מתודולוגיית בדיקה זו, היא התקדמות משמעותית בידע של חסינות תאים נגד מלריה בשלב הדם, מסייעת לחשוף מטרות טיפוליות חדשות ולהאיץ את התקדמות החיסון נגד מלריה. הקמת פלסמודיום במבחנה שניתן להשתמש בו עבור דגימות אדם או בעלי חיים הוא בעל ערך להבנה טובה יותר של פתוגנזה מלריה. חסינות מגינה מפני מלריה אינה מובנת לחלוטין.
לפיתוח טיפולים חדשים, חיוני לחקור מנגנונים של חסינות תאים לשלב הטפילי של המלריה. מי שידגימו את ההליך יהיו אני, לונה דה לסרדה וכריסטופר גומז, סטודנט לתואר ראשון מהמעבדה של קרוליין. כדי להתחיל, לשאוף 100 מיקרוליטר של פתרון הפרין לתוך מזרק אחד מיליליטר עם מחט 26 מד.
הניחו את העכבר על צדו והכניסו בניצב את המחט ממש מתחת למרפק, דרך הצלעות ולתוך הלב. משוך את בוכנה מזרק לאט לסובב את המחט עד 0.5 עד מיליליטר אחד של דם מתקבל. נקה את הצד השמאלי של העכבר עם 70% אתנול.
עם מספריים כירורגיים, לעשות חתך בצד שמאל של העכבר, עובר דרך העור ואת הצפק. אתר את הטחול והסר אותו. מניחים את טחול העכבר בצלחת פטרי עם חמישה מיליליטר של מדיום שלם כדי לטהר את אוכלוסיית תאי ההשפעה הרצויה.
מניחים מסננת תאים של 100 מיקרומולרית מעל צינור חרוטי של 50 מיליליטר ומעבירים את הטחול שנכרת למסננת התא באמצעות מלקחיים אנטומיים. מועכים את הטחול דרך המסננת עם בוכנה מזרק. לשטוף את התאים דרך מסננת עם 10 מיליליטר של מדיה מלאה.
צנטריפוגה את התאים ב 300 גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, השליכו את הסופר-נטנט. השהה מחדש את גלולת התא בשני מיליליטר של חיץ ליזיס RBC קר ודגר על המתלה במשך חמש דקות על קרח.
שטפו את תרחיף התא עם 10 מיליליטר של מדיה מלאה של ארבע מעלות צלזיוס והסירו את כל קרישי התאים בין שטיפות לטחול מעכברים נגועים בפלסמודיום. צנטריפוגה את התאים ב 400 גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, השליכו את הסופר-נטנט.
כעת מקם עמוד LS או LD בשדה המגנטי והכן את העמוד על ידי שטיפתו בשלושה מיליליטר של מאגר MACS. לאחר מכן, החל את השעיית התא על העמודה. לאחר שטיפת העמוד שלוש פעמים עם שלושה מיליליטר של מאגר MACS, לאסוף זרימה דרך המכיל את התאים splenic.
קצרו 10 מיקרוליטר של התאים הטפלניים והוסיפו 10 מיקרוליטר של טריפאן כחול כדי לבדוק את כדאיות התא. הוסף את התאים להמוציטומטר. ספרו את הטחול בתמיסה כחולה טריפאן ובדקו את כדאיות התא.
צנטריפוגות את כל הטחול ומשליכות את הסופרנטנט. להשעות מחדש את גלולת התא ב 40 מיקרוליטר של מאגר MACS. הוסיפו 10 מיקרוליטר של קוקטייל נוגדני ביוטין לתאים, ערבבו היטב ודגרו במשך חמש דקות על קרח.
לאחר הדגירה של מיקרו-כדוריות האנטי-ביוטין על קרח במשך 10 דקות, הניחו את עמודת MACS LS בתמיכת השדה המגנטי והכינו את העמוד על ידי שטיפתו בשלושה מיליליטר של מאגר MACS. החל את השעיית התא על העמודה. שטפו את העמוד שלוש פעמים עם שלושה מיליליטר של מאגר MACS ואספו את הזרימה המכילה את כל התאים ציטוטוקסיים ללא תווית.
לאחר צנטריפוגה הדם שנאסף ב 350 פעמים G במשך חמש דקות, להשליך את הסרום להשעות מחדש את הדם במיליליטר אחד של RPMI ללא FBS. לאחר הצבת עמוד ה-LS בתמיכת השדה המגנטי, יש לשטוף בסל"ד ולהעביר את מתלה ה-RBC דרך העמודה. ברגע שהתאים עוברים דרך העמודה, צנטריפוגו את הזרימה, השליכו את הסופרנטנט והפעילו מחדש מיליליטר אחד מהזרימה לתוך הטור כדי לבודד עוד iRBCs.
לשטוף את העמוד פעמיים עם חמישה מיליליטר של RPMI. בצע שלבי שטיפה על ידי הוספת aliquots חיץ ברגע מאגר עמודה ריק. הוסף חמישה מיליליטר של סל"ד, הסר את העמודה, ולטהר את iRBCs לתוך צינור 15 מיליליטר חדש.
לדלל מיקרוליטר אחד של תמיסת CFSE 10 מילימולרית בסל"ד מיליליטר אחד ללא FBS. לאחר השעיה מחדש של RBCs ב 500 מיליליטר של RPMI ללא FBS, להוסיף 500 מיליליטר של CFSE מדולל לדגור במשך שמונה דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 14 מיליליטר של מדיום מלא צנטריפוגה התאים פעמיים.
עבור תרבית משותפת של לימפוציטים ציטוטוקסיים, צלחת את התאים בצלחת עגולה 96 באר. הוסף את הלימפוציטים המטוהרים ואת iRBCs המסומנים ב- CFSE ביחס הרצוי בין האפקט לתא היעד לנפח סופי של 200 מיליליטר והומוגניז. מכינים כל מצב בשילוש ודגרים על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
ה-iRBCs טוהרו מעכברים נגועים ב-P.yoelii באמצעות עמודות LS. הטיהור מודגש על ידי כתמי דם מדם שנאסף לפני ואחרי העשרת העמוד. אסטרטגיית gating הדרוש כדי להעריך את אחוז הליזה RBC מוצג כאן.
שער העצירה נקבע לאוכלוסיית ספירת החרוזים. אסטרטגיית הגאטינג מתחילה על ידי בחירת התאים הבודדים, למעט פסולת, בהתבסס על יחס שיא הפיזור הקדמי בין גובה לאזור, ולאחר מכן בחירת אוכלוסיית RBC ב- Ter119+ ו- CD8-לאחר מכן, בחר IBC חיים כ- CFSE חיובי גבוה. הנה הניתוח המיושם על דוגמה ניסיונית באמצעות אפקטים שונים ליחסי מטרה, המציג RBCs חיים לאחר התרבות המשותפת.
מוצג ייצוג גרפי של אחוז הליזה של RBC, המחושב על בסיס נוסחה זו. המשמעות בין הקבוצות שהשתמשו ב- CD8 ציטוטוקסי או CD8 נאיבי הוערכה על ידי ANOVA דו-כיוונית עם השוואות מרובות. השיטה הנוכחית חוקרת ליזה RBC על ידי מגע ישיר של התא עם תאי הרג, וניתן לתכנן אותה לחשוף את המנגנונים המעורבים באמצעות נוגדנים חוסמים לקולטנים או מולקולות ספציפיים.
בדיקה זו של הרג חוץ גופי מציגה אסטרטגיה חדשה להבהרת מנגנוני החסינות התאית למלריה בשלב הדם, אשר תסייע להתקדמות של טיפולים וחיסונים חדשים למלריה.
