Somos gratos as discussões pensativo com membros do laboratório Ju e laboratório de Zhong e o apoio financeiro de Wright State University.

Nota: O protocolo descrito aqui é projetado para triagem plasmídeos biblioteca contidos em dez placas de 96 poços, mas pode ser escalado para cima ou para baixo em conformidade. O protocolo deve ser repetido para completar o rastreio de toda biblioteca. Normalmente, triagem contra 10 placas de genes biblioteca cada vez pode ser confortavelmente manipulada por 1 pessoa.
1. preparação para a transformação de leveduras de 96 poços
Nota: Este passo é feito como anteriormente descrito7,10.
<ol><li>Alíquota de 5 µ l (aproximadamente 50 – 100 ng) do plasmídeo de uma biblioteca de matriz do plasmídeo em cada poço de uma placa de 96 poços de fundo redondo. Nota: Um exemplo de uma biblioteca seria um fermento gene superexpressão biblioteca10.</li>
	<li>Semear em 150 mL de levedura peptona dextrose (YPD) meios de comunicação em um balão de 500 mL com uma colônia (2 – 3 mm de diâmetro), da cepa de levedura haploide W303α. Incube-los durante a noite a 30 ° C, com agitação (200 rpm).</li>
	<li>Na manhã seguinte, medir a OD600 da cultura durante a noite e diluir a cultura de levedura para OD600 = 0.1 em (até) 2 L de YPD. Incubar a 30 ° C, com agitação (200 rpm) para ~ 5 h até a cultura atinge OD600 = 0.4-0.6.</li>
</ol>2. fermento transformação
<ol><li>Colheita da cultura de levedura enchendo 8 garrafas de centrífuga estéril 250 mL e centrifugação-los à temperatura ambiente a 3.000 x g por 10 min. decantar o sobrenadante sem perturbar o sedimento. Nota: Realize todas as etapas de centrifugação à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavagem do fermento com destilada estéril H2O. Para isso, adicionar 100 mL de estéril H2O para cada garrafa de centrífuga e vórtice para Ressuspender as células. Combine as células lavadas em 2 garrafas e centrífuga-los a 3.000 x g durante 5 min. decantar o sobrenadante.</li>
	<li>Lavar as células em cada frasco em 100 mL de 0.1 M LiOAc/1XTE (100mm LiOAc; 10 mM Tris, pH 8,0; 1 mM EDTA) e os de centrifugação a 3.000 x g por 5 min. deite fora o sobrenadante.</li>
	<li>Durante a centrifugação, ferva 5 mL de esperma de salmão DNA (10 mg/mL) a 100 ° C, usando um aquecedor do bloco por 3 min e depois resfriá-lo no gelo.</li>
	<li>Ressuspender as células em 25 mL de 0.1 M LiOAc/1XTE em cada garrafa, combinar as células ressuspensa e transferi-los para um balão de 150 mL. Adicionar 5 mL do esperma de salmão pre-cooled DNA e ele incube a 30 ° C, com agitação (225 rpm) por 30 min.</li>
	<li>Despeje a mistura de células em um reservatório de reagente descartável estéril e, usando uma pipeta multicanal, transferir 35 µ l da mistura de célula para cada poço da placa de 96 poços de fundo redondo contendo o plasmídeo de biblioteca. Placas de vórtice de 96 poços, usando uma placa reaccional para 1 min a 1.000 rpm. Incube as placas durante 30 minutos a 30 ° C sem tremer. Nota: Não empilhe os pratos, para que o calor pode transferir mais eficientemente. Descobrimos que num Vortex as placas de 96 poços em 1.000 rpm não causa líquido derramar fora dos poços, mas uma velocidade vórtice seguro deve ser testada antes de executar o passo.</li>
	<li>Num balão, prepare 200 mL de tampão de transformação contendo uma concentração final de 40% PEG3350, 10% de DMSO e 0.1 M LiOAc. Preparar o tampão de transformação imediatamente antes da utilização e homogeneizar por agitação.</li>
	<li>Placas de remover 96 poços da incubadora a 30 ° C e misture-os por 30 s a 1.000 rpm usando a placa reaccional. Adicione 125 µ l de buffer de transformação para cada poço e, em seguida, vórtice as placas por 1 min em 1.000 rpm.</li>
	<li>Incubar as placas a 30 ° C por 30 min e depois aqueça o choque o fermento colocando as placas em uma incubadora de 42 ° C por 15 min. Nota: Não empilhe as placas.</li>
	<li>Centrifugar as placas por 5 min a 3.000 x g. Retire o tampão de transformação dos poços invertendo as placas sobre um caixote do lixo e despejo vigorosamente a reserva das placas. Rapidamente borre as placas invertidas sobre uma toalha de papel limpo para remover qualquer líquido na parte superior das placas.</li>
	<li>Enxague as células adicionando as placas 200 µ l de abandono mínimo médio correspondente para o marcador selecionável no plasmídeo a biblioteca. Nota: Usamos um sintético Ura-médio.</li>
	<li>Centrifugar as placas por 5 min a 3.000 x g e remover o sobrenadante sobre um caixote do lixo como na etapa 2.10.</li>
	<li>Adicione 160 µ l de mínimo Ura-médio contendo 2% de glicose. Vórtice as placas por 1 min a 1.000 rpm e incube-os a 30 ° C, durante 48 h sem tremer. Após 48 h, observe que uma pastilha de fermento transformado é visível na parte inferior de cada poço.</li>
	<li>Usando um distribuidor de líquido, adicione 100 µ l de glicose contendo Ura-mídia em cada poço de um novo conjunto de placas de 96 poços.</li>
	<li>Vórtice as placas contendo o fermento transformado (da etapa 2.13) a 1.000 rpm por 30 s. usando um replicador de 96-pino plástico estéril, coloque os pinos nos poços contendo o fermento transformado e então lhes inocular nos poços correspondentes das novas placas cheio de mídia. Incube as novas placas a 30 ° C por 24 h. Nota: Se a trabalhar com 10 placas, o médio pode também ser dispensado manualmente usando pipetas multicanais.</li>
	<li>Após 24h, uma pelota de fermento deve ser visível no fundo de cada poço contendo levedura transformada com êxito. Para salvar essas cepas de leveduras como estoques de glicerol, adicionar 50 µ l de glicerol a 50% para cada poço, vórtice as placas por 30 s a 1.000 rpm, selar as placas com fita de vedação e congelá-los a-80 ° C. Nota: Os passos acima só precisam ser executada uma vez. Projeções futuras de modelos diferentes de fermento contra o mesmo reservatório de reagente descartável de biblioteca podem começar das existências glicerol e proceder imediatamente abaixo da escadaria.</li>
</ol>3. acasalamento entre células que contêm Genes de biblioteca e levedura de consulta
<ol><li>Para reavivar as estirpes de biblioteca do estoque glicerol, tire as placas de 96 poços do freezer-80 ° C, retire a fita de vedação e deixar o fermento descongelar à temperatura ambiente por cerca de 30 min.</li>
	<li>Uma vez que o fermento esteja derretido, use um replicador de 96-pino plástico estéril para inocular os estoques de glicerol para 160 µ l de fresco Ura-mídia contendo 2% de glicose em placas de 96 poços e incube-os a 30 ° C por 24 h. imediatamente após as cepas de biblioteca são usadas , selar as placas com fita de vedação e devolvê-los ao congelador a-80 ° C.</li>
	<li>No mesmo dia as estirpes de biblioteca (W303α) são descongeladas, inocular a levedura de consulta (aqui, FUS em W303a) a 50 mL de YPD e cultivá-lo durante a noite a 30 ° C, com agitação a 250 rpm.</li>
	<li>Na manhã seguinte, despeje a cepa de levedura de consulta para um reservatório de reagente descartável estéril e a alíquota µ l 160 da estirpe utilizada na consulta para cada poço de uma placa de 96 poços, com uma pipeta multicanal.</li>
	<li>Usando o líquido dispensador, dispense 160 µ l de mídia YPD em cada poço de 10 placas de 96 poços. Use estas placas mais tarde para a cepa de levedura de consulta com o fermento da biblioteca de acasalamento.</li>
	<li>Brevemente vórtice para as placas YPD Coe a placa de 96 poços, contendo a estirpe de consulta e em seguida, use um replicador de 96 pinos estéril para transferir a consulta.</li>
	<li>Brevemente vórtice a biblioteca Coe placas e, para cada placa de estirpe de biblioteca, use um novo replicador de 96 pinos estéril para transferir as tensões de biblioteca para as placas YPD que têm sido inoculadas com a cepa de consulta. Nota: As células em glicerol perdem sua viabilidade após vários ciclos de gelo-degelo. Retornando as cepas de biblioteca para o armazenamento a longo prazo (-80 ° C congelador) logo que possível vai manter a biblioteca em boa qualidade e pronto para uso futuro. Mantido corretamente, o estoque de glicerol pode ser congelado e descongelado pelo menos 10 vezes. Também é altamente recomendável manter uma cópia de trabalho e cópias de backup da unidade populacional de glicerol. Quando o estoque de trabalho não funciona, imediatamente, fazer um novo trabalho cópia da cópia de backup.</li>
	<li>Incube as placas YPD a 30 ° C por 24 h. nota que uma pelota de levedura será visível no fundo de cada poço após 24 h.</li>
	<li>Preenchimento de 96 poços placas com um meio de evasão mínima contendo 2% rafinose, correspondente as marcadores selecionáveis no plasmídeo o esforço de consulta, bem como sobre o plasmídeo de biblioteca (por exemplo, Ura aqui - seu-).</li>
	<li>Utilize um replicador de 96 pinos estéril para transferir levedura da YPD culturas para os meios selectivos de acasalamento. Incubar as placas de 96 poços a 30 ° C, durante 48 h; fermento apenas células que tem acasalado e células diploides formado e, portanto, conter ambos o plasmídeo de consulta e o plasmídeo biblioteca será capaz de crescer nessa mídia. Depois de 2 dias, observe que uma pelota é visível no fundo dos poços.</li>
</ol>4. ensaio da mancha
<ol><li>
Após 48 h de crescimento nos meios seletivos contendo rafinose, aviste o fermento em placas de ágar.
	<ol>
<li>Prepare-se 2 conjuntos de placas de Ura-His-desistente contendo 2% de ágar usando placas de poliestireno clara, contendo um 2% galactose e o outro contendo 2% de glicose.</li>
		<li>Placas de vórtice de 96 poços para 1 min a 1.000 rpm, então detectar o fermento para as placas de Ura-His-desistente contendo galactose 2% e 2% de ágar (FUS e biblioteca de genes são induzidos) e as placas de Ura-His-desistente contendo 2% de glicose e 2% de ágar (FUS e biblioteca de genes reprimido) usando uma máquina de spotting robótica, pelo qual a cultura em cada um é bem vista nas chapas de ágar em quadriplicado (i.e., a cultura em 1 bem está manchada de 4 pontos na placa de ágar).</li>
		<li>Após a mancha, deixe as placas de ágar secar e depois colocá-los de cabeça para baixo em uma incubadora de 30 ° C. Fotografe as placas de ágar cada 24h para registar um crescimento mais rápido/mais fermento na qual a toxicidade para a cepa de consulta é resgatada ou para registrar um crescimento mais lento/menos no qual a toxicidade para a cepa de consulta é exacerbada. Incube as placas durante 4 dias. Nota: A cultura em cada bem pode ser manchada em placas de ágar 1-para-1, como mostrado em um anterior método baseado na transformação de10. No entanto, o 1-a-4 manchas aqui (que pode ser convenientemente configurado usando a máquina robótica spotting) aumenta significativamente a robustez do ensaio, reduzindo o número de falsos positivos. Sucessos positivos são considerados apenas quando todas as 4 colônias da mesma bem mostram um fenótipo semelhante.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dujon, B. A., Louis, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+diversity+and+evolution+in+the+budding+yeasts+(Saccharomycotina).">Genome diversity and evolution in the budding yeasts (Saccharomycotina).</a> Genetics. 206 (2), 717-750 (2017).</li><li>Khurana, V., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+neurodegeneration+in+Saccharomyces+cerevisiae:+why+cook+with+baker's+yeast.">Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker's yeast.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).</li><li>Willingham, S., Outeiro, T. F., DeVit, M. J., Lindquist, S. L., Muchowski, P. 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(53), e2836 (2011).</li><li>Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+cycle+of+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Life cycle of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiological Reviews. 52 (4), 536-553 (1988).</li><li>Suter, B., Auerbach, D., Stagljar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast-based+functional+genomics+and+proteomics+technologies:+the+first+15+years+and+beyond.">Yeast-based functional genomics and proteomics technologies: the first 15 years and beyond.</a> Biotechniques. 40 (5), 625-644 (2006).</li><li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+toxicity+in+neuronal+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+by+hUPF1.">Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (25), 7821-7826 (2015).</li><li>Jackson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+forelimb+function+by+UPF1+gene+therapy+in+a+rat+model+of+TDP-43-induced+motor+paralysis.">Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced motor paralysis.</a> Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui, descrevemos um protocolo para executar uma tela de superexpressão do plasmídeo no fermento usando o acasalamento para introduzir o modelo de fermento a biblioteca do plasmídeo. Usando essa abordagem, vários modelos de levedura de toxicidade de proteína de doenças neurodegenerativas podem ser selecionados usando a mesma coleção de fermento transformado com uma biblioteca de plasmídeo. O laborioso processo de transformação só precisa ser executada uma vez que, após a qual fermento altamente eficiente acasalamento é usado para introduzir a estirpe de consulta da biblioteca do plasmídeo. Este protocolo contam com o uso de equipamentos robóticos para dispensar a mídia e culturas de levedura local em placas de ágar. Enquanto o protocolo pode ser realizado sem o uso de equipamentos robóticos, vai ser mais demorado. Esse método com êxito foi utilizado para triagem de genes que pode modificar a toxicidade de FUS.
Observamos que o FUS é ligeiramente menos tóxico no fundo levedura diploide. Isto é provavelmente devido a diferenças na taxa de crescimento de levedura diploide e número de cópia do gene. A menos que o fenótipo que está sendo estudado é tipo de acasalamento ou dependentes de ploidia, o fenótipo do crescimento da toxicidade é consistente em leveduras haploides e diploides. Devido a isso, o método baseado em acasalamento deverá trabalhar amplamente em muitos modelos de levedura de vários fenótipos de crescimento. Não obstante, o fenótipo do modelo fermento deve ser verificado para certificar-se de que está ainda presente no fundo diploide antes que este método de exame é realizado. Esse método pode ser usado para estudar muitos diferentes fenótipos em levedura e não está limitado ao estudo da toxicidade de proteína neurodegenerativas. Além disso, podem ser usados qualquer vetores de expressão do plasmídeo biblioteca contendo levedura.
Depois de executar a tela, há uma série de ensaios de verificação que ajudará a garantir que os hits identificados são específicos para o modelo de levedura inspeccionado. Potenciadores de toxicidade devem ser testados no fermento sem co expressar a proteína da doença de interesse. Potenciadores de causar toxicidade independente da proteína doença de interesse devem ser eliminadas de um estudo mais aprofundado. É importante considerar se os supressores de toxicidade estão afetando a expressão da proteína doença afetando o promotor Gal1. Qualquer supressores que afectam a expressão do promotor Gal1 devem ser eliminadas de um estudo mais aprofundado.
Cepas de leveduras contendo o plasmídeo de biblioteca são permanentemente armazenadas em estoque de glicerol e podem rapidamente ser revividas, quando necessário para que o método de acasalamento pode ser facilmente aplicado a outros modelos de levedura em que os mesmos genes de biblioteca precisam ser protegidos contra. A eficiência do método baseado em acasalamento torna-se evidente quando o mesmo tipo de seleção é usado para remover falsos positivos, ou quando vários modelos diferentes de leveduras precisam ser estudados. Com sucesso usamos esse método para selecionar um modelo de levedura de TDP-43, outra proteína ligada à ALS.

A brotamento de levedura Saccharomyces cerevisiae tem sido amplamente utilizada em pesquisa científica básica1 compreender processos celulares diretamente relacionados a doenças humanas. Além disso, ela tem sido usada como um organismo modelo para estudar proteínas humanas associadas a doenças, tais como aquelas ligadas a doenças neurodegenerativas mais comuns, incluindo a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington e amiotrófica Esclerose lateral (ALS)2. Uma vantagem do modelo de levedura é a facilidade com que uma tela de todo o genoma pode ser realizada para identificar caminhos celulares relacionados à toxicidade de doença relacionada com proteínas, dando assim a visão sobre o mecanismo de sua toxicidade. Um tal tela chama-se uma tela de biblioteca superexpressão, em que cada um dos 5.500 genes fermento em uma biblioteca de matriz é transformado em um modelo de levedura para identificar quais genes podem modificar toxicidade quando overexpressed. Este método de triagem foi aplicado com sucesso nos modelos de levedura de múltiplos neurodegenerativas associadas a doença proteínas, incluindo huntingtina para a doença de Huntington3, α-synuclein para a doença de Parkinson4,5 , Aβ para a doença de Alzheimer,6e FUS e TDP-43 para ALS7,8,9. Enquanto é feito geralmente em uma maneira do elevado-throughput10, o passo mais trabalhoso da tela está transformando individualmente 5.500 genes fermento de uma biblioteca de matriz. Esta etapa deve ser executada cada vez que o rastreio é repetido, e sempre que um modelo de levedura recém-criada precisa ser estudado. É importante encontrar uma maneira mais eficiente para realizar essa tarefa.
Células de levedura podem existir estàvel em formas haploides e diploides. Há dois opostos acasalar tipos de células haploides, tipo de acasalamento um e α. células haploides de cada acasalamento tipo produzem e secretam seu próprios pheromone acasalamento específico, ao qual apenas as células acasalamento tipo oposto respondem. Isso permite que o acasalamento entre um e células α para produzir células diploides estáveis, a/α. Este processo é espontânea e altamente eficiente de11. Que pode tirar proveito deste exclusivo do ciclo de vida de S. cerevisiae para introduzir a biblioteca do plasmídeo. Mais especificamente, cada gene na biblioteca do plasmídeo matriz será transformado em células haploides de um tipo de acasalamento, isto é, células α. Estas células que contêm os genes de biblioteca serão então armazenadas em estoque de glicerol em formato matriz de 96 poços. Para cada modelo de fermento que precisa ser rastreada, células de levedura contendo os genes de biblioteca podem ser descongeladas partir do estoque de glicerol, e o rastreio pode ser feito através de acasalamento com o modelo de leveduras de interesse o acasalamento tipo oposto, ou seja, acasalamento tipo um. A ideia de usar o acasalamento para reunir dois genes em fermento não é nova. Foi aplicado com sucesso no fermento do elevado-throughput rastreio do dois-híbrido, em que uma isca construir (ou seja, fusões de domínio Gal4-DNA-binding) em um tipo de acasalamento é reuniu através de acasalamento com uma presa de construção de uma biblioteca de matriz 12. no entanto, essa estratégia nunca foi aplicada em seleções de biblioteca superexpressão, que sempre usaram métodos de transformação tradicional.
Nosso laboratório anteriormente estabelecido um modelo de levedura do ALS-associada da proteína FUS7. Descobrimos que cinco genes de levedura(ECM32, NAM8, SBP1, SKO1e VHR1) que resgatar a toxicidade de FUS quando overexpressed através de triagem de superexpressão biblioteca usando o método de transformação. Estes resultados foram confirmados independentemente com um estudo semelhante por outro grupo8. hUPF1, um homólogo humano de ECM32, mostrou-se mais tarde para suprimir a toxicidade em células neuronais primária13 e em um modelo animal de ALS14 também. Usando estes cinco genes como prova de princípio, vamos demonstrar que todos os cinco genes da mesma forma resgatar toxicidade FUS quando são introduzidos no modelo de levedura FUS por acasalamento. Uma vez que as células de levedura contendo os genes de biblioteca podem ser armazenadas permanentemente em estoque de glicerol e revividas sempre que necessário, este método baseado em acasalamento removerá a etapa demorada de transformação cada vez que a biblioteca precisa ser protegidos contra. Desde que o acasalamento é altamente eficiente com nenhuma transformação do plasmídeo envolvida, esta estratégia também significativamente diminui o custo associado a purificação e a transformação de uma biblioteca grande plasmídeo. Vamos com êxito aplicar este método em uma biblioteca de triagem contra modelo de levedura de FUS.
O procedimento para a seleção com base em acasalamento é brevemente descrito na Figura 1. Inicialmente, a biblioteca de matriz do plasmídeo é transformada em uma cepa de levedura haploide de acasalamento tipo α usando um protocolo de transformação de levedura de alta produtividade em que cada poço de uma placa de 96 poços contém fermento transformado com um plasmídeo de biblioteca específica. Esta coleção de fermento transformado é salvo como um estoque de glicerol que pode ser descongelado e ressuscitado para uso mais tarde. O modelo de leveduras de interesse, na toxicidade FUS neste caso, deve ser gerado em uma cepa de levedura haploide com o tipo oposto de acasalamento (tipo de acasalamento um). De forma elevado-throughput usando estéril 96 pinos replicadores, a estirpe FUS e cepas de leveduras contendo a biblioteca do plasmídeo são transferidas para placas de 96 poços contendo mídia rica e permissão para companheiro. Após o acasalamento, um pequeno volume de cada poço de cultura acasalamento é transferido para placas de 96 poços contendo mídia desistente sintético no qual fermento apenas diploide que contém ambos os FUS e genes de biblioteca podem crescer. Uma máquina robótica spotting é usada para transferência de cultura de levedura de cada poço em placas de ágar, onde a expressão de FUS e os genes de biblioteca é induzida.  Além disso, a cultura de levedura está manchada para controlar placas de ágar, onde FUS e os genes de biblioteca não são expressos. Após crescimento em placas de ágar, serão identificados os genes que resgatar ou exacerbam a toxicidade FUS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:555px;" width="554">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:183px;">salmon Sperm DNA (SS-DNA)</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:99px;">&#160; D1626</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:183px;">YPD broth</td>
			<td style="width:127px;">Research Products International (RPI)</td>
			<td style="width:99px;">Y20090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">Granulated Agar</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:99px;">BP97445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:183px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:127px;">Research Products International (RPI)</td>
			<td style="width:99px;">G32040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:183px;">D-(+)-Galactose</td>
			<td style="width:127px;">Research Products International (RPI)</td>
			<td style="width:99px;">G33000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:183px;">D-(+)-Raffinose Pentahydrate</td>
			<td style="width:127px;">Research Products International (RPI)</td>
			<td style="width:99px;">R20500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">Ammonium Sulfate</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:99px;">A702-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:183px;">Synthetic Ura- drop out medium</td>
			<td style="width:127px;">Clontech</td>
			<td style="width:99px;">630416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:183px;">Yeast amino acid drop out supplement -Histidine/-Uracil</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>630422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:183px;">Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and Ammonium Sulfate</td>
			<td style="width:127px;">Research Products International (RPI)</td>
			<td style="width:99px;">Y20060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:183px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:99px;">S67496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:183px;">Lithium acetate, anhydrous</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:99px;">AC268640010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:183px;">Polyethylene Glycol 3350 (PEG-3350)</td>
			<td style="width:127px;">Spectrum Chemical&#160;</td>
			<td style="width:99px;">PO125-12KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">96 Pin Replicator&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Scinomix</td>
			<td style="width:99px;">SCI-5010-OS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">Nunc OmniTray</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Sci</td>
			<td>140156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:183px;">Corning Costar 96 well assay plate, round bottom with lid</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:99px;">07-200-760</td>
			<td>non-treated, sterile</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:183px;">Eppendorf&#160;Research plus Multichannel Pipette</td>
			<td style="width:127px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:99px;">TI13690052</td>
			<td>30-300ul volume</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:183px;">Fisherbrand&#160;Isotemp Digital Dry Baths/Block Heaters</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:99px;">88-860-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">Eppendorf&#160;MixMate</td>
			<td style="width:127px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:99px;">21-379-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:183px;">Eppendorf 5810R Centrifuge</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:99px;">05-413-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">Avanti J-26 XPI Centrifuge</td>
			<td style="width:127px;">Beckman</td>
			<td style="width:99px;">393127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:183px;">MultiFlo FX Multi-Mode Dispenser</td>
			<td style="width:127px;">BioTek</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:183px;">Rotor HDA&#160;&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mating-based overexpression library screening in yeast

Brotamento de levedura tem sido amplamente utilizada como modelo no estudo de proteínas associadas a doenças humanas. Rastreio genético de todo o genoma é uma poderosa ferramenta comumente usada em estudos de levedura. A expressão de um número de proteínas de associada a doenças neurodegenerativas no fermento causa citotoxicidade e formação de agregados, sintetizando resultados vistos em pacientes com esses transtornos. Aqui, descrevemos um método para a seleção de um modelo de levedura da esclerose Lateral amiotrófica-associado proteína FUS para modificadores de sua toxicidade. Em vez de usar a transformação, esta nova plataforma de triagem depende do acasalamento de levedura para introduzir o modelo de fermento uma biblioteca matriz de plasmídeos. O método de acasalamento tem duas vantagens claras: em primeiro lugar, é altamente eficiente; em segundo lugar, a biblioteca matriz previamente transformada de plasmídeos pode ser armazenada para a longo prazo como um estoque de glicerol e rapidamente aplicada para outras telas sem a etapa de trabalho intensiva de transformação para o modelo de levedura cada vez. Demonstraremos como esse método pode ser usado com sucesso para triagem de genes que modificam a toxicidade de FUS.

A ALS associada proteína FUS, uma proteína de ligação de RNA/DNA, anteriormente foi estudada em levedura haploide7,8. Genética de seleção usando o método baseado na transformação descobriu vários genes de levedura que suprimem a toxicidade FUS. O homólogo humano de um dos genes fermento demonstrou-se mais tarde para ser eficaz em suprimir a toxicidade em uma célula neuronal primária e o modelo do rato de ALS13. Aqui, nós estamos usando o mesmo modelo de levedura para mostrar que a triagem de biblioteca superexpressão pode ser executada por acasalamento tão eficazmente quanto pela transformação.
FUS é tóxico para as duas células haploides e diploides fermento O modelo anterior do fermento de FUS e projeção de subsequente superexpressão biblioteca realizou-se no plano de fundo da célula haploide. Para o método baseado em acasalamento trabalhar, toxicidade FUS precisa ser demonstrada na levedura diploide. Para fazer isso, nós acoplado o FUS modelo de fermento em w303a (tipo de acasalamento um) com w303α transformada com um vetor vazio (α do tipo de acasalamento). Como indicado na Figura 2, embora não tão forte como em leveduras haploides, toxicidade FUS é evidente na levedura diploide.
Genes de supressão identificados anteriormente trabalho em levedura diploide Como prova de princípio para o método baseado em acasalamento, testamos cinco genes anteriormente identificados desde o método baseado na transformação. Acasalamento foi usado para cada um dos cinco genes introduzir o modelo de levedura haploide de FUS (em W303a), e sua capacidade de resgatar a toxicidade de FUS na levedura diploide subsequente foi testada (W303a/α). Como mostrado na Figura 3, todos os cinco genes resgatar a toxicidade de FUS em levedura diploide, indicando que o método de acasalamento foi eficaz.
Uma seleção de piloto de 940 genes (dispostos em dez placas de 96 poços) Seguindo os protocolos descritos acima, nós aplicamos o método baseado em acasalamento para uma triagem de biblioteca superexpressão de 940 genes. Figura 4 mostra uma foto de um prato representativo. Conforme indicado no lado direito da figura (FUS e biblioteca de genes expressados), FUS era tóxico para levedura diploide. O gene da biblioteca indicado pelo quadrado verde resgatados toxicidade FUS enquanto que indicado pela Praça Vermelha reforçada toxicidade.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57978/57978fig1.jpg"> Figura 1 : Diagrama para a seleção de modelos de levedura de toxicidade de proteínas usando-acasalamento. Uma biblioteca de plasmídeo (sob controle do promotor GAL1 que é altamente induzido na presença de galactose) é transformada em uma cepa de levedura haploide (MATα) usando um protocolo de transformação de alta produtividade. Esta coleção de levedura, transformada com o plasmídeo de biblioteca, é armazenada como um estoque de glicerol a-80 ° C e é revivida quando necessário para acasalar com o modelo de levedura haploide de toxicidade de proteína (no nosso caso, uma cópia do FUS integrado no locus HIS3, promotor GAL1 MATa). Levedura diploide, contendo a biblioteca plasmídeo e proteína tóxica (FUS) são selecionados e avistou a glicose (gene FUS e biblioteca 'off') e placas de ágar de galactose (gene FUS e biblioteca 'no'). Seguiu-se o crescimento da levedura para identificar genes que resgatar ou exacerbam a toxicidade de FUS. O quadrado verde indica um exemplo de um gene supressor que resgata a toxicidade FUS e o quadrado vermelho indica um exemplo de um gene de potenciador que exacerba a toxicidade FUS quando overexpressed. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57978/57978fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57978/57978fig2.jpg"> Figura 2 : FUS é tóxico para as duas células haploides e diploides fermento. Levedura haploide (w303 MATa) transformada com pRS303Gal1-FUS foram transformados com um plasmídeo vazio ou acasalado com levedura do tipo de acasalamento oposta (w303 MATα) transformada com o plasmídeo vazio mesmo para gerar uma cepa de levedura diploide. Estas cepas de leveduras, juntamente com uma cepa de controle foram então 5x serialmente diluída (da esquerda para a direita) e manchado de Ura-His-glicose médio (esquerdo, expressão de FUS reprimida) e médio de Ura-His-Galactose (à direita, expressão de FUS induzido). A foto foi tirada depois de 2 dias de crescimento, a 30 ° C. Crescimento quase idêntico da estirpe haploides e diploides controle observou-se, tão somente que a tensão de controle haploides foi mostrada. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57978/57978fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57978/57978fig3.jpg"> Figura 3 : Cinco genes de levedura(ECM32, NAM8, SBP1, SKO1e VHR1) resgatar toxicidade FUS através o método baseado em acasalamento. Plasmídeos contendo genes identificados anteriormente fermento que suprimem a toxicidade FUS foram transformados em uma cepa de levedura haploide (w303 MATα). Estas leveduras foram então acasalou com levedura haploide do tipo de acasalamento oposta (w303 MATa) transformada com um plasmídeo de expressão de FUS. Diploide levedura contendo FUS e um vetor vazio ou um dos cinco genes supressão foi selecionadas e manchadas em repetições em placas de ágar contendo glicose (genes 'off') e galactose (genes 'na'). (1) mostra uma cepa de levedura controle transformada com dois vetores vazios. (2) mostra a cepa de levedura diploide FUS com um vetor vazio onde a expressão de FUS é muito tóxica. (3 – 7) Mostrar levedura diploide expressando FUS, bem como um gene de supressão que pode resgatar a toxicidade FUS. Cada número (1-7) mostra duas fileiras de doze idênticos de Replica. A fotografia, representando três experimentos independentes, foi tirada depois de 3 dias de crescimento, a 30 ° C. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57978/57978fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57978/57978fig4.jpg"> Figura 4 : Seleção de biblioteca para genes que resgatar ou exacerbar a toxicidade FUS. Levedura haploide contendo FUS foi acoplada com levedura haploide contendo os genes de biblioteca. Após o acasalamento, células diploides, contendo um gene de biblioteca e FUS foram selecionadas e depois foi vistas em glicose (FUS e biblioteca de genes 'off') e galactose placas de ágar (FUS e biblioteca de genes 'em') em quatro exemplares. Na placa de galactose, em que foram expressas FUS e o gene da biblioteca, a maioria do fermento estava incapaz de crescer bem. Isso indica que FUS é tóxico, e a maioria dos genes de biblioteca não conseguiram resgatar a toxicidade. O quadrado verde demonstra um exemplo de um gene de biblioteca que suprime a toxicidade FUS e permite que o fermento que formam colônias. O quadrado vermelho indica um exemplo de um gene de biblioteca que exacerba a toxicidade FUS. As placas mostradas aqui são representante de 10 placas de genes de biblioteca que foram projectados contra. A foto foi tirada depois de 3 dias de crescimento, a 30 ° C. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57978/57978fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Este artigo apresenta um método baseado em acasalamento para facilitar a triagem de superexpressão em leveduras brotamento usando uma biblioteca de matriz do plasmídeo.

Rastreio de biblioteca superexpressão de acasalamento-baseado no fermento

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

mating-based-overexpression-library-screening-in-yeast

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

7.6K visualizações.  Wright State University. Este artigo apresenta um método baseado em acasalamento para facilitar a triagem de superexpressão em leveduras brotamento usando uma biblioteca de matriz do plasmídeo.

Vídeo: Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.

Visadas<em&gt; In Situ</em&gt; mutagénese de histona Genes em brotamento Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Genética

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 nuclease or a nuclease-dead dCas9 fusion protein) is targeted to a specific site in the genome by a small synthetic RNA known as the guide RNA, or gRNA. The bipartite nature of the CRISPR system enables its use in screening approaches since plasmid libraries containing expression cassettes of thousands of individual gRNAs can be used to interrogate many different sites in a single experiment. 
To date, gRNA sequences for the construction of libraries have been almost exclusively generated by oligonucleotide synthesis, which limits the achievable complexity of sequences in the library and is relatively cost-intensive. Here, a detailed protocol for CORALINA (comprehensive gRNA library generation through controlled nuclease activity), a simple and cost-effective method for the generation of highly complex gRNA libraries based on enzymatic digestion of input DNA, is described. Since CORALINA libraries can be generated from any source of DNA, plenty of options for customization exist, enabling a large variety of CRISPR-based screens.

Methods for generating large-scale gRNA libraries should be simple, efficient and cost-effective. We describe a protocol for the production of gRNA libraries based on enzymatic digestion of target DNA. This method, CORALINA (comprehensive gRNA library generation through controlled nuclease activity) presents an alternative to costly custom oligonucleotide synthesis.

Um protocolo Universal para grande escala gRNA biblioteca de produção a partir de qualquer fonte de DNA

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with a number of challenges including sample preservation quality, degraded DNA, and destructive sampling of rare specimens. In order to more effectively use herbarium material in large sequencing projects, a dependable and scalable method of DNA isolation and library preparation is needed. This paper demonstrates a robust, beginning-to-end protocol for DNA isolation and high-throughput library construction from herbarium specimens that does not require modification for individual samples. This protocol is tailored for low quality dried plant material and takes advantage of existing methods by optimizing tissue grinding, modifying library size selection, and introducing an optional reamplification step for low yield libraries. Reamplification of low yield DNA libraries can rescue samples derived from irreplaceable and potentially valuable herbarium specimens, negating the need for additional destructive sampling and without introducing discernible sequencing bias for common phylogenetic applications. The protocol has been tested on hundreds of grass species, but is expected to be adaptable for use in other plant lineages after verification. This protocol can be limited by extremely degraded DNA, where fragments do not exist in the desired size range, and by secondary metabolites present in some plant material that inhibit clean DNA isolation. Overall, this protocol introduces a fast and comprehensive method that allows for DNA isolation and library preparation of 24 samples in less than 13 h, with only 8 h of active hands-on time with minimal modifications.

This article demonstrates a detailed protocol for DNA isolation and high-throughput sequencing library construction from herbarium material including rescue of exceptionally poor-quality DNA.

Isolamento do DNA robusto e construção de biblioteca de sequenciamento de alto rendimento para espécimes de herbário

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve random mutagenesis, error-prone PCR is a convenient and efficient strategy for generating a diverse pool of mutants (i.e., a mutant library). Error-prone PCR is the method of choice when a researcher seeks to mutate a pre-defined region, such as the coding region of a gene while leaving other genomic regions unaffected. After the mutant library is amplified by error-prone PCR, it must be cloned into a suitable plasmid. The size of the library generated by error-prone PCR is constrained by the efficiency of the cloning step. However, in the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, the cloning step can be replaced by the use of a highly efficient one-step fusion PCR to generate constructs for transformation. Mutants of desired phenotypes may then be selected using appropriate reporters. Here, we describe this strategy in detail, taking as an example, a reporter inserted at centromeric heterochromatin.

This article describes a detailed methodology for random mutagenesis of a target gene in fission yeast. As an example, we target rpt4+, which encodes a subunit of the 19S proteasome, and screen for mutations that destabilize heterochromatin.

Gene-alvo Mutagenesis aleatório para selecionar heterocromatina-desestabilizando Proteassoma mutantes no fermento de fissão

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state when water is supplied. The genomic sequencing of microscopic animals such as tardigrades risks bacterial contamination that sometimes leads to erroneous interpretations, for example, regarding the extent of horizontal gene transfer in these animals. Here, we provide an ultralow input method to sequence the genome of the tardigrade, Hypsibius dujardini, from a single specimen. By employing rigorous washing and contaminant exclusion along with an efficient extraction of the 50 ~ 200 pg genomic DNA from a single individual, we constructed a library sequenced with a DNA sequencing instrument. These libraries were highly reproducible and unbiased, and an informatics analysis of the sequenced reads with other H. dujardini genomes showed a minimal amount of contamination. This method can be applied to unculturable tardigrades that could not be sequenced using previous methods.

Contamination during the genomic sequencing of microscopic organisms remains a large problem. Here, we show a method to sequence the genome of a tardigrade from a single specimen with as little as 50 pg of genomic DNA without whole genome amplification to minimize the risk of contamination.

Ultralow genoma entrada biblioteca preparação de um único espécime Tardigrade de sequenciamento

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect and count individual RNA molecules. Complementary to deep sequencing-based methods, smFISH provides information about the cell-to-cell variation in transcript abundance and the subcellular localization of a given RNA. Recently, we have used smFISH to study the expression of the gene&#160;NDC80&#160;during meiosis in budding yeast, in which two transcript isoforms exist and the short transcript isoform has its entire sequence shared with the long isoform. To confidently identify each transcript isoform, we optimized known smFISH protocols and obtained high consistency and quality of smFISH data for the samples acquired during budding yeast meiosis. Here, we describe this optimized protocol, the criteria that we use to determine whether high quality of smFISH data is obtained, and some tips for implementing this protocol in&#160;other yeast strains and growth conditions.

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

This single molecule fluorescence in situ hybridization protocol is optimized to quantify the number of RNA molecules in budding yeast during vegetative growth and meiosis.

Única molécula fluorescência In Situ Hybridization (smFISH) análise em Budding fermento crescimento vegetativo e meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives each year. Effective treatment options able to halt disease progression are lacking. Despite the extensive sequencing efforts in large patient populations, the majority of ALS and PD cases remain unexplained by genetic mutations alone. Epigenetics mechanisms, such as the post-translational modification of histone proteins, may be involved in neurodegenerative disease etiology and progression and lead to new targets for pharmaceutical intervention. Mammalian in vivo and in vitro models of ALS and PD are costly and often require prolonged and laborious experimental protocols. Here, we outline a practical, fast, and cost-effective approach to determining genome-wide alterations in histone modification levels using Saccharomyces cerevisiae as a model system. This protocol allows for comprehensive investigations into epigenetic changes connected to neurodegenerative proteinopathies that corroborate previous findings in different model systems while significantly expanding our knowledge of the neurodegenerative disease epigenome.

This protocol outlines experimental procedures to characterize genome-wide changes in the levels of histone post-translational modifications (PTM) occurring in connection with the overexpression of proteins associated with ALS and Parkinson&#39;s disease in Saccharomyces cerevisiae models. After SDS-PAGE separation, individual histone PTM levels are detected with modification-specific antibodies via Western blotting.

Caracterizando a histona modificação pós-traducional alterações nos modelos de Neurodegenerative Proteinopathy de levedura

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely related biochemical pathways. Previous methods such as the Synthetic Genetic Array (SGA) analysis, and random mutagenesis techniques using ultraviolet (UV) or chemicals like ethyl methanesulfonate (EMS) or N-ethyl-N- nitrosourea (ENU), have been widely used but are often costly and laborious. Also, these mutagen-based screening methods are frequently associated with severe side effects on the organism, inducing multiple mutations that add to the complexity of isolating the suppressors. Here, we present a simple and effective protocol to identify suppressor mutations in mutants which confer a growth defect in Schizosaccharomyces pombe. The fitness of cells with a growth deficiency in standard rich liquid media or synthetic liquid media can be monitored for recovery using an automated 96-well plate reader over an extended period. Once a cell acquires a suppressor mutation in the culture, its descendants outcompete those of the parental cells. The recovered cells that have a competitive growth advantage over the parental cells can then be isolated and backcrossed with the parental cells. The suppressor mutations are then identified using whole-genome sequencing. Using this approach, we have successfully isolated multiple suppressors that alleviate the severe growth defects caused by loss of Elf1, an AAA+ family ATPase that is important in nuclear mRNA transport and maintenance of genomic stability. There are currently over 400 genes in S. pombe with mutants conferring a growth defect. As many of these genes are uncharacterized, we propose that our method will hasten the identification of novel functional interactions with this user-friendly, high-throughput approach.

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

We present a simple suppressor screen protocol in fission yeast. This method is efficient, mutagen-free, and&#160; selective&#160; for&#160; mutations that&#160; often&#160; occur at&#160; &#160;a&#160; single&#160; genomic&#160; locus.&#160; The protocol is suitable for isolating suppressors that alleviate growth defects in liquid culture that are caused by a mutation or a drug.

Uma tela de supressor de Deep-sequenciamento-assistida, espontânea na fissão levedura Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries

CCCTC-binding factor (CTCF)-mediated stable topologically associating domains (TADs) play a critical role in constraining interactions of DNA elements that are located in neighboring TADs. CTCF plays an important role in regulating the spatial and temporal expression of HOX genes that control embryonic development, body patterning, hematopoiesis, and leukemogenesis. However, it remains largely unknown whether and how HOX loci associated CTCF boundaries regulate chromatin organization and HOX gene expression. In the current protocol, a specific sgRNA pooled library targeting all CTCF binding sites in the HOXA/B/C/D loci has been generated to examine the effects of disrupting CTCF-associated chromatin boundaries on TAD formation and HOX gene expression. Through CRISPR-Cas9 genetic screening, the CTCF binding site located between HOXA7/HOXA9 genes (CBS7/9) has been identified as a critical regulator of oncogenic chromatin domain, as well as being important for maintaining ectopic HOX gene expression patterns in MLL-rearranged acute myeloid leukemia (AML). Thus, this sgRNA library screening approach provides novel insights into CTCF mediated genome organization in specific gene loci and also provides a basis for the functional characterization of the annotated genetic regulatory elements, both coding and noncoding, during normal biological processes in the post-human genome project era.

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries

A CRISPR/sgRNA library has been applied to interrogating protein-coding genes.However, the feasibility of a sgRNA library to uncover the function of a CTCF boundary in gene regulation remains unexplored. Here, we describe a HOX loci specific sgRNA library to elucidate the function of CTCF boundaries in HOX loci.

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA biblioteca rastreio identificando crítico CTCF limites

CCCTC-binding factor (CTCF)-mediated stable topologically associating domains (TADs) play a critical role in constraining interactions of DNA elements ...

Expression, Purification, and Liposome Binding of Budding Yeast SNX-BAR Heterodimers

SNX-BAR proteins are an evolutionarily conserved class of membrane remodeling proteins that play key roles in sorting and trafficking of protein and lipids during endocytosis, sorting within the endosomal system, and autophagy. Central to SNX-BAR protein function is the ability to form homodimers or heterodimers that bind membranes using highly conserved phox-homology (PX) and BAR (Bin/Amphiphysin/Rvs) domains. In addition, oligomerization of SNX-BAR dimers on membranes can elicit the formation of membrane tubules and vesicles and this activity is thought to reflect their functions as coat proteins for endosome-derived transport carriers. Researchers have long utilized in vitro binding studies using recombinant SNX-BAR proteins on synthetic liposomes or giant unilamellar vesicles (GUVs) to reveal the precise makeup of lipids needed to drive membrane remodeling, thus revealing their mechanism of action. However, due to technical challenges with dual expression systems, toxicity of SNX-BAR protein expression in bacteria, and poor solubility of individual SNX-BAR proteins, most studies to date have examined SNX-BAR homodimers, including non-physiological dimers that form during expression in bacteria. Recently, we have optimized a protocol to overcome the major shortcomings of a typical bacterial expression system. Using this workflow, we demonstrate how to successfully express and purify large amounts of SNX-BAR heterodimers and how to reconstitute them on synthetic liposomes for binding and tubulation assays.

Here, we present a workflow for the expression, purification and liposome binding of SNX-BAR heterodimers in yeast.

Expressão, purificação e ligação lipossoma dos heterodimers brotamentos do SNX-BAR do fermento

SNX-BAR proteins are an evolutionarily conserved class of membrane remodeling proteins that play key roles in sorting and trafficking of protein and ...