. אנחנו אסירי תודה על הדיונים מתחשב עם חברי המעבדה Ju Zhong מעבדה, ואת התמיכה הכלכלית מטעם אוניברסיטת מצב רייט.

הערה: פרוטוקול המתוארים כאן מיועדת לסינון פלסמידים ספריית הכלול 10 צלחות 96-ובכן אבל וניתן לשנותם למעלה או למטה בהתאם. הפרוטוקול צריך לחזור כדי להשלים את ההקרנה כל ספריה. בדרך כלל, הקרנה נגד 10 צלחות של ספריית גנים בכל פעם ניתן לטפל בנוחות על ידי אדם אחד.
1. הכנה 96-ובכן שמרים טרנספורמציה
הערה: שלב זה מתבצע כמו בעבר תיאר7,10.
<ol><li>Aliquot 5 µL (בערך 50 – 100 ng) של פלסמיד DNA מספריה פלסמיד ערוכים כל טוב של צלחת 96-ובכן סיבוב המדרגה. הערה: דוגמה כזו ספרייה יהיה ספריית10ביטוי גנים שמרים.</li>
	<li>לחסן 150 מ ל מדיה דקסטרוז (YPD) peptone שמרים בבקבוקון 500 מ"ל עם מושבה (2 – 3 מ מ קוטר) של המתח הפלואידי שמרים W303α. דגירה אותם בן לילה ב 30 מעלות צלזיוס ברעידות (200 סל ד).</li>
	<li>למחרת בבוקר, למדוד את יתר600 של התרבות לילה ו לדלל את תרבות שמרים OD600 = 0.1 ב (עד) 2 ל' של YPD. תקופת דגירה זה ב 30 מעלות צלזיוס ברעידות (200 סל ד) של ~ 5 h עד התרבות מגיע OD600 = 0.4-0.6.</li>
</ol>2. שמרים טרנספורמציה
<ol><li>קציר התרבות שמרים על ידי מילוי שמיניית צנטריפוגה סטרילי 250 מ ל ו צריך שתוציאו אותם בטמפרטורת החדר x 3000 g עבור 10 דקות יוצקים את תגובת שיקוע מבלי לשבש את פעולת בגדר. הערה: לבצע את כל השלבים צנטריפוגה בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לשטוף את השמרים עם סטרילי מזוקק H2O. בשביל זה, להוסיף 100 מ של סטרילי H2O כל בקבוק צנטריפוגה, מערבולת זה ל resuspend בגדר תא. לשלב את התאים שטף 2 בקבוקים ו צנטריפוגה אותם ב x 3000 g עבור 5 דק יוצקים את תגובת שיקוע.</li>
	<li>רוחצים את התאים כל בקבוק ב- 100 מ של 0.1 M LiOAc/1XTE (100 מ מ LiOAc; 10 מ מ. טריס, pH 8.0; 1 מ מ EDTA) את centrifuge אותם ב x 3000 g עבור 5 דק לשפוך את תגובת שיקוע.</li>
	<li>בזמן, צריך שתוציאו להרתיח 5 מ של זרע סלמון DNA (10 מ"ג/מ"ל) ב- 100 ° C באמצעות תנור בלוק במשך 3 דקות, ואז צנני את זה על קרח.</li>
	<li>Resuspend בגדר תא ב 25 מ של 0.1 M LiOAc/1XTE ב כל בקבוק, לשלב את התאים resuspended ולהעביר אותם אל בקבוק 150 מ. הוסף 5 מ של טרום מקורר הזרע סלמון DNA, דגירה זה ב 30 ° C עם טלטול (225 סל ד) למשך 30 דקות.</li>
	<li>שופכים את התערובת תא לתוך מאגר ריאגנט חד פעמי סטרילי, באמצעות פיפטה רב-ערוצי, להעביר כל טוב של צלחת 96-ובכן עגול-התחתון המכיל את פלסמיד ספריית דנ א 35 µL של תערובת תא. מערבולת 96-ובכן צלחות באמצעות vortexer צלחת עבור 1 דקות ב- 1000 סל ד. דגירה הלוחות למשך 30 דקות ב 30 מעלות צלזיוס מבלי לרעוד. הערה: לא מחסנית הצלחות, אז החום ניתן להעביר בצורה יעילה יותר. מצאנו כי vortexing הצלחות 96-ובכן-1,000 סל ד אינו גורם נוזלי לשפוך החוצה הבארות, אך מהירות מערבולת בטוח צריך להיבדק לפני ביצוע השלב.</li>
	<li>בבקבוקון, להכין 200 מ של המאגר טרנספורמציה המכילה ריכוז סופי של 40% PEG3350, דימתיל סולפוקסיד 10% ו- 0.1 M LiOAc. הכנת המאגר טרנספורמציה מיד לפני השימוש ומערבבים אותו ביסודיות ע י ניעור.</li>
	<li>הסר 96-ובכן הצלחות מן החממה של 30 מעלות צלזיוס ומערבבים אותם ל 30 s ב 1,000 סל ד באמצעות vortexer על צלחת. להוסיף µL 125 המאגר טרנספורמציה כל טוב ולאחר מכן מערבולת הלוחות עבור 1 דקות בכל 1,000 סל ד.</li>
	<li>דגירה הלוחות ב 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות וחום ואז הלם השמרים על-ידי הצבת הלוחות חממה 42 º C למשך 15 דקות. הערה: לא מחסנית את הצלחות.</li>
	<li>Centrifuge הלוחות עבור 5 דקות ב x 3000 g. הסר המאגר טרנספורמציה מן הבארות על ידי היפוך הלוחות על פח אשפה ולזרוק בכוח המאגר של הלוחות. כתם במהירות את הצלחות הפוכה על מגבת נייר נקי כדי להסיר את כל נוזל על הצלחות.</li>
	<li>יש לשטוף את התאים על-ידי הוספת µL 200 הצלחות של הנשירה מינימלי בינונית המתאים דה מרקר לבחירה על פלסמיד הספרייה. הערה: השתמשנו ההחלטיים סינתטי-בינוני.</li>
	<li>Centrifuge הלוחות עבור 5 דקות ב x 3000 g ולהסיר את תגובת שיקוע על סל פסולת כמו שלב 2.10.</li>
	<li>הוסף µL 160 של מינימלי עורה-בינוני המכיל 2% גלוקוז. מערבולת הלוחות עבור 1 דקות ב- 1,000 סל ד דגירה אותם ב 30 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות מבלי לרעוד. לאחר 48 שעות, שימו לב כי גלולה של שמרים טרנספורמציה גלוי בחלק התחתון של כל טוב.</li>
	<li>בעזרת מתקן נוזלי, להוסיף 100 µL של עורה-מדיה המכילה גלוקוז לבאר כל סדרה חדשה של 96-ובכן צלחות.</li>
	<li>מערבולת הלוחות המכילים שמרים טרנספורמציה (מתוך שלב 2.13) ב- 1,000 סל ד ל 30 ס' באמצעות משכפל 96 פינים פלסטיק סטרילית, למקם את הסיכות הבארות המכילים שמרים טרנספורמציה, ואז לחסן אותם לתוך הבארות המקביל של הלוחות החדשים מלא מדיה. דגירה הלוחות חדש ב 30 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה. הערה: אם עובד עם 10 צלחות, המדיום יכול גם ובשמפו באופן ידני באמצעות פיפטות רב ערוצית.</li>
	<li>לאחר 24 שעות, גלולה של שמרים צריך להיות גלוי כל הבאר המכילים שמרים בהצלחה טרנספורמציה. לשמירת זנים אלו שמרים גליצרול מניות, להוסיף 50 µL של גליצרול 50% מכל קידוח, מערבולת הלוחות ל 30 s ב 1,000 סל ד, לאטום את הצלחות עם דבק סלוטייפ לסתימה ולהקפיא אותן ב- 80 ° C הערה: השלבים לעיל רק צריך להתבצע פעם אחת. הקרנות עתידיים של מודלים שמרים שונים נגד המאגר ריאגנט חד פעמיים באותה ספריה ניתן להתחיל המניות גליצרול, פנה/י מיד מן השלבים שלהלן.</li>
</ol>3. הזדווגות בין תאים המכילים גנים ספריית ושמרים שאילתה
<ol><li>כדי להחיות את זני ספריית המלאי גליצרול, לקחת את הצלחות 96-ובכן מהמקפיא-80 ° C, הסר איטום הקלטת, ולתת השמרים להפשיר בטמפרטורת החדר במשך כ 30 דקות.</li>
	<li>ברגע השמרים יש הקרת, השתמש משכפל 96 פינים פלסטיק סטרילית כדי לחסן את מניות גליצרול µL 160 של טרי עורה-מדיה המכיל 2% גלוקוז ב 96-ובכן צלחות דגירה אותם ב 30 ° C עבור ה 24. מיד לאחר זנים ספריית משמשים , חותם את הצלחות עם דבק סלוטייפ לסתימה, ולהחזיר אותם במקפיא-80 ° C.</li>
	<li>באותו יום ספריה זנים (W303α) הם הקרת, לחסן את המתח שמרים שאילתה (כאן, FUS ב W303a) 50 מ של YPD לגדל אותו בן לילה ב 30 מעלות צלזיוס ברעידות-250 סל"ד.</li>
	<li>למחרת בבוקר, שופכים את המתח שמרים שאילתה מאגר ריאגנט חד פעמי סטרילי, ולאחר aliquot µL 160 של המתח שאילתה כדי כל טוב של צלחת 96-ובכן באמצעות פיפטה רב-ערוצי.</li>
	<li>באמצעות מנפק נוזלי, לוותר על 160 µL של YPD מדיה לתוך כל טוב של עשר לוחות 96-ובכן. השתמש הצלחות האלה מאוחר יותר להזדווגות המתח שמרים שאילתה עם שמרים הספרייה.</li>
	<li>בקצרה מערבולת הצלחת 96-ובכן המכיל את המתח שאילתה ולאחר מכן להשתמש משכפל 96 פינים סטרילי כדי להעביר את השאילתה זן אל צלחות YPD.</li>
	<li>בקצרה מערבולת הספרייה זן צלחות ולהשתמש, עבור כל אחד מהלוחות זן בספריה, משכפל 96-pin חדש סטרילי כדי להעביר זנים ספריית הפלטות YPD שיש, כמובן עם המתח שאילתה. הערה: תאים גליצרול לאבד את הכדאיות שלהם לאחר מספר מחזורים ההפשרה-להקפיא. מבוקש זנים ספריית אחסון לטווח ארוך (מקפיא-80 ° C) בהקדם האפשרי לשמור על הספריה באיכות טובה, ומוכנים לשימוש עתידי. מתוחזק כראוי, המניה גליצרול ניתן להיות קפוא, הקרת לפחות 10 פעמים. אנו גם ממליצים לשמור עותק לעבודה של עותקי גיבוי של המניה גליצרול. כאשר המניה עבודה לא עובד, מיד לעשות חדש עובד עותק מעותק הגיבוי.</li>
	<li>דגירה הלוחות YPD ב 30 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה ה הערה כי גלולה של שמרים יהיה גלוי בחלק התחתון של כל טוב לאחר 24 שעות.</li>
	<li>מילוי 96-ובכן צלחות עם מדיום הנשירה מינימלי המכיל 2% raffinose, התואם את סמני לבחירה על פלסמיד בנימה זו שאילתה כמו גם על ספריית פלסמיד (למשל, כאן עורה - שלו-).</li>
	<li>השתמש משכפל 96 פינים סטרילי כדי להעביר שמרים YPD הזדווגות תרבויות בתקשורת סלקטיבי. דגירה הלוחות 96-ובכן ב 30 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות; רק תאים שיש הזדווגו שמרים דיפלואידי בנוי תאים, לכן, להכיל פלסמיד השאילתה את שני ו פלסמיד הספריה יוכלו לגדול מדיה זו. לאחר יומיים, להתבונן גלולה מוצגת בתחתית הבארות.</li>
</ol>4. הבחינה Assay
<ol><li>
לאחר 48 שעות של צמיחה בתקשורת סלקטיבי המכילים raffinose, במקום השמרים על פלטות אגר.
	<ol>
<li>להכין 2 סטים של צלחות עורה-שלו-נשירת המכיל 2% אגר באמצעות לוחות פוליסטירן ברור, אחד המכיל 2% גלקטוז והמכיל גלוקוזה 2% אחרים.</li>
		<li>מערבולת 96-ובכן לוחות עבור 1 דקות ב- 1,000 סל ד, ואז במקום השמרים את הצלחות עורה-שלו-נשירת המכיל 2% גלקטוז ו 2% אגר (גנים FUS וספריית הם המושרה) וכדי הלוחות עורה-שלו-נשירת המכיל 2% גלוקוז ו- 2% אגר (FUS וספריית גנים מודחק) באמצעות מכונת spotting רובוטית, לפיו התרבות בכל הוא מקום טוב על גבי הלוחות אגר ב ארבע פעמים (קרי, התרבות 1 הוא מקום טוב למקומות 4 בצלחת אגר).</li>
		<li>לאחר הבחינה, תן את הצלחות אגר יבש, ולאחר מכן למקם אותם במהופך בתוך חממה 30 מעלות צלזיוס. לצלם את הצלחות אגר כל 24 שעות לרשום צמיחה מהירה יותר או יותר שמרים שבו הוא חולץ רעילות לאמץ השאילתה או לרשום צמיחה איטית יותר/פחות שבו רעילות לאמץ השאילתה היא מתעצמת. תקופת דגירה לוחיות הרישוי של 4 ימים. הערה: התרבות בכל טוב ניתן הבחין על פלטות אגר 1 ל-1, כפי שמוצג של שיטה המבוססת על השינוי הקודם10. עם זאת, את 1-4 אכון כאן (אשר ניתן להגדיר בנוחות לשימוש במכונה spotting רובוטית) מגביר באופן משמעותי את היציבות של וזמינותו על-ידי הפחתת מספר תוצאות חיוביות שגויות. כניסות חיוביות נחשבים רק כאשר כל המושבות 4 מאותו מראים הפנוטיפ דומה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dujon, B. A., Louis, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+diversity+and+evolution+in+the+budding+yeasts+(Saccharomycotina).">Genome diversity and evolution in the budding yeasts (Saccharomycotina).</a> Genetics. 206 (2), 717-750 (2017).</li><li>Khurana, V., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+neurodegeneration+in+Saccharomyces+cerevisiae:+why+cook+with+baker's+yeast.">Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker's yeast.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).</li><li>Willingham, S., Outeiro, T. F., DeVit, M. J., Lindquist, S. L., Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+genes+that+enhance+the+toxicity+of+a+mutant+huntingtin+fragment+or+alpha-synuclein.">Yeast genes that enhance the toxicity of a mutant huntingtin fragment or alpha-synuclein.</a> Science. 302 (5651), 1769-1772 (2003).</li><li>Outeiro, T. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+cells+provide+insight+into+alpha-synuclein+biology+and+pathobiology.">Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology.</a> Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).</li><li>Cooper, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+blocks+ER-Golgi+traffic+and+Rab1+rescues+neuron+loss+in+Parkinson's+models.">Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models.</a> Science. 313 (5785), 324-328 (2006).</li><li>Treusch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+links+between+Abeta+toxicity,+endocytic+trafficking,+and+Alzheimer's+disease+risk+factors+in+yeast.">Functional links between Abeta toxicity, endocytic trafficking, and Alzheimer's disease risk factors in yeast.</a> Science. 334 (6060), 1241-1245 (2011).</li><li>Ju, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+model+of+FUS/TLS-dependent+cytotoxicity.">A yeast model of FUS/TLS-dependent cytotoxicity.</a> PLoS Biology. 9 (4), 1001052 (2011).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determinants+and+genetic+modifiers+of+aggregation+and+toxicity+for+the+ALS+disease+protein+FUS/TLS.">Molecular determinants and genetic modifiers of aggregation and toxicity for the ALS disease protein FUS/TLS.</a> PLoS Biology. 9 (4), 1000614 (2011).</li><li>Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+TDP-43+proteinopathy+model:+Exploring+the+molecular+determinants+of+TDP-43+aggregation+and+cellular+toxicity.">A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (17), 6439-6444 (2008).</li><li>Fleming, M. S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+yeast+plasmid+overexpression+screen.">High-throughput yeast plasmid overexpression screen.</a> Journal of Visualized Experiments. (53), e2836 (2011).</li><li>Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+cycle+of+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Life cycle of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiological Reviews. 52 (4), 536-553 (1988).</li><li>Suter, B., Auerbach, D., Stagljar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast-based+functional+genomics+and+proteomics+technologies:+the+first+15+years+and+beyond.">Yeast-based functional genomics and proteomics technologies: the first 15 years and beyond.</a> Biotechniques. 40 (5), 625-644 (2006).</li><li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+toxicity+in+neuronal+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+by+hUPF1.">Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (25), 7821-7826 (2015).</li><li>Jackson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+forelimb+function+by+UPF1+gene+therapy+in+a+rat+model+of+TDP-43-induced+motor+paralysis.">Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced motor paralysis.</a> Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול לבצע מסך ביטוי פלסמיד באמצעות הזדווגות כדי להציג את ספריית פלסמיד לתוך המודל שמרים שמרים. באמצעות גישה זו, מספר מודלים שמרים רעילות חלבון מחלות ניווניות יכולים להיות מוקרן באמצעות אוסף אותם שמרים טרנספורמציה עם ספרייה פלסמיד. תהליך מפרך של שינוי רק צריך להתבצע פעם אחת, לאחר שמרים יעילים ביותר אשר ההזדווגות משמשת להציג הספרייה פלסמיד לתוך המתח שאילתה. פרוטוקול זה מסתמכים על השימוש של הציוד רובוטית כדי לוותר על מדיה ותרבויות שמרים ספוט על פלטות אגר. בעוד הפרוטוקול יכול להתבצע ללא השימוש של ציוד רובוטית, זה יהיה זמן רב יותר. השיטה הזאת הייתה בהצלחה בשימוש עבור גנים יכולים לשנות הרעילות של FUS מסך.
הבחנו כי FUS הוא מעט פחות רעיל ברקע שמרים דיפלואידי. . זה ככל הנראה עקב מספר עותק הגן ואת הבדלי קצב צמיחה של שמרים דיפלואידי. אלא אם כן פנוטיפ זה נחקר הזדווגות סוג או פלואידיות-תלוי פנוטיפ צמיחה של הרעילות הוא עקבי שמרים הפלואידי, דיפלואידי. לכן, השיטה מבוססת על הזדווגות צפוי לעבוד נרחב בשלל דגמים שמרים של פנוטיפים שונים של צמיחה. בכל זאת, פנוטיפ של המודל שמרים צריך לאמת כדי לוודא כי זה עדיין נוכחים ברקע דיפלואידי לפני שיטה זו ההקרנה מבוצעת. בשיטה זו ניתן ללמוד רבות פנוטיפים שונים בשמרים, אינה מוגבלת המחקר רעילות חלבון ניווניות. בנוסף, ניתן להשתמש בכל וקטורים של פלסמיד ספריית ביטוי שמרים המכיל.
לאחר ביצוע המסך, ישנם מספר מבחני אימות אשר יסייעו להבטיח שהלהיטים שזוהו הן ספציפיות על הדגם שמרים מוקרן. משפרי רעילות צריך להיבדק ב שמרים מבלי להביע החלבון המחלה עניין משותף. מוצרי טיפוח טבעיים וגורם רעילות עצמאית של החלבון המחלה עניין צריכים להיות מסולקים מן לימוד נוסף. חשוב לקחת בחשבון אם מדכאי רעילות משפיעים על ביטוי של החלבון המחלה על ידי המשפיעים על האמרגן Gal1. כל מדכאי המשפיעים על ביטוי של האמרגן Gal1 צריכים להיות מסולקים מן לימוד נוסף.
זני שמרים המכיל את פלסמיד ספריית מאוחסנים לצמיתות במלאי גליצרול, ניתן לחדש במהירות בעת הצורך כך השיטה מבוססת על הזדווגות ניתן להחיל בקלות את דגמים אחרים שמרים שבו הגנים ספריית אותו צריך להיות מוקרן נגד. יעילות השיטה מבוססת על הזדווגות הופך להיות ברור כאשר אותו סוג של ההקרנה משמש כדי להסיר תוצאות חיוביות שגויות או כאשר מספר מודלים שונים שמרים צריך להילמד. אנחנו משתמשים בהצלחה בשיטה זו למסך דגם שמרים של TDP-43, חלבון אחר המקושר ALS.

שמרים ניצני האפייה כבר בשימוש נרחב כדי להבין תהליכים תאיים הקשורים ישירות מחלות אנושיות מחקר מדעי בסיסי1 . יתר על כן, הוא שימש כאורגניזם מודל עבור לומד האדם הקשורים למחלה חלבונים, כגון אלה קשורה מחלות ניווניות הנפוצים ביותר, כולל מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, מחלת הנטינגטון, מחלת ניוון שרירים טרשת נפוצה לרוחב (ALS)2. יתרון של המודל שמרים היא הקלות שבה ניתן לבצע מסך הגנום כולו כדי לזהות הסלולר מסלולים הקשורים הרעילות של חלבונים הקשורים למחלות, ובכך נותן תובנה מנגנון הרעילות שלהם. מסך אחד כזה נקרא מסך ספריה של ביטוי, שבו כל אחד הגנים שמרים 5,500 בספריה ערוכים הופכת מודל שמרים לזהות אילו גנים יכולים לשנות רעילות כאשר overexpressed. שיטה זו הקרנה יושם בהצלחה במודלים שמרים מרובות ניווניות הקשורות למחלות חלבונים, כולל huntingtin של מחלת הנטינגטון3, α-synuclein עבור מחלת פרקינסון4,5 , Aβ עבור מחלת אלצהיימר6, ואת FUS TDP-43 ALS-7,-8,-9. בזמן זה נעשה בדרך כלל באופן תפוקה גבוהה10, השלב הכי מהגידולים של המסך בנפרד משתנה 5,500 גנים שמרים מספריה ערוכים. שלב זה חייב להתבצע בכל פעם שחוזר על עצמו ההקרנה, בכל פעם דוגמנית שהוקם שמרים צריך להילמד. חשוב למצוא דרך יעילה יותר כדי לבצע משימה זו.
תאי שמרים יכולה להתקיים stably בצורות הפלואידי והן דיפלואידי. ישנם שני מול ההזדווגות סוגים של תאים הפלואידי, הזדווגות סוג α. תאים הפלואידי של כל הזדווגות הקלד התוצרת, מפרישות פרומון ההזדווגות משלהם ספציפי, אשר מגיבים רק מול ההזדווגות סוג התאים. דבר זה מאפשר הזדווגות בין α תאים כדי לייצר תאים דיפלואידי יציב, / α. תהליך זה הוא ספונטני ויעיל מאוד11. אנחנו יכולים לנצל את מחזור החיים הייחודי של cerevisiae ס כדי להציג את ספריית פלסמיד. ליתר דיוק, כל הגן בספריה פלסמיד ערוכים תעבור טרנספורמציה לתוך תאים הפלואידי של סוג ההזדווגות אחד, דהיינו, α התא. אלה תאים המכילים את הגנים ספריית ואז יאוחסנו במלאי גליצרול בתבנית 96-ובכן ערוכים. עבור כל דגם שמרים צריך להיות מוקרן, תאי שמרים המכיל את הגנים ספריה יכולה להיות הקרת מן המלאי גליצרול ולאחר ההקרנה יכול להיעשות באמצעות הזדווגות עם המודל שמרים עניין בסוג השני ההזדווגות, כלומר, סוג ההזדווגות. הרעיון של שימוש ההזדווגות כדי להפגיש את שני גנים לתוך שמרים אינו חדש. זה יושם בהצלחה בשמרים תפוקה גבוהה ההקרנה שני-היברידית, שבו פיתיון לבנות (קרי, Gal4-הדי-איגוד תחום fusions) בסוג אחד ההזדווגות הוא הביא יחד באמצעות הזדווגות עם מבנה טרף מספריה ערוכים 12. אולם, אסטרטגיה זו מעולם לא הוחל ב ביטוי בספריה הקרנות, אשר תמיד השתמשו בשיטות מסורתיות טרנספורמציה.
המעבדה שלנו הקימה בעבר מודל שמרים של חלבונים הקשורים ALS FUS7. דרך ביטוי בספריה ההקרנה בשיטת טרנספורמציה גילינו חמש שמרים הגנים (ECM32, NAM8, SBP1, SKO1, ו VHR1) להציל את רעילות FUS כאשר overexpressed. ממצאים אלה שאושרו באופן עצמאי עם מחקר דומה על-ידי קבוצה אחרת8. hUPF1, homolog האנושית של ECM32, הוצגה מאוחר יותר לדכא את רעילות ראשי תאים עצביים13 , במודל חיה של ALS14 גם כן. באמצעות גנים חמש אלה כהוכחה עקרון, נדגים כי כל הגנים 5 בדומה להציל FUS רעילות כאשר הם יוכנסו המודל שמרים FUS על ידי הזדווגות. כיוון שמרים תאים המכילים את הגנים הספרייה יכולים להיות מאוחסנים לצמיתות במלאי גליצרול לתחייה בכל פעם שיש צורך, שיטה זו מבוססת על הזדווגות יסיר את הצעד גוזלת זמן של שינוי בכל פעם שהספרייה צריך להיות מוקרן נגד. מאז ההזדווגות היא יעילה במיוחד עם שינוי פלסמיד לא מעורב, אסטרטגיה זו פוחתת משמעותי גם את העלות המשויכת לטיהור ושינוי של ספרייה פלסמיד גדול. אנחנו יחולו בהצלחה בשיטה זו לספריית הקרנה נגד שמרים מודל של FUS.
התהליך להקרנה ההזדווגות מבוסס בקצרה מתואר באיור1. בתחילה, הספרייה פלסמיד ערוכים הופכת זן שמרים הפלואידי של הזדווגות מסוג α באמצעות פרוטוקול השינוי בתפוקה גבוהה שמרים שבו כל טוב של צלחת 96-ובכן מכיל שמרים טרנספורמציה עם פלסמיד ספריה ספציפית. זה אוסף של שמרים טרנספורמציה נשמרת מניה גליצרול כי ניתן הקרת לתחייה לשימוש מאוחר יותר. הדגם שמרים של עניין, רעילות FUS במקרה הזה, להפיקם בזן הפלואידי שמרים עם סוג ההזדווגות הנגדי (ההזדווגות סוג). באופן תפוקה גבוהה באמצעות המשכפלים 96 פינים סטרילי, הלחץ FUS ואת זני שמרים המכיל ספריית פלסמיד הועבר צלחות 96-ובכן המכיל מדיה עשירים, רשאי חבר. לאחר ההזדווגות, נפח קטן מכל טוב של התרבות ההזדווגות מועבר המכיל התקשורת הנשירה סינתטי אשר שמרים בלבד דיפלואידי המכיל שני FUS את הצלחות 96-ובכן, ספריית גנים יכולים לגדול. מכונת spotting רובוטית משמש לאחר מכן להעביר שמרים תרבות מכל קידוח על פלטות אגר שבו הביטוי FUS ואת הגנים ספריית מושרה.  בנוסף, תרבות שמרים הוא הבחין לשלוט פלטות אגר איפה FUS ואת הגנים הספרייה אינם מבוטאים. בעקבות גידול על פלטות אגר, הגנים או להחריף FUS רעילות יזוהו.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:555px;" width="554">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:183px;">salmon Sperm DNA (SS-DNA)</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:99px;">&#160; D1626</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:183px;">YPD broth</td>
			<td style="width:127px;">Research Products International (RPI)</td>
			<td style="width:99px;">Y20090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">Granulated Agar</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:99px;">BP97445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:183px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:127px;">Research Products International (RPI)</td>
			<td style="width:99px;">G32040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:183px;">D-(+)-Galactose</td>
			<td style="width:127px;">Research Products International (RPI)</td>
			<td style="width:99px;">G33000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:183px;">D-(+)-Raffinose Pentahydrate</td>
			<td style="width:127px;">Research Products International (RPI)</td>
			<td style="width:99px;">R20500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">Ammonium Sulfate</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:99px;">A702-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:183px;">Synthetic Ura- drop out medium</td>
			<td style="width:127px;">Clontech</td>
			<td style="width:99px;">630416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:183px;">Yeast amino acid drop out supplement -Histidine/-Uracil</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>630422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:183px;">Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and Ammonium Sulfate</td>
			<td style="width:127px;">Research Products International (RPI)</td>
			<td style="width:99px;">Y20060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:183px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:99px;">S67496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:183px;">Lithium acetate, anhydrous</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:99px;">AC268640010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:183px;">Polyethylene Glycol 3350 (PEG-3350)</td>
			<td style="width:127px;">Spectrum Chemical&#160;</td>
			<td style="width:99px;">PO125-12KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">96 Pin Replicator&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Scinomix</td>
			<td style="width:99px;">SCI-5010-OS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">Nunc OmniTray</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Sci</td>
			<td>140156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:183px;">Corning Costar 96 well assay plate, round bottom with lid</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:99px;">07-200-760</td>
			<td>non-treated, sterile</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:183px;">Eppendorf&#160;Research plus Multichannel Pipette</td>
			<td style="width:127px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:99px;">TI13690052</td>
			<td>30-300ul volume</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:183px;">Fisherbrand&#160;Isotemp Digital Dry Baths/Block Heaters</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:99px;">88-860-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">Eppendorf&#160;MixMate</td>
			<td style="width:127px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:99px;">21-379-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:183px;">Eppendorf 5810R Centrifuge</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:99px;">05-413-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">Avanti J-26 XPI Centrifuge</td>
			<td style="width:127px;">Beckman</td>
			<td style="width:99px;">393127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:183px;">MultiFlo FX Multi-Mode Dispenser</td>
			<td style="width:127px;">BioTek</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:183px;">Rotor HDA&#160;&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mating-based overexpression library screening in yeast

ניצני שמרים כבר בשימוש נרחב כמודל בלימוד חלבונים הקשורים עם מחלות אנושיות. בדיקה גנטית הגנום כולו הוא כלי רב עוצמה נפוץ במחקרים שמרים. הביטוי של מספר חלבונים הקשורים למחלות ניווניות של שמרים גורם cytotoxicity ויצירת צבירה, recapitulating ממצאים לראות בחולים עם הפרעות אלה. כאן, אנו מתארים שיטה לסינון מודל שמרים של הקשורים נוירודגנרטיביות החלבון FUS מודיפיקטורי שלה רעילות. במקום להשתמש טרנספורמציה, הפלטפורמה ההקרנה הזאת מסתמכת על הזדווגות של שמרים להציג ספריה ערוכים של פלסמידים לתוך המודל שמרים. שיטת החיזור יש שני יתרונות ברורים: ראשית, זה יעיל ביותר; שנית, הספרייה ערוכים מראש טרנספורמציה של פלסמידים ניתן לאחסן לטווח ארוך כמו מניה גליצרול, ויישם במהירות למסכי אחרים ללא השלב מהגידולים של טרנספורמציה לתוך המודל שמרים בכל פעם. נדגים כיצד שיטה זו בהצלחה ניתן להשתמש עבור גנים המשנים הרעילות של FUS מסך.

החלבון ALS-הקשורים FUS, RNA/DNA מחייב חלבון, נחקרה בעבר שמרים הפלואידי7,8. השיטה מבוססת על שינוי גנטי. הסינון באמצעות גילו מספר גנים שמרים לדיכוי FUS רעילות. Homolog האנושית של אחד הגנים שמרים הודגם מאוחר יותר כדי להיות אפקטיבית שיתוק רעילות תאים עצביים הראשי ומודל עכברוש של ALS13. כאן, אנו משתמשים באותו דגם שמרים להראות כי ביטוי בספריה ההקרנה יכול להתבצע על ידי הזדווגות באופן יעיל על ידי שינוי.
FUS רעיל בשני תאי שמרים הפלואידי, דיפלואידי. הדגם הקודם שמרים FUS, ביטוי עוקבות ספריית ההקרנה בוצעה על רקע תא הפלואידי. עבור פעולת ההזדווגות מבוססי לעבודה, רעילות FUS צריך להיות הפגינו שמרים דיפלואידי. כדי לעשות זאת, אנחנו הזדווגו המודל שמרים FUS ב- w303a (ההזדווגות סוג) עם w303α הפך עם וקטור ריק (ההזדווגות מסוג α). כפי שמעידה איור 2, אמנם לא כמו חזק כמו שמרים הפלואידי, FUS רעילות זו באה לידי ביטוי שמרים דיפלואידי.
דיכוי גנים זוהו בעבר עבודה שמרים דיפלואידי מהווה הוכחה של עיקרון השיטה מבוססת על הזדווגות, בדקנו את הגנים חמש זוהו בעבר מן השיטה מבוססת על שינוי. ההזדווגות שימש כדי להציג כל אחד הגנים חמש לתוך מודל שמרים הפלואידי FUS (ב W303a), נבדקה יכולתם להציל את הרעילות של FUS ב שמרים דיפלואידי עוקבות (W303a/α). כפי שמוצג באיור3, כל הגנים חמש להציל את הרעילות של FUS ב שמרים דיפלואידי, המציין כי שיטת החיזור היה יעיל.
הקרנה פיילוט של 940 גנים (מופנים על צלחות 96-ובכן עשר) בעקבות הפרוטוקולים שתוארו לעיל, אנו להחיל בשיטה ההזדווגות המבוססת על ההקרנה ספריה ביטוי של גנים 940. איור 4 מציג תמונה של לוח נציג אחד. כמצוין בצד ימין של הדמות (FUS וספריית גנים ביטוי), FUS היה רעיל שמרים דיפלואידי. הגן ספריית שצוין על-ידי הריבוע הירוק חולץ FUS רעילות בזמן זה שציין הכיכר האדומה משופרת רעילות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57978/57978fig1.jpg"> איור 1 : תרשים לסינון שמרים מודלים של רעילות חלבון באמצעות הזדווגות. ספריה פלסמיד (תחת שליטה של האמרגן GAL1 אשר מאוד הנגרמת בנוכחות גלקטוז) הופכת זן שמרים הפלואידי (MATα) באמצעות פרוטוקול טרנספורמציה תפוקה גבוהה. זה אוסף של שמרים, טרנספורמציה עם פלסמידים הספרייה, מאוחסן מניה גליצרול ב-80 מעלות צלזיוס, הוא קם לתחייה בעת הצורך כדי להזדווג עם הדגם שמרים הפלואידי של חלבון רעילות (במקרה שלנו, עותק אחד של FUS משולב-מיקומה HIS3, יזם GAL1 מאטה). שמרים דיפלואידי המכיל את ספריית פלסמיד, חלבון רעיל (FUS) נבחרה, הבחין גלוקוז (ג'ין FUS וספריית 'off'), פלטות אגר גלקטוז (ג'ין FUS וספריית 'על'). צמיחת השמרים עקבו לזיהוי גנים להציל או להחריף הרעילות של FUS. ריבוע ירוק מציין לדוגמה של גנים משתיק קול שמצילה FUS רעילות, ומציין הכיכר האדומה הוא דוגמה ג'ין מעצם זה מחמיר רעילות FUS כאשר overexpressed. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57978/57978fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57978/57978fig2.jpg"> איור 2 : FUS רעיל בשני תאי שמרים הפלואידי, דיפלואידי. שמרים הפלואידי (w303 מאטה) הפך עם pRS303Gal1-FUS טרנספורמציה עם פלסמיד ריק או הזדווגה עם שמרים מסוג ההזדווגות הנגדי (w303 MATα) הפך עם פלסמיד ריק אותו כדי ליצור זן שמרים דיפלואידי. זנים אלו שמרים יחד עם זן הבקרה היו אז 5x באופן סדרתי מדולל (משמאל לימין) ו מנומר בינוני עורה-שלו-גלוקוז (מודחקים ביטוי שמאלה, FUS) ואת עורה-שלו-גלקטוז בינוני (מימין, ביטוי FUS המושרה). התמונה צולמה לאחר יומיים של צמיחה ב 30 º C. הצמיחה כמעט זהה של המתח הפלואידי ושליטה דיפלואידי נצפתה, אז רק שהמתח שליטה הפלואידי הוצגה. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57978/57978fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57978/57978fig3.jpg"> איור 3 : חמישה גנים שמרים (ECM32, NAM8, SBP1, SKO1, ו VHR1) להציל את רעילות FUS באמצעות השיטה מבוססת על הזדווגות. פלסמידים המכיל גנים שמרים שזוהה בעבר לדיכוי FUS רעילות הפכו זן שמרים הפלואידי (w303 MATα). היו אלה שמרים ואז הזדווגה עם שמרים הפלואידי של הסוג ההזדווגות הנגדי (w303 מאטה) הפך עם פלסמיד ביטוי FUS. שמרים דיפלואידי המכיל FUS וקטור ריק או באחד הגנים דיכוי חמש היה הנבחר, הבחין ב משכפל על פלטות אגר המכילה גלוקוז (גנים 'off'), גלקטוז (גנים 'על'). (1) מראה זן שמרים שליטה טרנספורמציה עם שני וקטורים ריק. (2) מציג את המתח שמרים FUS דיפלואידי עם וקטור ריק שבו הביטוי של FUS הוא רעיל מאוד. (3 – 7) מראים שמרים דיפלואידי לבטא FUS, כמו גם גן דיכוי כי ניתן להציל FUS רעילות. כל מספר (1-7) מראה שתי שורות 12 זהה משכפל. צולמה התמונה, המייצגים שלושה ניסויים עצמאית, לאחר שלושה ימים של צמיחה ב 30 º C. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57978/57978fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57978/57978fig4.jpg"> איור 4 : ספריית ואיתור הגנים או להחריף FUS רעילות. שמרים הפלואידי המכיל FUS היה הזדווגו עם שמרים הפלואידי המכיל את הגנים הספרייה. לאחר ההזדווגות, דיפלואידי תאים המכילים FUS והן ספריית הגן נבחר, נצפה גלוקוז (גנים FUS וספריית 'off'), גלקטוז פלטות אגר (גנים FUS וספריית 'על') בארבע פעמים. בצלחת גלקטוז, שבו היו הביע FUS, את ספריית הגן, רוב השמרים הצליחו לגדול היטב. אפשרות זו מציינת כי FUS רעיל, רוב הגנים הספרייה לא הצליחו להציל את רעילות. ריבוע ירוק מדגים דוגמה של ספריית גן כי מעלימה FUS רעילות ומאפשרת את השמרים למושבות טופס. הכיכר האדומה מציינת דוגמה של ספריית גן כי מחריף FUS רעילות. הלוחות המוצגים כאן הם נציג של 10 צלחות של ספריית גנים אשר הוקרנו נגד. התמונה צולמה לאחר 3 ימים של צמיחה ב 30 º C. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57978/57978fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast at JoVE.com

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

מאמר זה מציג שיטה מבוססת על הזיווג כדי להקל על הקרנת ביטוי ניצני שמרים באמצעות ספריה פלסמיד ערוכים.

ביטוי ההזדווגות מבוססי ספריית הקרנה שמרים

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

mating-based-overexpression-library-screening-in-yeast

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

7.6K Views.  Wright State University. מאמר זה מציג שיטה מבוססת על הזיווג כדי להקל על הקרנת ביטוי ניצני שמרים באמצעות ספריה פלסמיד ערוכים.

Video: Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.

ממוקד<em&gt; באתרו</em&gt; גני mutagenesis של היסטון שמרים הנץ

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 nuclease or a nuclease-dead dCas9 fusion protein) is targeted to a specific site in the genome by a small synthetic RNA known as the guide RNA, or gRNA. The bipartite nature of the CRISPR system enables its use in screening approaches since plasmid libraries containing expression cassettes of thousands of individual gRNAs can be used to interrogate many different sites in a single experiment. 
To date, gRNA sequences for the construction of libraries have been almost exclusively generated by oligonucleotide synthesis, which limits the achievable complexity of sequences in the library and is relatively cost-intensive. Here, a detailed protocol for CORALINA (comprehensive gRNA library generation through controlled nuclease activity), a simple and cost-effective method for the generation of highly complex gRNA libraries based on enzymatic digestion of input DNA, is described. Since CORALINA libraries can be generated from any source of DNA, plenty of options for customization exist, enabling a large variety of CRISPR-based screens.

Methods for generating large-scale gRNA libraries should be simple, efficient and cost-effective. We describe a protocol for the production of gRNA libraries based on enzymatic digestion of target DNA. This method, CORALINA (comprehensive gRNA library generation through controlled nuclease activity) presents an alternative to costly custom oligonucleotide synthesis.

פרוטוקול אוניברסלי עבור gRNA בקנה מידה גדול ספריית הפקה מכל מקור ה-DNA

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with a number of challenges including sample preservation quality, degraded DNA, and destructive sampling of rare specimens. In order to more effectively use herbarium material in large sequencing projects, a dependable and scalable method of DNA isolation and library preparation is needed. This paper demonstrates a robust, beginning-to-end protocol for DNA isolation and high-throughput library construction from herbarium specimens that does not require modification for individual samples. This protocol is tailored for low quality dried plant material and takes advantage of existing methods by optimizing tissue grinding, modifying library size selection, and introducing an optional reamplification step for low yield libraries. Reamplification of low yield DNA libraries can rescue samples derived from irreplaceable and potentially valuable herbarium specimens, negating the need for additional destructive sampling and without introducing discernible sequencing bias for common phylogenetic applications. The protocol has been tested on hundreds of grass species, but is expected to be adaptable for use in other plant lineages after verification. This protocol can be limited by extremely degraded DNA, where fragments do not exist in the desired size range, and by secondary metabolites present in some plant material that inhibit clean DNA isolation. Overall, this protocol introduces a fast and comprehensive method that allows for DNA isolation and library preparation of 24 samples in less than 13 h, with only 8 h of active hands-on time with minimal modifications.

This article demonstrates a detailed protocol for DNA isolation and high-throughput sequencing library construction from herbarium material including rescue of exceptionally poor-quality DNA.

DNA חזקים בידוד ובנייה ספריית רצף תפוקה גבוהה עבור דגימות עשבייה

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve random mutagenesis, error-prone PCR is a convenient and efficient strategy for generating a diverse pool of mutants (i.e., a mutant library). Error-prone PCR is the method of choice when a researcher seeks to mutate a pre-defined region, such as the coding region of a gene while leaving other genomic regions unaffected. After the mutant library is amplified by error-prone PCR, it must be cloned into a suitable plasmid. The size of the library generated by error-prone PCR is constrained by the efficiency of the cloning step. However, in the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, the cloning step can be replaced by the use of a highly efficient one-step fusion PCR to generate constructs for transformation. Mutants of desired phenotypes may then be selected using appropriate reporters. Here, we describe this strategy in detail, taking as an example, a reporter inserted at centromeric heterochromatin.

This article describes a detailed methodology for random mutagenesis of a target gene in fission yeast. As an example, we target rpt4+, which encodes a subunit of the 19S proteasome, and screen for mutations that destabilize heterochromatin.

גן במיקוד אקראי מוטגנזה מכוונת לבחירת יציב הטרוכרומטין פרוטאוזום מוטציות שמרים ביקוע

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state when water is supplied. The genomic sequencing of microscopic animals such as tardigrades risks bacterial contamination that sometimes leads to erroneous interpretations, for example, regarding the extent of horizontal gene transfer in these animals. Here, we provide an ultralow input method to sequence the genome of the tardigrade, Hypsibius dujardini, from a single specimen. By employing rigorous washing and contaminant exclusion along with an efficient extraction of the 50 ~ 200 pg genomic DNA from a single individual, we constructed a library sequenced with a DNA sequencing instrument. These libraries were highly reproducible and unbiased, and an informatics analysis of the sequenced reads with other H. dujardini genomes showed a minimal amount of contamination. This method can be applied to unculturable tardigrades that could not be sequenced using previous methods.

Contamination during the genomic sequencing of microscopic organisms remains a large problem. Here, we show a method to sequence the genome of a tardigrade from a single specimen with as little as 50 pg of genomic DNA without whole genome amplification to minimize the risk of contamination.

הגנום קלט ultralow רצף ספריית הכנה מ להצטננות Tardigrade

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect and count individual RNA molecules. Complementary to deep sequencing-based methods, smFISH provides information about the cell-to-cell variation in transcript abundance and the subcellular localization of a given RNA. Recently, we have used smFISH to study the expression of the gene&#160;NDC80&#160;during meiosis in budding yeast, in which two transcript isoforms exist and the short transcript isoform has its entire sequence shared with the long isoform. To confidently identify each transcript isoform, we optimized known smFISH protocols and obtained high consistency and quality of smFISH data for the samples acquired during budding yeast meiosis. Here, we describe this optimized protocol, the criteria that we use to determine whether high quality of smFISH data is obtained, and some tips for implementing this protocol in&#160;other yeast strains and growth conditions.

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

This single molecule fluorescence in situ hybridization protocol is optimized to quantify the number of RNA molecules in budding yeast during vegetative growth and meiosis.

קרינה פלואורסצנטית מולקולה בודדת ב באתרו הכלאה (smFISH) ניתוח הנצה גידול וגטטיבי שמרים, מיוזה

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives each year. Effective treatment options able to halt disease progression are lacking. Despite the extensive sequencing efforts in large patient populations, the majority of ALS and PD cases remain unexplained by genetic mutations alone. Epigenetics mechanisms, such as the post-translational modification of histone proteins, may be involved in neurodegenerative disease etiology and progression and lead to new targets for pharmaceutical intervention. Mammalian in vivo and in vitro models of ALS and PD are costly and often require prolonged and laborious experimental protocols. Here, we outline a practical, fast, and cost-effective approach to determining genome-wide alterations in histone modification levels using Saccharomyces cerevisiae as a model system. This protocol allows for comprehensive investigations into epigenetic changes connected to neurodegenerative proteinopathies that corroborate previous findings in different model systems while significantly expanding our knowledge of the neurodegenerative disease epigenome.

This protocol outlines experimental procedures to characterize genome-wide changes in the levels of histone post-translational modifications (PTM) occurring in connection with the overexpression of proteins associated with ALS and Parkinson&#39;s disease in Saccharomyces cerevisiae models. After SDS-PAGE separation, individual histone PTM levels are detected with modification-specific antibodies via Western blotting.

אפיון שינויים Post-translational שינוי היסטון במודלים ניווניות Proteinopathy שמרים

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely related biochemical pathways. Previous methods such as the Synthetic Genetic Array (SGA) analysis, and random mutagenesis techniques using ultraviolet (UV) or chemicals like ethyl methanesulfonate (EMS) or N-ethyl-N- nitrosourea (ENU), have been widely used but are often costly and laborious. Also, these mutagen-based screening methods are frequently associated with severe side effects on the organism, inducing multiple mutations that add to the complexity of isolating the suppressors. Here, we present a simple and effective protocol to identify suppressor mutations in mutants which confer a growth defect in Schizosaccharomyces pombe. The fitness of cells with a growth deficiency in standard rich liquid media or synthetic liquid media can be monitored for recovery using an automated 96-well plate reader over an extended period. Once a cell acquires a suppressor mutation in the culture, its descendants outcompete those of the parental cells. The recovered cells that have a competitive growth advantage over the parental cells can then be isolated and backcrossed with the parental cells. The suppressor mutations are then identified using whole-genome sequencing. Using this approach, we have successfully isolated multiple suppressors that alleviate the severe growth defects caused by loss of Elf1, an AAA+ family ATPase that is important in nuclear mRNA transport and maintenance of genomic stability. There are currently over 400 genes in S. pombe with mutants conferring a growth defect. As many of these genes are uncharacterized, we propose that our method will hasten the identification of novel functional interactions with this user-friendly, high-throughput approach.

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

We present a simple suppressor screen protocol in fission yeast. This method is efficient, mutagen-free, and&#160; selective&#160; for&#160; mutations that&#160; often&#160; occur at&#160; &#160;a&#160; single&#160; genomic&#160; locus.&#160; The protocol is suitable for isolating suppressors that alleviate growth defects in liquid culture that are caused by a mutation or a drug.

מסך משתיק קול עמוק רצף-בסיוע, ספונטני ב ביקוע שמרים שמר הביקוע

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries

CCCTC-binding factor (CTCF)-mediated stable topologically associating domains (TADs) play a critical role in constraining interactions of DNA elements that are located in neighboring TADs. CTCF plays an important role in regulating the spatial and temporal expression of HOX genes that control embryonic development, body patterning, hematopoiesis, and leukemogenesis. However, it remains largely unknown whether and how HOX loci associated CTCF boundaries regulate chromatin organization and HOX gene expression. In the current protocol, a specific sgRNA pooled library targeting all CTCF binding sites in the HOXA/B/C/D loci has been generated to examine the effects of disrupting CTCF-associated chromatin boundaries on TAD formation and HOX gene expression. Through CRISPR-Cas9 genetic screening, the CTCF binding site located between HOXA7/HOXA9 genes (CBS7/9) has been identified as a critical regulator of oncogenic chromatin domain, as well as being important for maintaining ectopic HOX gene expression patterns in MLL-rearranged acute myeloid leukemia (AML). Thus, this sgRNA library screening approach provides novel insights into CTCF mediated genome organization in specific gene loci and also provides a basis for the functional characterization of the annotated genetic regulatory elements, both coding and noncoding, during normal biological processes in the post-human genome project era.

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries

A CRISPR/sgRNA library has been applied to interrogating protein-coding genes.However, the feasibility of a sgRNA library to uncover the function of a CTCF boundary in gene regulation remains unexplored. Here, we describe a HOX loci specific sgRNA library to elucidate the function of CTCF boundaries in HOX loci.

HOX לוקוסים Focused CRISPR/sgRNA ספריית הקרנת זיהוי קריטי CTCF גבולות

CCCTC-binding factor (CTCF)-mediated stable topologically associating domains (TADs) play a critical role in constraining interactions of DNA elements ...

Expression, Purification, and Liposome Binding of Budding Yeast SNX-BAR Heterodimers

SNX-BAR proteins are an evolutionarily conserved class of membrane remodeling proteins that play key roles in sorting and trafficking of protein and lipids during endocytosis, sorting within the endosomal system, and autophagy. Central to SNX-BAR protein function is the ability to form homodimers or heterodimers that bind membranes using highly conserved phox-homology (PX) and BAR (Bin/Amphiphysin/Rvs) domains. In addition, oligomerization of SNX-BAR dimers on membranes can elicit the formation of membrane tubules and vesicles and this activity is thought to reflect their functions as coat proteins for endosome-derived transport carriers. Researchers have long utilized in vitro binding studies using recombinant SNX-BAR proteins on synthetic liposomes or giant unilamellar vesicles (GUVs) to reveal the precise makeup of lipids needed to drive membrane remodeling, thus revealing their mechanism of action. However, due to technical challenges with dual expression systems, toxicity of SNX-BAR protein expression in bacteria, and poor solubility of individual SNX-BAR proteins, most studies to date have examined SNX-BAR homodimers, including non-physiological dimers that form during expression in bacteria. Recently, we have optimized a protocol to overcome the major shortcomings of a typical bacterial expression system. Using this workflow, we demonstrate how to successfully express and purify large amounts of SNX-BAR heterodimers and how to reconstitute them on synthetic liposomes for binding and tubulation assays.

Here, we present a workflow for the expression, purification and liposome binding of SNX-BAR heterodimers in yeast.

ביטוי, טיהור, וליפוזום קשירה של שמרים מסוג SNX-BAR הטרודיורס

SNX-BAR proteins are an evolutionarily conserved class of membrane remodeling proteins that play key roles in sorting and trafficking of protein and ...