이 분석 방법론은 혈액 단계 말라리아에 대한 세포 면역 지식의 주요 발전으로 새로운 치료 표적을 발견하고 말라리아 백신의 진행을 가속화하는 데 도움이 됩니다. 인간 또는 동물 샘플에 사용할 수 있는 시험관 내 변형체 분석의 확립은 말라리아 발병기전을 더 잘 이해하는 데 중요합니다. 보호 말라리아 면역은 완전히 이해되지 않았습니다.
새로운 치료법의 개발을 위해서는 말라리아 기생충 단계에 대한 세포 면역 메커니즘을 탐구하는 것이 필수적입니다. 절차를 시연하는 것은 저, Luna de Lacerda, Caroline 연구실의 학부생인 Christopher Gomes가 될 것입니다. 시작하려면 100마이크로리터의 헤파린 용액을 26게이지 바늘이 있는 1밀리리터 주사기로 흡인합니다.
마우스를 옆으로 눕히고 바늘을 팔꿈치 바로 아래, 갈비뼈를 통해 심장에 수직으로 삽입합니다. 주사기 플런저를 천천히 빼내고 0.5-1 밀리리터의 혈액이 얻어 질 때까지 바늘을 돌립니다. 마우스의 왼쪽을 70% 에탄올로 무균 세척합니다.
수술 용 가위로 마우스의 왼쪽을 잘라 피부와 복막을 통과시킵니다. 비장을 찾아 제거하십시오. 마우스 비장을 5밀리리터의 완전한 배지가 있는 페트리 접시에 넣어 원하는 이펙터 세포 집단을 정제합니다.
50밀리리터 원뿔형 튜브 위에 100마이크로몰 세포 여과기를 놓고 해부학적 집게를 사용하여 절제된 비장을 세포 여과기로 옮깁니다. 주사기 플런저로 스트레이너를 통해 비장을 으깬다. 10 밀리리터의 완전한 매체로 여과기를 통해 세포를 세척하십시오.
섭씨 4도에서 10분 동안 300G에서 세포를 원심분리합니다. 그런 다음 상청액을 버립니다. 세포 펠릿을 2밀리리터의 차가운 RBC 용해 완충액에 재현탁하고 현탁액을 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다.
섭씨 4도의 완전 배지 10밀리리터로 세포 현탁액을 세척하고 변형체에 감염된 마우스의 비장 세척 사이에 세포 응고를 제거합니다. 세포를 섭씨 4도에서 5분 동안 400G에서 원심분리합니다. 그런 다음 상청액을 버립니다.
이제 자기장에 LS 또는 LD 컬럼을 놓고 3밀리리터의 MACS 버퍼로 헹구어 컬럼을 준비합니다. 다음으로, 세포 현탁액을 컬럼에 바릅니다. 3밀리리터의 MACS 완충액으로 컬럼을 3회 세척한 후, 비장 세포를 함유하는 플로우-스루를 수집한다.
10 마이크로 리터의 비장 세포를 수확하고 10 마이크로 리터의 트리 판 블루를 첨가하여 세포 생존력을 확인합니다. 혈구계에 세포를 추가합니다. 트리판 블루 용액에서 비장 세포를 세고 세포 생존율을 확인하십시오.
모든 비장 세포를 원심 분리하고 상층액을 버립니다. 세포 펠릿을 40마이크로리터의 MACS 완충액에 재현탁합니다. 10 마이크로 리터의 비오틴 항체 칵테일을 세포에 넣고 잘 섞은 다음 얼음에서 5 분 동안 배양합니다.
항-비오틴 마이크로비드를 얼음 위에서 10분 동안 배양한 후, MACS LS 컬럼을 자기장 지지체에 넣고 3밀리리터의 MACS 완충액으로 헹구어 컬럼을 준비한다. 세포 현탁액을 컬럼에 바릅니다. 3밀리리터의 MACS 완충액으로 컬럼을 3회 세척하고, 표지되지 않은 모든 세포독성 세포를 함유하는 플로우-스루를 수집한다.
채취한 혈액을 350배 G에서 5분 동안 원심분리한 후, 혈청을 버리고 FBS 없이 RPMI 1밀리리터에 혈액을 재현탁시킨다. LS 컬럼을 자기장 지지체에 넣은 후 RPMI로 헹구고 RBC 현탁액을 컬럼에 통과시킵니다. 세포가 컬럼을 통과하면 플로우 스루를 원심분리하고 상층액을 버리고 플로우 스루의 1밀리리터를 컬럼에 다시 적용하여 더 많은 iRBC를 분리합니다.
5 밀리리터의 RPMI로 컬럼을 두 번 세척하십시오. 컬럼 저장소가 비워지는 즉시 버퍼 분취량을 추가하여 세척 단계를 수행합니다. 5밀리리터의 RPMI를 추가하고, 컬럼을 제거하고, iRBC를 새로운 15밀리리터 튜브로 퍼지합니다.
FBS 없이 10밀리몰 CFSE 용액 1마이크로리터를 1밀리리터 RPMI로 희석합니다. FBS 없이 500 밀리리터의 RPMI에 적혈구를 재현탁시킨 후, 희석된 CFSE 500 밀리리터를 첨가하고, 빛으로부터 보호하면서, 실온에서 8분 동안 배양한다. 14 밀리리터의 완전 배지로 세포를 세 번 세척하고 세포를 두 번 원심 분리합니다.
세포독성 림프구 공동 배양의 경우, 세포를 96웰 둥근 바닥 플레이트에 플레이트합니다. 정제된 림프구 및 CFSE 표지된 iRBC를 원하는 이펙터/표적 세포 비율에 200밀리리터의 최종 부피에 첨가하고 균질화합니다. 각 조건을 세 번 준비하고 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다.
LS 컬럼을 사용하여 P.yoelii-감염된 마우스로부터 iRBCs를 정제하였다. 정화는 컬럼 농축 전후에 수집 된 혈액의 혈액 도말에 의해 강조됩니다. RBC 용해 비율을 평가하는 데 필요한 게이팅 전략이 여기에 나와 있습니다.
정지 게이트는 카운팅 비드 개체군으로 설정됩니다. 게이팅 전략은 전방 산란 피크 높이 대 면적 비율에 따라 파편을 제외한 단일 세포를 선택한 다음 Ter119+ 및 CD8에서 RBC 모집단을 선택한 다음 살아있는 IBC를 CFSE 높은 양성으로 선택합니다. 다음은 표적 비율에 대해 서로 다른 이펙터를 사용하여 실험 예에 적용된 분석으로, 공동 배양 후 살아있는 적혈구를 표시합니다.
이 공식을 기반으로 계산된 RBC 용해 비율의 그래픽 표현이 표시됩니다. 세포독성 CD8 또는 나이브 CD8을 사용하는 그룹 간의 유의성은 다중 비교를 통해 양방향 ANOVA에 의해 평가되었습니다. 현재의 방법은 킬러 세포와의 직접적인 세포 접촉에 의한 RBC 용해를 탐구하고 특정 수용체 또는 분자에 대한 차단 항체를 사용하여 관련 메커니즘을 밝히기 위해 계획할 수 있습니다.
이 시험관 내 사멸 분석은 혈액 단계 말라리아에 대한 세포 매개 면역의 메커니즘을 명확히 하기 위한 새로운 전략을 제시하며, 이는 새로운 말라리아 치료법 및 백신의 진행에 도움이 될 것입니다.
