הפרוטוקול שלנו מניב PCD פעיל מאוד ללא גרעין לגילוי, אשר ניתן להשתמש בו בכל פתרון שבו חמצן מים הוא מזהם. הטכניקות בהן אנו משתמשים קלות לשכפול ומבטיחות שלא יהיו מזהמי גרעין במוצר. כדי להתחיל, לשלב מיקרוליטר אחד של pVP91A-pcaHG PCD ביטוי פלסמיד ו 20 microliters של מסחרי זמין E.coli BL21 בצינור.
מצליפים בצינור כדי לערבב, ומ מניחים את הצינור על קרח במשך חמש דקות. כדי להמשיך את תגובת השינוי, מניחים את הצינור באמבט מים ב 42 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות, ולאחר מכן על קרח במשך שתי דקות. הוסיפו 80 מיקרוליטרים של מדיה SOC, ונערו במהירות של 225 סל"ד ו-37 מעלות צלזיוס למשך שעה.
לאחר מכן, יוצקים את תערובת תגובת הטרנספורמציה על אגר LB-ampicillin, ולהשתמש מפזר צלחת כדי להפיץ את התערובת. מכסים את הצלחת במכסה, ודוררים את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 עד 18 שעות. לאחר מכן, בחר מושבה אחת מהצלחת, וחסן ב 50 microliters של LB-אמפיצילין בבקבוק ארלנזייר 250 מיליליטר.
מניחים את הבקבוקון על שייקר ב 225 סל"ד כדי דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 עד 18 שעות. לאחר מכן, להעביר 20 מיליליטר של התרבות דגירה לבקבוק ארבעה ליטר מלא ליטר אחד של LB-ampicillin. לנער ב 225 סל"ד ב 37 מעלות צלזיוס.
בכל שעה, לצייר מיליליטר אחד של התרבות לתוך cuvette כדי למדוד את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר על פוטומטר. ככל שהצפיפות האופטית התרבותית עולה קרוב ל- 0.5, הגדל את תדירות המדידות לכל 15 דקות, עד שה- OD600 יגיע ל- 0.5. לאחר מכן, להעביר את בקבוק ארבעה ליטר לפח קרח.
מערבלים את הבקבוק באמבט הקרח כדי להפחית את טמפרטורת התרבות. מעבירים את בקבוק הארבעה ליטר לאנקובטור ב-17 מעלות צלזיוס ו-180 סל"ד. המשך לפקח על OD600 כל 20 דקות.
ב 0.7 OD600, להוסיף IPTG ו אמוניום ברזל סולפט hexahydrate פתרונות מלאי להגיע לריכוז הסופי של 0.5 מילימולאר ו 10 מיליגרם לליטר, בהתאמה. לנער את התרבות ב 180 סל"ד ו 17 מעלות צלזיוס במשך 18 שעות. לאחר הדגירה, מניחים את בקבוק התרבות בקרח במשך שתי דקות.
לקצור מיליליטר אחד של התאים המושרה בצינור מיקרו-מרכזיפוג פוליפרופילן 1.5 מיליליטר לניתוח SDS-PAGE. לאחר מכן, יוצקים את תרבות החיידקים לתוך בקבוקים, 500 מיליליטר כל בקבוק, עבור צנטריפוגה. גלולה את התרבות בארבע מעלות צלזיוס ו 3, 000 פעמים גרם במשך 20 דקות.
תדקן את העל-טבעיים. פיפטה כדי לעכל מחדש את כדורי, כל אחד 12.5 מיליליטר של PBS קר, ולשלב כל שני resuspensions בצינור חרוט 50 מיליליטר. גלולה התאים שוב כמו קודם לכן.
לאחר מכן, השלך את העל-טבעיים, ולהשתמש בפיגט כדי להוסיף 10 מיליליטר של מאגר תיזה בכל צינור כדי לנצל מחדש את התאים. לאחר sonicating את הצינורות עם תאים המושרה, יוצקים את lysate חיידקי לתוך בקבוק פוליקרבונט מקורר מראש. צנטריפוגה במשך 60 דקות ב 120, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס, ויוצקים את העל טבעי לצינור חרוט קר 50 מיליליטר.
לאחר הכנת מכשיר FPLC עם עמודת שף טעון ניקל, לטעון את המדגם לעמודה ב 0.15 מיליליטר לדקה. לשטוף את העמוד עם 20 מיליליטר של חיץ ניקל ב imidazole 20 מילימולאר. שמור את הכביסה בצינור 50 מיליליטר לניתוח.
לאחר מכן, לשטוף את העמוד עם 15 מיליליטר של חיץ ניקל ב 125 מילימולרים imidazole. לאסוף את האלוטיון ב 19 שברים של 0.8 מיליליטר כל אחד. לשטוף את הטור שוב עם 15 מיליליטר של 100% ניקל חיץ B, ולאסוף 75 שברים נוספים של 0.2 מיליליטר כל אחד.
המשך עם הניתוח של שברים שנאספו על 12% SDS-PAGE ג'לים כדי לאשר נוכחות של PCD. ראשית, להוסיף 35 microliters של חיץ תגובה לצינור מיקרו-מרכזיפוג פוליפרופילן 1.5 מיליליטר. בצינור, לשלב חמישה microliters של שברי כרומטוגרפיה שיא 500 ננוגרם של שלושה קילו-ק"מ זוג פלסמיד pXba supercoiled.
מניחים את הצינור באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לאחר הכנת ג'ל אגרוז על פי כתב היד, מוסיפים 30 מיקרוליטרים של כל תגובה לתוך בארות בג'ל. אלקטרופורזה ב 10 וולט בסנטימטר בטמפרטורת הסביבה במשך כשעה.
עכשיו, צבע הג'י הכתום הגיע לקצה הג'ל. מיד, השתמש בסורק פלואורסצנטי כדי לדמיין את אות האתידיום ברומיד של הג'ל. עם הפונקציה של העוצמה וגודל פיקסל התמונה, קבע את נפח הפיקסלים של מיני הדנ"א השונים, כגון עיגולים על-צבעיים, ליניאריים ועיגולים חתוכים.
כדי לקבוע את האחוז של כל מין דנ"א, חלק את נפח הפיקסלים של מין דנ"א יחיד בנפח הפיקסלים הכולל עבור כל המינים הבודדים. ניתוח SDS-PAGE מראה את שיא האלוטיון השני מכיל זיהום חלבון מינימלי, המייצג הטרודימר PCD כמעט טהור ופעילות נוקלאאז מינימלית עד בלתי ניתנת לגילוי. לכן, לשלב אלה 10 שברים מן elution PCD השני בצינור חרוט חמישה מיליליטר לניתוח נוסף.
לאחר טיהור כרומטוגרפיה של PCD, בחדר קר של ארבע מעלות צלזיוס, לשלב בצינור microcentrifuge נפח מתאים של נתרן כלורי, טריס הידרוכלוריד, מגנזיום כלורי, dithiothreitol, PCA, ו pXba פלסמיד supercoiled לעשות מלאי 5X. מניחים צלחת שטוחה תחתונה 96 היטב על קרח, ולהעביר 10 microliters של פתרון 5X משולב ל בארות. מיד לפני הניתוח, להוסיף לכל באר 10 microliters של שברי PCD SEC בודדים.
קבעו את קורא הלוחות לטמפרטורה פנימית של 37 מעלות צלזיוס, והעבירו את צלחת ה-96 היטב למחזיק הצלחת. יש לסגת ממחזיק הלוח לתוך המכשיר, ולמדוד ספיגה ב-290 ננומטר במרווחים של 20 שניות למשך שעה. הגדר את הכלי לנער את הצלחת חמש שניות לפני כל קריאה.
לאחר שעה אחת, להוסיף 10 microliters של פתרון עצירה לכל באר כדי לסיים את התגובות. בצע אלקטרופורזה ג'ל עבור שברי ה-SEC PCD. בחר שברים עם פעילות חמצון PCA ביותר, המצוין על ידי ספיגה מופחתת ולא זיהום גרעין שנצפה.
למדוד את הספיגה ב 280 ננומטר, ולחשב את ריכוז PCD הכולל מבוסס על ספיגת מקדם ההכחדה. אחסן את השברים שנבחרו לאחסון לטווח ארוך במינוס 80 מעלות צלזיוס. בניסוי זה, נמצא כי PCD רקומביננטי, הטרודימר של hexahistidine מתויג pcaH ו pcaG, בא לידי ביטוי E.coli.
ההטרודימר טוהר לראשונה על ידי כרומטוגרפיה של זיקה לניקל. הספיגה מוצגת בכחול, ואת הריכוז אחוז של חיץ ניקל B מוצג באדום. הזרימה מראה את החלבונים החיידקיים המסיסים שלא נקשרו לאסין הניקל.
כמה PCD אלוט בנוכחות imidazole 125-מילימולאר, אבל רוב החלבון eluted ב imidazole 250 מילימולאר. ניתוח SDS-PAGE מייצג מציין שהשברים מצעד האלוטיון היו נקיים ממזהמים. ג'ל אגרוז של בדיקת גרעין חושף זיהום באמצעות השוואה עם השליטה השלילית ללא תוספת חלבון ושליטה חיובית מזוהמת בגרעין DNA.
כימות של מיני ה-DNA השונים שנצפו בבדיקת ג'ל ג'ל אגרוז מראה שברים 29 עד 38 הייתה פעילות נוקלאז קטנה, אשר נבחרו להיות משולבים, מרוכזים, ומטוהרים עוד יותר על ידי ה-SEC. נתונים משלושה שברי SEC מייצגים הראו כי PCD מטוהר הפחית את הספיגה ב 290 ננומטר, המציין חמצון של PCA. בעקבות הליך זה, PCD מטוהרים ניתן להשתמש אופטימיזציה במערכת ניקוי החמצן הרצוי.
פעולה זו תקבע את הכמות המדויקת של PCD הנדרש עבור המערכת. טכניקה זו שימשה כדי להאריך את אורך החיים פלואורופור בניסויים מיקרוסקופיים מולקולה אחת, אשר אפשרה תקופות ארוכות יותר של איסוף נתונים. האולטרהצנטריפוגה המשמשת מסוכנת.
ודא כי צנטריפוגות מאוזנות כראוי לפני ספינינג. אתידיום ברומיד הוא רהוט מסוכן. הימנע ממגע על ידי לבישת ציוד מגן אישי, והיפטר ממנו כראוי.
