מחקר זה נתמך על ידי המחלקה לענייני יוצאי צבא קריירה פרס פיתוח 1IK2BX001701, CTSA פרס UL1TR000445 מהמרכז הלאומי לקידום מדעי התרגום, הקרן הלאומית למדע פרסים 1547757 ו 1400969, ומענק NIH GM05551. התוכן שלה הם באחריותם הבלעדית של המחברים ואינם מייצגים בהכרח דעות רשמיות של המרכז הלאומי לקידום מדעי התרגום או המכונים הלאומיים לבריאות.

1. ביטוי של S100A12 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרה המוסמכת BL21 DE3 תאים עם pGEMEX-S100a12 פלסמיד באמצעות תקן סטנדרטי חום ההלם 18 . הוסף 1 עד 5 μL של פלסמיד ל 50 μL של חיידקים בצינור microcentrifuge על הקרח. דגירה במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הלם חום התאים ב 42 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים על הקרח במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μL של מדיה SOC לתאים. דגירה על 37 מעלות צלזיוס עם רעד בסל&quot;ד 250 על שייקר מסלולית עבור 1 ח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת 150 μL של התגובה טרנספורמציה על בינוני LB- אגר (בתוספת 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​אמפיצילין). לדגור על 12-16 שעות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר מושבה אחת. לחסן 2 מ&quot;ל של LB (בתוספת 100 מיקרוגרם / mL ampicillin). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עבור 4-6 שעות על 37 מעלות צלזיוס על שייקר מסלולית (300 סל&quot;ד). OD 600 צריך לקרוא בין 1-3 ספיגת יחידות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μL של תרבות Starter ל 50 מ&quot;ל של ZYM-5052 autoinduהתקשורת ction 26 בתוספת 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של אמפיצילין. עבור אוורור הטוב ביותר ביטוי מקסימלי, להשתמש 250 מ&quot;ל מבולבל בקבוק ארלנמאייר. לנער (300 סל&quot;ד) עבור 24 שעות, על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת ההשעיה חיידקי לצינור צנטריפוגות. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה (4 XG, 10 דקות) ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג את המדיה, מדגם יומן, ואת הדבק לאחסן חנות ב -80 מעלות צלזיוס. המדגם יציב במשך שנים. </li></ol> 2. טיהור של S100A12 באמצעות כרומטוגרפיה בלחץ נמוך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend ב 30 מ&quot;ל של 20 מ&quot;מ טריס, pH 8.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate ההשעיה על קרח לתאי lyse. השתמש ~ 20 W פלט, 5 על 5 ו 5 את מחזור 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הפתרון צינורות צנטריפוגה במהירות גבוהה. להבהיר את lysate התא על ידי צנטריפוגה, 20,000 xg במשך 30 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג את supernatant ולהעביר כוס נקי 100 מ&quot;ל פוליפרופילן. מגניב את הפתרון על ידי הנחת כוס על הקרח. מוסיפים מערבביםR ולאט לאט להוסיף 11.20 גרם של אמוניום סולפט. אפשר פתרון לערבב על קרח במשך 1 שעות נוספות. זה תיצור פתרון 60% של אמוניום גופרתי ו להאיץ את רוב E. חלבונים אנדוגניים. S100A12 יישאר מסיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הפתרון ב 4 ° C, 20,000 xg במשך 20 דקות כדי גלולה החלבון זירז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג את supernatant ולהעביר צינורות דיאליזה (MWCO 3,500 kDa). Dialyze נגד 1 L של 20 מ&quot;מ טריס, pH 8.0 ב 4 ° C. לשנות את המאגר דיאליזה פעמיים. אפשר 4 שעות בין השינויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אניון חילופי כרומטוגרפיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע כרומטוגרפיה על מערכת לחץ נמוך. קצב זרימה אופייני הוא 1 מ&quot;ל / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן עמודה 5 מ&quot;ל Sepharose עם 10 מ&quot;ל של 20 מ&quot;מ טריס, pH 8.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את ~ 40 מ&quot;ל של פתרון S100A12 באמצעות משאבת מדגם (לאסוף את הזרימה דרך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הטור עם 10 מ&quot;ל של 20 מ&quot;מ טריס, pH 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתח את העמודה עם שיפוע 0-30% (BuFfer B הוא 20 מ&quot;מ טריס, pH 8.0, 1 M NaCl) על 19 כרכים טור (קורות חיים, 95 מ&quot;ל). איסוף 5 מ&quot;ל שברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח aliquot 10 μL של כל חלק ולנתח באמצעות MES SDS PAGE עם מכתים Coomassie. הפעל ג&#39;ל באמצעות מתח קבוע (20 V / cm) למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת שברים המכילים S100A12. S100A12 פועל ב ~ 10 חלבון kDa על ג&#39;ל denaturing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרוכזים שברים ל 5 מ&quot;ל באמצעות מכשיר ultrafiltration (MWCO 10 kDa). צנטריפוגה ב XG 3000 במשך 8 דקות ~. קח את החלק העליון. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כרומטוגרפיה הדרת גודל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן את העמודה S75 עם 1 קורות חיים (120 מ&quot;ל) של 20 מ&quot;מ טריס pH 8, 100 mM NaCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק &lt;5 מ&quot;ל של שברים מרוכזים S100A12 (מתוך חילופי יונים כרומטוגרפיה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתח את הטור בקצב זרימה של 1 מ&quot;ל / מ מעל 120 מ&quot;ל. איסוף 5 מ&quot;ל שברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח aliquot 10 μL של כל חלק ולנתח באמצעות SDS PAGE עם מכתים Coomassie. אימות זהות חלבון באמצעותכתם המערבי או ספקטרומטריית מסה (מחושב המסה המולקולארית של יחידת משנה monomeric 10,575.0 דה, נמדד 10575.4 דה). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת שברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את ספיגת החלבון 280 באמצעות ספקטרופוטומטר. השתמש במאגר ה- SEC כחסר. מקדם הכחדה מחושב עבור S100A12 homodimer הוא 5960 M -1 ס&quot;מ -1 . הערה: תשואות אופייניות הם 35-45 מ&quot;ג של S100A12 לכל 50 מ&quot;ל של התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot S100A12 לתוך צינורות microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל (1 מ&quot;ג / צינור), הקפאה פלאש בחנקן נוזלי לאחסן ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol></li></ol> 3. פעילות אנטי מיקרוביאלית Assays <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פס H. pylori זן G27 על לוחות אגר טריפטי אגר בתוספת 5% כבשים דם (צלחות אגר דם). לגדול 2-3 ימים ב 37 מעלות צלזיוס באוויר בחדר בתוספת 5% פחמן דו חמצני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן H. pylori לתוך מרק ברוסלה בתוספת 1x כולסטרול. תרבות מעללילה רועד (250 סל&quot;ד) ב 37 מעלות צלזיוס באוויר בחדר בתוספת 5% פחמן דו חמצני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל H. pylori 1:10 לתוך 50% מרק ברוסלה, 50% חיץ calprotectin בתוספת 1x כולסטרול ותרבות בינונית או בתוספת של 100 מיקרומטר אבץ כלוריד פלוס 0, 100 או 1000 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של S100A12 מטוהרים. תרבות לילה רועד (250 סל&quot;ד) ב 37 מעלות צלזיוס באוויר בחדר בתוספת 5% פחמן דו חמצני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לבצע דילולים סדרתי צלחת על צלחות אגר דם. אפשר מושבות חיידקים לגדול במשך 2-3 ימים על 37 מעלות צלזיוס באוויר בחדר בתוספת 5% פחמן דו חמצני. למנות את המושבה להרכיב יחידות לחשב את הגידול החיידקי בנוכחות או היעדר של S100A12 ו / או אקסוגני אקס. </li></ol>

<ol>
	<li>Schiopu, A., Cotoi, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100A8+and+S100A9:+DAMPs+at+the+crossroads+between+innate+immunity,+traditional+risk+factors,+and+cardiovascular+disease.">S100A8 and S100A9: DAMPs at the crossroads between innate immunity, traditional risk factors, and cardiovascular disease.</a> Mediators Inflamm. 2013, 828354 (2013).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100A9+induced+inflammatory+responses+are+mediated+by+distinct+damage+associated+molecular+patterns+(DAMP)+receptors+in+vitro+and+in+vivo.">S100A9 induced inflammatory responses are mediated by distinct damage associated molecular patterns (DAMP) receptors in vitro and in vivo.</a> PLoS One. 10 (2), e0115828 (2015).</li><li>Chernov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+calcium-binding+proteins+S100A8+and+S100A9+initiate+the+early+inflammatory+program+in+injured+peripheral+nerves.">The calcium-binding proteins S100A8 and S100A9 initiate the early inflammatory program in injured peripheral nerves.</a> J Biol Chem. 290 (18), 11771-11784 (2015).</li><li>Fanjul, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+MRP8+and+MRP14+in+pancreatic+cell+lines:+differential+expression+and+localization+in+CFPAC-1+cells.">Presence of MRP8 and MRP14 in pancreatic cell lines: differential expression and localization in CFPAC-1 cells.</a> Am J Physiol. 268 (5 Pt 1), C1241-C1251 (1995).</li><li>Vogl, T., Gharibyan, A. L., Morozova-Roche, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-inflammatory+S100A8+and+S100A9+proteins:+self-assembly+into+multifunctional+native+and+amyloid+complexes.">Pro-inflammatory S100A8 and S100A9 proteins: self-assembly into multifunctional native and amyloid complexes.</a> Int J Mol Sci. 13 (3), 2893-2917 (2012).</li><li>Smith, S. P., Shaw, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+change-in-hand+mechanism+for+S100+signalling.">A change-in-hand mechanism for S100 signalling.</a> Biochem Cell Biol. 76 (2-3), 324-333 (1998).</li><li>Bresnick, A. R., Weber, D. J., Zimmer, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100+proteins+in+cancer.">S100 proteins in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 15 (2), 96-109 (2015).</li><li>Leclerc, E., Heizmann, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+Ca2+/Zn2++signaling+S100+proteins+and+RAGE+in+translational+medicine.">The importance of Ca2+/Zn2+ signaling S100 proteins and RAGE in translational medicine.</a> Front Biosci (Schol Ed). 3, 1232-1262 (2011).</li><li>Goyette, J., Geczy, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation-associated+S100+proteins:+new+mechanisms+that+regulate+function.">Inflammation-associated S100 proteins: new mechanisms that regulate function.</a> Amino Acids. 41 (4), 821-842 (2011).</li><li>Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+immunity+beyond+iron:+a+role+for+manganese+and+zinc.">Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc.</a> Curr Opin Chem Biol. 14 (2), 218-224 (2010).</li><li>Zackular, J. P., Chazin, W. J., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+Immunity:+S100+Proteins+at+the+Host-Pathogen+Interface.">Nutritional Immunity: S100 Proteins at the Host-Pathogen Interface.</a> J Biol Chem. 290 (31), 18991-18998 (2015).</li><li>Realegeno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100A12+Is+Part+of+the+Antimicrobial+Network+against+Mycobacterium+leprae+in+Human+Macrophages.">S100A12 Is Part of the Antimicrobial Network against Mycobacterium leprae in Human Macrophages.</a> PLoS Pathog. 12 (6), e1005705 (2016).</li><li>Perera, C., McNeil, H. P., Geczy, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100+Calgranulins+in+inflammatory+arthritis.">S100 Calgranulins in inflammatory arthritis.</a> Immunol Cell Biol. 88 (1), 41-49 (2010).</li><li>Moroz, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+S100A12-copper+complex:+implications+for+host-parasite+defence.">Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).</li><li>Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structures+of+human+S100A12+in+apo+form+and+in+complex+with+zinc:+new+insights+into+S100A12+oligomerisation.">The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation.</a> J Mol Biol. 391 (3), 536-551 (2009).</li><li>Moroz, O. V., Dodson, G. G., Wilson, K. S., Lukanidin, E., Bronstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+structural+states+of+S100A12:+A+key+to+its+functional+diversity.">Multiple structural states of S100A12: A key to its functional diversity.</a> Microsc Res Tech. 60 (6), 581-592 (2003).</li><li>Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Ions+Tune+the+Zinc-Sequestering+Properties+and+Antimicrobial+Activity+of+Human+S100A12.">Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12.</a> Chem Sci. 7 (2), 1338-1348 (2016).</li><li>Haley, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Antimicrobial+Protein+Calgranulin+C+Participates+in+Control+of+Helicobacter+pylori+Growth+and+Regulation+of+Virulence.">The Human Antimicrobial Protein Calgranulin C Participates in Control of Helicobacter pylori Growth and Regulation of Virulence.</a> Infect Immun. 83 (7), 2944-2956 (2015).</li><li>Cover, T. L., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+in+health+and+disease.">Helicobacter pylori in health and disease.</a> Gastroenterology. 136 (6), 1863-1873 (2009).</li><li>Tham, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+genotypes,+host+factors,+and+gastric+mucosal+histopathology+in+peptic+ulcer+disease.">Helicobacter pylori genotypes, host factors, and gastric mucosal histopathology in peptic ulcer disease.</a> Hum Pathol. 32 (3), 264-273 (2001).</li><li>Wotherspoon, A. C., Ortiz-Hidalgo, C., Falzon, M. R., Isaacson, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori-associated+gastritis+and+primary+B-cell+gastric+lymphoma.">Helicobacter pylori-associated gastritis and primary B-cell gastric lymphoma.</a> Lancet. 338 (8776), 1175-1176 (1991).</li><li>Correa, P., Piazuelo, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gastric+precancerous+cascade.">The gastric precancerous cascade.</a> J Dig Dis. 13 (1), 2-9 (2012).</li><li>de Martel, C., Forman, D., Plummer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastric+cancer:+epidemiology+and+risk+factors.">Gastric cancer: epidemiology and risk factors.</a> Gastroenterol Clin North Am. 42 (2), 219-240 (2013).</li><li>Algood, H. M., Gallo-Romero, J., Wilson, K. T., Peek, R. M., Cover, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+response+to+Helicobacter+pylori+infection+before+initiation+of+the+adaptive+immune+response.">Host response to Helicobacter pylori infection before initiation of the adaptive immune response.</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 51 (3), 577-586 (2007).</li><li>Gaddy, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+protein+calprotectin+modulates+the+Helicobacter+pylori+cag+type+IV+secretion+system+via+zinc+sequestration.">The host protein calprotectin modulates the Helicobacter pylori cag type IV secretion system via zinc sequestration.</a> PLoS Pathog. 10 (10), e1004450 (2014).</li><li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+expression+clones+and+auto-induction+for+protein+production+in+E.+coli.">Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli.</a> Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).</li><li>Gilston, B. A., Skaar, E. P., Chazin, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+transition+metals+to+S100+proteins.">Binding of transition metals to S100 proteins.</a> Sci China Life Sci. 59 (8), 792-801 (2016).</li><li>Corbin, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+chelation+and+inhibition+of+bacterial+growth+in+tissue+abscesses.">Metal chelation and inhibition of bacterial growth in tissue abscesses.</a> Science. 319 (5865), 962-965 (2008).</li><li>Kehl-Fie, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrient+metal+sequestration+by+calprotectin+inhibits+bacterial+superoxide+defense,+enhancing+neutrophil+killing+of+Staphylococcus+aureus.">Nutrient metal sequestration by calprotectin inhibits bacterial superoxide defense, enhancing neutrophil killing of Staphylococcus aureus.</a> Cell Host Microbe. 10 (2), 158-164 (2011).</li><li>Liu, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+sequestration+by+the+neutrophil+protein+calprotectin+enhances+Salmonella+growth+in+the+inflamed+gut.">Zinc sequestration by the neutrophil protein calprotectin enhances Salmonella growth in the inflamed gut.</a> Cell Host Microbe. 11 (3), 227-239 (2012).</li><li>Damo, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+manganese+sequestration+by+calprotectin+and+roles+in+the+innate+immune+response+to+invading+bacterial+pathogens.">Molecular basis for manganese sequestration by calprotectin and roles in the innate immune response to invading bacterial pathogens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3841-3846 (2013).</li><li>Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+calprotectin+is+an+iron-sequestering+host-defense+protein.">Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein.</a> Nat Chem Biol. 11 (10), 765-771 (2015).</li><li>Gaddy, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+Resists+the+Antimicrobial+Activity+of+Calprotectin+via+Lipid+A+Modification+and+Associated+Biofilm+Formation.">Helicobacter pylori Resists the Antimicrobial Activity of Calprotectin via Lipid A Modification and Associated Biofilm Formation.</a> MBio. 6 (6), e01349-e01315 (2015).</li><li>Testerman, T. L., Conn, P. B., Mobley, H. L., McGee, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+requirements+and+antibiotic+resistance+patterns+of+Helicobacter+species+in+chemically+defined+media.">Nutritional requirements and antibiotic resistance patterns of Helicobacter species in chemically defined media.</a> J Clin Microbiol. 44 (5), 1650-1658 (2006).</li><li>Leach, S. T., Mitchell, H. M., Geczy, C. L., Sherman, P. M., Day, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100+calgranulin+proteins+S100A8,+S100A9+and+S100A12+are+expressed+in+the+inflamed+gastric+mucosa+of+Helicobacter+pylori-infected+children.">S100 calgranulin proteins S100A8, S100A9 and S100A12 are expressed in the inflamed gastric mucosa of Helicobacter pylori-infected children.</a> Can J Gastroenterol. 22 (5), 461-464 (2008).</li><li>Wilkie-Grantham, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloperoxidase-dependent+lipid+peroxidation+promotes+the+oxidative+modification+of+cytosolic+proteins+in+phagocytic+neutrophils.">Myeloperoxidase-dependent lipid peroxidation promotes the oxidative modification of cytosolic proteins in phagocytic neutrophils.</a> J Biol Chem. 290 (15), 9896-9905 (2015).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

פרוטוקול יעיל הן ביטוי וטיהור האדם S100A12 מוצג. מערכת ביטוי קולי קולי הוא הכלי הנפוץ ביותר המשמש לייצור חלבונים רקומביננטי, במיוחד כאשר כמויות מ&quot;ג נדרשים מחקרים ביוכימיים וביופיסיקליים. שיפור המפתח של הנוהל המתואר כאן הוא השימוש של אוטומטי אינדוקציה מדיה 26 אשר מגדילה את התשואה של חלבון מטוהרים על ידי גורם של כמעט שלושים לעומת ביטוי עם תקן Luria-Media מדיה 18 . בנוסף, אוטומטי אינדוקציה התקשורת מאוד מפשט את העבודה ביטוי חלבון. באמצעות התקשורת צמיחה קונבנציונאלי, תרבויות יש לפקח ברציפות, כך סוכן המניע ניתן להוסיף בשלב הצמיחה מעריכי. אין צורך לפקח על פעמים הכפלה בעת שימוש אוטומטי אינדוקציה התקשורת. התרבויות מורשות לגדול לרוויה. במהלך השלבים הראשונים של צמיחה עם אוטומטי inductiעל התקשורת, E. coli משתמש גלוקוז כמקור פחמן. לאחר גלוקוז הוא מדולדל, החיידקים לעבור לקטוז כמקור פחמן אשר גורם ביטוי חלבון 26 . הרכב אוטומטי של אינדוקציה התקשורת הוא מכוון להפליא כדי לאפשר את הצמיחה של תרבויות בצפיפות גבוהה ולכן ביטוי מוגבר של חלבון רקומביננטי. מניסיוננו עם S100A12, מדיה אינדוקציה אוטומטית מגדילה באופן משמעותי את כמות החלבון לידי ביטוי, אולם אנו מזהירים כי זה עשוי להיות תלוי בחלבון צריך להיות מאומת בניסוי. S100A12 מתבטאת בשבר cytoplasmic של E. coli אשר מציע כי הוא מסיס מקופל היטב. הצעד הראשון של טיהור כרוך הוספת אחוז גבוה של אמוניום סולפט אשר משקעים רבים של אנדוגניים E. חלבונים coli . צעד זה ממנף את היציבות הגבוהה ואת המסיסות של משפחת S100 של חלבונים. S100A12 הוא חומצי בינוני (pI 5.81). כך S100A12 הוא מטוהרים נוספת עם שרף חילופי אניון חזק. השלב האחרון בתהליך הטיהור הוא עמודה כרומטוגרפית של אי-הכללת גודל המבטיחה ש- S100A12 הוא מונודיספריס ודימריק. שלב זה של פרוטוקול חיוני כמו S100A12 הוכח טופס oligomers מסיס 15 וזה לא ידוע מה להשפיע אוליגומריזציה על פעילות מיקרוביאלית שלה. מאז חברי בכיתה S100 לשתף רצף גבוה הומולוגיה מבנית, התכונות הפיזיות שלהם דומים 27 . לפיכך, שיטה זו של טיהור של S100A12 עשוי להיות מיושם באופן רחב על כל חלבונים S100 אשר באים לידי ביטוי בחלק מסיס של E. coli. עבודה קודמת הוכיחה כי לחלבוני S100, כגון calprotectin, יש פעילות מיקרוביאלית נגד פתוגנים חיידקיים כגון H. pylori, וכי פעילות זו תלויה בפעילות מחייב אבץ 25 . המיקרוIal הפעילות של S100A12 הוא גם תלוי אבץ, אך עיכוב הצמיחה הוכיח מבחני הצמיחה חיידקי מגלה כי באופן משמעותי יותר S100A12 נדרש כדי לעכב את הצמיחה לעומת אחרים S100 משפחה חלבונים כגון calprotectin. לכן, חשוב להשתמש בריכוז גבוה יותר של S100A12 מאשר calprotectin כדי להשיג פנוטיפים דומים (עיכוב צמיחה או שינויים ארסיות). יישומים עתידיים של פרוטוקול זה יכול להיות מיושם כדי לקבוע את השינויים הגלובליים ביטוי גנטי ביטוי חיידקי, metabolomic, או proteomic בתגובה תגובה המתכת שהוטלו על ידי S100A12.

S100 חלבונים הם מחלקה של EF יד המשפחה של סידן מחייב חלבונים עם מגוון רחב של פונקציות 1 . הם באים לידי ביטוי באופן רקמות תא ספציפי, לווסת מגוון רחב של פונקציות הסלולר 2 , 3 . ייחודי חלבונים סידן מחייב, חלבונים S100 התערוכה הן פונקציות תאיים תאיים 4 , 5 . בתוך התא, Ca 2 + מחייב גורם לשינוי קונפורמציה החושפת משטח הידרופובי כי מטרות ספציפיות חלבון מחייב שותפים 6 . מנגנון תאיים זה מסדיר תהליכים חשובים כגון התפשטות תאים, התמיינות ואנרגיה מטבוליזם. בסביבה תאית, S100 חלבונים התערוכה שתי פונקציות 7 . באחד מהם, הם פועלים כנזק הנלווה לחלבון המולקולרי (DAMP) ויוצרים פרו-דלקתהתגובה החיסונית אטורי באמצעות אינטראקציה עם קולטנים הכרה דפוס 8 , 9 . בנוסף, כמה חברים של מחלקה S100 חלבון sequester המעבר מתכות, פונקציה המשמשת להרעב פתוגנים חיידקים בתהליך המכונה החסינות התזונתיים 10 , 11 . S100A12 (הידוע גם בשם calgranulin C ו- EN-RAGE) מתבטאת מאוד מקרופאגים ונויטרופילים ו זוהו כסימן ביולוגי פוטנציאלי למחלות דלקתיות 12 , 13 . בנוסף סידן מחייב באתרי EF-Hand שלה, S100A12 יש שני זיקה גבוהה מתכת מחייב אתרים הממוקם בקצה השני של ממשק dimer 14 , 15 . כל אתר מחייב מורכב משלושה שאריות histidine ושאריות חומצה אחת aspartic והוא יכול chelate אבץ או נחושת &lt;Sup class = &quot;xref&quot;&gt; 16 , 17 . לאחרונה, דיווחנו כי רעב אבץ תלוי S100A12 חשוב בויסות הצמיחה של הליקובקטר פילורי ופעילותם של גורמים ארסתיים דלקתיים 18 . H. pylori מדביק את הבטן של כמחצית מאוכלוסיית האדם בעולם; מה שהופך אותו ללא ספק לאחד הפתוגנים החיידקים המצליחים ביותר 19 . זיהום עם H. pylori יכול להוביל לתוצאות משמעותיות של מחלת קיבה, כולל גסטריטיס, כיב פפטי ותריסריון, רירית לימפומה לימפומה (MALT), וכן אדנוקרצינומה קיבה פולשנית (סרטן הקיבה). סרטן הקיבה הוא הגורם המוביל למוות שאינו קשור לסרטן בסרטן בעולם, וגורם הסיכון הגדול ביותר הקשור לסרטן הקיבה הוא זיהום ב- H. pylori . H. pylori נמשכת נישה קיבה למרות robuSt התגובה החיסונית הפתוגן, מדגיש את הצורך בהבנה טובה יותר של מנגנוני החיסון של שליטה זה זיהום חיידקי 20 , 21 , 22 , 23 . H. pylori - דלקת נלווה מאופיינת בחדירה עמוקה של תאים פולימורפונומיים, או נויטרופילים, המפקידים רפרטואר של חלבונים אנטי-מיקרוביאליים, כולל S100A12, באתר ההדבקה 18 , 24 , 25 . במאמץ להבין את הדיאלוג המורכב בין המארח לבין הפתוגן, ביקשנו לחדד את הטכניקה לטהר את S100A12 ולהשתמש בה כדי לחקור את המיקרוביאליות שמשפיעה על הפתוגן הרלוונטי מבחינה רפואית. פרוטוקול להלן מתאר טכניקה משופרת לטיהור S100A12 במצב פעיל ביולוגית שלה; המסוגל לחייב מתכות מזין עם אפיני גבוההTy ו chelating אותם מן הפולש מיקרואורגניזמים. יתר על כן, השיטות להלן מדגישות את התועלת של חלבון זה כמגיב קריטי כדי לחקור את המנגנון שבו מולקולות מולקולות מולדות להגביל את הצמיחה של פתוגנים חיידקיים. S100A- חלבונים משפחתיים זכו להערכה כקבוצה חשובה של מולקולות מערכת החיסון המולדת אשר משתתפים איתות החיסון וכן ההגנה המארח 27 . המחקר הטוב ביותר של אלה הוא calprotectin (MRP-8/14, calgranulin A / B, S100A8 / A9) 28 , 29 , 30 . Calprotectin הוא נויטרופיל הקשורים חלבון אשר יוצר heterodimer של S100A8 ו S100A9 יחידות משנה אשר נקשר מתכות המעבר בממשק dimer 31 . Calprotectin הוכח להחזיק שני אתרי מחייב מתכת: אתר 1 יכול לקשור Zn 2 + , Mn 2 + , או Fe 2 + , ואת האתר 2 יכול<html> כץ Zn 2+ 31 , 32 . דיווחים רבים הוכיחו שלקאלפרוקטין יש פעילות אנטי-מיקרוביאלית נגד גורמים שונים כגון Staphylococcus aureus , קנדידה אלביקנס , Acinetobacter baumannii , דלקת ריאות של קלבסילה , Escherichia coli ו- H. pylori , וכי ההשפעות המעכבות נובעות מפעולת הקלציה המתכתית של calprotectin 25 , 28 , חשוב מחקרים קודמים הראו כי פעילות ה- Calprotectin מפעילה מספר רב של פעילויות על H. pylori, כולל שינוי השומנים מבנה בקרום החיצוני, הדחקה של מערכת הפרשת הטיפוס הרביעי (שהיא גורם ארסי פרו-דלקתני משמעותי בתוך H. pylori ), יצירת היווצרות ביופילם והדחקה H. pylori הצמיחה ואת הכדאיות באופן תלוי מינוןClass = &quot;xref&quot;&gt; 25 , 33 . יתר על כן, בדיקות גנטיות וביוכימיות חשפו את הפעילות האנטיבקטריאלית של קלפרוטקטין כנגד H. pylori נבעה ברובה מיכולתה לקשור אבץ מזין 25 . H. pylori דורש אבץ, כפי שנקבע על ידי מחקר קודם אשר ניצל בינוני מוגדר כימית כדי לוודא את הדרישות micronutrient עבור הפתוגן הזה לגדול ולהתרבות 34 . בנוסף, קלפרוקטין היה שופע מאוד בתוך רקמות נגועות ב H. pylori , והוא קשור לחדירים נויטרופילים, דבר המצביע על כך שהמארח עשוי להעסיק את ה- Calprotectin כאסטרטגיה אנטי-מיקרוביאלית במהלך ההדבקה ודלקת שלאחר מכן , 25 , 35 . עדויות חדשות מ טכניקות הקרנה proteomics unbiased עולה כי בתנאים בהם מינים חמצן תגובתי בשפע, calprotecפח עובר שינויים לאחר טרנסלוציאציה אשר משנים את האתר מחייב hexa histidine, ובכך מעכב את הפעילות מחייב מתכת של חלבון 36 . ככזה, שיערנו כי חלבונים אחרים של משפחת S100A בין הרפרטואר הרחב של המולקולות הללו עשויים לשמש ככלי עזר-מתכת עזר. בחרנו את S100A12 לצורך מחקר נוסף, משום שהוא לא זוהה במסך הנ&quot;ל לתמורות פוסט-טרנסלציוניות, יש לו את היכולת לקשור אבץ, והוא שופע מאוד ברקמות אנושיות הנגזרות מאנשים של H. pylori- infected. העבודה שלנו מצביעה על כך ש- S100A12 יכול לעכב את צמיחת ה- H. pylori ואת הכדאיות במינון תלוי במינון G27 של H. pylori , וכי פעילות מיקרוביאלית של חלבון זה יכולה להפוך על ידי תוספת של אבץ מזין עודף. עבודה זו משלימה את העבודה הקודמת שלנו המעידה על פעילות מיקרוביאלית של S100A12 נגד PMSS1 ו- 7.13 זנים של H. pylori , מדגים פעילות אנטיבקטריאלית רחבה נגד מבודדים קליניים רבים זנים מותאמים למעבדה של H. pylori 18 . יחד, תוצאות אלה מאשרות את החשיבות של S100A12 כמנגנון לבקרה על צמיחה וחיידקים בקטריאליים באמצעות חסינות תזונתיים. מחקרים עתידיים על אינטראקציה חשובה זו של חיידק מארח יכולים לכלול ניצול של הפעילות של S100A12 כדי להפחית את נטל החיידקים ברקמות המארחות, או לקבוע את תרומתו של חלבון זה לחיבור החיסון בהקשר של זיהום H. pylori .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>S100A12 Expression</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expression cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL 21 (DE3) competent cells</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C25271</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoinduction medium components</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>Y20020-250.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>S23020-500.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>T60060-250.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2877</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>M65240-100.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>S23100-500.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>P41200-500.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A20424-500.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2SO4</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>S25150-500.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>G22020-1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>G32040-500.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lactose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2643</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selection agent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A40040-5.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100A12 Purification</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Start Chromatography System</td>
			<td>GE</td>
			<td>29-220-94</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Q Sepharaose Fast Flow</td>
			<td>GE</td>
			<td>17-5156-01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiPrep 16/60 S-200 HR</td>
			<td>GE</td>
			<td>17-1166-01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop lite spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-LITE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>T60040-1000.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H. pylori Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood agar plates</td>
			<td>Lab Supply Company</td>
			<td>BBL221261</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brucella broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B3051</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol (250X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12531018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>793566</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>229997</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression, purification, and antimicrobial activity of s100a12

חלבונים Calgranulin הם מתווכים חשובים של חסינות מולדת הם חברי המעמד S100 של המשפחה EF יד של חלבונים מחייב סידן. כמה חלבונים S100 יש את היכולת לקשור מתכות המעבר עם זיקה גבוהה ביעילות לשלוף אותם מן הפתוג חיידקים פתוגנים בתהליך זה כינה &quot;חסינות תזונתיים&quot;. S100A12 (EN-RAGE) מחייב הן אבץ והן נחושת, והוא שופע בתאי חיסון מולדים כגון מקרופאגים ונויטרופילים. אנו מדווחים על שיטה מעודנת לביטוי, העשרה וטיהור של S100A12 בתצורה הפעילה והמתכתבת. ניצול של חלבון זה בצמיחה חיידקים וניתוחי חיוניות מגלה כי S100A12 יש פעילות מיקרוביאלית נגד הפתוגן חיידק , Helicobacter pylori . הפעילות המיקרוביאלית מבוססת על פעילות מחייב אבץ של S100A12, אשר chelates אבץ מזין, ובכך רעב H. pylori אשר דורש אבץ לצמיחה pרוליפרציה.

S100A12 ביטוי וטיהור טיהור שלושה שלבים המיוצר ~ 40 מ&quot;ג של רקומביננטי S100A12 מ 50 מ&quot;ל של תרבות חיידקים. הצעד הראשון היה משקעים סולפט אמוניום של חלבונים אנדוגניים E. coli . צעד זה היה ואחריו anion חילופי כרומטוגרפיה ( איור 1 א ). החלבון הוא במעקב על ידי SDS-PAGE מוכתם עם כחול מבריק Coomassie ( איור 1 ב ). השלב האחרון של הליך טיהור מעורב איגום שברים המכילים S100A12 עבור כרומטוגרפיה הדרה גודל המפריד חלבונים על ידי משקל מולקולרי צורה ( איור 2 א ). S100A12 הוא homodimer (92 חומצות אמינו לכל יחידת משנה) ויש לו משקל מולקולרי כולל של כ 21 kDa. שברים שנאספו מן הכרומטוגרפיה ההדרה גודל נותחו על ידי SDS-PAGE ו דמיינו ידי מכתים קומסי ( איור 2 ב </sTrong&gt;). S100A12 מדכא את הצמיחה החיידקית באמצעות פעילות קלץ אבץ כדי לחקור את פעילות מיקרוביאלית של S100A12, ניתוחי חיוניות בקטריאלי בוצעו באמצעות טכניקות כמותיות התרבות המיקרוביולוגית ( איור 3 ). ספירה של תאים חיידקיים מגלה כי חשיפה 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של S100A12 בנוכחות או היעדר של מקור אקסוגני של אבץ מזין אינו מעכב באופן משמעותי את הכדאיות חיידקים לעומת בקרות ללא הוספת S100A12 (P&gt; 0.05, Anova דרך אחת). עם זאת, חשיפה ל 1000 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של S100A12 ב בינוני לבדו תוצאות ירידה של פי 69 חיוניות בקטריאלי לעומת המדיום לבדו (P = 0.0193, סטודנט לא מבחן, P&gt; 0.05 דרך אחת ANOVA); תוצאה שהופכה על ידי תוספת של מקור אקסוגני של אבץ מזין (P = 0.023, מבחן הסטודנט של t ). תוצאות אלה deMonstrate פעילות מיקרוביאלית של S100A12 תלוי בפעילות אבץ שלה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55557/55557fig1.jpg" /> איור 1: תא תמוך וטיהור S100A12 ידי כרומטוגרפיה אניון החליפין . ( א ) כרומטוגרמה של טיהור יון חילופי. עקבות של ספיגה UV ב 280 ננומטר מוצג כחול, שיפוע מלח מתואר ורוד, שברים שנאספו מסומנים באדום. ( ב ) SDS PAGE ג&#39;ל של שלבי טיהור. נתיבים: 1) תקן משקל מולקולרי 2) חלק מסיס lysate 3) אמוניום גופרתי גלולה 4) אמוניום סולפט supernatant 5-14) ש שברים כרומטוגרפיה 6-15. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55557/55557fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" srC = &quot;/ files / ftp_upload / 55557 / 55557fig2.jpg&quot; /&gt; איור 2: גודל chromatography ההדרה תוצאות של טיהור S100A12. ( א ) כרומטוגרמה של תוצאות הדרה גודל. עקבות ספיגת UV ב 280 ננומטר מוצג כחול, שברים שנאספו מסומנים באדום. ( ב ) SDS PAGE ג &#39;ל של כרומטוגרפיה הדרה גודל. נתיבים: 1) סמן משקל מולקולה 2) עומס מדגם 3-15) שברים 10-21. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55557/55557fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55557/55557fig3.jpg" /> איור 3: ניתוח כמותי של התרבות של הכדאיות חיידקים בתגובה לחשיפה קלץ אבץ S100A12 תלוי. חיידקים נחשפו 0, 100, או 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של S100A12 בינוני לבד (אפור ברים), או בינוני בתוספת 100 מיקרומטר אבץ כלוריד(ברים שחורים). חשיפה ל -1,000 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​בהעדר מקור אקסוגני של אבץ מזין תוצאות בעיכוב משמעותי של הכדאיות חיידקי (* P &lt;0.05, מבחן t של התלמיד לעומת בינוני + מצב אבץ). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55557/55557fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12 at JoVE.com

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

כאן, אנו מציגים שיטה להביע ולטהר S100A12 (calgranulin C). אנו מתארים פרוטוקול למדידת פעילות אנטי מיקרוביאלית שלו נגד הפתוגן האנושי H. pylori .

הביטוי, טיהור, פעילות אנטי מיקרוביאלית של S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

expression-purification-and-antimicrobial-activity-of-s100a12

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Biochemistry

Unit 1

Drugs for Peptic Ulcer Disease

SCIENTISTS IN ACTION

8.3K Views.  Fisk University.  כאן, אנו מציגים שיטה להביע ולטהר S100A12 (calgranulin C). אנו מתארים פרוטוקול למדידת פעילות אנטי מיקרוביאלית שלו נגד הפתוגן האנושי H. pylori . 

Video: Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug used to treat depression and anxiety by binding to the serotonin transporter with high-affinity, blocking serotonin reuptake. Here we report an efficient procedure and a set of tools to stabilize, express, purify, and crystallize serotonin transporter-antibody complexes bound to S-citalopram and other antidepressants. Mutations which stabilize the serotonin transporter were identified using an S-citalopram binding assay. Serotonin transporter expressed in baculovirus-transduced HEK293S GnTI- cells, was reconstituted into proteoliposomes and used to raise high-affinity antibodies. We have developed a strategy to discover antibodies that are useful for structural studies. A straightforward approach for the expression of antibody fragments in Sf9 cells has also been established. Transporter-antibody complexes purified using this procedure are well-behaved and readily crystallize, producing complexes with S-citalopram that diffract X-rays to 3-4 &#197; resolution. The strategies developed here can be utilized to determine the structure of other challenging membrane proteins.

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

This manuscript describes how to screen for thermostabilizing mutations, purify the human serotonin transporter, generate high affinity antibodies, and crystallize the serotonin transporter-antibody complex bound to the antidepressant drug S-citalopram. This protocol can be adapted to the study of other challenging membrane transporters, receptors, and channels.

Thermostabilization, ביטוי, טיהור, התגבשות של Transporter סרוטונין האדם Bound כדי<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the antibody genes followed by stable transfection into a suitable cell line. The stable clones are subjected to screening in order to select those clones with desired production and growth characteristics. This is a critical albeit time-consuming step in the process. This protocol considers vector selection and sourcing of antibody sequences for the expression of a therapeutic antibody. The methods describe preparation of vector DNA for stable transfection of a suspension variant of human embryonic kidney 293 (HEK-293) cell line, using polyethylenimine (PEI). The cells are transfected as adherent cells in serum-containing media to maximize transfection efficiency, and afterwards adapted to serum-free conditions. Large scale production, setup as batch overgrow cultures is used to yield antibody protein that is purified by affinity chromatography using an automated fast protein liquid chromatography (FPLC) instrument. The antibody yields produced by this method can provide sufficient protein to begin initial characterization of the antibody. This may include in vitro assay development or physicochemical characterization to aid in the time-consuming task of clonal screening for lead candidates. This method can be transferable to the development of an expression system for the production of biosimilar antibodies.

This protocol describes the production of a therapeutic antibody in a mammalian expression system. The methods described include preparation of vector DNA, stable transfection and serum-free adaptation of a human embryonic kidney 293 cell line, set up of large scale cultures and purification using affinity chromatography.

הפקה בקנה מידה מעבדתי וטיהור של נוגדן רפואי

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine and remain largely unknown. With recent advances in single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) shedding light on the structural features of agonist binding sites and the activation mechanism of several ion channels, the stage is set for an in-depth dynamic analysis of their gating mechanisms using spectroscopic approaches. Spectroscopic techniques such as electron paramagnetic resonance (EPR) and double electron-electron resonance (DEER) have been mainly restricted to the study of prokaryotic ion channels that can be purified in large quantities. The requirement for large amounts of functional and stable membrane proteins has hampered the study of mammalian ion channels using these approaches. EPR and DEER offer many advantages, including determination of the structure and dynamic changes of mobile protein regions, albeit at low resolution, that might be difficult to obtain by X-ray crystallography or cryo-EM, and monitoring reversible gating transition (i.e., closed, open, sensitized, and desensitized). Here, we provide protocols for obtaining milligrams of functional detergent-solubilized transient receptor potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) that can be labeled for EPR and DEER spectroscopy.

This article describes specific methods to obtain biochemical quantities of detergent-solubilized TRPV1 for spectroscopic analysis. The combined protocols provide biochemical and biophysical tools that can be adapted to facilitate structural and functional studies for mammalian ion channels in a membrane-controlled environment.

טיהור, בנייתו מחדש של TRPV1 לניתוח Spectroscopic

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- channel (CaCC) predominantly expressed in retinal pigment epithelium (RPE). The physiological and pathological significance of BEST1 is highlighted by the fact that over 200 distinct mutations in the BEST1 gene have been genetically linked to a spectrum of at least five retinal degenerative disorders, such as Best vitelliform macular dystrophy (Best disease). Therefore, understanding the biophysics of bestrophin channels at the single-molecule level holds tremendous significance. However, obtaining purified mammalian ion channels is often a challenging task. Here, we report a protocol for the expression of mammalian bestrophin proteins with the BacMam baculovirus gene transfer system and their purification by affinity and size-exclusion chromatography. The purified proteins have the potential to be utilized in subsequent functional and structural analyses, such as electrophysiological recording in lipid bilayers and crystallography. Importantly, this pipeline can be adapted to study the functions and structures of other ion channels.

The purification of ion channels is often challenging, but once achieved, it can potentially allow in vitro investigations of the functions and structures of the channels. Here, we describe the stepwise procedures for the expression and purification of mammalian bestrophin proteins, a family of Ca2+-activated Cl- channels.

ביטוי וטיהור של תעלות יונים Bestrophin מידע יונקים

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a chemical defense because it has antimicrobial activity and is considered a natural insecticide. Caffeine can also produce negative allelopathic effects that prevent the growth of surrounding plants. In addition, people around the world consume caffeine for its analgesic and stimulatory effects. Due to interest in the technological applications of caffeine, research on the biosynthetic pathway of this compound has grown. These studies have primarily focused on understanding the biochemical and molecular mechanisms that regulate the biosynthesis of caffeine. In vitro tissue culture has become a useful system for studying this biosynthetic pathway. This article will describe a step-by-step protocol for the quantification of caffeine and for measuring the transcript levels of the gene (CCS1) encoding caffeine synthase (CS) in cell suspensions of C. arabica L. as well as its activity.

This protocol describes an efficient methodology for the extraction and quantification of caffeine in cell suspensions of C. arabica L. and an experimental process for evaluating the enzymatic activity of caffeine synthase with the expression level of the gene that encodes this enzyme.

מיצוי קפאין, פעילות אנזימטיות, ביטוי גנים של קפאין סינתאז מ המתלים תא צמח

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic purification methods. This manuscript illustrates the technical details involved in the anaerobic purification process, including the preparation of buffers and reagents, the methods for column chromatography in a glove box, and the desalting of the protein prior to kinetics. Also described are the methods for preparing and using an oxygen electrode to perform kinetic characterization of an oxygen-utilizing enzyme. These methods are illustrated using the dioxygenase enzyme DesB, a gallate dioxygenase from the bacterium Sphingobium sp. strain SYK-6.

Here we present a protocol for anaerobic protein purification, anaerobic protein concentration, and subsequent kinetic characterization using an oxygen electrode system. The method is illustrated using the enzyme DesB, a dioxygenase enzyme which is more stable and active when purified and stored in an anaerobic environment.

חלבון אנאירובית טיהור וניתוח קינטי באמצעות אלקטרודה חמצן ללמוד DesB Dioxygenase פעילות וניגוד

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium homeostasis, particularly store-operated calcium entry, which is critical to maintaining proper function of synaptic vesicle release and intracellular signaling pathways. Accordingly, TRPC channels have been implicated in a variety of human diseases including cardiovascular disorders such as cardiac hypertrophy, neurodegenerative disorders such as Parkinson&#39;s disease, and neurologic disorders such as spinocerebellar ataxia. Therefore, TRPC channels represent a potential pharmacologic target in human diseases. However, the molecular mechanisms of gating in these channels are still unclear. The difficulty in obtaining large quantities of stable, homogeneous, and purified protein has been a limiting factor in structure determination studies, particularly for mammalian membrane proteins such as the TRPC ion channels. Here, we present a protocol for the large-scale expression of mammalian ion channel membrane proteins using a modified baculovirus gene transfer system and the purification of these proteins by affinity and size-exclusion chromatography. We further present a protocol to collect single-particle cryo-electron microscopy images from purified protein and to use these images to determine the protein structure. Structure determination is a powerful method for understanding the mechanisms of gating and function in ion channels.

This protocol describes techniques used to determine ion channel structures by cryo-electron microscopy, including a baculovirus system used to efficiently express genes in mammalian cells with minimum effort and toxicity, protein extraction, purification, and quality checking, sample grid preparation and screening, as well as data collection and processing.

הביטוי ולטיהור TRPC3 האדם רגיש השומנים הקטיון ערוץ לקביעת מבניים על-ידי הקפאה יחיד-חלקיקים-מיקרוסקופ

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also known as Band 3), the most abundant membrane protein in the red blood cells. The SLC4 family is homologous with borate transporters, which have been characterized in plants and fungi. It remains a significant technical challenge to express and purify membrane transport proteins to homogeneity in quantities suitable for&#160;structural or functional studies. Here we describe detailed procedures for the overexpression of borate transporters in Saccharomyces cerevisiae, isolation of yeast membranes, solubilization of protein by detergent, and purification of borate transporter homologs from S. cerevisiae, Arabidopsis thaliana, and Oryza sativa. We also detail a glutaraldehyde cross-linking experiment to assay multimerization of homomeric transporters. Our generalized procedures can be applied to all three proteins and have been optimized for efficacy. Many of the strategies developed here can be utilized for the study of other challenging membrane proteins.

Here we present a protocol to express, solubilize, and purify several eukaryotic borate transporters with homology to the SLC4 transporter family using yeast. We also describe a chemical cross-linking assay to assess the purified homomeric proteins for multimeric assembly. These protocols can be adapted for other challenging membrane proteins.

ביטוי Solubilization, טיהור של בוראט האיקריוטים שנאים

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, fluorophores are prone to loss of signal via photobleaching by dissolved oxygen (O2). To prevent photobleaching and extend the fluorophore lifetime, oxygen scavenging systems (OSS) are employed to reduce O2. Commercially available OSS may be contaminated by nucleases that damage or degrade nucleic acids, confounding interpretation of experimental results. Here we detail a protocol for the expression and purification of highly active Pseudomonas putida protocatechuate-3,4-dioxygenase (PCD) with no detectable nuclease contamination. PCD can efficiently remove reactive O2 species by conversion of the substrate protocatechuic acid (PCA) to 3-carboxy-cis,cis-muconic acid. This method can be used in any aqueous system where O2 plays a detrimental role in data acquisition. This method is effective in producing highly active, nuclease free PCD in comparison with commercially available PCD.

Protocatechuate 3,4-dioxygenase (PCD) can enzymatically remove free diatomic oxygen from an aqueous system using its substrate protocatechuic acid (PCA). This protocol describes the expression, purification, and activity analysis of this oxygen scavenging enzyme.

ביטוי וטיהור של Nuclease-מזבל החמצן חינם Protocatechuate 3, 4-דיחמצן

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this superfamily generally display multi-functionality, involving mainly hydrolase and decarboxylase mechanisms. This article presents a series of consecutive methods for the expression and purification of FAHD proteins, mainly FAHD protein 1 (FAHD1) orthologues among species (human, mouse, nematodes, plants, etc.). Covered methods are protein expression in E. coli, affinity chromatography, ion exchange chromatography, preparative and analytical gel filtration, crystallization, X-ray diffraction, and photometric assays. Concentrated protein of high levels of purity (&#62;98%) may be employed for crystallization or antibody production. Proteins of similar or lower quality may be employed in enzyme assays or used as antigens in detection systems (Western-Blot, ELISA). In the discussion of this work, the identified enzymatic mechanisms of FAHD1 are outlined to describe its hydrolase and decarboxylase bi-functionality in more detail.

Expression and purification of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins is described with examples (expression in E. coli, FPLC). Purified proteins are used for crystallization and antibody production and employed for enzyme assays. Selected photometric assays are presented to display the multi-functionality of FAHD1 as oxaloacetate decarboxylase and acylpyruvate hydrolase.

הביטוי, טיהור, פעילות אנטי מיקרוביאלית של S100A12

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Thermostabilization, ביטוי, טיהור, התגבשות של Transporter סרוטונין האדם Bound כדי