אנו מודים טיילור AuBuchon-אלדר, ירדן Teisher, קריסטינה Zudock לעזרה בארגון דגימה עשבייה דגימות, ואת הגן הבוטני מיזורי לגישה עשבייה דגימות לדיגום הרסני. עבודה זו הייתה תמיכה על ידי מענק של הקרן הלאומית למדע (דב-1457748).

<ol>
	<li>Savolainen, V., Cu&#233;noud, P., Spichiger, R., Martinez, M. D. P., Cr&#232;vecoeur, M., Manen, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+herbarium+specimens+in+DNA+phylogenetics:+Evaluation+and+improvement.">The use of herbarium specimens in DNA phylogenetics: Evaluation and improvement.</a> Plant Syst Evo. 197 (1-4), 87-98 (1995).</li><li>Zedane, L., Hong-Wa, C., Murienne, J., Jeziorski, C., Baldwin, B. G., Besnard, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Museomics+illuminate+the+history+of+an+extinct,+paleoendemic+plant+lineage+(Hesperelaea,+Oleaceae)+known+from+an+1875+collection+from+Guadalupe+Island,+Mexico.">Museomics illuminate the history of an extinct, paleoendemic plant lineage (Hesperelaea, Oleaceae) known from an 1875 collection from Guadalupe Island, Mexico.</a> Bio J Linn Soc. 117 (1), 44-57 (2016).</li><li>Teisher, J. K., McKain, M. R., Schaal, B. A., Kellogg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphyly+of+Arundinoideae+(Poaceae)+and+Evolution+of+the+Twisted+Geniculate+Lemma+Awn.">Polyphyly of Arundinoideae (Poaceae) and Evolution of the Twisted Geniculate Lemma Awn.</a> Ann Bot. , (2017).</li><li>Cozzolino, S., Cafasso, D., Pellegrino, G., Musacchio, A., Widmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variation+in+time+and+space:+the+use+of+herbarium+specimens+to+reconstruct+patterns+of+genetic+variation+in+the+endangered+orchid+Anacamptis+palustris.">Genetic variation in time and space: the use of herbarium specimens to reconstruct patterns of genetic variation in the endangered orchid Anacamptis palustris.</a> Conserv Gen. 8 (3), 629-639 (2007).</li><li>Wandeler, P., Hoeck, P. E. A., Keller, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Back+to+the+future:+museum+specimens+in+population+genetics.">Back to the future: museum specimens in population genetics.</a> Tre Eco &amp; Evo. 22 (12), 634-642 (2007).</li><li>Rivers, M. C., Taylor, L., Brummitt, N. A., Meagher, T. R., Roberts, D. L., Lughadha, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+herbarium+specimens+are+needed+to+detect+threatened+species?.">How many herbarium specimens are needed to detect threatened species?.</a> Bio Conserv. 144 (10), 2541-2547 (2011).</li><li>Saltonstall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptic+invasion+by+a+non-native+genotype+of+the+common+reed,+Phragmites+australis,+into+North+America.">Cryptic invasion by a non-native genotype of the common reed, Phragmites australis, into North America.</a> PNAS USA. 99 (4), 2445-2449 (2002).</li><li>Besnard, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+museums+to+genomics:+old+herbarium+specimens+shed+light+on+a+C3+to+C4+transition.">From museums to genomics: old herbarium specimens shed light on a C3 to C4 transition.</a> J Exp Bot. 65 (22), 6711-6721 (2014).</li><li>S&#228;rkinen, T., Staats, M., Richardson, J. E., Cowan, R. S., Bakker, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+open+the+treasure+chest?+Optimising+DNA+extraction+from+herbarium+specimens.">How to open the treasure chest? Optimising DNA extraction from herbarium specimens.</a> PLoS ONE. 7 (8), e43808 (2012).</li><li>Harris, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+analysis+of+tropical+plant+species:+An+assessment+of+different+drying+methods.">DNA analysis of tropical plant species: An assessment of different drying methods.</a> Plant Syst Evo. 188 (1-2), 57-64 (1994).</li><li>Staats, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+in+plant+herbarium+tissue.">DNA damage in plant herbarium tissue.</a> PLoS ONE. 6 (12), e28448 (2011).</li><li>Bakker, F. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbarium+genomics:+plastome+sequence+assembly+from+a+range+of+herbarium+specimens+using+an+Iterative+Organelle+Genome+Assembly+pipeline.">Herbarium genomics: plastome sequence assembly from a range of herbarium specimens using an Iterative Organelle Genome Assembly pipeline.</a> Bio J of the Linn Soc. 117 (1), 33-43 (2016).</li><li>Camacho, F. J., Gernandt, D. S., Liston, A., Stone, J. K., Klein, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endophytic+fungal+DNA,+the+source+of+contamination+in+spruce+needle+DNA.">Endophytic fungal DNA, the source of contamination in spruce needle DNA.</a> Mol Eco. 6 (10), 983-987 (1997).</li><li>Hofreiter, M., Jaenicke, V., Serre, D., Von Haeseler, A., P&#228;&#228;bo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequences+from+multiple+amplifications+reveal+artifacts+induced+by+cytosine+deamination+in+ancient+DNA.">DNA sequences from multiple amplifications reveal artifacts induced by cytosine deamination in ancient DNA.</a> Nucl Acids Res. 29 (23), 4793-4799 (2001).</li><li>Staats, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+treasure+troves:+Complete+genome+sequencing+of+herbarium+and+insect+museum+specimens.">Genomic treasure troves: Complete genome sequencing of herbarium and insect museum specimens.</a> PLoS ONE. 8 (7), e69189 (2013).</li><li>Bakker, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbarium+genomics:+skimming+and+plastomics+from+archival+specimens.">Herbarium genomics: skimming and plastomics from archival specimens.</a> Webbia. 72 (1), 35-45 (2017).</li><li>Doyle, J. J., Doyle, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+DNA+isolation+procedure+for+small+quantities+of+fresh+leaf+tissue.">A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue.</a> Phytochem Bul. 19, 11-15 (1987).</li><li>Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+protocol+for+rapid+DNA+isolation+from+plant+tissue+using+cetryltrimethylammonium+bromide.">A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissue using cetryltrimethylammonium bromide.</a> Nat Prot. 1, 2320-2325 (2006).</li><li>Twyford, A. D., Ness, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+complete+plastid+genome+seqeuncing.">Strategies for complete plastid genome seqeuncing.</a> Mol Eco Resour. , (2016).</li><li>Aird, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+and+minimizing+PCR+amplification+bias+in+Illumina+sequencing+libraries.">Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries.</a> Genome Bio. 12 (2), R18 (2011).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+A+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinf. 30, 2114-2120 (2014).</li><li>Grigoriev, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MycoCosm+portal:+gearing+up+for+1000+fungal+genomes.">MycoCosm portal: gearing up for 1000 fungal genomes.</a> Nucl Acids Res. 42 (1), D699-D704 (2014).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nat Meth. 9 (4), 357-359 (2012).</li><li>Herbarium Genomics. Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/mrmckain/">https://github.com/mrmckain/</a> (2017)</li><li>. Fast-Plast: Rapid de novo assembly and finishing for whole chloroplast genomes Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/mrmckain/">https://github.com/mrmckain/</a> (2017)</li><li>McKain, M. R., McNeal, J. R., Kellar, P. R., Eguiarte, L. E., Pires, J. C., Leebens-Mack, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+rapid+diversification+and+convergent+origins+of+active+pollination+within+Agavoideae+(Asparagaceae).">Timing of rapid diversification and convergent origins of active pollination within Agavoideae (Asparagaceae).</a> Am J Bot. 103 (10), 1717-1729 (2016).</li><li>McKain, M. R., Hartsock, R. H., Wohl, M. M., Kellogg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Verdant:+automated+annotation,+alignment,+and+phylogenetic+analysis+of+whole+chloroplast+genomes.">Verdant: automated annotation, alignment, and phylogenetic analysis of whole chloroplast genomes.</a> Bioinf. , (2016).</li><li>Staton, S. E., Burke, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposome:+A+toolkit+for+annotation+of+transposable+element+families+from+unassembled+sequence+reads.">Transposome: A toolkit for annotation of transposable element families from unassembled sequence reads.</a> Bioinf. 31 (11), 1827-1829 (2015).</li><li>Bao, W., Kojima, K. K., Kohany, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repbase+Update,+a+database+of+repetitive+elements+in+eukaryotic+genomes.">Repbase Update, a database of repetitive elements in eukaryotic genomes.</a> Mobile DNA. 6 (1), 11 (2015).</li><li>. Transposons Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/mrmckain/">https://github.com/mrmckain/</a> (2017)</li><li>Wei&#223;, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+patterns+of+damage+and+decay+kinetics+of+DNA+retrieved+from+plant+herbarium+specimens.">Temporal patterns of damage and decay kinetics of DNA retrieved from plant herbarium specimens.</a> Royal Soc Open Sci. 3 (6), 160239 (2016).</li><li>Sawyer, S., Krause, J., Guschanski, K., Savolainen, V., P&#228;&#228;bo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+patterns+of+nucleotide+misincorporations+and+DNA+fragmentation+in+ancient+DNA.">Temporal patterns of nucleotide misincorporations and DNA fragmentation in ancient DNA.</a> PLoS ONE. 7 (3), e34131 (2012).</li><li>Head, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Library+construction+for+next-generation+sequencing:+overviews+and+challenges.">Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges.</a> BioTechniques. 56 (2), 61-64 (2014).</li><li>Grover, C. E., Salmon, A., Wendel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+sequence+capture+as+a+powerful+tool+for+evolutionary+analysis.">Targeted sequence capture as a powerful tool for evolutionary analysis.</a> Am J Bot. 99, 312-319 (2012).</li></ol>

המחברים מצהירים שיש להם אין אינטרסים מתחרים.

פרוטוקול המובאת כאן היא שיטה מקיפה וחזק עבור ספריית הכנה של צמחים מיובשים דגימות DNA בידוד וסדר. העקביות של השיטה, מינימלי צורך לשנות אותו מבוסס על יצירת איכות הדגימה זה מדרגי לפרויקטים גדולים מבוססי עשבייה רצף. ההכללה של שלב reamplification אופציונלי עבור ספריות תשואה נמוכה מאפשר הכללת באיכות נמוכה, כמות נמוכה, נדיר, או חשיבות היסטורית דגימות שאחרת לא היה מתאים רצף.
חשיבות התשואה DNA הראשונית DNA נגזר עשבייה לעיתים קרובות יורד כתוצאה הדגימה הראשונית לשימור11, עם ה-DNA של דגימות פחות מ 300 שנה העתיקה היות מושפלת כמו DNA מבודד שרידי בעלי חיים שנמצאים כמה מאות אלפי בת31 , 32. כתוצאה מכך, אופטימיזציה של התשואה DNA הראשונית היא חיונית בהשגת מספיק dsDNA איכותיים להכנה ספריית רצף מוצלח. זני דשא, התשואה האופטימלית מושגת באמצעות שימוש משולב של חול מעוקר, חנקן נוזלי ב שהטחינה הראשונית צעד, מתן החורבן יסודית יותר של קירות התא ואת שחרורו של חומצות גרעין. גישה זו מגדילה dsDNA גדולה יותר רצוי וגם לא רצוי שברים קטנים יותר (איור 1, משלימה איור 1, בטבלה 2, משלימה טבלה 1). שלבי הניקוי חרוז עוקבות לבודד ולהעשיר על שברי בגודל מתאים על רצף (300 – 500 בסיסים), מאוד לצמצם שחזור אבל גם מועילות גם קטעים ארוכים (טבלה 2, משלימה טבלה 1). שינויים כדי השלבים הראשונים של בידוד ה-DNA, ייתכן שיהיה צורך בהתבסס על שושלת היוחסין להיות נדגמים כדי להפחית את ההשפעות של מטבוליטים משניים על עיבוד במורד הזרם18.
אופטימיזציה של ספריית מתאמים הריכוז של מתאמים משמש מצדו יש השפעה ישירה על מידת המתאם דיימר בספריות המוגמר. מתאם הדימרים לנבוע מתאם מצדו עצמית כאשר דגימת אין די קיים, לזהם את רצף הרצפים33. DsDNA סה כ נמוך יחסית זמין מ דגימות עשבייה מצריך דילול של מתאמים לפני מצדו. יכול להיות מדולל מתאמים 50-fold מן הריכוז מניות של 15 מיקרומטר (ראו סעיף פרוטוקול) והקלה על תפוקה גבוהה ספריית הכנה ללא הצורך בנפרד למדוד ו לדלל מתאם עבור כל דגימה (בטבלה 2, טבלה משלימה 1). למרות הרוויה של מתאמים יכול עקרונית ירידה התשואה הכוללת ספריה, סביר להניח כי דגימות עשבייה תניב dsDNA כזה עודף של מתאם.
וריאציה של חרוז ניקוי צעדים על תשואות גבוהות בחירת גודל בהכנה של רצף ספריות נעשית בדרך-כלל לאחר מתאם מצדו, המאפשרות הגברה של קטעים בעיקר בטווח הרצוי; פעולה זו מתבצעת על-ידי הסרת שברי כי הן גדולות יותר קטן יותר מהגודל היעד. הכמות הנמוכה של עשבייה, נגזר dsDNA להכנה הספרייה היא מתעצמת לאחר בחירת גודל בשלב זה, וכתוצאה מכך dsDNA סה כ unworkably נמוך, בסופו של דבר נמוך התשואה בספריה הסופי. על-ידי עריכת צעד חרוז לניקוי רגיל באמצעות 90% נפח חרוזים לאחר מצדו, dsDNA סה כ עוד נשאר העשרה שלב הגברה. שברי DNA קטן מאוד יוסרו מעדיפים שימוש 90% נפח חרוזים. בחירת גודל מבוצע בשלב האחרון על הספרייה מוגבר, אשר מבטיח העשרה בגדלים המקטע הרצוי. יכול להיות מותאם נפחים של חרוזים כדי לבחור את הטווח הרצוי, למרות אמצעי האחסון שני שלבים של 25 µL ו µL 6 של חרוזים המותאמים בצורה מיטבית כדי לאחזר ספריות של 400-500 מוסיף זוג בסיסים בתוך פרוטוקול זה (איור 1B, משלים איור 2).
חילוץ דגימת Reamplification של ספריות למרות מומלצות ב DNA בידוד והכנת ספריית, ריכוזים הסופי של רצף ספריות עלול להיות למחקר נוסף רצף. הטבע ההרסני של חומר מתכלה מדגם ומוגבל לעיתים קרובות עשבייה דגימות לא תמיד מאפשר חוזרות בידוד ה-DNA. על ידי reamplifying הספריה עד 12 מחזורי PCR נוספים, ספריות עניים מופלגים אפילו יכולים להיגאל. זוג פריימר רגיל משמש עבור הגברה, אשר תואמת או פרוטוקולים ספריה באינדקס כפול או בודד. הדאגה העיקרית של reamplification היא המבוא של הטיה, לעתים קרובות דרך הפחתת בחלקים GC-עשיר של הגנום20. באמצעות פולימראז של אמינות גבוהה (ראה טבלה של חומרים), הטיות אפשריות אלה הם נמנעו באופן פוטנציאלי. הוכח באמצעות וריאציית מינימלי של GC תוכן של הספריות ברצף TK686 ו- TK686-R (טבלה 3). כמו אימות השני, התוכן transposon של TK686 ו- TK686-R היה מוערך, אין כמעט הבדל ניכר (טבלה 3). לבסוף, הגנום כולו כלורופלסט של הצטרפות זו הורכבה TK686 ו- TK686-R, אשר הביא רצפים זהים שלאחר בדיקה מקרוב של וריאציה הסנ פ בין ההרכבות שני (איור 2, טבלה 3). בדיקות אלה מראים מדדים גנומית, תקן זה כמו תוכן GC transposon הרכב, ואת היכולת להרכיב הגנום השלם כלורופלסט, עשוי לא להיות מושפע reamplification. זה פותח את האפשרות של שילוב עשבייה דגימות חשב גם להיות מושפלת או חסר חומר phylogenomic במחקרים ללא חשש להטיה הציג דרך ה-PCR. ספריות אלה reamplified יכול לשמש גם עבור רצף לכידת34, למרות שזה יהיה צורך לבדוק אם הייעוד הסנ פ מגמתיות. מומלץ כי בדיקות בקנה מידה קטן של הטיה להתנהל עם כל פרוייקט כדי לוודא כי הטיה לא מוחדרים רצף ספריות.
מגבלות ושינויים אפשריים אף-על-פי פרוטוקול זה עבד על מאות דגימות עשבייה, גרוע לשימור רקמות עשויה להיכשל עדיין בשלב כלשהו. היא, לעומת זאת, ונדירה ביותר עבור ספריות להיכשל רקמות עם עקירות הדי מוצלחת, במיוחד אחרי ספריית הצלה דרך reamplification. ניתן לשנות את הצעדים בחירת גודל למטרה שברים בגדלים שונים או להקטין את המגוון הרחב של קטעים ראיתי כמה ספריות הסופי. כמו עם כל הפרוטוקולים המבוסס על צמח חילוץ, צעדים עשוי להיות נחוץ כדי להסיר חומרים משני שושלת היוחסין הספציפי יכול לעכב את פרוטוקול הכולל. כפי שהוצג, פרוטוקול זה מספק שיטה סטנדרטית להכנה DNA בידוד, תפוקה גבוהה ספריית דגימות עשבייה דשא, דרך אימות וניסוי צפוי להיות amendable כדי שושלות צמחים אחרים.

עשבייה אוספים הם מקור ערך פוטנציאלי של מינים ושל גיוון גנומית ללימודי כולל פילוגנטיקה1,2,3, גנטיקה של אוכלוסיות4,5, שימור ביולוגיה6, מין פולש ביולוגיה7ותכונה האבולוציה8. היכולת לקבל מגוון רחב של מינים, אוכלוסיות, מיקומים גיאוגרפיים ונקודות זמן מדגיש את "אוצר"9 זה עשבייה. מבחינה היסטורית, מהות נגזר עשבייה DNA מפורק יש הפריע פרויקטים מבוססי ה-PCR, לעיתים קרובות להשכיב חוקרים באמצעות סמנים בלבד נמצאו ב העתק גבוהה, כגון אזורים של הגנום כלורופלסט או מרווח משועתקים פנימי (ITS) של ribosomal ה-RNA. האיכות של דגימות DNA להשתנות בהרחבה על השיטות לשימור9,10, עם הפסקות גדילי כפול, פיצול מהאש המשמשים בתהליך ייבוש הצורות הנפוצות ביותר של נזק, יצירת בסיס מה שנקרא 90% DNA שכלוא יש לתאר מחקרים מבוססי ה-PCR11. מלבד הפיצול, לסוגיה השנייה הכי נפוצה עשבייה גנומיקה היא זיהום, כגון זה נגזר פטריות endophytic13 או פטריות רכשה לאחר המוות לאחר אוסף אך לפני הרכבה עשבייה12, למרות זאת בעיה זו יכולה להיות bioinformatically פתור נתן את מסד הנתונים נכון פטרייתיים (ראו להלן). בעיה השלישי, פחות נפוץ, הוא שינוי רצף עד ציטוזין (C/G→T/א) דיאמינציה14, למרות מוערך יהיה נמוך (~ 0.03%) עשבייה דגימות11. עם כניסתו של תפוקה גבוהה רצף (HTS), סוגיית הפיצול ניתן להתגבר עם רצף עומק12,15, המאפשר רכישת נתונים ברמת גנומית של דגימות רבות עם איכות נמוכה של קריאות קצר ה-DNA, ואפילו לפעמים המתיר רצף הגנום כולו15.
עשבייה דגימות נעשה שימוש בתדירות גבוהה יותר, הם מרכיב גדול של פרויקטים פילוגנטי16. אתגר הנוכחי של משתמש עשבייה דגימות HTS היא בעקביות קבלת מספיק DNA נטושים כפול, תנאי הכרחי עבור רצפי פרוטוקולים, ממינים רבים מבעוד, ללא צורך לייעל שיטות עבור הפרט דגימות. בנייר זה, הוכח עבור הפקת דנ א והכנת ספריית דגימות עשבייה פרוטוקול זה מנצל שיטות קיימות ומשנה אותם כדי לאפשר תוצאות מהר ו לטבלה הניתנת לשכפול. שיטה זו מאפשרת להשלים עיבוד הדגימה לספריה של דגימות 24 h 13, עם הזמן על הידיים של 8 שעות, או ח 16, עם הזמן על הידיים 9 h, כאשר השלב reamplification אופציונלית נדרשת. עיבוד סימולטני של דגימות נוספות הוא בר השגה, אבל הגורם המגביל הוא יכולת צנטריפוגה, מיומנות טכנית. הפרוטוקול נועד דרוש רק טיפוסי ציוד מעבדה (thermocycler צנטריפוגה, דוכני מגנטי) במקום ציוד מיוחד, כגון מפוחים או sonicator, עבור הטיית ה-DNA.
איכות ה-DNA, פרגמנט גודל וכמות המגבילים את הגורמים לשימוש של עשבייה דגימות בניסויים רצף תפוקה גבוהה. שיטות נוספות לבודד דנ א עשבייה ויצירת רצף תפוקה גבוהה ספריות הראו את התועלת של שימוש רק 10 ng של הדנ א16; אולם הם דורשים השפעול קביעת המספר האופטימלי של PCR מחזורי הנדרש להכנה הספרייה. זה הופך מעשית כאשר להתמודד עם כמויות קטנות מאוד של קיימא כפול תקועים דנ א (dsDNA), כמו הדגימות עשבייה לייצר רק מספיק דנ א הכנה בספריה מסוימת. השיטה המוצגת כאן משתמש מספר בודד של מחזורים ללא קשר לאיכות הדגימה, כך אין דנ א הוא איבד ספריית אופטימיזציה שלבים. במקום זאת, צעד reamplification מופעל כאשר ספריות אינן עונות על הכמויות המינימליות לצורך עריכה ברצף. דוגמאות עשבייה רבים נדירים ושולט קצת חומר מקשה להצדיק את הדגימה הרסני במקרים רבים. כדי לשנות זאת, פרוטוקול הציג מאפשר dsDNA קלט מידות פחות מ 1.25 ng לתוך תהליך הכנה ספריה, הרחבת הטווח של דגימות קיימא עבור תפוקה גבוהה רצף וצמצום הצורך דגימה ההרסני של דגימות.
להלן כללי התנהגות יש כבר אופטימיזציה עבור עשבי, נוסה על מאות מינים שונים מדגימות עשבייה, אף אנו צופים כי ניתן להחיל את הפרוטוקול להרבה קבוצות אחרות של הצמח. הוא כולל שלב אופציונלי שחזור יכול לשמש כדי לחסוך באיכות נמוכה ו/או דגימות נדירות. בהתבסס על דגימות עשבייה מעל מאתיים נבדק, פרוטוקול זה פועל על דגימות עם קלט רקמות נמוכה ואיכות, המאפשר השימור של דגימות נדירות באמצעות דגימה הרסני מינימלי. הנה היא מופיעה בפרוטוקול זה יכול לספק ספריות באיכות גבוהה יכול להיות רציף לפרויקטים מבוססי phylogenomics.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="733">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Veriti Thermal Cycler</td>
			<td style="width:180px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:104px;">4452300</td>
			<td style="width:147px;">96 well&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Gel Imaging System</td>
			<td style="width:180px;">Azure Biosystems</td>
			<td style="width:104px;">c300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Microfuge 20 Series</td>
			<td style="width:180px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:104px;">B30137</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Digital Dry Bath</td>
			<td style="width:180px;">Benchmark Scientific</td>
			<td style="width:104px;">BSH1001</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Electrophoresis System</td>
			<td style="width:180px;">EasyCast</td>
			<td style="width:104px;">B2</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">PURELAB flex 2 (Ultra pure water)</td>
			<td style="width:180px;">ELGA&#160;</td>
			<td style="width:104px;">89204-092</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">DNA LoBind Tube&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Eppendorf</td>
			<td>30108078</td>
			<td style="width:147px;">2 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Mini centrifuge</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">12-006-901</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Vortex-Genie 2</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">12-812</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Mortar</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">S02591</td>
			<td style="width:147px;">porcelain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Pestle</td>
			<td style="width:180px;">fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">S02595</td>
			<td style="width:147px;">porcelain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Centrifuge tubes</td>
			<td style="width:180px;">fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">21-403-161</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Microwave</td>
			<td style="width:180px;">Kenmore</td>
			<td style="width:104px;">405.7309231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Qubit Assay Tubes</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:104px;">Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">0.2 ml Strip tube and Cap for PCR</td>
			<td style="width:180px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">20170-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:104px;">Q32866</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Balance</td>
			<td style="width:180px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:104px;">PM2000</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Liquid Nitrogen Short-term Storage</td>
			<td style="width:180px;">Nalgene</td>
			<td style="width:104px;">F9401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Magnetic-Ring Stand&#160;</td>
			<td style="width:180px;">ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:104px;">AM10050</td>
			<td style="width:147px;">96 well&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Water Bath</td>
			<td style="width:180px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">89032-210</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Hot Plate Stirrers</td>
			<td style="width:180px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">97042-754</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td style="width:180px;">Airgas</td>
			<td style="width:104px;">UN1977</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">1 X TE Buffer</td>
			<td style="width:180px;">Ambion</td>
			<td style="width:104px;">AM9849</td>
			<td style="width:147px;">pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">CTAB</td>
			<td style="width:180px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:104px;">0833-500G</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">2-MERCAPTOETHANOL</td>
			<td style="width:180px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:104px;">0482-200ML</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Ribonuclease A</td>
			<td style="width:180px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:104px;">E866-5ML</td>
			<td style="width:147px;">10 mg/ml solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Agencourt AMPure XP</td>
			<td style="width:180px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:104px;">A63882</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:180px;">bio WORLD</td>
			<td style="width:104px;">705744</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Isopropyl Alcohol</td>
			<td style="width:180px;">bio WORLD</td>
			<td style="width:104px;">40970004-1</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Nuclease Free water</td>
			<td style="width:180px;">bio WORLD</td>
			<td style="width:104px;">42300012-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Isoamyl Alcohol</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">A393-500</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Sodium Acetate Trihydrate</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">s608-500</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">LE Agarose</td>
			<td style="width:180px;">GeneMate</td>
			<td style="width:104px;">E-3120-500</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">100bp PLUS DNA Ladder</td>
			<td style="width:180px;">Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:104px;">D003-500</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">EDTA, Disodium Salt</td>
			<td style="width:180px;">IBI Scientific</td>
			<td style="width:104px;">IB70182</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td style="width:180px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">Q32854</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">TRIS</td>
			<td style="width:180px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:104px;">103133</td>
			<td style="width:147px;">ultra pure</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Gel Loading Dye Purple (6 X)</td>
			<td style="width:180px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:104px;">B7024S</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">NEBNext dsDNA Fragmentase</td>
			<td style="width:180px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:104px;">M0348L</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:303px;">NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina&#160;</td>
			<td style="width:180px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:104px;">E7645L</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:303px;">NEBNext Multiplex Oligos for Illumina</td>
			<td style="width:180px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:104px;">E7600S</td>
			<td style="width:147px;">Dual Index Primers Set 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix</td>
			<td style="width:180px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:104px;">M0543L</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Mag-Bind RXNPure Plus</td>
			<td style="width:180px;">Omega bio-tek</td>
			<td style="width:104px;">M1386-02</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">GelRed 10000 X</td>
			<td style="width:180px;">Pheonix Research</td>
			<td style="width:104px;">41003-1</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Phenol solution</td>
			<td style="width:180px;">SIGMA Life Science</td>
			<td style="width:104px;">P4557-400ml</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">PVP40</td>
			<td style="width:180px;">SIGMA-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">PVP40-50G</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:303px;">Chloroform</td>
			<td style="width:180px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">EM8.22265.2500</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Ethanol</td>
			<td style="width:180px;">Koptec</td>
			<td style="width:104px;">V1016</td>
			<td style="width:147px;">200 Proof</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Silica sand</td>
			<td style="width:180px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">14808-60-7</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reamplification primers</td>
			<td colspan="2">Integrated DNA Technologies</td>
			<td>see text</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Sequencher v.5.0.1</td>
			<td style="width:180px;">GeneCodes</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

robust dna isolation and high-throughput sequencing library construction for herbarium specimens

Herbaria הם מקור יקר ערך של חומר צמחי יכול לשמש במגוון מחקרים ביולוגיים. השימוש של דגימות עשבייה מזוהה עם מספר אתגרים כולל איכות שימור הדגימה, DNA מפורק דגימה ההרסני של דגימות נדירות. על מנת להשתמש ביעילות רבה יותר חומר עשבייה בפרוייקטים גדולים רצף, דרושה שיטה מהימן ומדרגי הכנה בידוד וספריית הדי. מאמר זה מדגים פרוטוקול חזקות, ההתחלה-to-end לבנייה DNA בידוד, תפוקה גבוהה ספריה של דגימות עשבייה שאינה דורשת שינוי לקבלת דוגמאות בודדות. פרוטוקול זה המותאם במיוחד עבור איכות נמוכה מיובשים צמח חומר לוקח יתרון השיטות הקיימות על-ידי מיטוב רקמות שחיקה, שינוי בחירת גודל הספרייה, היכרות עם שלב reamplification אופציונלי עבור ספריות תשואה נמוכה. Reamplification של ספריות DNA תשואה נמוכה יכול להציל את דגימות נגזר דגימות עשבייה ללא תחליף, ערך פוטנציאלי, שלילת הצורך לדיגום הרסניים נוספים וללא היכרות עם רצף ניכרת הטיה על השכל יישומים פילוגנטי. הפרוטוקול נבדק על מאות מינים דשא, אך צפוי להיות להתאמה לשימוש אחר שושלות הצמח לאחר אימות. פרוטוקול זה יכול להיות מוגבל על ידי ה-DNA ביותר, שבו קטעים שלא קיימים בטווח הרצוי, ועל ידי מטבוליטים משניים נוכח חומר צמח המעכבות נקי בידוד ה-DNA. בסך הכל, פרוטוקול זה מציג שיטה מקיפה ומהירה המאפשרת בידוד ה-DNA והכנת ספריית דגימות 24 ב פחות מ 13 h, עם רק 8 שעות של זמן על הידיים פעילה עם שינויים מינימליים.

בידוד ה-DNA ועם תשואה ספריית הסופי במחקר זה, הדגימו את היעילות של הפרוטוקול עבור הבידוד של דנ א עשבייה ושחזור של ספריות רצף באיכות גבוהה באמצעות כחמישים דוגמאות שונות עם הבכור משנת 1920 הצעיר ביותר מ-2012 (טבלה 2). עבור כל דגימה, כ 10 מ ג של רקמת העלה שימש עבור בידוד של דנ א. רקמת העלה ירוק יותר היה המועדף אם היא זמינה, אין רקמות עם זיהום פטרייתי ברור נבחר. ומשום מוצלח יכול להתבצע באמצעות רקמות צהוב או חום, למרות התשואה אמור להיות צפוי להיות נמוך יותר. סך כפול תקועים דנ א (dsDNA) מן הבידוד הראשוני נע בין 3.56 נג ל 2,610 ng. כצפוי, המתקבל עשבייה דגימות DNA היה מושפל מאוד (איור 1A, המשלימים איור 1). חלק ומשום אלה שימשו אנזימטי הטיה (ng 1.26-464). למרות עשבייה DNA הוא לכסנתם כבר בתהליך שימור, אופטימיזציה של הפרוטוקול מחייבת הטיה נוספים כדי לשפר את התשואה הכוללת ספריה. התאוששות מוחלטת של dsDNA פוסט-הטיית נע בין < 1 51% dsDNA קלט, וכתוצאה מכך מינימום של פחות מ- 1.25 ng של התחלה DNA עבור ספריית והכנה היותר 328 ng. אובדן קיצוני של DNA ב דגימות ניתן לייחס את גודל מקטע קטן כבר הרבה של ה-DNA לפני אנזימטי ההטיה (איור 1A, משלימה איור 1). השימוש של ניקיון חרוז 90% נפח על ה-DNA הוטו הוסרו בכוונה הרסיסים הקטנים של דנ א כדי להעשיר לגדלים שבר גדול יותר, רצוי יותר. אלה קטעים קטנים במיוחד נראו בדגימות TK463, TK657, TK694, כפי מסומן על ידי אות עז-הסימן 100 זוג בסיסים (איור 1 א').
הכמות הכוללת של בחירת גודל הספרייה פוסט נע בין 1.425 ng כדי 942.5 ng (טבלה 2, משלימה טבלה 1). עבור 23 של הדגימות, הכנת מיצוי וספריית הראשונית לא נכנע כמות מספקת של הספרייה (< 10 ננומטר; טבלה 2, משלימה טבלה 1), כך הדוגמיות הללו עברו את השלבים reamplification ושחזור של הפרוטוקול, והתוצאה היא סימן x 14 – 680 לודיג הכולל ספריה (טבלה 2, משלימה טבלה 1). ספריות הסופי כתוצאה הלהקה בין 350 ו 500 זוגות בסיס (איור 1B, המשלימים איור 2). לעתים, נראתה להקת השני שהיה גדול גודל הספרייה הצפוי (איור 1B, המשלימים איור 2). זה אירע כאשר reamplification ה-PCR מותש תחל זמין והחל חישול ספריית מתאמים שברי DNA שאינם הומולוגיים. זה יוצר מולקולה איפה הקצוות (מתאמים) היו חישול כראוי, אבל תותב דנ א לא. מולקולה זו "מבעבע" הופיעו גדול על ג'ל, זה זז לאט יותר דרך המטריקס ג'ל. שגיאות מחזק אלה היו קבוע על-ידי הכנת התגובה reamplification אחר מהספריה reamplified כבר בודקים את זה עבור מחזור יחיד. מחזור יחיד זה מסופק תחל חישול נכונה, הגברה, הסרת הלהקה השנייה (משלימה איור 3).
Reamplification של ספריות הקל ספריית הסופי ריכוזים של פחות 10 ננומטר. ריכוזים אלה מותר ספריות לדלל את שווה molarity, במאגר של ייצוג שווה, עוזר כדי לשלול בעיות שהתעוררו עם איכות מדגם שוויוני, רצף ספריית התשואה. אם המטרה של פרוייקט הגנום כלורופלסט רצף, לאחר מכן הסכום הכולל של רצף הצורך ישתנו ככל שושלות שונות, רקמות שונות האחוזים הכולל של קריאות שמקורן כלורופלסט דנ א19. בדרך כלל, 50 – 100 x כיסוי המתוכננת של הגנום כלורופלסט מספיקה להרכבה, רצף הרצפים יכול להיות איחדו לכלול כ 70 אנשים בהתאם מינים שיטה.
בדיקות זיהום, הטיה של וריאציה נגרמת על ידי Reamplification דאגה HTS רצף הבולטים הוא הקדמה של הטיה לתוך ספריות באמצעות PCR נרחב הגברה20. כדי לבחון את ההשפעה של reamplification ולזהות יישומים פוטנציאליים במשותף פילוגנטי הסטייה של חומר עשבייה, השווינו ספרייה בהצלחה ברצף (TK686) עם אותה ספריה מדולל 1:5, reamplified (איזור TK686-R). שני TK686 ו- TK686-R היו וסודרו על HiSeq4000 אילומינה מרכז ביוטכנולוגיה באוניברסיטת אילינוי קארבר ג'יי רועי, מישיגן סטייט אוניברסיטת טכנולוגיית תמיכה במתקן המחקר, בהתאמה, באמצעות זוג בסיסים 150 סוף לזווג קורא (ראה טבלה 3 לפרטים רצף). קריאות גולמי נצברים בחשבון ההזמנות NCBI (SRP128083). קריאות נוקו באמצעות Trimmomatic v.0.3621 כולל מתאם זמירה באמצעות נב מתאם רצף, איכות סינון עבור ציון phred ממוצע של 20 עבור צמד בסיס 10 הזזה לחלון, ולנתק מינימום גודל 40 בסיסי זוגות. כמו אחד הנושאים העיקריים עם דגימות עשבייה זיהום פטרייתי, זיהום הוערך על-ידי מיפוי קריאות נגד חלק JGI MycoCosm הגנום פטרייתי מסד הנתונים22 (312 הגנום הגרעיני ואת הגנום מיטוכונדריאלי 79) באמצעות bowtie2 v . 2.2.923 שימוש בערכת פרמטר "מאוד רגיש-מקומית". ספריות TK686 ו- TK686-R היו להבחין מגניחותיה לזיהום פטרייתי גרעינית (9.24% ו 9.68%, בהתאמה), זיהום פטרייתי מיטוכונדריאלי (0.94% ו- 0.8%) (טבלה 3). אבל זו רק דוגמה אחת, יש רמזים כי זיהום פטרייתי של דגימות עשבייה is not זניח ויש להסירם לפני שימוש בנתונים רצף נגזר עשבייה. ניתן למצוא את מסד הנתונים ואת הפקודות המשמשות כדי לזהות ולהסיר זיהום פטרייתי במאגר GitHub עשבייה גנומיקה24של McKain מ ר.
רצף הגנום כלורופלסט משמש בדרך כלל עבור ניתוח פילוגנטי, דגימות עשבייה משמשים יותר ויותר כמו גשמי מקור12. על מנת לבדוק את אמינות reamplification בהרכבה הגנום כלורופלסט, כלורופלסט הגנום הן TK686 והן TK686-R כונסו באמצעות מדד עניבת הפרפר מוגדר דגנאים מהיר-Plast v.1.2.525 תחת הגדרות ברירת המחדל. הגנום המלא כלורופלסט הושג עבור TK686-R, אך הגנום כלורופלסט TK686 הורכב לתוך contigs שבע עקב נמוך יותר עומק קריאה. Contigs TK686 רוכזו באופן ידני בעקבות McKain. et al. 26 כלורופלסט שהרכבתם הגנום היו מיושר לשני תוכנה מבוססת-GUI יישור (ראה טבלה של חומרים) וריאציה בין הרכבות היה להעריך. סכום כולל של 12 SNPs, ויאסין אחד זוהו בין הרכבות כלורופלסט עבור TK686 TK686-R. עבור כל משתנה, כיסוי הוערכה ערכות קריאה הן TK686 והן TK686-R. בכל המקרים, הגרסה הנפוצה ביותר היה זהה בין שתי הספריות. TK686 הפגינו T→C אחד G→A אחת, G→T אחד, אחד G→-, C→A אחד, T→A אחת, ארבע גרסאות C→A. חמש גרסאות אלה אירעה בתוך מחרוזת homopolymer, רומז שלהם שהשתלבה ההרכבה היה התוצאה של שגיאת רצף וכיסוי הכוללת נמוכה. ייתכן האחרים היה התוצאה של כלורופלסט haplotype וריאציה, רצף שגיאה, או ציטוזין דיאמינציה, או שילוב של גורמים אלה. TK686-R היו C→T אחת, G→T אחד A→G אחת. גרסאות C→T ו- G→T נמצאו homopolymer כמתואר לעיל. בסופו של דבר, כלורופלסט מלאה זהה הגנום אותרו שתי מערכות קריאה. גנום כלורופלסט יחיד של TK686 היה מבואר באמצעות מוריקים21 , לעומת שאר חברי השבט Andropogoneae. כל התכונות כלורופלסט רגיל היו מבואר: 8 rRNAs, 38 tRNAs ו- 84 גנים קידוד החלבון. הגנום השלם כלורופלסט זמין GenBank (MF170217) ו מוריקים27.
הטיה אפשרית מן reamplification של הספריות נקבע גם דרך הערכה של אחוז GC ותוכן הכולל transposon המשוער. GC אחוז הוערך באמצעות script מותאם אישית24. ההבדלים בתוכן GC בשתי הדגימות היו זניחים, עם GC 49.7% ב- TK686 ו- GC 51.2% ב- TK686-R. Transposon הרכב הוערך באמצעות Transposome28. עבור שתי הספריות, קריאות 100,000 היו subsampled באופן אקראי, קומפוזיציה transposon הוערך באמצעות זהות אחוז של 90, כיסוי שבר של 0.55, גודל האשכול של 100, ההפניה אני חוזר של דשא RepBase 21.10 להגדיר29. זה חזר על עצמו 100 פעמים כדי לבצע אתחול לפי הערכה transposon של אלה נתונים (datasets). אחוזי הגנום הכולל עבור subfamilies הגדולות של טרנספוזונים חולצו מתוך פלט Transposome, וסטיית אלה עבור 100 משכפל הוערך. כל קבצי ה-script המשמש ליצירת תפוקות אלה ניתן למצוא במאגר Github טרנספוזונים30של McKain מ ר, כל התוצאות נצברים בחשבון דריאדה (doi:10.5061/dryad.r8t2m). שימוש subfamilies transposon הנפוצות ביותר של שני אינדיקטורים (העתק וצועני מסוף זמן חוזר retrotransposons), התוצאות היו כמעט זהות עם העתק 33.52 ± 4.00% ו 31.68 ± 2.94%, צועני -24.83 ± 2.72% ל- 2.35% 24.00 ± TK686 ו- TK686-R, בהתאמה (טבלה 3). אלו תוצאות הבדיקה מראים כי השלב reamplification של פרוטוקול זה לא יצר רצף משמעות הסטייה עבור מדדים הגנום ברמה גבוהה. עם זאת, יצוין כי זו דוגמה יחידה לא ייתכן נציג באופן מלא כל הספריות reamplified. מבחן יחיד זה מדגים כי הצעד reamplification היה לא מטבעו ממתח הגנום מדדים ב TK686/TK686-R. הטיה הציג לא ישפיע על ההרכבה של הגנום כלורופלסט נותן כיסוי מספיק של רצף, אך מומלץ כי הניסויים, כפי שהוצג במחקר זה עם TK686/TK686-R, נערכות על שושלות היעד כדי לוודא bias לא המתרחשים במהלך לימודי חוקרים טרנספוזון גיוון.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56837/56837fig1.jpg"> איור 1: Agarose תמונות ג'ל של A) DNA בידוד וספריות רצף ב) הסופי של דגימות עשבייה עשר. במשך כל ליין, שימש µL 3 של ה-DNA או ספריה. דנ א (א) היה מושפל, ומשום עשבייה כל כפי שנראה את השמצות גנרל. ספריות רצף הסופי (B) מתארים להקה העיקרי של 300-500 בסיסים עם הפצה רחבה יותר של 200-1, 000 בסיסים אפשריים; האחרון הוא נפוץ יותר בספריות reamplified. נתיבים עבור שניהם (A) ו- (B) זוהו על ידי דגימה, ניתן להשוות תוצאות בטבלה מס ' 2. סולם גודל תוארה בזוגות בסיס (bp). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56837/56837fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56837/56837fig2v2.jpg"> איור 2 : חלקה עגולה של Schizachyrium scoparium הגנום כלורופלסט (TK686) עם ביאור. הגנום שהרכבתם מן הרובה רצף ה-DNA נגזר עשבייה הציג באורך כולל של 139,296 בסיסי זוגות (bp), אזור גדול עותק בודד (ה-LSC) 81,401 bp, אזור חוזר הפוכה (IR) של 22,669 bp, אזור קטן עותק בודד (האס) 12,557 bp. כל הגנים חלבון-קידוד סטנדרטיים, tRNAs ו rRNAs עבור בני שבט Andropogoneae זוהו הביאור. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56837/56837fig2v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
בטבלה 2: תוצאות הדנ א החילוץ וספריית הכנה עבור עשר עשבייה דוגמיות וספריות reamplified 4. DNA נטושים זוגי הכולל שונים צעדים בפרוטוקול והפגינו באיכות משתנה? איך יכול להיות, במיוחד כאשר סינון של גודל. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56837/Table%202.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את השולחן הזה.</a>
טבלה 3: קביעת רצף נתונים סטטיסטיים TK686, את TK686R reamplified. Reamplification אינו משפיע על השכיחות הכוללת של זיהום פטרייתי הגנום, GC תוכן הערכה, הערכת הרכב transposon או היכולת להרכיב כלורופלסט כל הגנום. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56837/Table3_Sequencing_Statistics_TK686.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את השולחן הזה.</a>
משלימה טבלה 1: תוצאות הדנ א החילוץ וספריית הכנה עבור 40 דגימות עשבייה נוספים, כולל ספריות reamplified 20- DNA נטושים זוגי הכולל שונים צעדים בפרוטוקול והפגינו באיכות משתנה? איך יכול להיות, במיוחד כאשר סינון של גודל. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56837/Supplemental_Table1_Data.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את השולחן הזה.</a>
משלימה איור 1: Agarose תמונות ג'ל של ארבעים ומשום DNA נוספים של עשבייה דגימות. שני (A) ו- (B) מתארים את עשרים ומשום DNA נפרד ומדגימים השפלה האופיינית של DNA נגזר עשבייה. במשך כל ליין, שימש µL 3 של ה-DNA. נתיבים עבור שניהם (A) ו- (B) זוהו על ידי דגימה, ניתן להשוות תוצאות משלימה טבלה 1. סולם גודל מתואר בזוגות בסיס (bp). לבן כתמים על התמונה הן בשל חפצי אמנות םלצה ג'ל זה לא היתה אפשרות להסיר עם ניקוי. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56837/Supplmental_Figure1_DNA_Isolation.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות הזו.</a>
משלימה איור 2: Agarose תמונות ג'ל של ספריות ארבעים רצף נוספים מ- DNA נגזר עשבייה. במשך כל ליין, שימש µL 3 של הספריה. רצף הסופי ספריות מצויים שני (A) ו- (B) עם גודל ממוצע של 300-500 בסיסים. להקות משני אצל כמה דגימות מוגבר מציע "מבעבעים" של ספריות. נתיבים עבור שניהם (A) ו- (B) מזוהים באמצעות דגימה, ניתן להשוות תוצאות משלימה טבלה 1. סולם גודל מתואר בזוגות בסיס (bp). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56837/Supplemental_Figure_2_Library_Prep.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות הזו.</a>
משלימה איור 3: Agarose ג'ל תמונה של הלהקה משני הסרת עם שלב ה-PCR מחזור יחיד נוספים- <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56837/Supplmental_Figure3_Single_Cycle_Clean.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות הזו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens at JoVE.com

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

DNA חזקים בידוד ובנייה ספריית רצף תפוקה גבוהה עבור דגימות עשבייה

מאמר זה מדגים פרוטוקול מפורט DNA בידוד ובניה ספריית תפוקה גבוהה רצף מחומר עשבייה כולל חילוץ של ה-DNA בצורה יוצאת דופן באיכות ירודה.

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

robust-dna-isolation-high-throughput-sequencing-library-construction

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

10.5K Views.  Donald Danforth Plant Science Center. מאמר זה מדגים פרוטוקול מפורט DNA בידוד ובניה ספריית תפוקה גבוהה רצף מחומר עשבייה כולל חילוץ של ה-DNA בצורה יוצאת דופן באיכות ירודה.

Video: Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable development and differentiation of different tissue types. Dysregulation of this process is often the hallmark of various diseases like cancer. Here, we outline one of the recent sequencing techniques, Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq), used to quantify methylation in various normal and disease tissues for large patient cohorts. We describe a detailed protocol of this affinity enrichment approach along with a bioinformatics pipeline to achieve optimal quantification. This technique has been used to sequence hundreds of patients across various cancer types as a part of the 1,000 methylome project (Cancer Methylome System).

Here we present a protocol to investigate genome wide DNA methylation in large scale clinical patient screening studies using the Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq or MBD-seq) technology and the subsequent bioinformatics analysis pipeline.

רצף ללכוד מתיל-DNA מחייב עבור רקמות חולות

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal transduction pathways, transcriptional regulatory networks, gene expression, genome-editing, and gene-silencing. Furthermore, significant progress has been made in the regeneration of plants from protoplasts, which has generated even more interest in the use of these systems for plant genomics. In this work, a protocol has been developed for automation of protoplast isolation and transformation from a &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) tobacco suspension culture using a robotic platform. The transformation procedures were validated using an orange fluorescent protein (OFP) reporter gene (pporRFP) under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter (35S). OFP expression in protoplasts was confirmed by epifluorescence microscopy. Analyses also included protoplast production efficiency methods using propidium iodide. Finally, low-cost food-grade enzymes were used for the protoplast isolation procedure, circumventing the need for lab-grade enzymes that are cost-prohibitive in high-throughput automated protoplast isolation and analysis. Based on the protocol developed in this work, the complete procedure from protoplast isolation to transformation can be conducted in under 4 hr, without any input from the operator. While the protocol developed in this work was validated with the BY-2 cell culture, the procedures and methods should be translatable to any plant suspension culture/protoplast system, which should enable acceleration of crop genomics research.

A high-throughput, automated, tobacco protoplast production and transformation methodology is described. The robotic system enables massively parallel gene expression and discovery in the model BY-2 system that should be translatable to non-model crops.

פלטפורמה רובוטית עבור תפוקה גבוהה בידוד פרוטופלאסט וההשנאה

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics of these pathogens, in part due to a lack of well-developed genetic and genomic resources. These organisms have large, repetitive genomes, which have made genome sequencing and assembly prohibitively difficult. Here, we describe methods for the collection, extraction, purification and quality control assessment of high molecular weight genomic DNA from one powdery mildew species, Golovinomyces cichoracearum. The protocol described includes mechanical disruption of spores followed by an optimized phenol/chloroform genomic DNA extraction. A typical yield was 7 &#181;g DNA per 150 mg conidia. The genomic DNA that is isolated using this procedure is suitable for long-read sequencing (i.e., &#62; 48.5 kbp). Quality control measures to ensure the size, yield, and purity of the genomic DNA are also described in this method. Sequencing of the genomic DNA of the quality described here will allow for the assembly and comparison of multiple powdery mildew genomes, which in turn will lead to a better understanding and improved control of this agricultural pathogen.

Described here is a method for the extraction, purification, and quality control of genomic DNA from the obligate biotrophic fungal pathogen, powdery mildew, for use in long-read genome sequencing.

טיהור של ה- DNA הגנומי משקל מולקולרי גבוה מ אבקתי טחב על רצף ארוך לקריאה

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution based analysis methodology (nucleosome density ChIP-seq; ndChIP-seq) that enables the generation of combined measurements of micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification genome-wide. Nucleosome position and local density, and the posttranslational modification of their histone subunits, act in concert to regulate local transcription states. Combinatorial measurements of nucleosome accessibility with histone modification generated by ndChIP-seq allows for the simultaneous interrogation of these features. The ndChIP-seq methodology is applicable to small numbers of primary cells inaccessible to cross-linking based ChIP-seq protocols. Taken together, ndChIP-seq enables the measurement of histone modification in combination with local nucleosome density to obtain new insights into shared mechanisms that regulate RNA transcription within rare primary cell populations.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) methodology for the generation of sequence datasets suitable for a nucleosome density ChIP-seq analytical framework integrating micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification measurements.

דור של כרומטין יליד Immunoprecipitation רצף ספריות לניתוח צפיפות נוקלאוזום

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 nuclease or a nuclease-dead dCas9 fusion protein) is targeted to a specific site in the genome by a small synthetic RNA known as the guide RNA, or gRNA. The bipartite nature of the CRISPR system enables its use in screening approaches since plasmid libraries containing expression cassettes of thousands of individual gRNAs can be used to interrogate many different sites in a single experiment. 
To date, gRNA sequences for the construction of libraries have been almost exclusively generated by oligonucleotide synthesis, which limits the achievable complexity of sequences in the library and is relatively cost-intensive. Here, a detailed protocol for CORALINA (comprehensive gRNA library generation through controlled nuclease activity), a simple and cost-effective method for the generation of highly complex gRNA libraries based on enzymatic digestion of input DNA, is described. Since CORALINA libraries can be generated from any source of DNA, plenty of options for customization exist, enabling a large variety of CRISPR-based screens.

Methods for generating large-scale gRNA libraries should be simple, efficient and cost-effective. We describe a protocol for the production of gRNA libraries based on enzymatic digestion of target DNA. This method, CORALINA (comprehensive gRNA library generation through controlled nuclease activity) presents an alternative to costly custom oligonucleotide synthesis.

פרוטוקול אוניברסלי עבור gRNA בקנה מידה גדול ספריית הפקה מכל מקור ה-DNA

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have been directed toward elucidation of the location and timing of initiation of genome duplication rather than its completion. However, it is critical that we understand regions of the genome that are last to complete replication, because these regions suffer elevated levels of chromosomal breakage and mutation, and they have been associated with both disease and aging. Here we describe how we have extended a technique that has been used to monitor replication initiation to instead identify those regions of the genome last to complete replication. This approach is based on a combination of flow cytometry and high throughput sequencing. Although this report focuses on the application of this technique to yeast, the approach can be used with any cells that can be sorted in a flow cytometer according to DNA content.

We describe a technique for combining flow cytometry and high throughput sequencing to identify late replicating regions of the genome.

G2-seq: תפוקה גבוהה המבוססת על רצף טכניקה לזיהוי מאוחר לבצע שיכפול אזורים בגנום

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of cancer development. By using non-invasive or pre-malignant lesions from patients who later develop invasive disease, gene expression analyses may help identify early molecular alterations that predispose to cancer risk. It has been well described that nucleic acids recovered from FFPE tissues have undergone severe physical damage and chemical modifications, which make their analysis difficult and generally requires adapted assays. MicroRNAs (miRNAs), however, which represent a small class of RNA molecules spanning only up to ~18&#8211;24 nucleotides, have been shown to withstand long-term storage and have been successfully analyzed in FFPE samples. Here we present a 3&#39; barcoded complementary DNA (cDNA) library preparation protocol specifically optimized for the analysis of small RNAs extracted from archived tissues, which was recently demonstrated to be robust and highly reproducible when using archived clinical specimens stored for up to 35 years. This library preparation is well adapted to the multiplex analysis of compromised/degraded material where RNA samples (up to 18) are ligated with individual 3&#39; barcoded adapters and then pooled together for subsequent enzymatic and biochemical preparations prior to analysis. All purifications are performed by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), which allows size-specific selections and enrichments of barcoded small RNA species. This cDNA library preparation is well adapted to minute RNA inputs, as a pilot polymerase chain reaction (PCR) allows determination of a specific amplification cycle to produce optimal amounts of material for next-generation sequencing (NGS). This approach was optimized for the use of degraded FFPE RNA from specimens archived for up to 35 years and provides highly reproducible NGS data.

Formalin-fixed paraffin-embedded specimens represent a valuable source of molecular biomarkers of human diseases. Here we present a laboratory-based cDNA library preparation protocol, initially designed with fresh frozen RNA, and optimized for the analysis of archived microRNAs from tissues stored up to 35 years.

רצף MicroRNA רטרוספקטיבה: DNA משלימים ספריית הכנת פרוטוקול באמצעות פורמלין-קבוע RNA פרפין-מוטבע דגימות

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been used to analyze the spectrum of clonal mutations in malignancy. Though far more efficient than traditional Sanger methods, NGS struggles with identifying rare clonal and subclonal mutations due to its high error rate of ~0.5&#8211;2.0%. Thus, standard NGS has a limit of detection for mutations that are &#62;0.02 variant allele fraction (VAF). While the clinical significance for mutations this rare in patients without known disease remains unclear, patients treated for leukemia have significantly improved outcomes when residual disease is &#60;0.0001 by flow cytometry. In order to mitigate this artefactual background of NGS, numerous methods have been developed. Here we describe a method for Error-corrected DNA and RNA Sequencing (ECS), which involves tagging individual molecules with both a 16 bp random index for error-correction and an 8 bp patient-specific index for multiplexing. Our method can detect and track clonal mutations at variant allele fractions (VAFs) two orders of magnitude lower than the detection limit of NGS and as rare as 0.0001 VAF.

Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for genomic characterization that is limited by the high error rate of the platform (~0.5&#8211;2.0%). We describe our methods of error-corrected sequencing that allow us to obviate the NGS error rate and detect mutations at variant allele fractions as rare as 0.0001.

אירוע נדיר איתור שגיאות DNA ו RNA רצף

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state when water is supplied. The genomic sequencing of microscopic animals such as tardigrades risks bacterial contamination that sometimes leads to erroneous interpretations, for example, regarding the extent of horizontal gene transfer in these animals. Here, we provide an ultralow input method to sequence the genome of the tardigrade, Hypsibius dujardini, from a single specimen. By employing rigorous washing and contaminant exclusion along with an efficient extraction of the 50 ~ 200 pg genomic DNA from a single individual, we constructed a library sequenced with a DNA sequencing instrument. These libraries were highly reproducible and unbiased, and an informatics analysis of the sequenced reads with other H. dujardini genomes showed a minimal amount of contamination. This method can be applied to unculturable tardigrades that could not be sequenced using previous methods.

Contamination during the genomic sequencing of microscopic organisms remains a large problem. Here, we show a method to sequence the genome of a tardigrade from a single specimen with as little as 50 pg of genomic DNA without whole genome amplification to minimize the risk of contamination.

הגנום קלט ultralow רצף ספריית הכנה מ להצטננות Tardigrade

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short generation time, are easy to handle, display a high reproductive rate, low cost, and are easily amenable to genetic manipulations by microinjection of DNA in embryos. Recent advances in gene editing tools are enabling precise introduction of mutations and transgenes in zebrafish. Disease modeling in zebrafish often leads to larval phenotypes and early death which can be challenging to interpret if genotypes are unknown. This early identification of genotypes is also needed in experiments requiring sample pooling, such as in gene expression or mass spectrometry studies. However, extensive genotypic screening is limited by traditional methods, which in most labs are performed only on adult zebrafish or in postmortem larvae. We addressed this problem by adapting a method for the isolation of PCR-ready genomic DNA from live zebrafish larvae that can be achieved as early as 72 h post-fertilization (hpf). This time and cost-effective technique, improved from a previously published genotyping protocol, allows the identification of genotypes from microscopic fin biopsies. The fins quickly regenerate as the larvae develop. Researchers are then able to select and raise the desired genotypes to adulthood by utilizing this high-throughput PCR-based genotyping procedure.

Zebrafish have been used as reliable genetic model organisms in biomedical research, especially with the advent of gene-editing technologies. When larval phenotypes are expected, DNA extraction and genotype identification can be challenging. Here, we describe an efficient genotyping procedure for zebrafish larvae, by tail clipping, as early as 72-h post-fertilization.

מיצוי DNA תפוקה גבוהה, Genotyping של הזחלים דג זברה 3dpf על-ידי המסיכה פין

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...