体外 细胞毒性淋巴细胞杀伤疟 原虫感染红细胞的测定

这种检测方法是细胞免疫对血期疟疾知识的重大进步，有助于发现新的治疗靶点并加速疟疾疫苗的进展。建立可用于人类或动物样本的疟原虫体外测定对于更好地了解疟疾发病机制很有价值。保护性疟疾免疫尚不完全清楚。

为了开发新疗法，必须探索细胞对疟疾寄生虫阶段的免疫机制。演示该程序的将是我，Luna de Lacerda和Christopher Gomes，Caroline实验室的本科生。首先，用26号针头将100微升肝素溶液吸入1毫升注射器中。

将鼠标侧放，将针垂直插入肘部下方，穿过肋骨并插入心脏。慢慢拉出注射器柱塞并旋转针头，直到获得0.5至1毫升的血液。用70%乙醇无菌清洁小鼠左侧。

用手术剪刀在小鼠的左侧切开，穿过皮肤和腹膜。找到脾脏并将其移除。将小鼠脾脏放入装有五毫升完全培养基的培养皿中，以纯化所需的效应细胞群。

将100微摩尔细胞过滤器放在50毫升锥形管上，并使用解剖钳将切除的脾脏转移到细胞过滤器中。用注射器柱塞将脾脏捣碎通过过滤器。用10毫升完整培养基通过过滤器清洗细胞。

将细胞在 300 G 下在 4 摄氏度下离心 10 分钟。然后，弃去上清液。将细胞沉淀重悬于两毫升冷红细胞裂解缓冲液中，并将悬浮液在冰上孵育五分钟。

用10毫升四摄氏度的完整培养基洗涤细胞悬液，并在两次洗涤之间去除任何细胞凝块，以用于疟原虫感染小鼠的脾脏。将细胞在 400 G 下在 4 摄氏度下离心五分钟。然后，弃去上清液。

现在将LS或LD色谱柱置于磁场中，并通过用三毫升MACS缓冲液冲洗来制备色谱柱。接下来，将细胞悬液涂在色谱柱上。用三毫升MACS缓冲液洗涤色谱柱三次后，收集含有脾细胞的流通物。

收获10微升脾细胞，加入10微升台盼蓝以检查细胞活力。将细胞添加到血细胞计数器中。计数台盼蓝溶液中的脾细胞并检查细胞活力。

离心所有脾细胞并弃去上清液。将细胞沉淀重悬于40微升MACS缓冲液中。向细胞中加入10微升生物素抗体混合物，充分混合，并在冰上孵育五分钟。

将抗生物素微珠在冰上孵育10分钟后，将MACS LS色谱柱置于磁场载体中，并通过用3毫升MACS缓冲液冲洗来制备色谱柱。将细胞悬液涂在色谱柱上。用三毫升MACS缓冲液洗涤色谱柱三次，并收集含有所有未标记细胞毒性细胞的流出物。

将收集的血液以350倍G离心五分钟后，丢弃血清并将血液重悬于一毫升RPMI中，不含FBS。将LS色谱柱置于磁场支架中后，用RPMI冲洗并将RBC悬浮液通过色谱柱。一旦细胞通过色谱柱，离心流通液，弃去上清液，然后将一毫升流通液重新注入色谱柱中以分离更多的iRBC。

用五毫升RPMI清洗色谱柱两次。在色谱柱储液槽为空后立即添加缓冲液等分试样来执行洗涤步骤。加入 5 毫升 RPMI，取出色谱柱，然后将 iRBC 吹扫到新的 15 毫升管中。

在没有FBS的一毫升RPMI中稀释一微升10毫摩尔CFSE溶液。将红细胞重悬于不含FBS的500毫升RPMI中后，加入500毫升稀释的CFSE，并在室温下避光孵育8分钟。用14毫升完全培养基洗涤细胞三次，并将细胞离心两次。

对于细胞毒性淋巴细胞共培养，将细胞接种在 96 孔圆底板中。以所需的效应/靶细胞比例加入纯化的淋巴细胞和CFSE标记的iRBC至200毫升的最终体积并匀浆。一式三份制备每个条件，并将细胞在37摄氏度下孵育。

使用LS柱从P.yoelii感染的小鼠中纯化iRBC。在色谱柱富集之前和之后收集的血液中的血涂片突出了纯化。本文将介绍评估红细胞裂解百分比所需的门控策略。

停止门设置在计数珠群中。门控策略首先根据前向散射峰高面积比选择单个细胞（不包括碎片），然后在Ter119+和CD8中选择红细胞群，然后选择活的IBC作为CFSE高阳性。以下是应用于实验示例的分析，使用不同的效应器与目标比率，显示共培养后的活红细胞。

显示了基于此公式计算的红细胞裂解百分比的图形表示。使用细胞毒性CD8或幼稚CD8的组之间的显著性通过双向方差分析进行多重比较。目前的方法通过与杀伤细胞的直接细胞接触来探索红细胞裂解，并且可以计划使用针对特定受体或分子的阻断抗体来揭示所涉及的机制。

这种体外杀伤测定提供了一种新的策略，以阐明细胞介导的对血期疟疾免疫的机制，这将有助于新的疟疾疗法和疫苗的进展。