8, 18 ve 19), ve nükleer leke 4 ',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) olarak tanımlanır. Bunun aksine, anti-kirletici lökosit CD45-Allophycocyanin (APC) ve DAPI ile bağlı hücreler olarak tanımlanır. Tarama sonra, bilgisayar tanımlanmış potansiyel tümör hücrelerinin kullanıcıya sunulmaktadır. Bu görüntülerden, kullanıcı olayları KTC olduğunu belirlemek için yukarıda tartışılan tanımlı parametreleri ve diferansiyel boyama kullanılarak kalitatif analizi istihdam etmek zorundadır.

CTC numaralandırma için standart bir yöntem sağlamaya ek olarak, CSS ilgi protein belirteçleri göre kapalı zaman eğrileri moleküler karakterizasyonu için izin verir. Bu sorgulama cbir CTC tanımlama ¹⁶ için gerekli olmayan bir floresan izotiyosiyanat (FITC) floresan kanalını kullanarak, tek hücre düzeyinde gerçekleştirilebilir. Bu platform moleküler karakterizasyonu için kapasite sağlamasına rağmen, protokol geliştirme ve optimizasyon detaylı süreci iyi tanımlanmış değildir. Üç ticari olarak temin edilebilen belirteçler, epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR), insan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 (HER2) ve insülin benzeri büyüme faktörü reseptörü 1 (IGF-1 R) dahil olmak üzere, CSS ile kullanım için, üretici tarafından geliştirilmiştir. HER2 analizi, CSS ile birlikte, klinik karar verme bilgilendirmek ve potansiyel mevcut tedavi kuralları değiştirmek için CTC karakterizasyonu için potansiyel göstermek için çeşitli gruplar tarafından kullanılmıştır. Örneğin, Fehm et al. ¹⁷ HER2-primer tümörlü göğüs kanserli hastaların yaklaşık üçte biri HER2 ⁺ CTCS sahip olduğunu göstermiştir. Buna ek olarak, Liu et al.18 yakın HER ⁺ metastatik meme kanseri hastalarının% 50 kadar HER2 ⁺ CTCS yoktu bildirdi. Herceptin, büyük olan tümörler HER2 yeterli düzeyde ifade HER2 ⁺ primer tümörleri ^19-21 olan hastalar için yaygın olarak kullanılan tedavi hastaların yararına göstermiştir monoklonal antikor müdahale HER2 reseptörü. Ancak bu çalışmalar Herceptin alt-optimal düzeyde kullanıldığı ve CTC karakterizasyonu tedavi yanıtını belirlemede yardımcı olabilir varlık olabileceğini düşündürmektedir. Sonuçta, CTC karakterizasyon kişisel bakım geliştirmek için potansiyeli olabilir.

Büyük ölçüde bir başucu-to-benchtop yaklaşımı kullanmış olmasıyla CTC araştırma benzersizdir. Bu yöntem, genellikle hasta bakımını etkileyecek yıl sürebilir benchtop-to-başucu araştırma, aksine, klinik ortamda içine KTC hızlı bir giriş sağladı. Ancak, hekimlerin hasta tedavi kararı-mak CTC analiz sonuçları kullanmak için tereddütlünedeniyle altta yatan biyolojinin anlayış eksikliği ing. Bu nedenle metastaz ve tamamlayıcı CTC analiz teknikleri, uygun klinik öncesi fare modelleri bu olağanüstü soruları araştırmak amacıyla kullanılmalıdır. Genel olarak, metastatik kademeli olarak tüm adımların çalışma için izin metastatik kaskad çalışma için kullanılan klinik öncesi modellerinin iki tür, (1) kendiliğinden metastaz modelleri vardır ve sadece izin verir (2) deneysel metastaz modelleri Böyle ekstravazasyonun ve ikincil tümör oluşumu ²² olarak metastatik süreçte adımlardan çalışma. Spontan metastaz modelleri uygun ortotopik yerle (prostat kanseri araştırması için prostat bezine prostat kanseri hücreleri, örneğin enjeksiyon) içine tümör hücre enjeksiyonu içerir. Hücreler daha sonra, birincil tümörler oluşturan ve kendiliğinden gibi kemik, akciğer, lenf düğümleri gibi ikincil bölgelere metastaz için zaman verilir. Içindekontrast, deneysel metastaz modelleri (belirli yerlere hücrelerini hedef kuyruk ven veya intrakardiyak enjeksiyon yoluyla örneğin) kan dolaşımına, tümör hücrelerinin doğrudan enjeksiyon içerir ve bu nedenle ikincil organlara ²² intravasation ve yaygınlaştırma ilk adımları atlayın. Bu zamana kadar in vivo model sistemlerinde de CTC analiz çoğunluğu sitometri tabanlı ²³ ya da dönüştürülmüş insan merkezli CTC teknikler (örneğin AdnaTest) ²⁴ kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Yararlı olsa da, bu tekniklerin hiçbiri yeterince altın standart CSS kullanarak CTC numaralandırma yansıtmaktadır. Sonuçlar kıyaslanabilir olacağı gibi klinik onayı, standart doğa ve CSS yaygın kullanıma göre, bir eşdeğer numune hazırlama, işleme kullanır in vivo modelleme için CTC yakalama ve algılama tekniği ve kimlik kriterleri geliştirme avantajlı olacaktır hasta örneklerinden elde edilmiştir. Bununla birlikte, hacim reqhazırlama aygıtının uirements bu otomatik bir platform kullanılarak kan küçük hacimli işlemek mümkün değildir. . Olarak fare skuamöz epitel hücrelerinin yanlış sınıflandırma yol açabilir ^- Ayrıca, Eliane ark ²⁵ tarafından önceki çalışma (aynı zamanda standart CTC tanımını [EpCAM ⁺ CK ⁺ DAPI ⁺ CD45] karşılamak) fare epitel hücreleri ile numunelerin kontaminasyonu olduğunu göstermiştir KTC. Bu sorunlar, manuel izolasyon prosedürü ile birlikte CSS CTC kiti reaktiflerin kullanımı geliştirilen sağlayan bir uyarlanmış tekniği ele almak için. Tahlile bir FITC etiketli insan lökosit antijeni (HLA) antikor ilave insan tümör hücreleri, fare skuamöz epitel hücrelerden ayırt edilmesini sağlar.

Bu el yazması uyumsuzluğu dahil karşılaştı olabilir Hasta kan örnekleri ve ortak tuzaklar, işlenmesi için ticari olarak geliştirilen standart ve optimize CSS kuralını açıklarCTC yanlış sınıflandırma hatalara yol açabilir t ürün. Buna ek olarak, yakalanan kapalı zaman eğrileri ve metastaz klinik öncesi fare modellerinde kan küçük hacimlerinden kapalı zaman eğrileri zenginleşmesi ve saptanması için uyarlanmış izin veren karşılaştırılabilir bir CSS tekniğinin kullanıcı tanımlı protein özelliklerini incelemek için CSS tahlilinin özelleştirme açıklanmıştır.

Bu yazıda anlatılan tüm insan çalışmalarda Batı Üniversitesi İnsan Araştırmaları Etik Kurulu tarafından onaylanan protokol çerçevesinde yürütülmüştür. Tüm Hayvan çalışmaları Western University Hayvan Kullanımı Alt Komitesi tarafından onaylanan protokoller çerçevesinde, Hayvan Bakımı Kanada Konseyi tavsiyeleri doğrultusunda yapılmıştır.

1.. CSS kullanarak Hasta kan örnekleri standart CTC Numaralama

1.. Hazırlık Enstrüman İnsan Kan Örnek Toplama ve İşleme Hazırlık

1. Standart aseptik flebotomi teknikleri kullanılarak, etilen diamintetraasetik asit (EDTA) ve özel bir hücre koruyucu madde içermektedir, (bundan sonra CTC koruyucu boru olarak da adlandırılır), bir 10 ml tüp içine CellSave insan kanı 8.0 ml 'lik bir minimum çizin. Pıhtılaşma kan önlemek için tüp 5x ters çevirin. Örnekler hemen işleme ya da en fazla 96 saat boyunca oda sıcaklığında saklanabilir.
2. Remove CSS buzdolabı reaktifler ve onları kullanmadan önce oda sıcaklığına gelmesini bekleyin.
3. Tek kullanımlık bir pipet 10 mi ve otomatik pipet kullanarak, CTC koruyucu boru kan 7.5 ml toplar ve yavaş yavaş bir şekilde etiketlenmiş hazırlama alet işleme tüp içine kan dağıtmak.
4. Her bir örnek için seyreltme tamponu 6.5 ml ilave edilir. Örnek 5x ters çevirerek karıştırın. "Kapalı" konumunda freni ile 10 dakika boyunca 800 x g santrifüj örnek. Işleme sistemi üzerine tüm hasta numuneleri yüklemek için hazırlık enstrüman üzerinde ekrandaki yönergeleri izleyin. Örnekler hazırlama, 1 saat içinde işlenmelidir.

2. Hazırlık Instrument İşleme Kontrolü Hazırlama

1. Yavaşça kontrol şişeyi vorteks ve karıştırmak için 5x ters.
2. Dikkatle kontrol şişesi kapağını çıkarın ve kapağını açıp şişenin üstüne ters bir hazırlık enstrüman işleme tüp yerleştirin. Tek bir hareketle, tersşişe, kontrol ve işlem tüpe içeriğini dökün. Ters çevrilmiş olsa da, hafifçe geri kalan içeriği serbest bırakmak için kontrol şişe kenarlarını hafifçe vurun.
3. Dikkatle, işleme tüp ters kontrol flakonun çıkarılması hiçbir sıvı kaybolur sağlamak ve bir kenara koyun. 1000 ul pipet kullanarak, şişe ve kapak kalan içeriğini toplamak ve yavaşça işlem tüp içine pipetle.
4. Işleme sistemi üzerine denetimini yüklemek için hazırlık enstrüman üzerinde ekrandaki yönergeleri izleyin.

3. Analiz Instrument Numune Tarama

1. Sistemin tüm örnekleri kaldırmak için hazırlık enstrüman üzerinde ekrandaki yönergeleri izleyin. Gevşek, her bir manyetik cihaz kartuşu kap ve kartuş kenarlarına yapışmış herhangi kabarcıkları serbest bırakmak için ellerini veya laboratuar tezgah kullanarak manyetik cihaz dokunun. Tüm kabarcıklar çıkarıldıktan sonra, sıkıca i kartuşu kap düz manyetik cihaz yatıyordu, ve, oda sıcaklığında en az 20 dakika boyunca karanlıkta ncubate. Örnekler hazırlama 24 saat içinde taranmalıdır.
2. Analiz aracı açın ve lambayı başlatmak. Once (~ 15 dk) ısındı, analiz enstrümanı üzerine sistem doğrulama kartuşu yükleyin ve QC Testi sekmesini seçin. Gerekli kalite kontrol önlemleri gerçekleştirmek için ekrandaki talimatları izleyin.
3. Analiz enstrümanı üzerine bir örnek Yük ve Hasta Testi sekmesini seçin. Hazırlık enstrüman kayıtlı tüm bilgiler ekrana gelecektir. Örnek taramayı başlatmak için Başlat düğmesini tıklatın. Sistem manyetik cihaz kartuş üzerindeki bir kaba odak ve kenar algılama yapacak.
4. Yön tuşlarını kullanarak gerekli tüm kenarları ayarlayın. Seç. Sistem ince odak gerçekleştirmek ve örnek taramaya başlayacak.
5. Sonuçları tarayarak aşağıdaki kontrol yüksek (CK ⁺ DA çivili hücreler için tanımlanmış kriterler kullanılarak valide edilmelidirPI ⁺ CD45 ^- APC ⁺⁾ ve düşük (CK ⁺ DAPI ⁺ CD45 ^- FITC ⁺⁾ konsantrasyonları. Sonuçları tarayarak aşağıdaki hasta numunesi tanımlanan CTC kriterleri (CK ⁺ DAPI ⁺ CD45 ^-) kullanılarak çekilen kapalı zaman eğrileri için gözden geçirilmelidir.

2. CSS kullanarak kullanıcı tanımlı Markers için CTC Karakterizasyonu

1.. Kullanıcı tanımlı Göstergeleri ve Enstrüman başlatması hazırlanması

1. Çalışma konsantrasyonu örnek ile stok konsantrasyonu ilave sonra antikorun konsantrasyonu aşağıdaki formül kullanılarak bir işaretleyici reaktif bir kap içinde istenen konsantrasyona Bond birincil antikor seyreltici kullanılarak, ilgi konusu antikorun sulandırınız antikor konsantrasyonudur reaktif fincan. Birden örnekleri için, Tablo 1 'de tarif edildiği gibi antikor seviyesini ayarlamak. Reaktif kartuş ve l 1 konumuna işaretleyici reaktif fincan yerleştirinCSS üzerine kartuşu OAD.
   Stok Konsantrasyon = (Çalışılan Konsantrasyon x 850 ul) / 150 ul
   
2. , Kan toplamak örnekleri hazırlamak ve CSS protokol kullanılarak hasta kan örnekleri arasındaki standart CTC Numaralama, yukarıda tarif edildiği gibi hazırlama aleti yükleyin. Hazırlık cihaz tarafından istendiğinde özel işaretleyici eklenmesini etkinleştirmek için, Kullanıcı Testi tanımlanmıştır. Girdi işaretleyici adı seçin ve Kaydet. Numuneler cihazın üzerine yüklenir gibi, operatör olarak gerekli Hayır Evet seçerek veya tarafından özel işaretleyici almalıdır hangi göstermek istenir.

2. Analiz Instrument Kullanıcı Tanımlı Markers örnek Tarama

1. , Analiz enstrümanı açmak lambayı başlatmak ve CSS kullanarak Hasta kan örneklerinden Standart CTC Numaralama Bölüm 3.2 'de açıklandığı gibi kalite kontrol ve sistem doğrulama gerçekleştirmek protokolü.
2. Analiz enstrümanı üzerine bir örnek yükleyin ve Kur sekmesini seçin. FITC kanalı başlatmak için, Test Protokolleri bölümünde Kit kimliği olarak CellSearch CTC seçin. Bu menüde, CTC Araştırma, Düzenle düğmesini tıklatın ve istediğiniz gibi pozlama süresini ayarlayın. Bu CTC tespiti için kullanılan diğer floresan kanallar içine akmalarını artırabilir gibi CSS CTC kitini kullanarak 1.0 saniye bir pozlama süresi aşılmamalıdır önerilir.

3. Klinik öncesi Fare Modelleri kullanılmak için Standart CSSProtocol adaptasyonu

** Veridex Fare / Rat CellCapture Kit uyarlanmıştır (artık piyasada mevcut)

1.. Fare Kan Toplama ve Saklama

1. Önceki kan toplama için, 0.5 M EDTA, 30 ul EDTA merkezi olarak küçük bir miktar bırakarak geri ve ileri bir 22 G iğne ile ~ çalıştırın.
2. Daha önce ortotopik, kuyruk ven veya kalp içi yolları ile insan tümör hücreleri ile enjekte edilmiş farelerden alınan fare kan 50 ul, en az toplayın. (Seri CTC analizi için) safen veninden veya (CTC terminali analizi için) ve kardiyak delik ile kan toplamak. İğneyi çıkarın ve 1 ml EDTA Microtainer kan toplama tüpüne kan akıtın. Pıhtılaşma kan önlemek için ters ya da hafifçe fiske tüp ile karıştırın. Kan CytoChex hücre koruyucu eşit hacimde ilave edildikten sonra en fazla 48 saat boyunca hemen işleme veya oda sıcaklığında saklanabilir.

2. CTC Zenginleştirme

1. Buzdolabı CSS reaktifleri kaldırmak ve onları kullanmadan önce oda sıcaklığına gelmesini bekleyin.
2. Tüp sitometrisi, bir 12 mm x 75 mm, tam kan akışı 50 ul eşdeğer aktarın. Tüp yanlarındaki kalan bir kan aşağı yıkama, her bir örnek için seyreltme tamponu içinde 500 ul ekleyin. Gerekirse, kısa bir santrifüj sıkmaKalan kan toplamak için kullanılabilir.
3. Yavaşça anti-EpCAM ferrofluid girdap doğrudan numune içine pipet ucu koyarak her bir örnek için, 25 ul ekle. Hafifçe karıştırın Yakalama Geliştirme reaktif ve vorteks 25 ul ekleyin. 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
4. Mıknatısın örnek tüpleri içine yerleştirin ve 10 dakika için inkübe edilir. Örnek tüpleri mıknatıs hala birlikte, dikkatli bir şekilde bir sonraki mıknatısa tüpün duvarına dokunmadan kalan sıvı aspire ve atmak için cam pipet kullanın.

3. CTC Boyama

1. Nükleik asit Boya, boyama reaktifi, anti-fare CD45-APC, anti-insan HLA-Alexa Fluor 488 ve 100 ul permeabilizasyon 5.0 ul 1.5 ul, 50 ul, 50 ul mıknatıs ve tekrar süspansiyon gelen numune tüpleri çıkarın Reaktif. Birden örnekleri için, bu maddeler önceden karıştırılmış olabilir ve karışım 206.5 ul, her bir tüpe ilave edilebilir. Hafifçe karıştırın Vortexve karanlıkta, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin.
2. Mıknatısın içine yavaşça 500 ul seyreltme tampon maddesi, girdap, yeri örnek tüplerini ekleyin ve 10 dakika için inkübe edilir. Örnek tüpleri mıknatıs hala birlikte, dikkatli bir şekilde bir sonraki mıknatısa tüpün duvarına dokunmadan kalan sıvı aspire ve atmak için cam pipet kullanın. Mıknatıstan numune tüpleri çıkarın ve seyreltme tamponu içinde 350 ul içerisinde tekrar süspansiyon haline getirin. Vortex hafifçe karıştırın.

4. Manyetik Aygıt Yükleme

1. Bir jel yükleme ucu kullanarak dikkatli bir şekilde manyetik bir cihazın bir kartuş içine örnek tüpten tüm hacmi aktarın. Kartuşun alt başlatın ve örnek dağıtılır yavaş yavaş ucu geri.
2. Tüm numune aktarıldıktan sonra, gevşek manyetik cihaz kartuşunun kapak ve sezaryen açıklandığı gibi kartuşun kenarlarına yapışmış kabarcıkları serbest bırakmak için el ya da laboratuar tezgah kullanılarak manyetik cihaz dokununn CSS kullanarak Hasta kan örneklerinden Standart CTC Numaralama 3.1.
3. Eğim ve kartuşun kenarı arasında onları yakalama tarafından steril bir 22 G iğne kullanarak herhangi kabarcıklar pop. Tüm kabarcıklar çıkarıldıktan sonra, sıkı bir şekilde, kartuş kapağı düz manyetik cihaz koymak ve en az 10 dakika süreyle karanlıkta inkübe edilir. Örnekler hazırlama 24 saat içinde taranmalıdır.

5. Analiz Enstrüman üzerinde elle Ayrılmış Numune Tarama

1. , Analiz enstrümanı açmak lambayı başlatmak ve CSS kuralını kullanarak Hasta kan örneklerinden Standart CTC Numaralama Bölüm 3.2 'de açıklandığı gibi kalite kontrol ve sistem doğrulama gerçekleştirmek.
2. Analiz aracı üzerine örnek yükleyin ve Kur sekmesini seçin. Biçim Örnek düğmesini tıklayarak manyetik cihaz veri düğmeye üzerindeki mevcut verilerin temizleyin. FITC kanal a etkinleştirinCSS kullanarak Kullanıcı Tanımlı Belirteçleri için CTC Karakterizasyonu Bölüm 2.2 'de açıklandığı gibi nd 1.0 sn pozlama süresini ayarlayın.
3. Hasta Testi sekmesini tıklayın ve girişine örnek bilgileri Düzen'i seçin. Testi Protokolü olarak Kit kimliği olarak CellSearch CTC CTC ve Araştırma seçin. Girdi Yıldızla olarak belirtildiği gibi kalan gerekli bilgi. Örnek bilgileri kaydedin ve Başlat düğmesini tıklatın.

Standart CTC Sayım Deneyi

CSS duyarlılığı ve özgünlüğü de literatürde belgelenmiştir. Bununla birlikte, eşit CTC kurtarma doğrulamak için, çivili (1000 LNCaP insan prostat kanser hücreleri) ve sağlıklı gönüllü vericilerden Katkısız bir insan kan numuneleri, standart CSSCTC protokolü kullanılarak CSS işlenmiştir. Beklendiği gibi, Katkısız numuneler, 0.00 ± 0.00% kapalı zaman eğrileri ücretsiz vardı ve CTC kurtarma çivili numuneler (Şekil 1A) için 86.9 ± 4.71% olarak gösterilmiştir. Çivili örneklerinden elde CSS galeri görüntüleri optimum kalite ve KTC olmayan kapalı zaman eğrileri ayırt etmek kolay. Kanser hastalarından elde edilen numune işleme Bununla birlikte, kapalı zaman eğrileri belirlenmesi birçok hücre boyut olarak daha küçük ve daha az görünen kolayca ayırt olmayan kapalı zaman eğrileri (Şekil 1B) için olmak üzere, biraz daha zordur. Buna ek olarak, hasta numuneleri olaylar 6 kategori incelerken identifi edildiyorumcular (Şekil 1C) arasında yaygın discrepant öğe vardı ed. Bu 6 kategoriler dahil, (1) küçük CTC sınıflandırma için 4 mikron boyutu ihtiyacını karşılamak vermedi etkinlikler; loş CK ve / veya DAPI boyama (2) ürün, (3) haklı haksız karşı (CTC olarak sayılmalıdır) (CTC olarak sayılmamalıdır) parlak CK-PE boyama neden CD45-APC kanalı içine akmasını, (4) FITC + olaylar, (5), CK ve / veya DAPI kanallarda pikselli görüntüler ve (6) olayları CK görüntü veya CK görüntü ile>% 50 örtüşmeyen DAPI boyama ile daha büyük DAPI boyama ile. Kategoriler için (2) ve (5) belirli kriterler CTC sınıflandırma var. Kategori (2), loş CK / DAPI ile ürün KTC sağlam bir zar CK kanalda görülebilir kaydıyla olarak sınıflandırılabilir ve edilebilir biruygun büyüklükte DAPI görüntü kaydetti. Herhangi pikselleşmeyi CK kanalda görülmediği takdirde kategori için (5), pikselli CK / DAPI ile ürün kapalı zaman eğrileri olarak sınıflandırılmış olamaz. Veya diffüz (must - Ancak, pikselleşmeyi DAPI kanalda kabul edilebilir o (beyaz bir siyah arka plan üzerinde boya olarak Janssen Diagnostics (eski Veridex) tarafından tanımlanan, yani görüntü, hiçbir gri alanlar bir arka plan tamamen beyaz olan) çok şiddetli olmaması şartıyla hala) şeklinde oval görünür ve CK sığacak.

Kullanıcı Tanımlı Marker Testi Geliştirme

Kullanıcı tanımlı işaretleri için CTCS karakterize etmek için, CSS adaptasyonu sıkı kontrol ile önemli bir iş-up gerektirir ve daha önce ¹⁶ tarif edilmiştir. Genel bir kural olarak, her bir kullanıcı tanımlı markörün uygun bir optimizasyon negatif kontrol sonuçlar spesifik olduğundan emin olmak için kullanılabilir olması gerekir. Çivili örnekler her iki ile işlendiğinde iyi sonuçlar elde edilmektedirHedef antikorun yerine ve daha önce tarif edildiği gibi tek başına antikor, bir seyreltici ile spesifik olmayan IgG kontrolü. Çeşitli hedef antikor konsantrasyonları ve maruz kalma süreleri de değerlendirildi ve, yüksek, düşük ve yok (negatif) antijen yoğunlukları ile hücre hatları kullanılarak valide edilmelidir. Deney ^16, spesifik olmayan bağlama gelen hedef antijene ve düşük arka plan sesi için yüksek duyarlılık ortaya koyduğunu, optimal protokol koşullar elde edilir.

Bir kanser kök hücre işaretleyici, CD44 kullanarak bu Çökmenin bir örneği, burada sunulmuştur. Bu belirteç ile ilk test kullanıcı tanımlı işaretleyici geliştirilmesi için FITC kanalı kullanır (bundan sonra geleneksel CTC kit olarak da adlandırılır), standart CSS CTC kiti kullanılarak başladı. Geleneksel CTC kiti kullanılarak, önemli optimizasyon sonra, CD44 ⁺ olarak sınıflandırılmış olabilir kapalı zaman eğrileri maksimum sayıda örnekleri kullanılarak 69.3 ± 2.67% 1,000 MDA-MB-468 huma ile çivili olduğunu ortaya konmuşturn, hücrelerin çoğunluğunda yüksek CD44 ifadesini göstermek için bilinen göğüs kanseri hücreleri (98.4 ±% 0.90, akış sitometrisi ile belirlendiği gibi), bu protein (Şekil 2A) ifade. Bu bulgulara dayalı olarak bu ticari olarak temin edilebilir kit CSS CXC geliştirilmiş sonuçlar olabileceği varsayılmıştır. Bu kit, hangi CK8 / floresans kanalı ters çevirerek (~ 100,000 antijenler / hücre yoğunluğunda olan bir belirteç için optimize edilmiş) geleneksel CTC kiti ile karşılaştırıldığında daha düşük bir antijen yoğunluğu (yaklaşık 50,000 antijenler / hücre) ile belirteçlerin daha iyi görünüm sağlar 18/19 (geleneksel PE kanal temsil edilir) ve (geleneksel olarak FITC kanalda gösterilen) ilgi kullanıcının işaretleyici (bu yüzden CXC kiti bundan sonra, düşük antijen yoğunluğuna CTC kit olarak anılacaktır) ²⁶ temsil edilir. Anlamlı optimizasyon sonra, bu değişiklik CD44 ^{+ sınıflandırılan kapalı zaman eğrileri 98.8 ± 0.51 ile% geliştirilmiş CD44 boyanması için izin olduğu gösterilmiştir/ Sup> herhangi bir kullanıcı-tanımlı işaretleyici Uygun optimizasyonu aynı zamanda yüksek antijen yoğunluğu (MDA-MB-468) kullanılarak doğrulama gerektiren ml 1.0 ug / bir konsantrasyon ve 0.6 saniyelik bir pozlama süresi (Şekil 2A). Da CD44-PE kullanılarak, Düşük antijen yoğunluğu (NT 21) ve ilgilenilen belirteci (Şekil 2B) için negatif (LNCaPs) hücre çizgileri dahildir.}

Klinik öncesi Fare Modeller CTC Analizi

Adapte edilen fare CSS protokolünün hassasiyet ve özgüllük belirlemek için, standart kullanarak işlemden çivili (1000 LNCaP insan prostat kanseri hücreleri) ve Katkısız bir fare kan örnekleri manuel olarak ve taranmış analiz aracı ile aynı hücre çizgisi kullanılarak elde edilen sonuçlarla karşılaştırılmıştır hazırlama aleti (Şekil 3A) hakkında otomatik bir CSS protokolü. Beklendiği gibi, Katkısız numuneler, hem tahlilleri kullanılarak kapalı zaman eğrileri ücretsiz olan 0.00 ± 0.00 ve% adapte fare kiti (90.8 ± 5.18%) kullanılarak CTC kurtarma s değildi, standart otomatik sistem kullanılarak elde edilen sonuçlar birleşmesi önemli ölçüde farklıdır (86.9 ±% 4.71, p> 0.05). Elle fare adapte protokol kullanılarak elde edilen görüntüler HLA-FITC marker ilavesinin hariç olmak üzere, standart otomatik bir teknikle gözlenenden farklı değildi. Buna ek olarak, fare yassı epitel hücreleri, HLA-FITC (Şekil 3B) için pozitif leke yoktur. Bu teknik kapalı zaman eğrileri düşük sayıda izole edilmesi için standart bir CSS protokolü kadar hassas olduğunu doğrulamak için, seri seyreltileri kirpi kan numuneleri ile yapıldı ve hücrelerin geri sayısına karşı hücre beklenen dizi korelasyon (Şekil 3C) değerlendirildi. Sonuçlar kapalı zaman eğrilerinin etkili bu tahlili kullanarak, bütün haldeki kan 5 s/50 ul bir duyarlılık aşağı geri olabilir göstermektedir. Bir r ² = 0.99 ile beklenen sonuçlar ile ilişkilidir Bu değerler.

Şekil 1. Standart CSS kuralını kullanarak CTC numaralandırma ve yorumlanması. (A) CTC kurtarma kirpi hücre sayısının bir yüzdesi olarak ölçülür. Hücreler, hemositometre ile sayıldı ve ~ 1000 LNCaP insan prostat kanser hücreleri, insan kanı 7,5 ml çivili edilmiştir. Katkısız, insan kan numuneleri, negatif kontrol olarak kullanılmıştır (n = 3). Veriler ± SEM ortalaması olarak sunulmaktadır. (B) kanser hastalarından alınan örneklerde karşı kirpi kan örnekleri (kültüründen tümör hücreleri ile tutturuldu örneğin, sağlıklı kan verici) gözlenen CTC kalitesinde farklılıklar Örnek CSS galeri ve görüntüler. (C) Örnek genellikle sınıflandırıldıgı, yaygın olarak uyumsuz öğelerin CSS galeri görüntüleri. Portakal kareler CK ⁺ / DAPI ⁺ / CD45 olarak tanımlanan kabul edilebilir CTCS belirtmek^-. 10X objektif büyütmede elde edilen görüntü. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Şekil 2. CSS kullanarak kullanıcı tanımlı işaretleri için kapalı zaman eğrileri karakterizasyonu. (A) CD44 CSS CTC CXC ve kitleri kullanılarak ⁺ olarak sınıflandırılan hücrelerin yüzdesi (n = 3). Veriler ± SEM ortalaması olarak sunulmuştur. *** = (P <0.0005). (B) önemli ölçüde farklı, sağlıklı gönüllü verici (7.5 ml) kan Örnek CSS galeri görsel anti-1.5 ug / ml 'si ile inkübe belirlenen hücre hattından ~ 1000 hücreleri ile çivili -CD44-PE, ve 0.2 saniyelik bir pozlama sırasında taranır. Portakal kareler ^{+ göstermektedir/ Sup> CK + / DAPI + / CD45 olarak tanımlanan KTC, - / CD44 -. PE + resmi büyütmek için buraya tıklayın.}

Şekil 3,. Metastaz klinik öncesi fare modellerinde kullanılmak için CSS prosedür adaptasyonu. (A) kirpi hücre sayısının bir yüzdesi olarak ölçülmüş ve standart bir protokol, insan CSS kullanılarak elde edilen sonuçlar ile karşılaştırıldığında, adapte edilen fare CSS protokol kullanılarak CTC iyileşme. Hücreler, hemositometre ile sayıldı ve ~ 1000 LNCaP insan prostat kanser hücreleri, insan kanı 7,5 ml çivili edilmiştir. Katkısız, insan kan numuneleri, negatif kontrol olarak kullanılmıştır (n = 3). Veriler ± SEM ortalaması olarak sunulmuştur. ns = anlamlı değil. (B) kapalı zaman eğrileri Temsilcisi CSS galeri görüntüleri HLA-AF488 fare hücrelerinden insan ayırt etmek mümkün olduğunu gösteren adapte fare CSS kuralını yakalanır. korelasyon ve lineer regresyon (C) Analiz, çeşitli konsantrasyonlarda çivili tümör hücrelerinin geri sayısına karşı bekleniyor . LNCaP insan prostat kanser hücreleri, başlangıçta hemositometre ile sayıldı ve daha sonra kan ul ~ 1000 tümör s/50 bir konsantrasyonda fare kan içine çivili edilmiştir. Spiked fare kan daha sonra seri olarak 5 s/50 tümör ul bir konsantrasyona seyreltilmiş ve fare adapte CSS protokolü (n = 3). Kullanılarak işlenmiştir büyük resim görüntülemek için.

Tablo 1. . Kullanıcı tanımlı bir işaretleyici ile numunelerin çeşitli sayıda işlerken CSS için toplam hacim gereksinimleri ** (: mevcut Veridex White Paper uyarlanmıştır http://www.veridex.com/pdf/CXC_Application_Guideline.PDF ).

2004 yılında CSS yana birçok yeni CTC teknolojilerin geliştirilmesine rağmen, bu teknik bugün piyasada sadece klinik onaylı bir teknolojidir ve bu nedenle CTC tespiti ve sayımı için geçerli altın standart olarak kabul edilir. Bu el yazması CSS sıkı kalite kontrol standartları olmasına rağmen bu yanlı yorumlanmasına tabi olacak ve hasta örneklerinde CTC kimlik çivili örneklerinde kimlik çok farklı olduğunu olduğunu göstermiştir. Yaygın olarak uyumsuz öğelerin altı kategoride CTC yanlış sınıflandırılması oluşmasına neden olabilir belirlendi. Bu tutarsız öğeler bu alet üzerinde işlenen her hasta örneği birden yorumcular için ihtiyaç vurgulayın. Buna ek olarak, CTCS elde hastada karşı kirpi gözlenen farklılıklar hem çivili ve hasta örneklerinde valide edilecek herhangi bir yeni CTC teknolojiler için bir zorunluluk olduğunu göstermektedir. Buna ek olarak, bu yeni teknolojiler b gerekirE çivili örneklerden verimli CTC yakalama sadece zorunlu olarak hasta örneklerinde CTC yakalama verimliliği yansıtmaz hem çivili ve hasta numunelerinin yarık numune testi kullanılarak altın standart CSS göre.

CSS yakalanan kapalı zaman eğrileri karakterizasyonu gerçekleştirmek için yeteneğine sahip olsa da, oldukça yüksek derecede özelleştirilebilir optimizasyon açısından sınırlıdır. Genel olarak, kullanıcı tarafından tanımlanan belirteçlerin optimizasyonu için bu alet üzerinde değiştirilebilir tek parametreler antikor konsantrasyonu ile florofor cıva lambası maruz kaldığı sürenin uzunluğu vardır. Optimizasyonu için bu sınırlı kapasite sorunları ortaya çıkabilir zaman çalışma-up kullanıcı-tanımlı belirteçleri CSS. Bu makalede önerilen bir çözüm, (daha önce ¹⁶ ayrıntılı olarak açıklanmıştır) FITC ve düşük antijen yoğunluğuna sahip belirteçlerin daha iyi görüntülenmesi için izin PE floresan kanal geçer düşük antijen yoğunluğuna CTC kitinin kullanılmasıdır. Ne olursa olsunkit uygun bir belirteç duyarlılık, özgüllük ve optimizasyonu sağlamak için yapılması gereken birkaç gerekli adımlar vardır (geleneksel ya da düşük yoğunluklu antijen CTC kiti) kullanılmaktadır hangi. İlk olarak, deney duyarlılık kullanıcı of (ilgi konusu işaretleyici ifade eden hücre popülasyonunda hücre yüzdesi, yani) beklenen saptama seviyesinin belirlenmesini sağlayacak gibi akış sitometri gibi bir zamanda geçerli bir yöntem, göre değerlendirilmelidir tanımlı işaretleyici. İkinci olarak, deney ifade çeşitli seviyelerde (örneğin yüksek ve düşük antijen yoğunlukları) ve özgüllük ile hücre hatlarında, ilgi konusu işaretleyici tespit edebilme kabiliyeti açısından değerlendirilmelidir ilgi marker için negatif olan bir hücre hattı olarak geçerli olmalıdır . Tüm durumlarda, her hücre çizgileri mo belirlemek için bir kontrol hücreleri sadece (herhangi bir antikor ilave edilir), uygun IgG kontrolü, ve çeşitli konsantrasyonlarda ve maruziyet zamanlarda ilgi konusu antikoru kullanılarak test edilmelidirkullanıcı-tanımlı işaretleyici optimizasyonunu sağlayacak st uygun ayarları. Bununla birlikte, kapalı zaman eğrileri karakterizasyonu CSS mümkün olsa da, şu anda ilgi duyulan tek bir kullanıcı tanımlı işaretleyici her bir örnek olarak araştırılmış ve bu edilebilir unutulmamalıdır sistem çok nedeniyle sert işleme alt uygulamaları ile ilgili olarak sınırlıdır Numunelerin.

CTC araştırma kullanılan eşsiz başucu-to-benchtop yaklaşım klinik ortamda içine bu yararlı testin hızlı giriş için izin verdi. Ancak, bu nadir hücrelerin temel biyoloji yetersiz bir anlayış ile sonuçlanmıştır. Bu nedenle kanser vivo fare modellerinde klinik öncesi in kapalı zaman eğrileri değerlendirilmesi için izin tahlillerin geliştirilmesi ve optimizasyon ihtiyaç vardır. Bu el yazması KTC ideal seri CTC toplama deneysel modeller için uygun fare kan 50 ul hacimlerde, değerlendirilmelidir için izin veren bir uyarlanmış CSS protokol tanımlamaktadır. Bu el yazması dBu protokolü kullanarak CTC numaralandırma otomatik ve manuel ayırma teknikleri arasında CTC yakalama verimlilik anlamlı farklılıklar, geleneksel CTC kiti ile birlikte CSS kullanılarak elde edilen sonuçlar karşılaştırılabilir olduğunu emonstrates. Buna ek olarak, bu tahlilde geliştirilmesi sırasında bir önceki literatürde ^25'te tarif edildiği gibi, kabul edilmiş, bu fare yassı epitel hücre kontaminasyon kapalı zaman eğrileri doğru tanımlanması daha zor ve bazen de imkansız hale getirebilir. Uygun kapalı zaman eğrileri olarak tahsis edilmektedir Dolayısıyla bu meseleyi bir kullanıcı-tanımlı HLA-Alexa Fluor 488 mücadele sadece insan hücreleri ^(- HLA ^- Alexa Fluor 488 ⁺ CK ⁺ DAPI ⁺ CD45) sağlamak için bu protokole eklendi. Bu yazıda kullanılan LNCaP hücre hattı HLAlow ve bu nedenle HLA-Alexa Fluor 488 farklı HLA bir ifade ile, hücre hatları için titre edilmesi gereklidir dikkat etmek önemlidir. Biz bir HLA-Alexa FLUO ekledi rağmenr bizim protokol 488 kapalı zaman eğrileri doğru tanımlanmasını sağlamak için, bu fare skuamöz epitel hücrelerinin büyük çoğunluğu morfolojisi tarafından kolayca tanımlanabilir ve hücre sayısı sınırlı olduğu dikkat çekicidir (0.33 ± 0.24 events/50 ul; n = 9). (Kalp delinerek) kan toplama zor olduğu ve tekrarlanan girişimler gerekli iken yüksek hücre sayıları (en fazla 11 events/50 ul) sadece gözlendi. Bu nedenle arzu edildiği takdirde, kapalı zaman eğrileri on-sistemi karakterizasyon Bu işaretleyiciyi atlanması ile gerçekleştirilebilir ki öneriyoruz. Buna ek olarak, burada tarif olmasa da, biz daha önce CSS ^27,28 kullanarak gösterildiği gibi KTC ve diğer yöntemleri kullanarak kapalı zaman eğrileri daha aşağısında karakterizasyonu toplama kolaylıkla elde edilebileceğini tahmin ediyoruz.

CSS etkili bir metastatik göğüs, prostat ve kolorektal kanser hastalarının ^4,10,29 kanında CTCS tespit etmek için klinik olarak kullanılmıştır, ancak birkaç li varmitations. Çeşitli metastatik kanser hastalarının% 35 olarak, KTC yaygın sistemik hastalık ³⁰ varlığına rağmen saptanamaz. Algılama eksikliği epitel-to-mezenkimal geçiş, kanser istila, metastaz arttırdığı bilinmektedir iyi belgelenmiş bir işlem ve genel saldırganlık ³¹ sonucu olarak önerilmiştir. Bu geçiş, EpCAM gibi epitel belirteçleri, önemli bir azalma ile ilişkilendirilmiştir ve mezenşimal karşılık gelen bir artış ³² işaretler. Çeşitli çalışmalar son zamanlarda kapalı zaman eğrileri, bu mezenkimal belirteçlerin bulunması kötü prognoz göstergesidir ve bu hücrelerin çoğu CSS ^24,33-38 kullanılarak saptanması için gerekli olacaktır epitel markerlerinin ifadesi yoksun olduğunu göstermiştir. Bu standart CSS tanımı en agresif kapalı zaman eğrileri bazıları eksik olabileceğini düşündürmektedir.

Açıklanan sınırlamalara rağmen, beklenen thBu yazıda anlatılan e protokoller vivo preklinik fare modelleri kullanarak yeni CTC teknolojiler, kullanıcı-tanımlı belirteçlerin optimizasyonu ve CTC biyoloji geliştirilmiş anlayış CSS, geliştirme kullanarak geliştirilmiş CTC analizi için önemli bir araç olacaktır. Birlikte ele alındığında, bu protokoller metastaz ve kapalı zaman eğrileri ilişkin klinik öncesi ve klinik araştırma ile ilgilenen bu platform kullanıcıları için yararlı bir kaynak sağlayacaktır.

Yazar (ALA) olan ana şirket Johnson & Johnson da bu yazıda kullanılan reaktifler ve aletleri üreten Janssen Teşhis LLC, sahibi Janssen Onkoloji tarafından sağlanan fon aldı.

Bu çalışma Kanser Araştırma Ontario Enstitüsü (# 08NOV230), Yenilik için Kanada Vakfı (# 13199), Prostat Kanseri Kanada, Janssen Onkoloji, Londra Bölgesel Kanser Programı, ve John ve Donna Bristol donör desteği ile hibe tarafından desteklenmiştir (ALA) Londra Sağlık Bilimleri Vakfı. LEL bir Frederick Banting ve Charles Best Kanada Yüksek Lisans Bursu Doktora Ödülü tarafından desteklenmektedir. ALA CIHR Yeni Araştırmacı Ödülü ve Araştırma ve Yenilik Ontario Bakanlığı'ndan Erken Araştırmacı Ödülü tarafından desteklenmektedir.