הליך זה מאפשר לחוקרי יתושים להתייחס בקלות לכושר הרבייה של היתושים שלהם ברמה האישית. בהשוואה לשיטות המקובלות, פרוטוקול זה מקצר באופן משמעותי את הזמן, המרחב והעבודה הנדרשים לבדיקת פוריותם ופוריותם של יתושים ברמה האישית. התחל על ידי הכנת צלחות לניסוי oviposition.
לקדוח ארבעה עד שישה חורים לכל באר במכסה של צלחת תרבות 24 באר באמצעות מקדחה ביתית עם קצת 1.6 מ"מ. יום אחד לפני הניסוי, לשטוף ולשטוף את הצלחות ולהשרות אותם 1%-5% אקונומיקה במשך 30 עד 60 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף את הצלחות ביסודיות תחת מים deionized ריצה ולייבש אותם.
ממיסים 2% אגרוז במים שעברו דה-יון ומוסיפים מיד 500 מיקרוליטרים של ההתעוררות המותכת לכל באר של צלחת של 24 בארות. השאירו את הצלחות על ספסל המעבדה למשך הלילה כדי לייבש כל עיבוי. לפחות 16 שעות לפני האכלת הדם, להסיר כל מקור של מים או סוכר מן היתושים הנשי.
ביום ההאכלה, מחממים סירקולטור מים ל 37 מעלות צלזיוס ומאכילים את היתושים בדם בעלי חוליות המוצב במאכילים מלאכותיים במשך 15 עד 30 דקות. לאחר מכן, להעביר את היתושים לצלחת זכוכית על קרח. בחר את אלה כי הם engorged עם דם ומניחים אותם לתוך מיכל עם 30% מי סוכרוז.
אפשר לפחות 72 שעות לנקבות לסיים את הפרשת הביצים והתפתחות הביצים. כשעה לפני העברת יתושים לצלחת 24-באר, להשתמש פיפטה העברה להוסיף שתיים עד שלוש טיפות מים לתוך כל באר. להפיל יתושים עם פחמן דו חמצני ולהעביר אותם לצלחת זכוכית על קרח.
לאחר מכן, בנפרד למקם כל יתוש על מכסה הפוך של צלחת 24-well. לאחר כל 24 יתושים הונחו, לכסות את המכסה עם תחתית צלחת הפוכה, לאבטח אותו עם גומייה חדשה ורעננה ומניחים אותו בתא סביבתי עד יתושים להתאושש. לאחר מכן, להפוך את הצלחת בצד ימין למעלה.
אפשר יתושים נקבה oviposit במשך 24 עד 48 שעות. לאחר מכן, להסיר את הנקבות על ידי שחרור אותם מן הצלחות לתוך כלוב גדול. לפני ספירת הביצים, לבדוק כל באר עבור ביצים כי הם על קירות הבאר בשולי agarose ומשטח פלסטיק שבו הם קשים לפתרון בתצלומים.
השתמש מברשת צבע רטובה כדי להעביר את הביצים האלה על פני השטח השטוחים, כך שכל הביצים נמצאות במישור אחיד ולא חופפות זו לזו. השתמש מלקחיים כדי להסיר את כל הרגליים שבורות, כנפיים, וחלקיקים אחרים בבארות שעלולים להפריע ביצי הדמיה. הגדר מצלמה דיגיטלית קומפקטית במצב מיקרוסקופ, המאפשרת למשתמש להתמקד באובייקטים קרוב לסנטימטר אחד ולצלם תמונה של כל באר.
לאחר צילום כל באר של צלחת, לצלם תמונה של הצלחת כולה. השתמש בתווית סדר דימות כדי להבחין בין כל לוח מאוחר יותר. מוסיפים כחמש טיפות מים לכל באר כדי למנוע את תקע ההתעוררות שלה ואת הביצים לייבוש ולגרום להתפתחות העובר ולבקיעה.
העבר את התמונות למחשב ושנה את שמות הקבצים עם הלוח ומזהים טובים עבור ארגון קל יותר. פתחו את התמונות באמצעות ImageJ והשתמשו בכלי מרובה הנקודות כדי לסמן כל ביצה, תוך הגדלה או הקטנה של התצוגה כדי לספור את גושי הביצים. לאחר סימון כל הביצים, לחץ פעמיים על הסמל Multi-point כדי להעלות את מספר הסימנים ולתעד את התוצאות בגיליון אלקטרוני.
התחל להוסיף מזון לבארות המכילות זחלים שבקעו ברגע שהם מופיעים. כחמישה עד שמונה ימים לאחר מכן, להרדים את הזחלים על ידי כיסוי הצלחת עם קרח כתוש במשך 15 עד 20 דקות. הכנס חומר שחור מתחת לצלחת כדי לשפר את הניגודיות ולצלם כל באר תוך שמירה על הצלחות על הקרח.
לאחר צילום כל באר, צלם תמונה של הצלחת כולה עם תווית סדר הדמיה. פתחו תמונות עם ImageJ והשתמשו בכלי מרובה הנקודות לספירת הזחלים. הזחלים יכולים להשתנות בצורה, בזווית ובמיקוד.
אל תכלול את cuticles סככה, אשר נראים כמו זחלים ראש בלבד עם קצת גוף, או זחלים מכווצים. רשום את התוצאות בגיליון האלקטרוני. יתושים הוזרקו עם RNA דו גדילי מיקוד טרנספורטר ברזל מועמד, FeT, או גן בקרה, EGFP.
לאחר מכן, הם הוזנו בדם ונמדדו עבור פוריות ותפוקת פוריות בשיטת צלחת הנשר. יתושים שבהם הושתק ביטוי טרנספורטר הברזל הראו ירידה משמעותית הן במספר הביצים והן בקצב הצוהר. יתושים מושתקים FeT גם הציגו הפרשה מאוחרת וביצים קטנות וקלות.
צילום תמונות טובות הוא צעד קריטי עבור שיטה זו, כי איכות התמונות והכמות של ביצים בודדות או זחלים משפיעים ישירות על איכות התוצאות.
