אנו מכירים במימון התמיכה מהמועצה למחקר הבריאות והרפואה הלאומי (להעניק APP605524, 490,037 ו1,047,082), המועצה האוסטרלית למחקר (להעניק DP12010061), האסטרטגיה המחקר המשותפת התשתיות הלאומיות של אוסטרליה ושל קרן החינוך להשקעה מהמחלקה לחדשנות, תעשייה , מדע ומחקר. PML הוא נמען של הפרס שלאחר התואר הראשון באוסטרליה.

כל הנהלים בוצעו בהתאם למדיניות של אוניברסיטת Macquarie והותאמו למועצה הלאומית לבריאות והמחקר רפואי (NHMRC) הקוד אוסטרלי של תרגול. העבודה בוצעה תחת האתיקה הסכם לא ARA 2012/017 אושר והתקבל מוועדת האתיקה בבעלי חיים באוניברסיטת Macquarie. כל הניסויים בוצעו על עכברי SJL / J אלא אם צוין אחרת. 1. עכברים וזיהום ניסיון מלריה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברי בית תחת טמפרטורה מבוקרת (21 מעלות צלזיוס) עם מחזור אור-חושך 00:12 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר aliquot של פ cryopreserved DS Adami chabaudi עם 5% RBCs parasitized (pRBCs) ולהזריק 200 μl לתוך חלל intraperitoneal של C57BL / 6 עכבר תורם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג parasitemia עכבר תורם כל 1-2 ימים באמצעות cytometry זרימה כפי שתואר בסעיף 3 - 4 לפרוטוקול זה. ברגע שמגיעים לתורמים 5 - parasitemia 15%, לאסוף דם על ידי לנקב לב כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl">לשאוב מפתרון הפרין (300 U הפרין / מיליליטר בפתרון העכבר Ringer (MTR) (154 מ&quot;מ NaCl, 5.6 מ&quot;מ KCl, 1 מ&quot;מ MgCl 2, 2.2 מ&quot;מ CaCl 2, 20 מ&quot;מ HEPES 100 μl, 10 גלוקוז מ&quot;מ, 30 U / ml הפרין, pH 7.4, 0.22 מסנן מיקרומטר מעוקר)) לתוך מזרק 1 מיליליטר עם מחט 26 G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר על ידי שאיפה עם isofluorane 5%, המאשר את העומק הרצוי של הרדמה על ידי היעדר תגובת נסיגת דוושה ורפלקסים של קרנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את העכבר על צידו ומחט להכניס ניצב ממש מתחת למרפק, דרך הצלעות, ואל תוך הלב. משוך את בוכנת מזרק באיטיות ובלסובב מחט עד 0.5-1 מיליליטר של דם מתקבל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע המתת חסד הומנית נקע בצוואר רחם בהרדמה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את pRBCs לכל נפח של דם תורם בהנחת ספירה של 9 x 10 6 RBC / μl (דם כלומר, אם התורם היה ב 10% parasitemia כאשר הקריבו, דם יכיל 9 x 10 5pRBC / μl). לדלל דם parasitized בקרבס נאגר מלוח (126 מ&quot;מ NaCl, 2.5 מ&quot;מ KCl, 25 מ&quot;מ NaHCO 3, 1.2 מ&quot;מ לאא 2 PO 4, 1.2 מ&quot;מ MgCl 2, 2.5 מ&quot;מ CaCl 2, גלוקוז 0.2%, pH 7.2, 0.22 מסנן מיקרומטר מעוקר) כך שהריכוז הוא 1 x 10 4 pRBCs ל-200 μl ולהזריק 200 μl לתוך חלל intraperitoneal של עכברים הנדרשים לתיוג RBC וניסוי עירוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג parasitemia כל 1-2 ימים באמצעות cytometry זרימה כמתואר בסעיפים 3-4 לפרוטוקול זה. </li></ol> 2. תיוג של RBCs ועירוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף דם heparinized מעכברים ידי לנקב לב כמתואר בשלב 1.3, ומניח על קרח. לשמור על דם על 4 מעלות צלזיוס בכל העת. לאסוף כ -200 דם μl לכל עכבר להיות מוזרק. במידת צורך, לפצל דם לשתי דגימות ולטפל דגימה אחת כרצוי. הערה: בדרך זו, פלישה של samp טופלניתן להשוות le לשליטה, לדוגמא מטופל (ראה איור 1 עבור סכמטית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 2x של כל תווית RBC ניאון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 2 מ&quot;ג / מיליליטר פתרון מניות של Atto 633-N-Hydroxysuccinimide (Atto 633-NHS) בMTR, כך שהריכוז הוא 20 מיקרוגרם / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 25 מ&quot;ג / מיליליטר פתרון מניות של ביוטין-N-Hydroxysuccinimide (ביוטין-NHS) בMTR, כך שהריכוז הוא 250 מיקרוגרם / מיליליטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול דגימות דם לשני צינורות ולהוסיף נפח שווה של פתרון 633-NHS 2x Atto לצינור אחד, ונפח שווה של 2x יוטין-NHS לצינור האחר. מערבבים מייד. דגירה דם על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 עם ערבוב איטי קבוע, או לחלופין, לערבב מדגם כל 10 - 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 פעמים שכותרתו דם עם MTRC (MTR 0.5% אלבומין + סרום שור (BSA), 0.22 מסנן מיקרומטר מעוקר) כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף לפחות 2 כרכים של MTRC, צנטריפוגות ב 750 XG במשך 5 דקות, להסיר את supernatant, וresuspenד גלולה בלפחות 2 כרכים של MTRC. חזור על פי 2 יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף הסופיים, צנטריפוגות ב 750 XG דקות ו -5 לשלב דם pelleted בשילובים שונים (כלומר, שלא טופל Atto 633 / ביוטין טופל, ביוטין שלא טופל / טופל Atto 633). להוסיף MTR לעשות עד נפח של 200 μl לכל עכבר להיות מוזרקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק דם שכותרתו intravascularly לעכברים נגועים במלריה מכרסם או בקרות נגוע כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע עירוי של 2 - parasitemia 15% בשיאו של רְבִיַת שֶׁסַע הטפיל. הערה: זה קורה בערך באמצע הדרך דרך המחזור הכהה (כלומר, בין 12-2 בבוקר במחזור אור רגיל, או 12-2 בערב במחזור אור הפוך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים חמים באמצעות מנורת חום למשך 5-10 דקות כדי להגביר את זרימת דם, אך לנקוט באמצעי זהירות שלא לחמם יותר מדי את העכברים. מניחים עכברים במכשיר הרחקה וintravascularly להזריק 200 μl דם שכותרתו (כ 1 - 2 x 10 RB 9Cs) דרך וריד הזנב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף דגימות דם בנקודות זמן שונות לאחר ההזרקה כפי שתואר בסעיף 3. ניתן לכמת שיעורי פלישה פחות מ -10 דקות לאחר הזרקה, בהתאם לparasitemia של עכבר הנמען: הערה. </li></ol> 3. איסוף דגימות דם והכנה לcytometry הזרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 50 μl של פתרון מכתים לדגימה, בתוספת נוספת, ביום של הניסוי כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר aliquot של 6 מ&quot;מ JC-1 המאוחסן ב -20 ° C בsulfoxide דימתיל (DMSO). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 μl החם של MTRC לדגימה, בתוספת נוספת, עד 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד ברציפות vortexing MTRC מראש חימם, להוסיף JC-1, כך שהריכוז הסופי הוא 12 מיקרומטר. הדבר נעשה כדי להפחית את היווצרות JC-1 אגרגטים; אם מצרפים אין טופס, לעשות צינור לא צנטריפוגות כמו זה יהיה למנוע הכתמה. הערה: כמות קטנה של צבירה לא תשפיע על תוצאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף אנטיCD45 APC eFluor 780 ואנטי-CD71 PerCP eFluor 710, כך שהריכוז הסופי הוא מיקרוגרם / מיליליטר 1. אם ביצוע ניסוי RBC שכותרתו, להוסיף streptavidin PE-Cy7 כך שהריכוז הסופי הוא מיקרוגרם / מיליליטר 1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע דימום זנב על ידי קטיעה של קצה הזנב או קריעה של כלי הדם בתוך הזנב. מניחים ירידה של דם זנב על שקופית לשקול סירה או זכוכית קטנה. לאחר איסוף דם, לוודא שדימום הפסק. פיפטה 3 μl דם זנב לתוך 50 μl של פתרון מכתים מראש לחמם 37 ° C ו דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר aliquot של 4 מ&quot;מ Hoechst 33342 מאוחסן ב -20 ° C במים מזוקקים (אם באמצעות לייזר 355 ננומטר) או 2 מ&quot;מ Hoechst 34580 מאוחסן ב -20 ° C במים מזוקקים (אם באמצעות לייזר 405 ננומטר). הכן 500 μl לדגימה, בתוספת נוספת, של פתרון 4 מיקרומטר או 2 מיקרומטר של Hoechst בMTRC, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של 4 מיקרומטר Hoechst33342 או 2 מיקרומטר Hoechst 34580 לדגימות לדגור על RT במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגה ב 750 XG במשך 3 דקות על 4 מעלות צלזיוס, supernatant קלפים שנזרקו, להוסיף 700 μl MTRC ולנתח ידי cytometry זרימה. </li></ol> 4. cytometry הזרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח דגימות באמצעות לייזר 355/488/633 ננומטר או 405/488/633 מכשיר לייזר ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות מסנן דרך מסננת תא 35 מיקרומטר מייד לפני הניתוח. יש לשטוף את מסננת תא במים מזוקקים בין דגימות ושימוש חוזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקליט מספיק אירועים, כך שהאוכלוסייה הקטנה ביותר מכילה לפחות 500 אירועים (בדרך כלל 1,000,000 - 10,000,000 אירועים הכולל לדוגמה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Excite Hoechst 33342 באמצעות לייזר 355 nm ולזהות אירועים דרך מסנן 460/50. Excite Hoechst 34580 באמצעות לייזר 405 nm ולזהות אירועים דרך מסנן 460/50. Excite JC-1, אנטי-CD71 PerCP eFluor 710 וstreptavidin PE-Cy7 באמצעות לייזר 488 ננומטר ולזהות אירועים דרך 530/40, 692/40, ו750LP לסנן בהתאמהly. Excite Atto 633 ואנטי-CD45 APC eFluor 780 באמצעות לייזר 633 ננומטר ולזהות אירועים דרך מסנן 670/30 או 750LP בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע ניתוח ופיצוי באמצעות זרימה מתאימה cytometry תוכנת ניתוח כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר תאים שלמים ולא לכלול רעש, פסולת, וטסיות דם המבוססת על FSC מאפיינים / SSC (איור 2 א). בחר תאים בודדים המבוססים על או רוחב דופק הדק (איור 2) או על ידי שימוש באזור שיא FSC יחס גובה (איור 2 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר RBCs הבוגר, ולא לכלול אבות RBC וכדוריות דם לבנות, המבוסס על הקרינה שלילית בPerCP eFluor 710 וAPC eFluor 780 הערוצים (איור 2 ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ביצוע ניסוי RBC המסומן, בחר כל אוכלוסייה של RBCs שכותרתו מבוסס על PE-Cy7 וAtto 633 הקרינה ולנתח בנפרד (איור 3 א) אלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר pRBCs המבוסס על הקרינה חיובית עבור שני JC-1 וHoechst ( <strאונג&gt; איור 2E-H). </li></ol></li></ol> 5. חישובים וסטטיסטיקות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב parasitemia על ידי חלוקת מספר pRBCs במספר הכולל של תאי דם אדומים (כלומר, מספר האירועים בQ2 שער מחולק במספר האירועים בG4 שער). בעת ביצוע parasitemia assay הפלישה של שתי האוכלוסיות שכותרתו יכולה להיות מחושב על ידי חלוקת מספר pRBCs שכותרתו במספר RBCs שכותרתו באוכלוסייה ש( כלומר, מספר האירועים שנמצאים בשני L1 השערים וQ2, מחולק במספר האירועים בשער L1). הערה: parasitemia תווית משתנה במידה ניכרת בהתאם לגורמים כגון parasitemia ומספר merozoites במחזור אנדוגני. מסיבה זו, כדאי לדווח על יחס parasitemia, המחושב כparasitemia של המטופלים האוכלוסייה שהכותרת מחולקת בparasitemia של אוכלוסיית השליטה שכותרתו בכל עכבר בודד. כדי לתקן את השפעות צבע אפשריות, דו&quot;ח תוצאותזה יחס parasitemia ממוצע על פני שני שילובי הצבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע מובהקות סטטיסטיות של יחסים באמצעות דגימה אחת -test t עם 1 כממוצע היפותטי. </li></ol>

<ol>
	<li>Jacobberger, J. W., Horan, P. K., Hare, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+malaria+parasite-infected+blood+by+flow+cytometry.">Analysis of malaria parasite-infected blood by flow cytometry.</a> Cytometry. 4 (3), 228-237 (1983).</li><li>Bianco, A. E., Battye, F. L., Brown, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum:+rapid+quantification+of+parasitemia+in+fixed+malaria+cultures+by+flow+cytometry.">Plasmodium falciparum: rapid quantification of parasitemia in fixed malaria cultures by flow cytometry.</a> Exp Parasitol. 62 (2), 275-282 (1986).</li><li>Makler, M. T., Lee, L. G., Recktenwald, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiazole+orange:+a+new+dye+for+Plasmodium+species+analysis.">Thiazole orange: a new dye for Plasmodium species analysis.</a> Cytometry. 8 (6), 568-570 (1987).</li><li>Heyde, H. C., Elloso, M. M., van de Waa, J., Schell, K., Weidanz, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+hydroethidine+and+flow+cytometry+to+assess+the+effects+of+leukocytes+on+the+malarial+parasite+Plasmodium+falciparum.">Use of hydroethidine and flow cytometry to assess the effects of leukocytes on the malarial parasite Plasmodium falciparum.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 2 (4), 417-425 (1995).</li><li>Pattanapanyasat, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+malaria+parasites+in+two+different+red+blood+cell+populations+using+biotin+and+flow+cytometry.">Culture of malaria parasites in two different red blood cell populations using biotin and flow cytometry.</a> Cytometry. 25 (3), 287-294 (1996).</li><li>Grimberg, B. T., Erickson, J. J., Sramkoski, R. M., Jacobberger, J. W., Zimmerman, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Plasmodium+falciparum+growth+and+development+by+UV+flow+cytometry+using+an+optimized+Hoechst-thiazole+orange+staining+strategy.">Monitoring Plasmodium falciparum growth and development by UV flow cytometry using an optimized Hoechst-thiazole orange staining strategy.</a> Cytometry A. 73 (6), 546-554 (2008).</li><li>Theron, M., Hesketh, R. L., Subramanian, S., Rayner, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adaptable+two-color+flow+cytometric+assay+to+quantitate+the+invasion+of+erythrocytes+by+Plasmodium+falciparum+parasites.">An adaptable two-color flow cytometric assay to quantitate the invasion of erythrocytes by Plasmodium falciparum parasites.</a> Cytometry A. 77 (11), 1067-1074 (2010).</li><li>Bei, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometry-based+assay+for+measuring+invasion+of+red+blood+cells+by+Plasmodium+falciparum.">A flow cytometry-based assay for measuring invasion of red blood cells by Plasmodium falciparum.</a> Am J Hematol. 85 (4), 234-237 (2010).</li><li>Clark, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RBC+barcoding+allows+for+the+study+of+erythrocyte+population+dynamics+and+P.+falciparum+merozoite+invasion.">RBC barcoding allows for the study of erythrocyte population dynamics and P. falciparum merozoite invasion.</a> PLoS One. 9 (7), e101041 (2014).</li><li>Malleret, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+robust+tri-color+flow+cytometry+assay+for+monitoring+malaria+parasite+development.">A rapid and robust tri-color flow cytometry assay for monitoring malaria parasite development.</a> Sci Rep. 1 (118), (2011).</li><li>Jimenez-Diaz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+Plasmodium-infected+erythrocytes+in+murine+models+of+malaria+by+flow+cytometry+using+bidimensional+assessment+of+SYTO-16+fluorescence.">Quantitative measurement of Plasmodium-infected erythrocytes in murine models of malaria by flow cytometry using bidimensional assessment of SYTO-16 fluorescence.</a> Cytometry A. 75 (3), 225-235 (2009).</li><li>Jimenez-Diaz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+detection+specificity+of+Plasmodium-infected+murine+erythrocytes+by+flow+cytometry+using+autofluorescence+and+YOYO-1.">Improvement of detection specificity of Plasmodium-infected murine erythrocytes by flow cytometry using autofluorescence and YOYO-1.</a> Cytometry A. 67 (1), 27-36 (2005).</li><li>Jun, G., Lee, J. S., Jung, Y. J., Park, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+determination+of+Plasmodium+parasitemia+by+flow+cytometry+and+microscopy.">Quantitative determination of Plasmodium parasitemia by flow cytometry and microscopy.</a> J Korean Med Sci. 27 (10), 1137-1142 (2012).</li><li>Lelliott, P. M., Lampkin, S., McMorran, B. J., Foote, S. J., Burgio, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometric+assay+to+quantify+invasion+of+red+blood+cells+by+rodent+Plasmodium+parasites+in+vivo.">A flow cytometric assay to quantify invasion of red blood cells by rodent Plasmodium parasites in vivo.</a> Malar J. 13 (1), 100 (2014).</li><li>Morohashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+abnormalities+in+the+spleen+of+an+mFtz-F1+gene-disrupted+mouse.">Structural and functional abnormalities in the spleen of an mFtz-F1 gene-disrupted mouse.</a> Blood. 93 (5), 1586-1594 (1999).</li><li>Shet, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+functional+platelet+abnormalities+in+Berkeley+sickle+cell+mice.">Morphological and functional platelet abnormalities in Berkeley sickle cell mice.</a> Blood Cells Mol Dis. 41 (1), 109-118 (2008).</li><li>Duraisingh, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+variation+of+Plasmodium+falciparum+merozoite+proteins+directs+receptor+targeting+for+invasion+of+human+erythrocytes.">Phenotypic variation of Plasmodium falciparum merozoite proteins directs receptor targeting for invasion of human erythrocytes.</a> EMBO J. 22 (5), 1047-1057 (2003).</li><li>Okoyeh, J. N., Pillai, C. R., Chitnis, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+field+isolates+commonly+use+erythrocyte+invasion+pathways+that+are+independent+of+sialic+acid+residues+of+glycophorin+A.">Plasmodium falciparum field isolates commonly use erythrocyte invasion pathways that are independent of sialic acid residues of glycophorin A.</a> Infect Immun. 67 (11), 5784-5791 (1999).</li><li>Dolan, S. A., Miller, L. H., Wellems, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+switching+mechanism+in+the+invasion+of+erythrocytes+by+Plasmodium+falciparum.">Evidence for a switching mechanism in the invasion of erythrocytes by Plasmodium falciparum.</a> J Clin Invest. 86 (2), 618-624 (1990).</li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

יש לנו תיארתי שיטה למדידה של שתי פלישת parasitemia וmerozoite של דגימות in vivo. במונחים של מדידת parasitemia, שיטה זו מציעה יתרון על פני שיטות קודמות 10-13 שבHJ-RBCs ניתן להבחין בין pRBCs, ובכך להפחית את מספר האירועים חיוביים כוזבים. בעוד HJ-RBCs הוא בדרך כלל נדיר בבני אדם, כמה מחקרים מדווחים על רמות גבוהות בעכברים 15,16 עושים ההבחנה בין תאים אלה וpRBCs החשובים למדידה מדויקת של parasitemia מכרסמים. באמצעות שיטה זו המגבלה של זיהוי לparasitemia הוא כ 0.007% 14, למרות שזה אפשרי כדי להפחית נמוך כמו זה 0.0005% בתנאים המתאימים. יש לציין, מגבלה זו מוכתבת על ידי הניקיון של cytometer את הזרימה משמש והיכולת להשיג מספר גדול של אירועים בזמן סביר. הבעיה הנפוצה ביותר הקשורים לשימוש בטכניקה זו היא שנינות צביעה מספיקהh JC-1. הקרינה של JC-1 תלויה בפוטנציאל קרום המיטוכונדריה של הטפיל, וטפילים חייבים להיות בריאים על מנת לקבל מכתים אופטימלי. אחסון ממושך של טפילים או קיבעון לכן יש להימנע לפני הצביעה. גם טיפול צריך להיות למימוש בעת ניתוח טפילים אשר היו כפוף לטיפול תרופתי, כפי שזה עשוי להשפיע גם על המידה של מכתים עם JC-1. במקרים אלה עשויים להיות מועילים כדי לנתח parasitemia המבוסס על הקרינה Hoechst לבד, בהשוואה לparasitemia עם התוספת של הצבע JC-1. ואכן, זו עשויה לספק מידה של ספירה טפילה, כמו גם אינדיקציה כוללת של בריאות טפיל. לבסוף, הצבע JC-1 יכול להעביר הקרינה שלה משיא ב529 nm לשיא ב590 ננומטר על ידי יצירת J-אגרגטים. ההיווצרות של אגרגטים אלה תלויה בריכוז צבע, אשר בתורו תלוי בפוטנציאל קרום המיטוכונדריה של התא. אובדן potenti קרום המיטוכונדריהאל גורם לשינוי בקרינה לכיוון 529 ננומטר, אשר עשוי להצביע על תאים אפופטוטיים. בpRBCs הניסיון שלנו מוכתם בJC-1 תמיד הציג דפוס הקרינה דומה שהיה בעוצמה שווה בערך בשני 530/40 ננומטר הערוץ והערוץ 585/42 ננומטר. עם זאת, בחלק מהמחקרים, כדוגמת אלה המעסיקים התערבויות סמים, זה עשוי להיות כדאי לעקוב אחר שינויים ביחס בין הקרינה 530/40 ננומטר הערוץ וערוץ 585/42 ננומטר לכל אינדיקציות של אובדן פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה. כמו כן, חשוב לציין כי JC-1 הוא רגיש במיוחד לשפלה וצריכה להיות מוכן טרי מaliquot קפוא כפי שתואר, בזמן שיש להימנע מחזורי הקפאה / הפשרה. לאחר צביעה, הקרינה JC-1 היא יציבה יחסית עם ירידה קטנה או לא בקרינה, לפחות במשך כמה שעות. עבור assay פלישת in vivo, הגורמים הקריטיים ביותר הם שני עקביות ביחסי ציבור תיוג RBCocess וזמן הזרקה של דם שכותרתו. לתיוג RBC, יש להשתמש בכמות המינימלית של צבע כדי למנוע כל הפרעה ליכולת של הטפיל לפלוש RBC, שהועלה כאפשרות בעת שימוש בתוויות משטח 7. בתנאי התיוג המתוארים כאן פלישה לא עכבה 14, אולם תשומת לב קפדן צריכה להינתן לשמירה על ריכוזי תווית עקביים, וצבעים צריכים להיות מופעל, כדי למנוע כל אי דיוקים בשל עיכוב פלישה על ידי תווית RBC. כטפילים לעבור מחזור פלישה מסונכרן, חשוב שתאי שכותרתו מוזרקים בזמן הנכון בכל מחזור החיים של טפילים. זה צריך להיעשות על מנת למקסם את מספר אירועי פלישה, ולכן הדיוק של assay. מניסיוננו השיא של פלישה מתרחש בערך באמצע הדרך דרך המחזור הכהה, מה שהופך את חדר מחזור אור הפוך יתרון עבור assay זה. Tוו assay פלישת תווית מציע שיטה מדויקת כדי לקבוע את יעילות פלישת merozoite לסוגים שונים של RBC in vivo. גישה זו לכן מאפשרת השוואה בין RBCs טופל, כלומר, trypsinized, וRBCs שליטה. לחלופין, RBCs מעכברים מהונדסים גנטי יכול להיות בהשוואה לאלו של עכברי שליטה, או RBCs של פרמטרים פיסיולוגיים שונים או גיל שונה ניתן להשוות. בעוד assay דומה תואר למדידת פלישה במבחנה 9, assay כאן מספק פוטנציאל לדין וחשבון על השפעות הנוכחיות רק in vivo, כוללים ההשפעה של המערכת החיסונית, אשר יכול לשנות את מנגנוני פלישה טפילה 17-19. לבסוף, assay זה גם יש את הפוטנציאל לספק תובנות פתולוגיות כגון אישור חיסוני של pRBCs, וצמיחה טפילה, אם pRBCs בתוך האוכלוסיות שכותרתו מנוטר על פני תקופה ממושכת. Overall, פרוטוקול מפורט למדידה מדויקת של parasitemia בin vivo דגימות מתואר, שבו יש יתרון על פני מבחני קודמים בכך שHJ-RBCs ניתן להבחין בין pRBCs. יתר על כן, assay מתואר לכימות של יעילות פלישה לסוגים שונים RBC in vivo.

The clinical symptoms associated with malaria occur during the Plasmodium parasite&#8217;s asexual replicative cycle within red blood cells (RBCs). Merozoites, released during the liver stage of infection, quickly attach to and invade RBCs. After gaining entry into the cell, the parasite grows and matures, eventually undergoing schizogony, splitting open the cell, and releasing a cluster of newly formed merozoites which go on to repeat this cycle. As such, an assessment of malaria infection often involves monitoring both parasitemia, which is the percentage of RBCs appropriated by one or more parasites, and the rate of merozoite invasion into uninfected RBCs. 
Flow cytometry is a powerful tool which can be used to record the properties of vast numbers of cells in a short period of time. This technique has clear applicability for the measurement of malaria parasitemia and invasion, and offers several advantages over traditional microscopy techniques. These include the accurate measurement of very low parasitemia, which would be prohibitively time consuming by microscopy, the unbiased nature of the measurement, and the ability to measure multiple cell parameters simultaneously. Flow cytometry is widely used to determine both parasitemia and merozoite invasion in in vitro culture1-9, however, techniques for measuring these parameters in vivo are less well developed, and can be complicated by the presence of additional cell types which interfere with analysis. No assays have been described for measurement of in vivo invasion, and while some assays exist for the analysis of in vivo parasitemia, these lack the ability to distinguish between parasitized RBCs (pRBCs) and RBCs containing Howell-Jolly bodies (HJ-RBCs)10-13. The later issue is particularly important as in mice HJ-RBCs may account for up to 0.9% of mature RBCs14-16, thereby preventing the accurate measurement of low parasitemia. 
We have previously demonstrated an approach for the measurement of parasitemia and merozoite invasion in a rodent model of malaria infection14. Here, we provide a more detailed protocol and accompanying video. This approach builds on previous methodologies and allows for the accurate identification of parasitized RBCs, as distinct from leukocytes, RBC progenitors, and HJ-RBCs. Additionally, this assay allows the simultaneous measurement of merozoite invasion into two labeled RBC populations, a treated, or target, population, and a control population, thereby providing a robust platform for the assessment of invasion into different cell types.

<table><tbody><tr><td>bisBenzimide H 33342 trihydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>Hoechst 33342. Store a 4 mM stock solution at -20 &amp;deg;C in distilled water</td></tr><tr><td>Hoechst 34580</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63493</td><td>Store a 2 mM stock solution at -20 &amp;deg;C in distilled water</td></tr><tr><td>JC-1 Dye</td><td>Life Technologies</td><td>T-3168</td><td>Store small aliquots of 6 mM stock solution at -20 &amp;deg;C in DMSO</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD45 APC-eFluor 780</td><td>eBioscience</td><td>47-0451-80</td><td>Clone 30-F11</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD71 PerCP-eFluor 710</td><td>eBioscience</td><td>46-0711-80</td><td>Clone R17217</td></tr><tr><td>Atto 633 NHS ester</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1464</td><td>Atto 633-NHS. Store a 2 mg/ml stock solution at -20 &amp;deg;C in DMF</td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21335</td><td>Biotin-NHS. Store a 25 mg/ml stock solution at -20 &amp;deg;C in DMF</td></tr><tr><td>Streptavidin PE-Cyanine7</td><td>eBioscience</td><td>25-4317-82</td><td>Streptavidin PE-Cy7</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H478</td><td></td></tr><tr><td>35 &amp;micro;M filter cap tubes</td><td>Becton Dickinson</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer: BD LSRFortessa</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer: BD FACSAria II</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer: BD Influx</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer: CyAn ADP Analyzer</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo assessment of rodent plasmodium parasitemia and merozoite invasion by flow cytometry

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an exponential increase in the proportion of malaria infected RBCs, known as parasitemia. We describe a flow cytometry based protocol which utilizes a combination of the DNA dye Hoechst, and the mitochondrial membrane potential dye, JC-1, to identify RBCs which contain parasites and therefore the parasitemia, of in vivo blood samples from Plasmodium chabaudi adami DS infected mice. Using this approach, in combination with fluorescently conjugated antibodies, parasitized RBCs can be distinguished from leukocytes, RBC progenitors, and RBCs containing Howell-Jolly bodies (HJ-RBCs), with a limit of detection of 0.007% parasitemia. Additionally, we outline a method for the comparative assessment of merozoite invasion into two different RBC populations. In this assay RBCs, labeled with two distinct compounds identifiable by flow cytometry, are transfused into infected mice. The relative rate of invasion into the two populations can then be assessed by flow cytometry based on the proportion of parasitized RBCs in each population over time. This combined approach allows the accurate measurement of both parasitemia and merozoite invasion in an in vivo model of malaria infection.

מדידה של parasitemia. למדידה parasitemia, צריכים להיות ראשון שנבחרו תאי דם, ורעש, פסולת וטסיות דם נשללו, המבוססים על מאפייני FSC / SSC (איור 2 א). בהתאם לcytometer משמש, אז צריכים להיות נבחרו תאים בודדים המבוססים על או רוחב דופק הדק (איור 2), או גובה שיא FSC ליחס שטח (איור 2 ג). נותר אירועים צריכים להיות מורכבים של לויקוציטים, מוכתם חיובי לAPC eFluor 780, אבות RBC (כולל reticulocytes), מוכתמים חיובי לPerCP eFluor 710, וRBCs הבוגר, שלילי עבור שני כתמים אלה (איור 2 ד). לאחר בחירת אוכלוסיית RBC הבוגרת, אירועים צריכים להפריד לארבע אוכלוסיות כאשר הקרינה JC-1 זממה נגד Hoechst 33342 (איור 2E, F) או Hoechst 34580 הקרינה (איור 2G, ח). האוכלוסייה החיובית הכפולה מייצגת RBCs parasitized, בעוד rאוכלוסיות emaining הם או RBCs נגוע (שלילי כפול), HJ-RBCs (Hoechst חיובי, שלילי JC-1), או תאים לא ידועים (JC-1 חיובי, Hoechst שלילי). יש לציין, הקרינה JC-1 יכולה לעבור ממקסימום ב529 nm לשיא פליטה רחב ב590 ננומטר, בהתאם לפוטנציאל קרום המיטוכונדריה של התא. ללא קשר לשינוי זה JC-1 יהיה לזרוח בעוצמה ב530 / 40 ננומטר הערוץ, מה שהופך את הערוץ הזה מתאים ביותר לניתוח. עם זאת, במקרים מסוימים זה עשוי להיות כדאי בנוסף שיא הקרינה ב585 / 42 ננומטר הערוץ, אשר עשוי לספק אינדיקציה לפוטנציאל קרום המיטוכונדריה של תאים. בדגימות נגוע פחות מ 0.007% מאירועים צריכים להיות חיוביים כפול (איור 2E, G). תוצאה זו תהיה תלויה בניקיון של cytometer את הזרימה ועלולה להשתנות במידה ניכרת, ניקוי מקיף לפני הניתוח עשוי לשפר את התוצאות. HJ-RBCs הדין וחשבון על 0.3-0.9% מRBCs הבוגר, מה שהופך את התוספת של הצבע JC-1 קריטית לaccמדידת urate של parasitemia הנמוך. הערכה של פלישת merozoite. לאחר שהזריק לעכברים שכותרתו RBCs נגועים ניתן לקבוע שיעורי הפלישה ביחס לשתי האוכלוסיות שכותרתו. יש לנקוט דגימות דם ומוכנות כפי שתוארו למדידת parasitemia עם התוספת של streptavidin PE Cy7. הזמן שבו המדגם נלקח תלוי בתנאי הניסוי והתוצאות רצויות של הניתוח. באופן כללי, נקודת זמן מוקדמת יותר תהיה הטוב ביותר משקפת פנוטיפ פלישה, למרות שזה עשוי להיות מועיל כדי לאסוף נקודות זמן מרובות כדי להגדיל את הדיוק. לניתוח הזרימה cytometry נתונים, יש לבחור RBCs הבוגר כמו באיור 2. מהתאים אלה, ניתן לזהות Atto 633 וRBCs ביוטין שכותרתו מבוססים על הקרינה בערוצי 670/30 ו750LP בהתאמה (איור 3 א). מכאן ואילך שלוש אוכלוסיות RBC (633 Atto, ביוטין, וללא תווית)יש לנתח בנפרד. בכל אחד מparasitemia האוכלוסיות אלה יכול להיקבע על בסיס צביעה עם Hoechst וJC-1 (איור 3-D). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52736/52736fig1.jpg" /> איור 1. סכמטי של assay הפלישה טפילה in vivo. דוגמא לאופן שassay זה יכול לשמש כדי לקבוע שיעורי פלישה יחסי בRBCs יטופלו בהתאם לשאלה הביולוגית של המשתמש מוצג. דם שנאסף מעכברים נגוע מחולק לשני צינורות. מטופל צינור אחד כרצוי תוך המדגם האחר אינה מטופלת כראוי (). צינורות מתחלקים שוב עם אחד שכותרתו עם NHS-ביוטין והשני עם NHS-Atto 633 (ב). דוגמאות משולבות לאחר מכן בשני שילובים; ביוטין שכותרתו RBCs טופל בAtto 633 RBCs שלא טופל שכותרת וכותרתו טופל Atto 633 RBCs עם יוRBCs פח שכותרתו שלא טופל (C). שני שילובים הללו מוזרקים בנפרד לשני המון עכברים נגועים ברְבִיַת שֶׁסַע ב2-15 parasitemia% (D). סכום כולל של 6 עכברי נמען מומלץ כדי להשיג מובהקות סטטיסטיות בתוצאה, אם כי פחות או יותר ניתן להשתמש במידת הצורך. מעובד מתוך Lelliott et al. 14, שפורסם במקור על ידי ביומד המרכזי. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52736/52736fig2highres.jpg" width="430" /> איור 2. מדידה של parasitemia ידי cytometry זרימה. רסיסים, רעש, וטסיות דם יוסרו מניתוח המבוססים על מאפייני FSC / SSC (). לאחר מכן תאים בודדים שנבחרו מהתאים הנותרים המבוססים על או רוחב דופק הדק (B), או שיא FSC ליחס שטח (C). סוגי תאים אז יכולים להיות מכובד על בסיס צביעה חיובית עם eFluor CD45 APC780 (לויקוציטים), CD71 PerCP eFluor 710 (אבות RBC), או מכתים שלילי (להבשיל RBCs) (D). לאחר בחירת RBCs הבוגר, תאים הם או:, JC-1 שלילי Hoechst וJC-1 (RBCs parasitized) החיובי Hoechst חיובי ושלילי JC-1 (RBCs מכיל גופי Howell Jolly), חיובי ושלילי Hoechst (תאים לא ידועים), או כפול (RBCs נגוע). נגוע וP. chabaudi דגימות נגועות מוכתמות Hoechst 33342 (E, F), או Hoechst 34580 (G, H), מוצגים. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52736/52736fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52736/52736fig3highres.jpg" width="430" /> איור 3. הערכה של פלישת merozoite לשתי אוכלוסיות RBC שכותרת in vivo. מגרשים של RBCs הבוגר, מגודרכמו באיור 2. ניתן לבחור שתי אוכלוסיות RBC שכותרתו מבוססת על התווית שלהם (). Atto 633 תאים שכותרתו לזרוח בערוץ 670/30 (L1), תאי ביוטין שכותרתו להיקשר לstreptavidin ולזרוח בערוץ PE-Cy7 (L3), ותאים ללא תווית שליליים לכתמים אלה (L4). בכל אחד מאוכלוסיות אלה ניתן לזהות RBCs parasitized מבוסס על Hoechst וJC-1 מכתים חיובי (Q2) (BD). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52736/52736fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry at JoVE.com

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

פולש טפיל המלריה והמשכפל בתוך תאי דם אדומים. ההערכה מדויקת של פלישת merozoite וparasitemia לכן חיונית בהערכה במהלך הידבקות במלריה. כאן אנו מתארים זרימה cytometry פרוטוקול מבוסס למדידת הפרמטרים הללו במודל עכבר של מלריה.

בVivo ההערכה של מכרסמים Plasmodium Parasitemia וMerozoite פלישה על ידי cytometry הזרימה

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an ...

in-vivo-assessment-rodent-plasmodium-parasitemia-merozoite-invasion

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

9.9K Views.  Macquarie University.  פולש טפיל המלריה והמשכפל בתוך תאי דם אדומים. ההערכה מדויקת של פלישת merozoite וparasitemia לכן חיונית בהערכה במהלך הידבקות במלריה. כאן אנו מתארים זרימה cytometry פרוטוקול מבוסס למדידת הפרמטרים הללו במודל עכבר של מלריה. 

Video: In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to successful identification of genes or loci underlying various traits in malaria parasites of rodents1-3 and humans4-6. The malaria parasite Plasmodium yoelii is one of many malaria species isolated from wild African rodents and has been adapted to grow in laboratories. This species reproduces many of the biologic characteristics of the human malaria parasites; genetic markers such as microsatellite and amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers have also been developed for the parasite7-9. Thus, genetic studies in rodent malaria parasites can be performed to complement research on Plasmodium falciparum. Here, we demonstrate the techniques for producing a genetic cross in P. yoelii that were first pioneered by Drs. David Walliker, Richard Carter, and colleagues at the University of Edinburgh10.

Genetic crosses in P. yoelii and other rodent malaria parasites are conducted by infecting mice Mus musculus with an inoculum containing gametocytes of two genetically distinct clones that differ in phenotypes of interest and by allowing mosquitoes to feed on the infected mice 4 days after infection. The presence of male and female gametocytes in the mouse blood is microscopically confirmed before feeding. Within 48 hrs after feeding, in the midgut of the mosquito, the haploid gametocytes differentiate into male and female gametes, fertilize, and form a diploid zygote (Fig. 1). During development of a zygote into an ookinete, meiosis appears to occur11. If the zygote is derived through cross-fertilization between gametes of the two genetically distinct parasites, genetic exchanges (chromosomal reassortment and cross-overs between the non-sister chromatids of a pair of homologous chromosomes; Fig. 2) may occur, resulting in recombination of genetic material at homologous loci. Each zygote undergoes two successive nuclear divisions, leading to four haploid nuclei. An ookinete further develops into an oocyst. Once the oocyst matures, thousands of sporozoites (the progeny of the cross) are formed and released into mosquito hemoceal. Sporozoites are harvested from the salivary glands and injected into a new murine host, where pre-erythrocytic and erythrocytic stage development takes place. Erythrocytic forms are cloned and classified with regard to the characters distinguishing the parental lines prior to genetic linkage mapping. Control infections of individual parental clones are performed in the same way as the production of a genetic cross.

Genetic crosses of rodent malaria parasites are performed by feeding two genetically distinct parasites to mosquitoes. Recombinant progeny are cloned from mouse blood after allowing mosquitoes to bite infected mice. This video shows how to produce genetic crosses of Plasmodium yoelii and is applicable to other rodent malaria parasites.

פרוטוקול עבור הפקה של הצלב גנטית של טפילי מלריה מכרסמים

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, inflammatory and metabolic conditions, using in vivo fluorescence microscopy. A closed cranial window is placed over the left parieto-occipital cortex of the mice. Local microcirculation is recorded in real time through the window using epi and fluorescence illumination, and measurements of vessels diameters and red blood cell (RBC) velocities are performed. RBC velocity is measured using real-time cross-correlation and/or fluorescent-labeled erythrocytes. Leukocyte and platelet adherence to pial vessels and assessment of perfusion and vascular leakage are made with the help of fluorescence-labeled markers such as Albumin-FITC and anti-CD45-TxR antibodies. Microcirculation can be repeatedly video-recorded over several days. We used for the first time the close window brain intravital microscopy to study the pial microcirculation to follow dynamic changes during the course of Plasmodium berghei ANKA infection in mice and show that expression of CM is associated with microcirculatory dysfunctions characterized by vasoconstriction, profound decrease in blood flow and eventually vascular collapse.

Intravital microscopy to follow temporal and spatial hemodynamic and inflammatory events in the pial microcirculation.

מיקרוסקופית Intravital של microcirculation המוח עכבר באמצעות חלון גולגולתי סגור

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

Neuroscience

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

מיקרוסקופית Intravital של הטחול: ניתוח כמותי של ניידות טפיל ואת זרימת הדם

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

בידוד ואנליזה של Leukocytes המוחי מוחרם מ<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; עכברי אנקה נגוע

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of free merozoites from the blood by phagocytic cells. However assessing the functional efficacy of merozoite specific opsonizing antibodies is challenging due to the short half-life of merozoites and the variability of primary phagocytic cells. Described in detail herein is a method for generating viable merozoites using the E64 protease inhibitor, and an assay of merozoite opsonin-dependent phagocytosis using the pro-monocytic cell line THP-1. E64 prevents schizont rupture while allowing the development of merozoites which are released by filtration of treated schizonts. &#160;Ethidium bromide labelled merozoites are opsonized with human plasma samples and added to THP-1 cells. Phagocytosis is assessed by a standardized high throughput protocol. Viable merozoites are a valuable resource for assessing numerous aspects of P. falciparum biology, including assessment of immune function. Antibody levels measured by this assay are associated with clinical immunity to malaria in naturally exposed individuals. The assay may also be of use for assessing vaccine induced antibodies. &#160;

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Measuring antibody function is key to understanding immunity to Plasmodium falciparum malaria. This method describes the purification of viable merozoites, and measurement of opsonization-dependent phagocytosis by flow cytometry.

טיהור תשואה גבוהה של<em&gt; Falciparum Plasmodium</em&gt; Merozoites לשימוש בOpsonizing נוגדן מבחני

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

<em&gt; במבחנה</em&gt; מודל למדידה של מערכת חיסונית למלריה בהקשר של HIV Co-זיהום

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. However, effective malaria parasite targets for vaccine and chemotherapy development are still limited. This is largely due to the unavailability of relevant and practical in vivo infection models for human Plasmodium species, most notably for P.&#160;falciparum and P. vivax. Therefore, rodent malaria species have been extensively used as practical alternative in vivo models for malaria vaccine, drug targeting, immune response, and functional characterization studies of conserved Plasmodiumspp. genes. Indeed, rodent malaria models have proven to be invaluable, especially for exploring mosquito transmission and liver stage biology, and were indispensable for immunological studies. However, there are discrepancies in the methods used to evaluate the phenotypes of transgenic and wild-type asexual and sexual blood-stage parasites.&#160;Examples of these discrepancies are the choice of an intravenous vs. intraperitoneal infection of rodents with blood-stage parasites and the evaluation of male gamete exflagellation. Herein, we detail standardized experimental methods to evaluate the phenotypes of asexual and sexual blood stages in transgenic parasites expressing reporter-gene or wild-type rodent malaria parasite species. We also detail the methods to evaluate the phenotypes of malaria parasite mosquito stages (gametes, ookinetes, oocysts, and sporozoites) inside Anopheles mosquito vectors. These methods are detailed and simplified here for the lethal and non-lethal strains of P. berghei and P. yoelii but can also be applied with some adjustments to P. chabaudi and P. vinckei rodent malaria species.

Due to the striking similarities of the life cycle and biology of rodent malaria parasites to human malaria parasites, rodent malaria models have become indispensable for malaria research. Herein, we standardized some of the most important techniques used in the phenotypic analysis of wild-type and transgenic rodent malaria species.

ניתוח פנוטימית של מלריה מכרסם טפיל מינית ושלבי דם מיניים ושלבי יתוש

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. ...

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology in a Model of Experimental Cerebral Malaria Using Magnetic Resonance Imaging

Cerebral malaria is a sign of severe malarial disease and is often a harbinger of death. While aggressive management can be life-saving, the detection of cerebral malaria can be difficult. We present an experimental mouse model of cerebral malaria that shares multiple features of the human disease, including edema and microvascular pathology. Using magnetic resonance imaging (MRI), we can detect and track the blood-brain barrier disruption, edema development, and subsequent brain swelling. We describe multiple MRI techniques that can visualize these pertinent pathological changes. Thus, we show that MRI represents a valuable tool to visualize and track pathological changes, such as edema, brain swelling, and microvascular pathology, in vivo.

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology in a Model of Experimental Cerebral Malaria Using Magnetic Resonance Imaging

We describe a mouse model of experimental cerebral malaria and show how inflammatory and microvascular pathology can be tracked in vivo using magnetic resonance imaging.

בשנת מעקב Vivo של בצקת פיתוח ופתולוגיה מיקרוסקולרית במודל של מלריה מוחית ניסיוני באמצעות תהודה מגנטית הדמיה

Cerebral malaria is a sign of severe malarial disease and is often a harbinger of death. While aggressive management can be life-saving, the detection of ...

Medicine

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by naturally acquired IgG antibodies specific for VAR2CSA. VAR2CSA is the parasite antigen that mediates the selective sequestration of IEs in the placenta that can cause a severe form of malaria in pregnant women, called placental malaria (PM). Protection from PM is mediated by VAR2CSA-specific antibodies that are believed to function by inhibiting placental sequestration and/or by opsonizing IEs for phagocytosis. The assay employs late-stage-synchronized IEs that have been selected in vitro to express VAR2CSA, plasma/serum-antibodies from women with naturally acquired PM-specific immunity, and the phagocytic cell line THP-1. However, the protocol can easily be modified to assay the functionality of antibodies to any parasite antigen present on the IE surface, whether induced by natural exposure or by vaccination. The assay offers simple and high-throughput evaluation, with good reproducibility, of an important functional aspect of antibody-mediated immunity in malaria. It is, therefore, useful when evaluating clinical immunity to P. falciparum malaria, a major cause of morbidity and mortality in the tropics, particularly in sub-Saharan Africa.

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

The overall goal of this protocol is to provide instruction on how to measure the capacity of antibodies present in sera or plasma of individuals, naturally exposed to Plasmodium falciparum infection, to opsonize and induce phagocytosis of the parasite-infected erythrocytes (IEs).

מדידת נוגדנים הרום Phagocytosis-באופן טבעי כדי Plasmodium falciparum טפילי על ידי אסאי מבוסס ציטומטריה זרימה

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by ...

In Vitro Assay of Plasmodium-Infected Red Blood Cell Killing by Cytotoxic Lymphocytes

Malaria is a major public health concern, presenting more than 200 million cases per year worldwide. Despite years of scientific efforts, protective immunity to malaria is still poorly understood, mainly due to methodological limitations of long-term Plasmodium culture, especially for Plasmodium vivax. Most studies have focused on adaptive immunity protection against malaria by antibodies, which play a key role in controlling malaria. However, the sterile protection induced by attenuated Plasmodium sporozoites vaccines is related to cellular response, mainly to cytotoxic T lymphocytes, such as CD8+ and gamma delta T cells (&#947;&#948; T). Hence, new methodologies must be developed to better comprehend the functions of the cellular immune response and thus support future therapy and vaccine development. To find a new strategy to analyze this cell-mediated immunity to Plasmodium blood-stage infection, our group established an in vitro assay that measures infected red blood cell (iRBC) killing by cytotoxic lymphocytes. This assay can be used to study cellular immune response mechanisms against different Plasmodium spp. in the blood stage. Innate and adaptative cytotoxic immune cells can directly eliminate iRBCs and the intracellular parasite in an effector:target mechanism. Target iRBCs are labeled to evaluate cell viability, and cocultured with effector cells (CD8+ T, &#947;&#948; T, NK cells, etc.). The lysis percentage is calculated based on tested conditions, compared to a spontaneous lysis control in a flow cytometry-based assay. Ultimately, this killing assay methodology is a major advance in understanding cell-mediated immunity to blood-stage malaria, helping uncover new potential therapeutic targets and accelerate the development of malaria vaccines.

In Vitro Assay of Plasmodium-Infected Red Blood Cell Killing by Cytotoxic Lymphocytes

Here we describe a new method to help elucidate the mechanisms of cellular immunity to Plasmodium during the blood stage of infection. This is an in vitro assay that measures infected red blood cell killing by cytotoxic lymphocytes.&#160;

במבחנה בדיקה של הרג תאי דם אדומים נגועים בפלסמודיום על ידי לימפוציטים ציטוטוקסיים

Malaria is a major public health concern, presenting more than 200 million cases per year worldwide. Despite years of scientific efforts, protective ...

בVivo ההערכה של מכרסמים Plasmodium Parasitemia וMerozoite פלישה על ידי cytometry הזרימה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video