منهجية الفحص هذه ، إنها تقدم كبير في معرفة مناعة الخلايا ضد ملاريا مرحلة الدم ، مما يساعد على الكشف عن أهداف علاجية جديدة وتسريع تقدم لقاح الملاريا. يعد إنشاء مقايسة البلازموديوم في المختبر التي يمكن استخدامها للعينات البشرية أو الحيوانية أمرا قيما لفهم أفضل لمسببات الملاريا. المناعة الوقائية ضد الملاريا ليست مفهومة تماما.
لتطوير علاجات جديدة ، من الضروري استكشاف آليات مناعة الخلايا للمرحلة الطفيلية للملاريا. سأكون أنا ولونا دي لاسيردا وكريستوفر جوميز ، وهو طالب جامعي من مختبر كارولين. للبدء ، نضح 100 ميكرولتر من محلول الهيبارين في حقنة واحد ملليلتر مع إبرة قياس 26.
ضع الماوس على جانبه وأدخل الإبرة بشكل عمودي أسفل الكوع مباشرة ، من خلال الضلوع ، وفي القلب. اسحب مكبس المحقنة ببطء وقم بتدوير الإبرة حتى يتم الحصول على 0.5 إلى ملليلتر واحد من الدم. قم بتنظيف الجانب الأيسر من الماوس باستخدام 70٪ إيثانول.
باستخدام المقص الجراحي ، قم بعمل قطع على الجانب الأيسر من الماوس ، مرورا بالجلد والبريتوني. حدد موقع الطحال وقم بإزالته. ضع طحال الفأر في طبق بتري مع خمسة ملليلتر من الوسط الكامل لتنقية عدد الخلايا المستجيبة المطلوبة.
ضع مصفاة خلية 100 ميكرومولار فوق أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر وانقل الطحال المستأصل إلى مصفاة الخلية باستخدام ملقط تشريحي. هرس الطحال من خلال مصفاة مع حقنة المكبس. اغسل الخلايا من خلال المصفاة ب 10 ملليلتر من الوسائط الكاملة.
أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 300 غرام لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. ثم تخلص من المادة الطافية. أعد تعليق حبيبات الخلية في ملليلتر من محلول تحلل كرات الدم الحمراء البارد واحتضان التعليق لمدة خمس دقائق على الجليد.
اغسل معلق الخلية ب 10 ملليلتر من الوسائط الكاملة ذات الأربع درجات مئوية وقم بإزالة أي جلطات خلوية بين غسلات الطحال من الفئران المصابة بالبلازموديوم. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 400 غرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. ثم تخلص من المادة الطافية.
الآن ضع عمود LS أو LD في المجال المغناطيسي وقم بإعداد العمود عن طريق شطفه بثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت MACS. بعد ذلك ، قم بتطبيق تعليق الخلية على العمود. بعد غسل العمود ثلاث مرات بثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت MACS ، اجمع التدفق الذي يحتوي على الخلايا الطحالية.
احصد 10 ميكرولترات من الخلايا الطحالية وأضف 10 ميكرولترات من التريبان الأزرق للتحقق من صلاحية الخلية. أضف الخلايا إلى مقياس الدم. عد الخلايا الطحالية في محلول تريبان الأزرق وتحقق من صلاحية الخلية.
أجهزة الطرد المركزي جميع الخلايا الطحالية وتجاهل الطاف. أعد تعليق حبيبات الخلية في 40 ميكرولترا من المخزن المؤقت MACS. أضف 10 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة للبيوتين إلى الخلايا ، واخلطها جيدا ، واحتضنها لمدة خمس دقائق على الجليد.
بعد احتضان الميكروبيدات المضادة للبيوتين على الجليد لمدة 10 دقائق ، ضع عمود MACS LS في دعم المجال المغناطيسي وقم بإعداد العمود عن طريق شطفه بثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت MACS. تطبيق تعليق الخلية على العمود. اغسل العمود ثلاث مرات بثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت MACS واجمع التدفق الذي يحتوي على جميع الخلايا السامة للخلايا غير المصنفة.
بعد الطرد المركزي للدم الذي تم جمعه عند 350 مرة G لمدة خمس دقائق ، تخلص من المصل وأعد تعليق الدم في ملليلتر واحد من RPMI بدون FBS. بعد وضع عمود LS في دعامة المجال المغناطيسي ، اشطفه باستخدام RPMI وقم بتمرير تعليق RBC عبر العمود. بمجرد مرور الخلايا عبر العمود ، يقوم جهاز الطرد المركزي بالتدفق من خلاله ، وتجاهل المادة الطافية ، وإعادة تطبيق ملليلتر واحد من التدفق في العمود لعزل المزيد من كرات الدم المتقلبة.
اغسل العمود مرتين بخمسة ملليلتر من RPMI. قم بتنفيذ خطوات الغسيل عن طريق إضافة قسامات عازلة بمجرد أن يكون خزان العمود فارغا. أضف خمسة ملليلتر من RPMI ، وقم بإزالة العمود ، وقم بتطهير iRBCs في أنبوب جديد سعة 15 ملليلتر.
قم بتخفيف ميكرولتر واحد من محلول CFSE 10 مليمولار في ملليلتر واحد RPMI بدون FBS. بعد تعليق كرات الدم الحمراء في 500 ملليلتر من RPMI بدون FBS ، أضف 500 ملليلتر من CFSE المخفف واحتضانها لمدة ثماني دقائق في درجة حرارة الغرفة ، محمية من الضوء. اغسل الخلايا ثلاث مرات ب 14 ملليلتر من الوسط الكامل وأجهزة الطرد المركزي للخلايا مرتين.
بالنسبة للاستزراع المشترك للخلايا الليمفاوية السامة للخلايا ، قم بطلاء الخلايا في صفيحة مستديرة القاع مكونة من 96 بئرا. أضف الخلايا الليمفاوية المنقاة و iRBCs المسمى CFSE في نسبة المستجيب / الخلية المستهدفة المطلوبة إلى حجم نهائي يبلغ 200 ملليلتر وقم بالتجانس. تحضير كل حالة في ثلاث نسخ واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية.
تم تنقية iRBCs من الفئران المصابة ب P.yoelii باستخدام أعمدة LS. يتم تسليط الضوء على التنقية من خلال مسحات الدم من الدم الذي تم جمعه قبل وبعد تخصيب العمود. يتم عرض استراتيجية البوابات اللازمة لتقييم النسبة المئوية لتحلل كرات الدم الحمراء هنا.
يتم تعيين بوابة التوقف في عد حبات السكان. تبدأ استراتيجية البوابات باختيار الخلايا المفردة ، باستثناء الحطام ، بناء على نسبة ارتفاع ذروة التشتت الأمامي إلى المنطقة ، متبوعة باختيار مجموعة كرات الدم الحمراء في Ter119 + و CD8-ثم ، حدد IBCs الحية على أنها CFSE إيجابية عالية. فيما يلي التحليل المطبق على مثال تجريبي باستخدام مستجيبات مختلفة لاستهداف النسب ، وعرض كرات الدم الحمراء الحية بعد الثقافة المشتركة.
يتم عرض تمثيل رسومي لنسبة تحلل كرات الدم الحمراء ، محسوبة بناء على هذه الصيغة. تم تقييم الأهمية بين المجموعات التي تستخدم CD8 السامة للخلايا أو CD8 الساذجة بواسطة ANOVA ثنائي الاتجاه مع مقارنات متعددة. تستكشف الطريقة الحالية تحلل كرات الدم الحمراء عن طريق الاتصال المباشر للخلايا مع الخلايا القاتلة ، ويمكن التخطيط للكشف عن الآليات المعنية باستخدام الأجسام المضادة المانعة لمستقبلات أو جزيئات معينة.
يقدم اختبار القتل في المختبر هذا استراتيجية جديدة لتوضيح آليات المناعة الخلوية لملاريا مرحلة الدم ، مما سيساعد على تقدم علاجات ولقاحات الملاريا الجديدة.
