ونحن ممتنون لمناقشات عميقة مع الأعضاء في جو المختبر ومختبر تشونغ، والدعم المالي من جامعة ولاية رأيت.

ملاحظة: بروتوكول الموصوفة هنا صمم لفحص والبلازميدات مكتبة الواردة في عشر لوحات 96-جيدا لكن يمكن تحجيمها صعودا أو هبوطاً تبعاً لذلك. البروتوكول يحتاج إلى تكرار لإكمال فحص مكتبة كاملة. عادة، يمكن أن تعالج بشكل مريح الفحص ضد 10 لوحات من الجينات مكتبة في كل مرة بشخص واحد.
1-الإعداد للتحول الخميرة 96-جيدا
ملاحظة: هذه الخطوة ويتم ذلك كما سبق وصف7،10.
<ol><li>الكوة 5 ميليلتر (حوالي 50 – 100 نانوغرام) من بلازميد الحمض النووي من مكتبة بلازميد المنتشرة في كل من لوحة 96-بئر مستديرة القاع جيدا. ملاحظة: سيكون مثالاً لتلك المكتبة خميرة جينات overexpression مكتبة10.</li>
	<li>تلقيح 150 مل من الخميرة ببتون سكر العنب (YPD) وسائط الإعلام في قارورة 500 مل مع مستعمرة (2-3 مم) من سلالة الخميرة فرداني W303α. تبني عليها بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية مع الهز (200 لفة في الدقيقة).</li>
	<li>في صباح اليوم التالي، قياس OD600 الثقافة بين عشية وضحاها، وتمييع ثقافة الخميرة OD600 = 0.1 في (تصل إلى) 2 لتر YPD. احتضان عند 30 درجة مئوية مع الهز (200 لفة في الدقيقة) ح ~ 5 حتى يصل إلى الثقافة OD600 = 0.4 – 0.6.</li>
</ol>2-الخميرة التحول
<ol><li>حصاد الثقافة الخميرة بملء 8 زجاجات الطرد المركزي العقيمة 250 مل وسينتريفوجينج لهم في درجة حرارة الغرفة في س 3,000 ز للحد الأدنى 10 من أجل إيقاف المادة طافية دون تعطيل بيليه. ملاحظة: القيام بجميع الخطوات الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>أغسل الخميرة مع العقيمة المقطر H2o. لهذا، إضافة 100 مل من العقيم ح2س لكل زجاجة للطرد المركزي ودوامه أن ريسوسبيند بيليه الخلية. دمج الخلايا غسلها 2 زجاجات والطرد المركزي لهم في س 3,000 ز 5 كحد أدنى من أجل إيقاف المادة طافية.</li>
	<li>تغسل الخلايا في كل زجاجة في 100 مل من 0.1 م ليواك/1XTE (100 مم ليواك؛ 10 ملم تريس، pH 8.0; 1 مم يدتا) والطرد المركزي لهم في 3,000 س ز 5 كحد أدنى من أجل إيقاف المادة طافية.</li>
	<li>بينما سينتريفوجينج، يغلي 5 مل من سمك السلمون الحيوانات المنوية الحمض النووي (10 مغ/مل) عند 100 درجة مئوية باستخدام سخان كتلة لمدة 3 دقائق وثم تبرد على الجليد.</li>
	<li>ريسوسبيند بيليه الخلية في 25 مل من 0.1 م ليواك/1XTE في كل زجاجة، والجمع بين الخلايا ريسوسبينديد ونقلها إلى قارورة 150 مل. إضافة 5 مل من الحيوانات المنوية السلمون يبرد قبل الحمض النووي واحتضان أنه عند 30 درجة مئوية مع الهز (225 لفة في الدقيقة) لمدة 30 دقيقة.</li>
	<li>صب الخليط خلية في خزان كاشف المتاح عقيمة، واستخدام ماصة متعددة القنوات، نقل 35 ميليلتر من الخليط خلية لكل بئر من الجولة-أسفل لوحة 96-البئر الذي يحتوي على مكتبة بلازميد الحمض النووي. لوحات دوامة 96-البئر باستخدام فورتيكسير طبق لمدة 1 دقيقة 1,000 لفة في الدقيقة. احتضان لوحات لمدة 30 دقيقة في 30 درجة مئوية دون المصافحة. ملاحظة: لا المكدس اللوحات، وحتى يمكن نقل الحرارة أكثر كفاءة. وقد وجدنا أن فورتيكسينج لوحات 96-بئر 1,000 لفة في الدقيقة لا يسبب السائل إلى تسرب من الآبار، ولكن ينبغي اختبار سرعة دوامة آمنة قبل القيام بالخطوة.</li>
	<li>وفي قارورة، تعد 200 مل من تحويل المخزن المؤقت الذي يحتوي على تركيز نهائي من 40% PEG3350 و [دمس] 10% 0.1 م ليواك. إعداد المخزن المؤقت التحول فورا قبل الاستخدام ومزجها جيدا بالهز.</li>
	<li>لوحات إزالة 96-جيدا من الحاضنة 30 درجة مئوية ومزجها لمدة 30 ثانية 1,000 لفة في الدقيقة باستخدام فورتيكسير لوحة. إضافة 125 ميليلتر من المخزن المؤقت التحول لكل بئر ومن ثم دوامة لوحات لمدة 1 دقيقة 1,000 لفة في الدقيقة.</li>
	<li>احتضان لوحات عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وثم الحرارة صدمة الخميرة بوضع اللوحات في حاضنة 42 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. ملاحظة: لا المكدس اللوحات.</li>
	<li>الطرد المركزي لوحات لمدة 5 دقائق في 3,000 س ز. إزالة المخزن المؤقت التحول من الآبار بعكس اللوحات على حاوية نفايات وبقوة إلقاء المخزن المؤقت من اللوحات. لطخة لوحات مقلوبة على منشفة ورقية نظيفة لإزالة أي سائل على رأس اللوحات بسرعة.</li>
	<li>شطف الخلايا عن طريق إضافة إلى ميليلتر 200 لوحات من التسرب الحد الأدنى المتوسط المقابلة لعلامة اختيار على بلازميد المكتبة. ملاحظة: قمنا باستخدام وسيلة اتفاق جولة أوروغواي اصطناعية.</li>
	<li>الطرد المركزي لوحات لمدة 5 دقائق في 3,000 س ز وإزالة المادة طافية على حاوية نفايات كما في الخطوة 2، 10.</li>
	<li>إضافة 160 ميليلتر أورا-المتوسطة تحتوي على حد أدنى 2% الجلوكوز. دوامة لوحات لمدة 1 دقيقة 1,000 لفة في الدقيقة واحتضانها لهم عند 30 درجة مئوية عن 48 ساعة دون المصافحة. بعد 48 ساعة، ملاحظة أن بيليه خميرة المحولة مرئياً في الجزء السفلي من كل بئر.</li>
	<li>استخدام موزع سائلة، إضافة 100 ميليلتر من اتفاق جولة أوروغواي، وسائل الإعلام التي تحتوي على الجلوكوز في كل من مجموعة جديدة من لوحات 96-جيدا جيدا.</li>
	<li>دوامة لوحات تحتوي على الخميرة المحولة (من الخطوة 2، 13) 1,000 لفة في الدقيقة لمدة 30 س. باستخدام وحدة النسخ متماثل 96-دبوس بلاستيك عقيمة ووضع الدبابيس في الآبار التي تحتوي على الخميرة المحولة وتطعيم لهم ثم إلى الآبار المقابلة للوحات الجديدة مليئة بوسائل الإعلام. احتضان لوحات جديدة عند 30 درجة مئوية ح 24. ملاحظة: إذا كان يعمل مع 10 لوحات، المتوسط يمكن أيضا يمكن الاستغناء عن يدوياً باستخدام الماصات متعدد القنوات.</li>
	<li>بعد 24 ساعة، ينبغي أن يكون بيليه خميرة مرئية في الجزء السفلي من كل بئر يحتوي على الخميرة المحولة بنجاح. لحفظ هذه سلالات الخميرة كمخزون والغليسيرول، إضافة 50 ميليلتر من الجلسرين 50% لكل بئر، دوامة لوحات لمدة 30 ثانية 1,000 لفة في الدقيقة، ختم اللوحات مع ختم الشريط وتجميدها في-80 درجة مئوية. ملاحظة: الخطوات المذكورة أعلاه تحتاج إلى تتم مرة واحدة فقط. البدء من مخزونات والغليسيرول العروض المستقبلية لنماذج مختلفة من الخميرة ضد نفس مكتبة كاشف المتاح الخزان والشروع فورا من الخطوات المذكورة أدناه.</li>
</ol>3-التزاوج بين الخلايا التي تحتوي على جينات مكتبة والخميرة الاستعلام
<ol><li>لإنعاش سلالات مكتبة من المخزون والغليسيرول، تأخذ لوحات 96-جيدا للخروج من الثلاجة-80 درجة مئوية، إزالة الشريط الختم، وترك الخميرة ذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة لمدة حوالي 30 دقيقة.</li>
	<li>بمجرد قد إذابة الخميرة، استخدام وحدة النسخ متماثل 96-دبوس بلاستيك عقيمة لتطعيم الأرصدة والغليسيرول إلى 160 ميليلتر الطازجة التي تحتوي على اتفاق جولة أوروغواي-وسائط 2% الجلوكوز في لوحات 96-جيدا واحتضانها لهم عند 30 درجة مئوية ل 24 h. فورا بعد أن يتم استخدام سلالات المكتبة ، ختم اللوحات مع ختم الشريط، وإعادتها إلى الثلاجة-80 درجة مئوية.</li>
	<li>في نفس اليوم هي إذابة سلالات مكتبة (W303α)، تطعيم سلالة الخميرة الاستعلام (هنا، فوس في W303a) إلى 50 مل YPD، وأنها تنمو بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية مع الهز 250 لفة في الدقيقة.</li>
	<li>في صباح اليوم التالي، صب سلالة الخميرة الاستعلام إلى خزان كاشف المتاح عقيمة، والكوة ميليلتر 160 من سلالة الاستعلام لكل بئر من صفيحة 96-جيدا ماصة متعددة باستخدام.</li>
	<li>استخدام موزع السائلة، الاستغناء عن 160 ميليلتر من YPD وسائل الإعلام في كل من عشر لوحات 96-جيدا جيدا. استخدام هذه اللوحات في وقت لاحق للتزاوج سلالة الخميرة الاستعلام مع الخميرة المكتبة.</li>
	<li>باختصار دوامة سلالة لوحة 96-كذلك يتضمن سلالة الاستعلام ومن ثم استخدام وحدة النسخ متماثل 96-دبوس معقم لنقل الاستعلام إلى لوحات YPD.</li>
	<li>باختصار دوامة المكتبة سلالة لوحات، وكل لوحة مكتبة السلالة، استخدام وحدة النسخ متماثل 96-دبوس معقم جديدة لنقل سلالات مكتبة إلى لوحات YPD التي قد تم تلقيح مع سلالة الاستعلام. ملاحظة: الخلايا في والغليسيرول تفقد صلاحيتها بعد عدة دورات تجميد ذوبان الجليد. العودة سلالات مكتبة للتخزين طويل الأجل (الثلاجة-80 درجة مئوية) أقرب الاحتفاظ المكتبة في ذات نوعية جيدة، وجاهزة للاستخدام في المستقبل. حفظت بشكل صحيح، يمكن تجميد الأسهم والغليسيرول وإذابة 10 مرات على الأقل. نوصي بشدة أيضا حفظ نسخة عمل ونسخ احتياطية من الأسهم والغليسيرول. عندما لا يعمل العامل المخزون، فورا جعل جديدة تعمل نسخة من نسخة احتياطية.</li>
	<li>احتضان لوحات YPD عند 30 درجة مئوية ل h. 24 علما أن بيليه خميرة سيكون مرئياً في الجزء السفلي من كل بئر بعد 24 ساعة.</li>
	<li>لوحات ملء 96-جيدا مع متوسط تسرب الحد أدنى الذي يحتوي على 2% رافينوسي، المقابلة لعلامات التحديد على بلازميد في سلالة الاستعلام وكذلك على بلازميد المكتبة (مثلاً، هنا أورا-له-).</li>
	<li>استخدام النسخ متماثل 96-دبوس عقيمة لنقل الخميرة من YPD التزاوج الثقافات لوسائط الإعلام الانتقائي. احتضان لوحات 96-جيدا عند 30 درجة مئوية عن 48 ساعة؛ الخميرة فقط الخلايا التي قد تزاوج وشكلت مثنوية الخلايا لذلك، تحتوي على كلا بلازميد الاستعلام وبلازميد المكتبة سوف تكون قادرة على النمو في هذه الوسائط. بعد يومين، نلاحظ أن بيليه مرئياً في الجزء السفلي من الآبار.</li>
</ol>4-اكتشاف الإنزيم
<ol><li>
بعد 48 ساعة نمو في وسائل الإعلام الانتقائي التي تحتوي على رافينوسي، على الفور الخميرة لوحات أجار.
	<ol>
<li>إعداد مجموعات من لوحات أورا-صاحب التسرب تتضمن أجار 2% باستخدام ألواح البوليسترين واضحة وواحدة تحتوي على اللبن 2% والجلوكوز 2% أخرى تحتوي على 2.</li>
		<li>لوحات دوامة 96-جيدا لمدة 1 دقيقة 1,000 لفة في الدقيقة، ثم بقعة الخميرة لوحات أورا-صاحب الانقطاع عن الدراسة التي تحتوي على اللبن 2% واجار 2% (هي التي يسببها الجينات فوس ومكتبة) ولوحات أورا-صاحب التسرب الذي يحتوي على الجلوكوز 2% و 2% أجار (الجينات فوس ومكتبة القمع) باستخدام جهاز اكتشاف روبوتية، التي رصدت الثقافة في كل جيدا على لوحات أجار في البيلوروسية (أيالثقافة في 1 كذلك رصدت للبقع 4 على لوحة أجار).</li>
		<li>بعد أن شاهد، اسمحوا لوحات أجار الجاف، وثم وضعها في حاضنة 30 درجة مئوية رأسا على عقب. تصوير لوحات أجار كل 24 ساعة لتسجيل نمو أسرع/أكثر خميرة التي أنقذت السمية على سلالة الاستعلام أو تسجل نمواً أبطأ/أقل من الذي يتفاقم السمية على سلالة الاستعلام. احتضان اللوحات لمدة 4 أيام. ملاحظة: الثقافة في كل جيدا يمكن رصدها على ألواح أجار 1 إلى 1, كما هو موضح في أسلوب المستندة إلى التحول سابق10. ومع ذلك، 1-إلى-4 شاهد هنا (والتي يمكن وضع مريح حتى باستخدام آلة اكتشاف الروبوتية) يزيد بشكل كبير مدى متانة المقايسة بالحد من العدد إيجابيات كاذبة. وتعتبر الزيارات إيجابية فقط عندما تظهر جميع المستعمرات 4 من نفس جيدا النمط الظاهري مماثلة.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dujon, B. A., Louis, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+diversity+and+evolution+in+the+budding+yeasts+(Saccharomycotina).">Genome diversity and evolution in the budding yeasts (Saccharomycotina).</a> Genetics. 206 (2), 717-750 (2017).</li><li>Khurana, V., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+neurodegeneration+in+Saccharomyces+cerevisiae:+why+cook+with+baker's+yeast.">Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker's yeast.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).</li><li>Willingham, S., Outeiro, T. F., DeVit, M. J., Lindquist, S. L., Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+genes+that+enhance+the+toxicity+of+a+mutant+huntingtin+fragment+or+alpha-synuclein.">Yeast genes that enhance the toxicity of a mutant huntingtin fragment or alpha-synuclein.</a> Science. 302 (5651), 1769-1772 (2003).</li><li>Outeiro, T. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+cells+provide+insight+into+alpha-synuclein+biology+and+pathobiology.">Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology.</a> Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).</li><li>Cooper, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+blocks+ER-Golgi+traffic+and+Rab1+rescues+neuron+loss+in+Parkinson's+models.">Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models.</a> Science. 313 (5785), 324-328 (2006).</li><li>Treusch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+links+between+Abeta+toxicity,+endocytic+trafficking,+and+Alzheimer's+disease+risk+factors+in+yeast.">Functional links between Abeta toxicity, endocytic trafficking, and Alzheimer's disease risk factors in yeast.</a> Science. 334 (6060), 1241-1245 (2011).</li><li>Ju, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+model+of+FUS/TLS-dependent+cytotoxicity.">A yeast model of FUS/TLS-dependent cytotoxicity.</a> PLoS Biology. 9 (4), 1001052 (2011).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determinants+and+genetic+modifiers+of+aggregation+and+toxicity+for+the+ALS+disease+protein+FUS/TLS.">Molecular determinants and genetic modifiers of aggregation and toxicity for the ALS disease protein FUS/TLS.</a> PLoS Biology. 9 (4), 1000614 (2011).</li><li>Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+TDP-43+proteinopathy+model:+Exploring+the+molecular+determinants+of+TDP-43+aggregation+and+cellular+toxicity.">A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (17), 6439-6444 (2008).</li><li>Fleming, M. S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+yeast+plasmid+overexpression+screen.">High-throughput yeast plasmid overexpression screen.</a> Journal of Visualized Experiments. (53), e2836 (2011).</li><li>Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+cycle+of+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Life cycle of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiological Reviews. 52 (4), 536-553 (1988).</li><li>Suter, B., Auerbach, D., Stagljar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast-based+functional+genomics+and+proteomics+technologies:+the+first+15+years+and+beyond.">Yeast-based functional genomics and proteomics technologies: the first 15 years and beyond.</a> Biotechniques. 40 (5), 625-644 (2006).</li><li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+toxicity+in+neuronal+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+by+hUPF1.">Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (25), 7821-7826 (2015).</li><li>Jackson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+forelimb+function+by+UPF1+gene+therapy+in+a+rat+model+of+TDP-43-induced+motor+paralysis.">Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced motor paralysis.</a> Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

هنا، يمكننا وصف بروتوكولا لأداء شاشة overexpression بلازميد في استخدام التزاوج لإدخال بلازميد المكتبة في نموذج الخميرة الخميرة. باستخدام هذا النهج، يمكن فحص نماذج متعددة من الخميرة سمية البروتين أمراض الأعصاب باستخدام نفس المجموعة من الخميرة تحول مع مكتبة بلازميد. عملية شاقة للتحول يحتاج فقط إلى إجراء مرة واحدة، وبعد فيه الخميرة ذات كفاءة عالية التزاوج يستخدم لإدخال بلازميد المكتبة في سلالة الاستعلام. يعتمد هذا البروتوكول على استخدام المعدات الآلية الاستغناء عن وسائل الإعلام والثقافات الخميرة بقعة على لوحات أجار. في حين يمكن أن يؤديها البروتوكول دون استخدام المعدات الآلية، ستكون أكثر استهلاكاً للوقت. وكان هذا الأسلوب بنجاح المستخدمة على الشاشة للجينات التي يمكن تعديل سمية فوس.
ولاحظنا أن فوس أقل قليلاً في الخلفية الخميرة النباتات السامة. هذا الأكثر احتمالاً بسبب عدد نسخ الجينات والفروق في معدل نمو الخميرة مثنوية. إلا النمط الظاهري الذي قيد الدراسة التزاوج نوع أو تعتمد على بلويدي، والنمط الظاهري النمو عن السمية يتسق في الخميرة فرداني والنباتات. وبسبب هذا، يتوقع الأسلوب القائم على التزاوج للعمل على نطاق واسع في العديد من نماذج مختلفة النمو تعمل الخميرة. ومع ذلك، ينبغي التحقق من النمط الظاهري طراز الخميرة للتأكد من أنها لا تزال موجودة في الخلفية ضعفاني قبل أن يتم تنفيذ هذا الأسلوب الفرز. هذا الأسلوب يمكن استخدامها لدراسة تعمل مختلفة كثيرة في الخميرة ولا يقتصر على دراسة سمية البروتين الأعصاب. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام أي بلازميد المكتبة التي تحتوي على الخميرة التعبير المتجهات.
بعد أداء الشاشة، وهناك عدد من فحوصات التحقق التي سوف تساعد على ضمان أن يضرب المحددة محددة إلى نموذج الخميرة يجري فرزهم. ينبغي اختبار القدرة على سميتها في الخميرة دون المشاركة الإعراب عن البروتين المرض للفائدة. ينبغي إلغاء معززات يسبب سمية مستقلة من البروتين المرض للفائدة من إجراء المزيد من الدراسة. من المهم أن تنظر سواء المكثفات سمية تؤثر على التعبير عن البروتين الأمراض التي تؤثر على مروج Gal1. ينبغي إزالة أي المكثفات التي تؤثر على التعبير من المروج Gal1 من إجراء المزيد من الدراسة.
سلالات الخميرة التي تحتوي على بلازميد المكتبة مخزنة بشكل دائم في الأسهم والغليسيرول ويمكن إحياؤها بسرعة عند الحاجة إليها حيث أن الأسلوب القائم على التزاوج يمكن تطبيقها بسهولة على نماذج الخميرة الأخرى التي تحتاج إلى فحص ضد الجينات المكتبة نفسها. كفاءة الأسلوب القائم على التزاوج يصبح واضحا عندما يتم استخدام نفس النوع من الفحص لإزالة المغلوطة أو عند نماذج مختلفة من الخميرة متعددة تحتاج إلى دراسة. لقد استخدمت بنجاح هذا الأسلوب للشاشة طراز خميرة من ماساتشوستس-43، البروتين أخرى مرتبطة بالمرض.

مهدها الخميرة Saccharomyces cerevisiae كانت تستخدم على نطاق واسع في البحوث العلمية الأساسية1 فهم العمليات الخلوية التي تتصل مباشرة بالأمراض التي تصيب الإنسان. وعلاوة على ذلك، قد استخدمت ككائن نموذج لدراسة البروتينات البشرية المرتبطة بالمرض، مثل تلك المرتبطة بأمراض الأعصاب الأكثر شيوعاً، بما في ذلك مرض الزهايمر ومرض باركنسون ومرض هنتنغتون والجانبي الضموري 2من التصلب الجانبي (المرض). ميزة نموذج الخميرة هو السهولة التي يمكن أن يؤديها شاشة على نطاق الجينوم لتحديد المسارات الخلوية المتصلة بسمية البروتينات ذات الصلة بالمرض، مما يعطي نظرة ثاقبة إليه سميتها. شاشة واحدة من هذا القبيل يطلق على شاشة مكتبة overexpression، فيه كل من جينات الخميرة 5,500 في مكتبة أراييد تتحول إلى نموذج خميرة على تحديد الجينات التي يمكن تعديل السمية عند أوفيريكسبريسيد. هذا أسلوب الفرز قد طبقت بنجاح في نماذج الخميرة متعددة الأعصاب المرتبطة بالمرض البروتينات، بما في ذلك هونتينجتين لمرض هنتنغتون3، α-سينوكلين لمرض باركنسون4،5 ، Aβ6من مرض الزهايمر، وفوس، ماساتشوستس-43 للمرض7،،من89. الخطوة كثيفة العمالة أكثر من الشاشة على حدة في حين أنه يتم عادة في طريقة الفائق10، هو تحويل جينات الخميرة 5,500 من مكتبة أراييد. يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوة في كل مرة يتم تكرار الفحص، وكلما نموذجا خميرة المنشأة حديثا تحتاج إلى دراسة. من المهم إيجاد وسيلة أكثر كفاءة لإنجاز هذه المهمة.
[ستبلى] يمكن أن توجد خلايا الخميرة في أشكال فرداني والنباتات على حد سواء. هناك نوعان من المقابلة للتزاوج أنواع الخلايا فرداني، يزاوج نوع والخلايا α. فرداني للتزاوج كل نوع تنتج وتفرز فرمون التزاوج المحددة الخاصة بهم، التي تستجيب فقط الخلايا نوع التزاوج المعاكس. وهذا يسمح للتزاوج بين والخلايا α لإنتاج الخلايا ضعفاني مستقرة،/α. هذه العملية هي عفوية وذات كفاءة عالية11. يمكن لنا أن نستفيد من هذه دورة حياة فريدة من نوعها S. cerevisiae لإدخال بلازميد المكتبة. وبشكل أكثر تحديداً، ستحول كل الجينات في مكتبة صفت بلازميد إلى الخلايا فرداني من نوع التزاوج واحد، أي، خلية α. سيتم تخزين هذه الخلايا التي تحتوي على جينات مكتبة ثم والغليسيرول الأسهم في شكل 96-جيدا أراييد. لكل طراز الخميرة التي تحتاج إلى فحص، يمكن إذابة خلايا الخميرة التي تحتوي على جينات مكتبة من المخزون والغليسيرول، ويمكن أن يتم الفحص عن طريق التزاوج مع نموذج الخميرة من اهتمام بالمقابل التزاوج نوع، أينوع التزاوج. هذه الفكرة من استخدام التزاوج للجمع بين اثنين من الجينات في الخميرة ليست جديدة. قد طبقت بنجاح في الخميرة الفائق الفرز الهجين اثنين، فيه بناء طعم (أي، Gal4-الحمض النووي-ملزمة المجال الأنشطار) في نوع التزاوج واحد جمعت عن طريق التزاوج مع بنية بري من مكتبة أراييد 12-غير أن هذه الاستراتيجية لم تطبق ابدأ في عروض مكتبة أوفيريكسبريشن، التي استخدمت دائماً طرق التحويل التقليدية.
قبل إنشاء مختبرنا نموذج خميرة فوس البروتين المرتبط بالمرض7. من خلال الفحص مكتبة أوفيريكسبريشن باستخدام أسلوب التحويل اكتشفنا خمس جينات الخميرة (ECM32، NAM8، SBP1، SKO1، و VHR1) أن إنقاذ سمية فوس عند أوفيريكسبريسيد. وتأكدت هذه النتائج بشكل مستقل مع دراسة مماثلة بآخر مجموعة8. وأبدى hUPF1، homolog الإنسان من ECM32، لاحقاً لقمع السمية في الخلايا العصبية الأولية13 وفي نموذج حيوان من المرض14 كذلك. باستخدام هذه الجينات الخمسة كدليل على المبدأ، علينا أن نبرهن أن الجينات خمس جميع المثل إنقاذ فوس السمية عند إدخالها في نموذج الخميرة فوس بالتزاوج. حيث يمكن تخزينها بشكل دائم في الأسهم والغليسيرول خلايا الخميرة التي تحتوي على جينات مكتبة وإحياء كلما دعت الحاجة، سيتم إزالة هذا الأسلوب القائم على التزاوج خطوة وقتاً طويلاً لتحويل كل مرة المكتبة بحاجة إلى فحص ضد. منذ التزاوج ذات كفاءة عالية بأي تحويل بلازميد المعنية، هذه الاستراتيجية أيضا إلى حد كبير يقلل التكلفة المرتبطة بتنقية وتحويل مكتبة بلازميد كبيرة. سوف نطبق هذا الأسلوب بنجاح إلى مكتبة الفرز ضد الخميرة نموذج فوس.
إجراء الفرز على أساس التزاوج يرد بإيجاز في الشكل 1. في البداية، تتحول إلى سلالة خميرة فرداني من التزاوج α نوع استخدام بروتوكول تحول الفائق خميرة التي يحتوي على كل من لوحة 96-جيدا جيدا الخميرة تحول مع بلازميد مكتبة محددة المكتبة بلازميد صفت. يتم حفظ هذه المجموعة من الخميرة المحولة كمخزون والغليسيرول يمكن إذابة وإحياؤها لاستخدامها في وقت لاحق. نموذج الخميرة من الاهتمام، في هذه الحالة سمية فوس، يجب أن يتم إنشاؤها في سلالة خميرة فرداني مع نوع التزاوج المعاكس (التزاوج نوع). في طريقة الفائق باستخدام معقم 96-دبوس مثاليان، سلالة فوس وسلالات الخميرة التي تحتوي على مكتبة بلازميد يتم تحويلها إلى لوحات 96-البئر الذي يحتوي على الوسائط الغنية، ويسمح لرفيقه. بعد التزاوج، كمية صغيرة من كل بئر الثقافة التزاوج يتم نقلها إلى 96-جيدا لوحات تحتوي على وسائط الإعلام التسرب الاصطناعية في الخميرة مثنوية فقط التي تحتوي على كلا فوس ومكتبة الجينات يمكن أن تنمو. ثم يتم استخدام جهاز اكتشاف روبوتية لنقل الثقافة الخميرة من كل بئر على لوحات أجار فيها فعل التعبير عن فوس والجينات المكتبة.  بالإضافة إلى ذلك، رصدت الثقافة الخميرة للتحكم في لوحات أجار حيث فوس والجينات مكتبة لا يعبر عن. في أعقاب النمو على ألواح أجار، سيتم تحديد الجينات التي إنقاذ أو تزيد من حدة سمية فوس.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:555px;" width="554">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:183px;">salmon Sperm DNA (SS-DNA)</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:99px;">&#160; D1626</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:183px;">YPD broth</td>
			<td style="width:127px;">Research Products International (RPI)</td>
			<td style="width:99px;">Y20090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">Granulated Agar</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:99px;">BP97445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:183px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:127px;">Research Products International (RPI)</td>
			<td style="width:99px;">G32040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:183px;">D-(+)-Galactose</td>
			<td style="width:127px;">Research Products International (RPI)</td>
			<td style="width:99px;">G33000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:183px;">D-(+)-Raffinose Pentahydrate</td>
			<td style="width:127px;">Research Products International (RPI)</td>
			<td style="width:99px;">R20500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">Ammonium Sulfate</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:99px;">A702-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:183px;">Synthetic Ura- drop out medium</td>
			<td style="width:127px;">Clontech</td>
			<td style="width:99px;">630416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:183px;">Yeast amino acid drop out supplement -Histidine/-Uracil</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>630422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:183px;">Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and Ammonium Sulfate</td>
			<td style="width:127px;">Research Products International (RPI)</td>
			<td style="width:99px;">Y20060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:183px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:99px;">S67496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:183px;">Lithium acetate, anhydrous</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:99px;">AC268640010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:183px;">Polyethylene Glycol 3350 (PEG-3350)</td>
			<td style="width:127px;">Spectrum Chemical&#160;</td>
			<td style="width:99px;">PO125-12KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">96 Pin Replicator&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Scinomix</td>
			<td style="width:99px;">SCI-5010-OS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">Nunc OmniTray</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Sci</td>
			<td>140156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:183px;">Corning Costar 96 well assay plate, round bottom with lid</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:99px;">07-200-760</td>
			<td>non-treated, sterile</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:183px;">Eppendorf&#160;Research plus Multichannel Pipette</td>
			<td style="width:127px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:99px;">TI13690052</td>
			<td>30-300ul volume</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:183px;">Fisherbrand&#160;Isotemp Digital Dry Baths/Block Heaters</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:99px;">88-860-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">Eppendorf&#160;MixMate</td>
			<td style="width:127px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:99px;">21-379-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:183px;">Eppendorf 5810R Centrifuge</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:99px;">05-413-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">Avanti J-26 XPI Centrifuge</td>
			<td style="width:127px;">Beckman</td>
			<td style="width:99px;">393127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:183px;">MultiFlo FX Multi-Mode Dispenser</td>
			<td style="width:127px;">BioTek</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:183px;">Rotor HDA&#160;&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mating-based overexpression library screening in yeast

الخميرة مهدها قد استخدمت على نطاق واسع كنموذج لدراسة البروتينات المرتبطة بالأمراض التي تصيب الإنسان. الفحص الوراثي على نطاق الجينوم أداة قوية التي يشيع استخدامها في الدراسات الخميرة. التعبير عن عدد من البروتينات المرتبطة بأمراض الأعصاب في الخميرة الأسباب سيتوتوكسيسيتي وتشكيل التجميعية، ولخص النتائج في المرضى الذين يعانون من هذه الاضطرابات. هنا، يمكننا وصف طريقة لفحص نموذج خميرة من البروتين المرتبط بالتصلب العضلي الجانبي فوس لمعدلات سميته. بدلاً من استخدام التحويل، هذا البرنامج فحص جديدة تعتمد على التزاوج من الخميرة لإدخال لمكتبة أراييد من البلازميدات في نموذج الخميرة. يحتوي الأسلوب على التزاوج اثنين من مزايا واضحة: أولاً، أنها ذات كفاءة عالية؛ ثانيا، يمكن تخزين مكتبة والبلازميدات arrayed قبل تحويلها للطويلة الأجل أسهم والغليسيرول وتطبيقها بسرعة على شاشات أخرى دون أن الخطوة كثيفة العمالة للتحول إلى نموذج الخميرة في كل مرة. ونحن تثبت كيف يمكن أن تستخدم هذا الأسلوب بنجاح على الشاشة للجينات التي تعديل سمية فوس.

البروتين المرتبط بالمرض فوس، الحمض النووي الريبي/DNA بروتين، درست سابقا في الخميرة فرداني7،8. الوراثية الفحص باستخدام الأسلوب القائم على التحول اكتشفت عدة جينات الخميرة التي تقمع سمية فوس. Homolog الإنسان واحدة من جينات الخميرة اتضح فيما بعد أن تكون فعالة في قمع السمية في الخلايا العصبية الأولية ونموذج الفئران من ALS13. هنا، نقوم باستخدام نفس نموذج الخميرة لإظهار أن overexpression مكتبة الفرز يمكن أن يؤديها التزاوج بشكل فعال بالتحول.
فوس سامة لخلايا الخميرة فرداني والنباتات على حد سواء وأجرى طراز الخميرة السابقة فوس وفرز مكتبة overexpression اللاحقة في الخلفية الخلية فرداني. للأسلوب القائم على التزاوج للعمل، بحاجة إلى إثبات في الخميرة مثنوية سمية فوس. للقيام بهذا، نحن تزاوج نموذج الخميرة فوس في w303a (التزاوج نوع) مع w303α تحول مع موجه فارغ (التزاوج نوع α). وكما هو مبين في الشكل 2، على الرغم من أن سمية فوس لا كقوى كما هو الحال في الخميرة فرداني، يتجلى في الخميرة مثنوية.
التعرف على الجينات قمع سابقا عمل في الخميرة مثنوية كدليل على مبدأ للأسلوب القائم على التزاوج، قمنا باختبار الجينات الخمسة المحددة سابقا من الأسلوب القائم على التحول. التزاوج كان يستخدم لإدخال كل من الجينات الخمسة في نموذج الخميرة فرداني فوس (في W303a)، وقد تم اختبار قدرتها على إنقاذ سمية فوس في الخميرة مثنوية اللاحقة (W303a/α). كما هو موضح في الشكل 3، إنقاذ جميع الجينات خمسة سمية فوس في الخميرة مثنوية، مما يشير إلى أن الأسلوب التزاوج الفعال.
لفحص تجريبي من الجينات 940 (صفت على عشر لوحات 96-جيدا) عقب البروتوكولات المذكورة أعلاه، يمكننا تطبيق الأسلوب القائم على التزاوج فحص مكتبة overexpression من الجينات 940. 4 الشكل يعرض صورة للوحة ممثل واحد. وكما هو مبين في الجانب الأيمن من الشكل (الجينات فوس ومكتبة وأعرب)، كان فوس السامة للخميرة مثنوية. الجين مكتبة أشار إلى جانب الساحة الخضراء إنقاذ سمية فوس في حين أشارت بالساحة الحمراء إلى تعزيز سمية.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57978/57978fig1.jpg"> الشكل 1 : الرسم التخطيطي لفحص نماذج الخميرة سمية البروتين باستخدام التزاوج. مكتبة بلازميد (تحت سيطرة المروج GAL1 الذي هو الغاية التي يسببها حضور اللبن) تتحول إلى سلالة خميرة فرداني (MATα) باستخدام بروتوكول تحول الفائق. هذه المجموعة من الخميرة، تحولت مع والبلازميدات المكتبة، يتم تخزينها كمخزون والغليسيرول في-80 درجة مئوية، ويتم أحياء عند الحاجة إلى رفيقه مع نموذج الخميرة فرداني سمية البروتين (في حالتنا، نسخة واحدة من فوس المتكاملة في محور HIS3، GAL1 المروج ، ماتا). مثنوية الخميرة تحتوي على مكتبة بلازميد والبروتينات السامة (فوس) هي المحدد ورصدت للسكر (الجين فوس ومكتبة 'إيقاف') ولوحات أجار اللبن (الجين فوس ومكتبة 'على'). وتلت نمو الخميرة إلى تحديد الجينات التي إنقاذ أو تزيد من حدة سمية فوس. الساحة الخضراء تشير إلى مثال الجينات القامع أن تنقذ سمية فوس، والساحة الحمراء تشير إلى مثال للجينات محسن الذي يزيد من حدة سمية فوس عند أوفيريكسبريسيد. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57978/57978fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57978/57978fig2.jpg"> الشكل 2 : فوس سامة لخلايا الخميرة فرداني والنباتات على حد سواء. الخميرة فرداني (w303 ماتا) تحول مع pRS303Gal1-فوس تحول مع بلازميد فارغة أو تزاوج مع الخميرة نوع التزاوج المعاكس (w303 MATα) تحول مع بلازميد فارغة ذاته لتوليد سلالة خميرة مثنوية. وكانت هذه سلالات الخميرة جنبا إلى جنب مع سلالة تحكم ثم 5 × متسلسل المخفف (من اليسار إلى اليمين) ورصدت لاتفاق جولة أوروغواي-صاحب الجلوكوز المتوسطة (اليسار، فوس التعبير مكبوتة) واتفاق جولة أوروغواي-صاحب اللبن المتوسطة (يمين، الناجم عن التعبير فوس). التقطت الصورة بعد يومين نمو في 30 درجة مئوية. قد لوحظ النمو متطابقة تقريبا من سلالة تحكم فرداني والنباتات، فقط كان سيظهر سلالة تحكم فرداني. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57978/57978fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57978/57978fig3.jpg"> الشكل 3 : خمس جينات الخميرة (ECM32، NAM8، SBP1، SKO1، و VHR1) إنقاذ سمية فوس من خلال الأسلوب القائم على التزاوج. البلازميدات المحتوية على الجينات التي سبق تحديدها الخميرة التي تقمع سمية فوس تحولت إلى سلالة خميرة فرداني (w303 MATα). ثم تم تزاوج هذه الخميرة مع الخميرة فرداني من نوع التزاوج المعاكس (w303 ماتا) تحول مع بلازميد تعبير فوس. وكان الخميرة مثنوية تتضمن فوس وأما موجه فارغ أو واحد من الجينات قمع خمسة replicates المحددة ورصدت في لوحات أجار المحتوية على الجلوكوز (الجينات 'إيقاف') واللبن (الجينات 'على'). (1) يظهر تحولت سلالة خميرة عنصر تحكم مع اثنين من ناقلات فارغة. (2) يبين سلالة الخميرة فوس مثنوية مع موجه فارغ حيث يتم التعبير عن فوس سامة جداً. (3-7) إظهار الخميرة مثنوية معربا عن فوس، فضلا عن قمع جينات التي يمكن إنقاذ سمية فوس. كل رقم (1-7) يظهر صفين من اثني عشر مطابقة يتطابق. تم التقاط الصورة، تمثل ثلاث تجارب مستقلة، بعد 3 أيام نمو في 30 درجة مئوية. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57978/57978fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57978/57978fig4.jpg"> الشكل 4 : مكتبة فحص للجينات أن الإنقاذ أو تزيد من حدة سمية فوس. وكان تزاوج فرداني الخميرة التي تحتوي على فوس مع الخميرة فرداني المحتوية على الجينات مكتبة. بعد التزاوج، تحديد مثنوية الخلايا التي تحتوي على فوس وجين مكتبة ورصدت للسكر (الجينات فوس ومكتبة 'إيقاف') واللبن ثم لوحات أجار (الجينات فوس ومكتبة 'على') في البيلوروسية. على لوحة اللبن، التي أبديت فوس والجينات مكتبة، كانت معظم الخميرة غير قادر على النمو أيضا. وهذا يشير إلى أن فوس السامة وكانت معظم مكتبة جينات غير قادر على إنقاذ سمية. الساحة الخضراء يوضح مثال على مكتبة الجين يقمع سمية فوس ويسمح الخميرة على شكل مستعمرات. الساحة الحمراء تشير إلى مثال على مكتبة الجين الذي يزيد من حدة سمية فوس. اللوحات المعروضة هنا هي ممثل 10 لوحات من مكتبة الجينات التي تم فحص ضد. التقطت الصورة بعد 3 أيام نمو في 30 درجة مئوية. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57978/57978fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast at JoVE.com

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

تقدم هذه المقالة طريقة التزاوج القائم لتسهيل فحص أوفيريكسبريشن في مهدها الخميرة استخدام مكتبة صفت بلازميد.

فحص مكتبة Overexpression المستندة إلى التزاوج في الخميرة

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

mating-based-overexpression-library-screening-in-yeast

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

7.6K Views.  Wright State University. تقدم هذه المقالة طريقة التزاوج القائم لتسهيل فحص أوفيريكسبريشن في مهدها الخميرة استخدام مكتبة صفت بلازميد.

Video: Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.

المستهدفة<em&gt; في الموقع</em&gt; الطفرات من هيستون الجينات في مهدها الخميرة

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 nuclease or a nuclease-dead dCas9 fusion protein) is targeted to a specific site in the genome by a small synthetic RNA known as the guide RNA, or gRNA. The bipartite nature of the CRISPR system enables its use in screening approaches since plasmid libraries containing expression cassettes of thousands of individual gRNAs can be used to interrogate many different sites in a single experiment. 
To date, gRNA sequences for the construction of libraries have been almost exclusively generated by oligonucleotide synthesis, which limits the achievable complexity of sequences in the library and is relatively cost-intensive. Here, a detailed protocol for CORALINA (comprehensive gRNA library generation through controlled nuclease activity), a simple and cost-effective method for the generation of highly complex gRNA libraries based on enzymatic digestion of input DNA, is described. Since CORALINA libraries can be generated from any source of DNA, plenty of options for customization exist, enabling a large variety of CRISPR-based screens.

Methods for generating large-scale gRNA libraries should be simple, efficient and cost-effective. We describe a protocol for the production of gRNA libraries based on enzymatic digestion of target DNA. This method, CORALINA (comprehensive gRNA library generation through controlled nuclease activity) presents an alternative to costly custom oligonucleotide synthesis.

بروتوكول عالمي جرنة على نطاق واسع "الإنتاج مكتبة" من أي "مصدر الحمض النووي"

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with a number of challenges including sample preservation quality, degraded DNA, and destructive sampling of rare specimens. In order to more effectively use herbarium material in large sequencing projects, a dependable and scalable method of DNA isolation and library preparation is needed. This paper demonstrates a robust, beginning-to-end protocol for DNA isolation and high-throughput library construction from herbarium specimens that does not require modification for individual samples. This protocol is tailored for low quality dried plant material and takes advantage of existing methods by optimizing tissue grinding, modifying library size selection, and introducing an optional reamplification step for low yield libraries. Reamplification of low yield DNA libraries can rescue samples derived from irreplaceable and potentially valuable herbarium specimens, negating the need for additional destructive sampling and without introducing discernible sequencing bias for common phylogenetic applications. The protocol has been tested on hundreds of grass species, but is expected to be adaptable for use in other plant lineages after verification. This protocol can be limited by extremely degraded DNA, where fragments do not exist in the desired size range, and by secondary metabolites present in some plant material that inhibit clean DNA isolation. Overall, this protocol introduces a fast and comprehensive method that allows for DNA isolation and library preparation of 24 samples in less than 13 h, with only 8 h of active hands-on time with minimal modifications.

This article demonstrates a detailed protocol for DNA isolation and high-throughput sequencing library construction from herbarium material including rescue of exceptionally poor-quality DNA.

عزل الحمض النووي قوية وبناء مكتبة التسلسل الفائق للعينات دار النباتات

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve random mutagenesis, error-prone PCR is a convenient and efficient strategy for generating a diverse pool of mutants (i.e., a mutant library). Error-prone PCR is the method of choice when a researcher seeks to mutate a pre-defined region, such as the coding region of a gene while leaving other genomic regions unaffected. After the mutant library is amplified by error-prone PCR, it must be cloned into a suitable plasmid. The size of the library generated by error-prone PCR is constrained by the efficiency of the cloning step. However, in the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, the cloning step can be replaced by the use of a highly efficient one-step fusion PCR to generate constructs for transformation. Mutants of desired phenotypes may then be selected using appropriate reporters. Here, we describe this strategy in detail, taking as an example, a reporter inserted at centromeric heterochromatin.

This article describes a detailed methodology for random mutagenesis of a target gene in fission yeast. As an example, we target rpt4+, which encodes a subunit of the 19S proteasome, and screen for mutations that destabilize heterochromatin.

استهداف الجين الطفرات العشوائية لتحديد طفرات بروتوزوم هيتيروتشروماتين-زعزعة الاستقرار في انشطار الخميرة

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state when water is supplied. The genomic sequencing of microscopic animals such as tardigrades risks bacterial contamination that sometimes leads to erroneous interpretations, for example, regarding the extent of horizontal gene transfer in these animals. Here, we provide an ultralow input method to sequence the genome of the tardigrade, Hypsibius dujardini, from a single specimen. By employing rigorous washing and contaminant exclusion along with an efficient extraction of the 50 ~ 200 pg genomic DNA from a single individual, we constructed a library sequenced with a DNA sequencing instrument. These libraries were highly reproducible and unbiased, and an informatics analysis of the sequenced reads with other H. dujardini genomes showed a minimal amount of contamination. This method can be applied to unculturable tardigrades that could not be sequenced using previous methods.

Contamination during the genomic sequencing of microscopic organisms remains a large problem. Here, we show a method to sequence the genome of a tardigrade from a single specimen with as little as 50 pg of genomic DNA without whole genome amplification to minimize the risk of contamination.

معالجات الجينوم الإدخال تسلسل إعداد مكتبة من عينة تارديجرادي واحد

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect and count individual RNA molecules. Complementary to deep sequencing-based methods, smFISH provides information about the cell-to-cell variation in transcript abundance and the subcellular localization of a given RNA. Recently, we have used smFISH to study the expression of the gene&#160;NDC80&#160;during meiosis in budding yeast, in which two transcript isoforms exist and the short transcript isoform has its entire sequence shared with the long isoform. To confidently identify each transcript isoform, we optimized known smFISH protocols and obtained high consistency and quality of smFISH data for the samples acquired during budding yeast meiosis. Here, we describe this optimized protocol, the criteria that we use to determine whether high quality of smFISH data is obtained, and some tips for implementing this protocol in&#160;other yeast strains and growth conditions.

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

This single molecule fluorescence in situ hybridization protocol is optimized to quantify the number of RNA molecules in budding yeast during vegetative growth and meiosis.

التهجين في الموقع Fluorescence جزيء واحد (سمفيش) التحليل في مهدها الخميرة النمو الخضري والانقسام الاختزالي

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives each year. Effective treatment options able to halt disease progression are lacking. Despite the extensive sequencing efforts in large patient populations, the majority of ALS and PD cases remain unexplained by genetic mutations alone. Epigenetics mechanisms, such as the post-translational modification of histone proteins, may be involved in neurodegenerative disease etiology and progression and lead to new targets for pharmaceutical intervention. Mammalian in vivo and in vitro models of ALS and PD are costly and often require prolonged and laborious experimental protocols. Here, we outline a practical, fast, and cost-effective approach to determining genome-wide alterations in histone modification levels using Saccharomyces cerevisiae as a model system. This protocol allows for comprehensive investigations into epigenetic changes connected to neurodegenerative proteinopathies that corroborate previous findings in different model systems while significantly expanding our knowledge of the neurodegenerative disease epigenome.

This protocol outlines experimental procedures to characterize genome-wide changes in the levels of histone post-translational modifications (PTM) occurring in connection with the overexpression of proteins associated with ALS and Parkinson&#39;s disease in Saccharomyces cerevisiae models. After SDS-PAGE separation, individual histone PTM levels are detected with modification-specific antibodies via Western blotting.

يصف هستون تعديل بوستترانسلاشونال التعديلات في نماذج بروتينوباثي الأعصاب الخميرة

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely related biochemical pathways. Previous methods such as the Synthetic Genetic Array (SGA) analysis, and random mutagenesis techniques using ultraviolet (UV) or chemicals like ethyl methanesulfonate (EMS) or N-ethyl-N- nitrosourea (ENU), have been widely used but are often costly and laborious. Also, these mutagen-based screening methods are frequently associated with severe side effects on the organism, inducing multiple mutations that add to the complexity of isolating the suppressors. Here, we present a simple and effective protocol to identify suppressor mutations in mutants which confer a growth defect in Schizosaccharomyces pombe. The fitness of cells with a growth deficiency in standard rich liquid media or synthetic liquid media can be monitored for recovery using an automated 96-well plate reader over an extended period. Once a cell acquires a suppressor mutation in the culture, its descendants outcompete those of the parental cells. The recovered cells that have a competitive growth advantage over the parental cells can then be isolated and backcrossed with the parental cells. The suppressor mutations are then identified using whole-genome sequencing. Using this approach, we have successfully isolated multiple suppressors that alleviate the severe growth defects caused by loss of Elf1, an AAA+ family ATPase that is important in nuclear mRNA transport and maintenance of genomic stability. There are currently over 400 genes in S. pombe with mutants conferring a growth defect. As many of these genes are uncharacterized, we propose that our method will hasten the identification of novel functional interactions with this user-friendly, high-throughput approach.

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

We present a simple suppressor screen protocol in fission yeast. This method is efficient, mutagen-free, and&#160; selective&#160; for&#160; mutations that&#160; often&#160; occur at&#160; &#160;a&#160; single&#160; genomic&#160; locus.&#160; The protocol is suitable for isolating suppressors that alleviate growth defects in liquid culture that are caused by a mutation or a drug.

شاشة القامع عميق--التسلسل-ساعد، عفوية في "انشطار الخميرة" شيزوساكتشاروميسيس بومبي

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries

CCCTC-binding factor (CTCF)-mediated stable topologically associating domains (TADs) play a critical role in constraining interactions of DNA elements that are located in neighboring TADs. CTCF plays an important role in regulating the spatial and temporal expression of HOX genes that control embryonic development, body patterning, hematopoiesis, and leukemogenesis. However, it remains largely unknown whether and how HOX loci associated CTCF boundaries regulate chromatin organization and HOX gene expression. In the current protocol, a specific sgRNA pooled library targeting all CTCF binding sites in the HOXA/B/C/D loci has been generated to examine the effects of disrupting CTCF-associated chromatin boundaries on TAD formation and HOX gene expression. Through CRISPR-Cas9 genetic screening, the CTCF binding site located between HOXA7/HOXA9 genes (CBS7/9) has been identified as a critical regulator of oncogenic chromatin domain, as well as being important for maintaining ectopic HOX gene expression patterns in MLL-rearranged acute myeloid leukemia (AML). Thus, this sgRNA library screening approach provides novel insights into CTCF mediated genome organization in specific gene loci and also provides a basis for the functional characterization of the annotated genetic regulatory elements, both coding and noncoding, during normal biological processes in the post-human genome project era.

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries

A CRISPR/sgRNA library has been applied to interrogating protein-coding genes.However, the feasibility of a sgRNA library to uncover the function of a CTCF boundary in gene regulation remains unexplored. Here, we describe a HOX loci specific sgRNA library to elucidate the function of CTCF boundaries in HOX loci.

HOX المكاني مركزة كريسبر/سجرنا "مكتبة الفرز تحديد الحرجة كتكف الحدود"

CCCTC-binding factor (CTCF)-mediated stable topologically associating domains (TADs) play a critical role in constraining interactions of DNA elements ...

Expression, Purification, and Liposome Binding of Budding Yeast SNX-BAR Heterodimers

SNX-BAR proteins are an evolutionarily conserved class of membrane remodeling proteins that play key roles in sorting and trafficking of protein and lipids during endocytosis, sorting within the endosomal system, and autophagy. Central to SNX-BAR protein function is the ability to form homodimers or heterodimers that bind membranes using highly conserved phox-homology (PX) and BAR (Bin/Amphiphysin/Rvs) domains. In addition, oligomerization of SNX-BAR dimers on membranes can elicit the formation of membrane tubules and vesicles and this activity is thought to reflect their functions as coat proteins for endosome-derived transport carriers. Researchers have long utilized in vitro binding studies using recombinant SNX-BAR proteins on synthetic liposomes or giant unilamellar vesicles (GUVs) to reveal the precise makeup of lipids needed to drive membrane remodeling, thus revealing their mechanism of action. However, due to technical challenges with dual expression systems, toxicity of SNX-BAR protein expression in bacteria, and poor solubility of individual SNX-BAR proteins, most studies to date have examined SNX-BAR homodimers, including non-physiological dimers that form during expression in bacteria. Recently, we have optimized a protocol to overcome the major shortcomings of a typical bacterial expression system. Using this workflow, we demonstrate how to successfully express and purify large amounts of SNX-BAR heterodimers and how to reconstitute them on synthetic liposomes for binding and tubulation assays.

Here, we present a workflow for the expression, purification and liposome binding of SNX-BAR heterodimers in yeast.

التعبير ، وتنقيه ، وملزمه ليبوسوم من الخميرة الناشئة SNX-شريط مغاير

SNX-BAR proteins are an evolutionarily conserved class of membrane remodeling proteins that play key roles in sorting and trafficking of protein and ...